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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Vandenbussche, G. (1990). Caractérisation physico-chimique des formes solubles et membranaires des glycoprotéines variables de surface de Trypanosoma brucei brucei (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/213169/3/5caa5043-8f0f-4eb8-889a-fce7fd8ba0a3.txt
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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Facultédes Sciences
Laboratoire de Chimie-Physique des Macromolécules aux Interfaces J-M. Ruysschaert
Caractérisation physico-chimique des formes solubles et membranaires des glycoprotéines variables de surface
de Trypanosoma brucei brucei.
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences
Guy VANDENBUSSCHE Mai 1990
Guy Vandenbussche
Intitulé de la thèse annexe
L’étude des interactions protéines-lipides dans les surfactants pulmonaires devrait permettre de proposer de nouveaux surfactants de remplacement utilisables dans le traitement du syndrome de détresse respiratoire.
Tous mes remerciements vont...
à Monsieur J-M. Ruysschaert qui a dirigé ce travail et qui par sa confiance et sa persévérance m’a permis de surmonter les nombreuses embûches rencontrées au cours de ces recherches.
à Monsieur M. Steinert qui m’a accueilli dans son laboratoire et a mis aimablement à ma disposition les souches de trypanosomes.
à Monsieur H.P. Voorheis pour m’avoir offert les deux formes de la VSG du variant MITat 1.1 et pour l’attention qu’il a accordée à ce travail.
à Messieurs N. Van Meirvenne et T. Vervoort qui ont mis à notre disposition les séra de lapins.
à Mesdames S. Van Assel, A. Pays, M. Laurent, à Monsieur E. Pays et à tous les membres du laboratoire de Cytologie et d’Embryologie moléculaires qui ont guidé, toujours avec le sourire, mes premiers pas dans le vaste domaine des trypanosomes et dont l’aide m’a été précieuse.
à Madame F. Defrise-Quertain, Mademoiselle V. Cabiaux et à Messieurs R. Brasseur, E.
Goormaghtigh et M. Vandenbranden qui en collaborant à ce travail m’ont fait partager leur expérience et leurs connaissances scientifiques avec grande gentillesse.
à Monsieur P. Duquenoy pour ses talents de dessinateur.
à tous les membres du laboratoire (je ne les citerai pas de peur d’en oublier) qui par leur enthousiasme et leur formidable soutien moral m’ont permis de réaliser ce travail dans une atmosphère détendue.
à Lucie pour son aide irremplaçable lors de l’élaboration et de la mise en page de cette thèse.
à toute ma famille qui avec patience, m’a toujours entouré et soutenu durant ces longues années.
à l’IRSIA pour l’aide financière qu’il m’a accordée.
Je voudrais également avoir une pensée pour tous ces petits rongeurs qui, bien malgré
Table des matières.
Abréviations
I. Introduction 3
1.1. Les trypanosomiases africaines 5
1.2. Cycle de développement des trypanosomes 10
1.3. La variation antigénique 16
1.4. Identification et localisation des molécules responsables de la
variation antigénique 17
1.4. a. Structure primaire des glycoprotéines variables de surface 21 1.4. b. Glycosylation de la chaîne polypeptidique 25 1.4. C. La forme membranaire des glycoprotéines variables de surface 27 1.5. La phospholipase C glycosyl-phosphatidylinositol spécifique du
trypanosome 34
1.6. Propriétés des glycoprotéines variables de surface 38 1.7. Structure secondaire et tertiaire des glycoprotéines variables de surface 40 1.8. Synthèse des glycoprotéines variables de surface 43 1.9. Caractéristiques de la membrane plasmique du trypanosome 49
1.10. Thérapie 52
II. Matériel et méthodes 54
11.1. Substances utilisées 54
11.2. Techniques et procédures expérimentales 55
Isolement des trypanosomes 55
Isolement des glycoprotéines variables de surface 56 Clivage enzymatique des glycoprotéines variables de surface 56
Electrophorèse 57
Fluorescence du 8-anilino-l-naphtalène sulfonate (ANS) 57
Préparations de vésicules lipidiques 57
Mesures d'agrégation de vésicules lipidiques 58
Spectrophotométrie UV-visible 58
Efflux de calcéine 58
Pression superficielle 59
Dosage des protéines 59
Dosage des phospholipides 59
Spectroscopie infrarouge 60
Calcul conformationnel 61
Synthèse du 1-azidonaphtalène tritié 62
Marquage in vivo de trypanosomes par le 1-azidonaphtalène tritié 62 Atténuation de fluorescence du pérylène par le 1-azidonaphtalène tritié 62
III. Résultats et discussion 64 III. 1. Comparaison des propriétés associées aux deux formes des
glycoprotéines variables de surface 64
III. 1.a. Caractérisation des VSG utilisées _ 64 III. 1.b. Fluorescence du 8-anilino-l-naphtalène sulfonate (ANS) 71 111.1. c. Interaction des glycoprotéines variables de surface avec des
modèles de membrane 73
A. Evolution de la densité optique 74
B. Efflux de calcéine 75
C. Mesures de pression superficielle 76
111.2. Etude de la structure secondaire des glycoprotéines variables de surface 79
111.2. a. Ponts disulfures 79
111.2. b. Spectroscopie infrarouge 83
111.2. C. Etude par analyse conformationnelle de la structure du segment carboxy-terminal hydrophobe et du glycolipide d’ancrage
des VSG 88
A. Segment carboxy-terminal 88
B. Glycosyl-phosphatidylinositol 91
111.3. Marquage in vivo de trypanosomes par le 1-azidonaphtalène tritié 99
111.3. a. Localisation du [®H]-AzN in vivo 99
111.3. b. Marquage in vivo de trypanosomes par le [^H]-AzN 102
111.4. Discussion et conclusion 109
Annexe 112
IV. Bibliographie 113
Abréviations.
ANS: 8-anilino-l-naphtalène sulfonate AnTat Antwerp Trypanozoon antigen type ATR: attenuated total reflection
AzN: 1-azidonaphtalène BHK: baby hamster kidney
BUT: blood incubation infectivity test BoTat Bordeaux Trypanozoon antigen type BrCN: bromure de cyanogène
cADN: acide désoxyribonucléique complémentaire CD: dichroïsme circulaire
CRD: cross-reacting déterminant d: dalton
DAF: decay accelerating factor
DEAE-cellulose: diéthylaminoéthyl cellulose DPH: 1,6-diphényl-1,3,5-hexatriène
DPPC: D,L-û:-dipalmitoylphosphatidylcholine ELC: expression linked copy
ESR: résonance électronique de spin
ETat Edinburgh Trypanozoon antigenic type GPI: glycosyl phosphatidylinositol
GPI-PLC: phospholipase C glycosyl-phosphatidylinositol spécifique HDL: high density lipoprotein - lipoprotéine de haute densité HEPES: acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N’-2-éthanesulfonique lEF: isoelectric focusing
IgG: immunoglobuline G IgM: immunoglobuline M
ILTat: ILRAD Trypanozoon antigen type
LDL: low density lipoprotein - lipoprotéine de faible densité LUV: large unilamellar vesicles - grands liposomes unilamellaires MITat Molteno Institute Trypanozoon antigen type
MLV: multilamellar vesicles - liposomes multilamellaires mARN: acide ribonucléique messager
M-VAT: metacyclic variable antigenic type - type de variant antigénique métacyclique mfVSG: forme membranaire de la glycoprotéine variable de surface
n-OGP: n-octyl-;S-D-glucopyranoside
pCMPSA: acide para-chloromercuriphénylsulfonique PMSF: phénylméthylsulfonyl fluorure
PSG: phosphate saline glucose
RP-HPLC: reverse-phase high-performance liquid chromatography SDS: sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE: SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
SUV: small unilamellar vesicles - petits liposomes unilamellaires sVSG: forme soluble de la glycoprotéine variable de surface TCA: acide trichloracétique
Thy-1: antigène de surface des thymocytes et du cerveau de mammifères TLCK: Na-p-tosyl-L-lysine chlorométhyl cétone
Tris: tris(hydroxyméthyl)aminométhane TxTat: Texas Trypanozoon antigen type
VAT: variable antigenic type - type de variant antigénique
VSG: variant surface glycoprotein - glycoprotéine variable de surface WaTac Washington Trypanozoon antigen type
YNatYale Nannomonas antigen type YTat: Yale Trypanozoon antigen type
Acides aminés.
Ala: Alanine (A) Arg: Arginine (R) Asn; Asparagine (N) Asp: Acide aspartique (D) Cys: Cystéine (C)
Gin: Glutamine (Q)
Glu: Acide glutamique (E) Gly: Glycine (G)
His: Histidine (H) Ile: Isoleucine (I) Leu: Leucine (L) Lys: Lysine (K) Met Méthionine (M) Phe: Phénylalanine (F) Pro: Proline (P)
Sen Sérine (S) Thr. Thréonine (T) Trp: Tryptophane (W) Tyr. Tyrosine (Y) Val: Valine (V)
I. Introduction
Dans le modèle classique de la mosaïque fluide décrivant la structure de la membrane biologique, l’insertion des protéines membranaires et transmembranaires dans la bicouche lipidique résulte d’interactions hydrophobes entre des domaines peptidiques apolaires et les chaînes acylées des lipides. Il apparaît cependant aujourd’hui que des modifications covalentes de la chaîne polypeptidique permettent à certaines protéines de s’associer à la membrane lipidique. Une première modification consiste en l’acylation de protéines d’eucaryotes ou de virus. Les acides gras impliqués sont généralement l’acide palmitique engagé dans des liaisons ester ou thioester avec une cystéine et l’acide myristique formant une liaison amide avec une glycine amino-terminale. Chez les bactéries, ces modifications sont plus complexes et résultent de la liaison d’acyl ou diacylglycérol sur la cystéine amino-terminale. Dans un troisième type de modification, un glycolipide d’ancrage est fixé post-traductionnellement sur l’acide aminé carboxy
terminal de la protéine. Ce glycolipide constitué de glycosyl-phosphatidylinositol (GPI) a été identifié pour un nombre croissant de protéines localisées essentiellement à la surface de la membrane plasmique.
Nous nous sommes intéressés à ce troisième mode d’attachement à la membrane et plus particulièrement à l’étude du glycolipide d’ancrage des glycoprotéines variables de surface (VSG) des trypanosomes africains. Ces protozoaires sont encore de nos jours responsables de maladies parasitaires affectant aussi bien les humains, le bétail que les animaux sauvages, la plus connue de ces affections étant la trypanosomiase humaine ou
"maladie du sommeil". L’association de multiples copies d’une glycoprotéine variable de surface forme un manteau compact à la surface de la membrane plasmique du protozoaire. Ce manteau confère à chaque trypanosome son identité antigénique. En exprimant successivement différents antigènes de surface parmi un vaste répertoire de plusieurs centaines de glycoprotéines, les trypanosomes développent un mécanisme de variation antigénique leur permettant d’échapper au système immunitaire de l’hôte infecté.
Les glycoprotéines variables de surface étudiées chez Trypanosoma brucei brucei sont ancrées à la surface de la membrane plasmique par l’intermédiaire de glycosyl-5«- 1,2-dimyristoylphosphatidylinositol. Libérée en solution suite à la lyse de la cellule, la forme membranaire de ces glycoprotéines (mfVSG) est transformée en la forme soluble (sVSG) dépourvue du s«-l,2-dimyristoyl glycérol contenu dans le glycolipide. Une phospholipase C glycosyl phosphatidylinositol spécifique est responsable du clivage. Cette lipase permettrait au trypanosome de se libérer de son manteau protéique lors de l’étape de différenciation de la forme sanguicole en la forme procyclique, étape nécessaire au développement du parasite dans les mouches vecteurs de la maladie.
Nous nous sommes proposés dans ce travail d’étudier les propriétés physico
chimiques et structurales associées aux deux formes de la glycoprotéine.
La première partie est consacrée à l’étude des propriétés hydrophobes en solution des mfVSG et sVSG ainsi que leur capacité de modifier l’organisation de la bicouche lipidique de modèles de membrane.
Dans une seconde partie, nous nous sommes attachés à l’étude de la structure secondaire des glycoprotéines par spectroscopie infrarouge. Une méthode de modélisation moléculaire nous a permis de proposer une structure probable à l’interface lipide-eau du glycolipide d’ancrage.
Enfin, par une méthode de marquage in vivo des trypanosomes, nous avons apporté des arguments en faveur de l’insertion du glycolipide dans la bicouche lipidique de la membrane plasmique.
I.l. Les trypanosomiases africaines.
Observé sans doute pour la première fois vers 1680 par Antonie van Leeuwenhoek, le trypanosome fut identifié vers la fin du 19*“>« siècle comme l’agent responsable de maladies décimant en Afrique des milliers d’être humains et d’animaux.
La plus connue de ces affections parasitaires est la trypanosomiase humaine ou maladie du sommeil. Appartenant à la famille des Trypanosomatidae, ce protozoaire flagellé d’une taille de 15 à 30 /xm (figure I.l.l) est propagé d’hôte à hôte par un insecte vecteur, la mouche tsé-tsé (arthropode hématophage du genre Glossina).
Figure I.l.l: Vue au microscope électronique à balayage d’un trypanosome africain entouré d’érythrocytes de l’hôte infecté (agrandissement 5500 fois) (Donelson et Turner, 1985).
La maladie du sommeil, endémique en Afrique sub-saharienne, expose environ 50 millions de personnes au risque d’infection avec une incidence de plus de 20000 cas par an (O.M.S., 1989). Si l’importance de cette maladie peut paraître relativement faible par rapport à d’autres parasitoses tropicales (tableau I.l.l) et ceci grâce aux efforts médicaux déployés depuis une cinquantaine d’années, les trypanosomiases touchant les animaux domestiques et le bétail représentent un grave problème économique et social (tableau 1.1.2). La présence de glossines et de trypanosomes sur un territoire recouvrant près de 12 millions de kilomètres carrés y rend l’élevage du bétail difficile voire impossible (figure 1.1.2). Les peuplades vivant dans ces régions, affaiblies par le manque de nourriture, sont ainsi plus sensibles à l’action d’autres agents pathogènes.
Tableau I.l.l
Statistique! épidémiologiques mondiales de plusieurs maladies parasitaires (O.M.S., 1989).
Maladies Prévalence Incidence par
année
Nombre de personnes exposées
Paludisme (Malaria) 100 000 000
Schistosomiase (Bilharziose) 200 000 000 600 000 000
Filariose 90 000 000 905 000 000
Onchocercose 17 600 000 80 000 000
Trypanosomiases africaines > 20 000 50 000 000
Maladie de Chagas 16-18 000 000 90 000 000
Leishmaniose! > 12 000 000 400 000
Lèpre 10-12 000 000
Tableau 1.1.2
Taux de mortalité du bétail causé paï différentes maladies parasitaires (Bloom, 1979).
Maladies Estimation de la
mortalité annuelle
Trypanosomiases africaines 3 000 000
Anapl<ismose 1 000 000
Fièvre exanthématique de l’Est africain 500 000
Babésiose (Piroplasmose) 250 000
La famille des Trypanosomatidae comprend une grande variété d’organismes parasitant l’entièreté de la classe des vertébrés, des invertébrés et même quelques plantes.
Les trypanosomes infectant les mammifères peuvent être classés en deux groupes:
- Salivaria: comprenant les espèces* dont le cycle de développement se termine dans la bouche de l’insecte vecteur; la transmission se faisant par inoculation lors d’une piqûre (représentants principaux: la plupart des trypanosomes africains)
- Stercoraria: comprenant les espèces dont le cycle de développement se termine dans le rectum de l’insecte vecteur; la transmission se faisant par voie fécale et l’invasion de l’hôte par les muqueuses ou des écorchures (représentant principal: Trypanosoma cruzi, trypanosome sud-américain responsable de la maladie de Chagas)
Les différentes espèces pathogènes responsables de la majorité des trypanosomiases humaines et animales en Afrique sont Trypanosoma brucei.
* voir définition en annexe
Figure 1.1.2; En Afrique, les glossines et les trypanosomes rendent inutilisables pour l’élevage environ 12 millions de kilomètres carrés. Il existe ainsi très peu de correspondances (■) entre l’aire de répartition de la mouche (^) et l’ensemble des régions d’élevage (=) (Donelson et Turner, 1985).
Trypanosoma congolense et Trypanosoma vivax. L’espèce Trypanosoma brucei comprend plusieurs sous-espèces* qu’il est possible de classer selon l’hôte et la virulence (figure 1.1.3). Deux de celles-ci, Trypanosoma brucei gambiense et Trypanosoma brucei rhodesiense sont à l’origine de la maladie du sommeil. Morphologiquement non distinguables, Trypanosoma b. gambiense (Afrique occidentale et équatoriale) et Trypanosoma b. rhodesiense (Afrique orientale et australe), pour qui l’homme est un hôte accidentel, expriment une pathogénie différente (Greenwood et Whittle, 1980; Poltera,
1985). Trypanosoma b. gambiense est à l’origine d’une maladie neurologique chronique à progression lente. Deux phases distinctes de l’infection sont observées chez les patients:
* voir définition en annexe
Figure 1.1.3: Taxinomie et hôtes de différents trypanosomes africains. L’appartenance de Trypanosoma equiperdum et de Trypanosoma evansi à une espèce fait encore l'objet de nombreuses controverses.
- peu après la piqûre de l’insecte apparaît à l’endroit de l’inoculation un petit nodule ou chancre (Barry et Emery, 1984). C’est au départ de ce foyer que les trypanosomes vont envahir la circulation générale soit par un chemin direct via les veinules du derme soit via le système lymphatique (Ssenyonga et Adam, 1975). Après une période d’incubation relativement longue, variant de quelques semaines à plusieurs mois, durant laquelle les trypanosomes vont se multiplier, apparaissent des fièvres progressives, lymphadénopathie, splénomégalie etc...
- l’invasion du système nerveux central par les parasites constitue la phase critique de la maladie. Les aspects cliniques sont variables: maux de tête, méningites, encéphalites, troubles du comportement, du sommeil, de la nutrition aboutissant finalement au coma. Non traitée, la trypanosomiase conduit à ce stade inévitablement à la mort.
Les caractéristiques de la maladie due à Trypanosoma b. rhodesiense sont similaires à celles décrites ci-dessus mais sous une forme plus aiguë et avec une différenciation moins nette entre la phase précoce et la phase d’invasion du système nerveux central. L’incidence d’anémie et de problèmes cardiaques est ici plus importante.
Non soignée, la mort de l’individu survient lors d’une forte parasitémie, dans les mois qui suivent alors que l’échéance est de quelques années lors d’une infection par Trypanosoma b. gambiense.
Les manifestations pathologiques associées à la maladie du sommeil, pourraient être essentiellement dues à des réactions immunologiques et à la libération par les trypanosomes, durant leur cycle de développement, de facteurs biologiquement actifs (Tizard et al., 1978; Greenwood et Whittle, 1980). Les signes immunologiques les plus classiques sont une forte augmentation du taux d’IgM, l’apparition d’auto-anticorps, une diminution du taux de complément accessible dans le sang et une immunodépression vis- à-vis d’antigènes hétérologues (Urquhart et al., 1973; Hudson et al., 1976; Musoke et Barbet, 1977; Greenwood et Whittle, 1980; Bruijn et al., 1987).
Les variétés les plus communes responsables de trypanosomiases animales dans les régions sub-sahariennes appartiennent aux espèces Trypanosoma congolense (Afrique orientale), Trypanosoma vivax (Afrique occidentale) et à la sous-espèce Trypanosoma brucei brucei, causant une maladie connue sous le nom de "nagana". Cette dernière sous- espèce, moins pathogène que ne le sont les deux précédentes, est morphologiquement similaire à Trypanosoma b. gambiense et à Trypanosoma b. rhodesiense. Les affections animales sont généralement de type chronique et les symptômes sont semblables à ceux enregistrés chez l’humain (Urquhart, 1980).
Parmi les autres trypanosomiases animales, citons également la "surra" des chevaux et des chameaux due à Trypanosoma evansi et la "dourine" des chevaux due à Trypanosoma equiperdum.
1.2. Cycle de développement des trypanosomes.
La transmission cyclique des trypanosomes africains entre les différents hôtes et la mouche tsé-tsé s’accompagne de modifications morphologiques caractérisant chaque étape du développement (figure 1.2.1). A celles-ci, vont s’ajouter principalement des transformations du système mitochondrial permettant au parasite d’adapter son métabolisme énergétique à l’environnement extérieur (revue par Vickerman, 1985).
Figure 1.2.1: Diagram of life-cycle in Trypanosoma brucei-like trypanosomes. In the mammalian bloodstream slender forms divide or transform into stumpy forms via intermediate forms. Stumpy forms, on entering the tsetse fly, transform into elongate midgut flagellâtes which, after multiplication and migration in the fly, multipiy as crithidial forms in the salivary glands. The metacyclic forms which arise from crithidias are infective to the mammalian host when injected with the fly’s saliva (Vickerman, 1965).
Les formes sanguicoles des trypanosomes ingérées par l’insecte entreprennent un long périple accompagné d’un cycle de développement complexe avant d’atteindre l’étape infectieuse dite trypomastigote métacyclique dans la salive de l’insecte (terminologie instaurée par Hoare et Wallace, 1966). La voie empruntée par le parasite au sein du vecteur et la durée du cycle dépendent de l’espèce considérée (revue par Vickerman et al., 1988). Après ingestion, les protozoaires de l’espèce Trypanosoma brucei se divisent activement dans l’intestin moyen de la mouche sous la forme procyclique. Les parasites utilisent à ce stade la proline comme principale source d’énergie; cet acide aminé est
métabolisé par la mouche lors du vol. Après avoir traversé plusieurs membranes, ils atteignent les glandes salivaires via l’oesophage, sous la forme épimastigote. Attachés par leur flagelle à la membrane des glandes, ils s’y divisent. Ce n’est qu’après une dernière différenciation que les protozoaires se retrouvent libres dans les glandes salivaires, après trois à cinq semaines de développement, sous la forme trypomastigote métacyclique ayant réacquis la capacité d’infecter les mammifères (figure 1.2.2). Cet organisme, inoculé par l’insecte, va se multiplier activement chez l’humain ou l’animal infecté sous la forme trypomastigote longue et mince (long slender) par division cellulaire (figure 1.2.3); le nombre de trypanosomes aura doublé en environ six heures (Vickerman, 1985). La croissance du parasite est à ce stade dépendante du glucose extracellulaire (Ryley, 1956).
SALIVARY GLAND
Figure 1.2.2: Trypanosoma brucei. Route taken by trypanosomes in the tsetse fly vector.
Trypanosome-infected blood is ingested via the labrum into the crop, from which it is released into the midgut lumen. Trypanosome development (procyclic différentiation and division) commences in the posterior midgut. From here trypanosomes migrate via the route shown to the salivary glands. Mammal- infecting (metacyclic) trypanosomes are discharged in the fly’s saliva during feeding (Vickerman et al., 1988).
Comme lors de la plupart des infections, qu’elles soient d’origine bactérienne, virale ou dues à un protozoaire, le système immunitaire de l’hôte devrait répondre à cette intrusion par une suite de réactions aboutissant à la destruction du "non-soi". La situation rencontrée lors d’une trypanosomiase est sensiblement différente. Au cours d’une infection chronique, apparaissent des vagues de parasitémie (figure 1.2.4) (Vickerman, 1978; Cross, 1978). A chaque pic correspond une population* de
* voir définition en annexe
Figure 1.2.3: Scanning électron micrographs of Trypanoioma brucei, showing the flagellum attached to the body and changes in form. Metacyclic trypanosomes (a) from the salivary glands of the tsetse fly are inoculated into the mammalian host when the fly bites. The trypanosome multiplies in the long slender form (b) in the blood and connective tissues of the mammal. Non-multiplicative short stumpy forma (c) arise from slender forms in the blood: although the stumpy forms can infect the vector, they cannot continue the infection in the mammal. Scale bar 1 /Im (micrographs: L. Tetley) (Vickerman, 1978).
trypanosomes qui n’est pas reconnue par les anticorps dirigés contre les parasites appartenant aux vagues précédentes. Ce phénomène, appelé "variation antigénique",
résulte de l’expression séquentielle d’un vaste répertoire* antigénique conférant une individualité sérologique aux trypanosomes se développant successivement lors d’une infection chronique. Par ce procédé, le trypanosome déjoue l’action du système immunitaire de l’hôte infecté.
Figure 1.2.4: Fluctuation of parasitaemia in a case of human trypanosomiasis (T. gambiense) (Cross, 1978).
Lorsque la vague de parasitémie décline, des formes courtes et trapues (short stumpy) ne se divisant pas vont remplacer les formes longues (figures 1.2.3 et 1.2.5). Ces formes trapues sont les seules à pouvoir être transmises à la mouche et à pouvoir entreprendre un nouveau cycle de développement dans le vecteur alors que les propriétés d’infection et de variation antigénique sont le privilège des formes longues.
Maintenus dans des animaux de laboratoire, les trypanosomes peuvent perdre leur caractère pléomorphique et exister seulement sous la forme monomorphique longue (Vickerman, 1965). L’absence de pléomorphisme s’accompagne tout naturellement d’un perte de transmissibilité à la mouche.
Selon l’espèce considérée, les trypanosomes africains présentent des comportements et des distributions différentes au sein de l’hôte infecté. Les trypanosomes de l’espèce brucei ont la capacité de franchir la barrière endothéliale des capillaires sanguins, d’envahir le système extravasculaire et de s’y multiplier. Ces parasites se distribuent dans l’organisme et se retrouvent dans le fluide interstitiel, la lymphe, le liquide céphalo-rachidien. Au contraire, Trypanosoma congolense et Trypanosoma vivax restent localisés dans le flux sanguin avec une prédilection pour les capillaires où ils s’y multiplient fixés à l’endothélium (Goodwin et Guy, 1973; Ssenyonga,
1974; Ssenyonga et Adam, 1975).
* voir définition en annexe
Figure 1.2.5: The course of parasitemia and the percentage of long-slender and short-stumpy forma présent during a chronic infection in a mouse (Hajduk, 1984).
Les trypanosomes africains diffèrent également par leur capacité de survie en présence de sérum humain normal. Alors que Trypanosoma b. gambiense et Trypanosoma b. rhodesiense sont relativement résistants à l’action lytique d’un tel sérum, Trypanosoma b. brucei et Trypanosoma equiperdum y sont particulièrement sensibles, ce qui les rend non infectieux pour l’être humain (Rickman et Robson, 1970b; Hawking, 1973; Hawking et al., 1973). Cette propriété donna le jour au test BUT (Blood Incubation Infectivity Test) permettant de vérifier le pouvoir infectieux pour l’homme d’une souche* inconnue sans avoir recours à l’injection de ces trypanosomes à des volontaires (Rickman et Robson, 1970a). La souche suspectée infectieuse est incubée in vitro en présence de sang humain ou de tampon phosphate durant 5 heures à 37°C. Chaque échantillon est ensuite injecté intrapéritonéalement à des rats; si une parasitémie persistante est observée pour les deux échantillons, la souche est déclarée infectieuse. Dans certains cas cependant, les
* voir définition en annexe
résultats de ce test sont équivoques. Transmise séquentiellement sur modèle animal, une souche de Trypanosoma b. rhodesiense résistante (R) peut se transformer en une forme sensible (S) au sérum humain et réciproquement (Van Meirvenne et al., 1976). Cette différence de phénotype serait associée à la présence de mARN spécifiques détectés seulement chez les parasites de la forme R, bien que les deux formes contiennent le gène codant pour ce messager (De Greef et al., 1989). La conversion impliquerait l’activation de ce gène et l’expression d’une nouvelle protéine. Ni Trypanosoma b. brucei, ni Trypanosoma b. gambiense n’expriment ce gène ce qui suggérerait pour ce dernier un autre mécanisme de résistance au sérum humain.
La sensibilité au sérum humain a fait de Trypanosoma brucei brucei le modèle de laboratoire de prédilection.
L’existence d’un facteur trypanocide associé à la fraction sérique contenant les lipoprotéines de haute densité (HDL) a été suggérée (Rifkin, 1978). Ces lipoprotéines appartiendraient plus particulièrement a une sous-classe mineure de HDL de très haute densité contenant des apolipoprotéines AI, AU, CI, CII et CIII (masse moléculaire apparente: 490 kd) (Hajduk et al., 1989). Une modification des propriétés de la membrane plasmique trypanosomiale par abaissement de la température ou stabilisation par des anesthésiques locaux, diminue l’effet lytique des HDL (Rifkin, 1983). Le mécanisme conduisant à la lyse des trypanosomes est encore méconnu. Il pourrait être dû à un échange de cholestérol entre la membrane plasmique du parasite et les HDL (Rifkin, 1978 et 1983). L’étendue des lésions dépendrait alors soit de la différence du rapport cholestérol/phospholipides entre HDL et trypanosomes, soit d’une différence de métabolisme permettant à certaines cellules de réparer les lésions membranaires plus efficacement que d’autres. Le temps de latence observé avant la lyse des trypanosomes par les HDL et l’inhibition de celle-ci en-dessous de 17"C indiquent que le facteur trypanocide serait endocyté avant d’exercer son action. De plus, la forme procyclique dont l’activité endocytaire est plus faible que celle de la forme sanguicole, n’est pas sensible à l’action lytique des HDL (Hajduk et al., 1989).
Une nouvelle méthode permettant d’isoler le facteur trypanocide a conduit à des résultats qui sont en totale contradiction avec la théorie généralement admise. Ce facteur serait formé d’un complexe protéique de haute masse moléculaire (>1000 kd) contenant quatre peptides différents (Barth, 1989). Ces quatre peptides de nature encore inconnue, présentent sur gel de polyacrylamide des masses moléculaires apparentes totalement différentes de celles des apolipoprotéines retrouvées dans les HDL.
Dans l’état actuel des connaissances, rien ne permet de trancher entre ces deux théories et de déterminer avec certitude la nature du facteur responsable de la trypanolyse.
1.3. La variation antigènique.
Durant la phase ascendante de la parasitémie, la majorité des formes sanguicoles expriment un type de variant antigénique (VAT)* appelé "homotype"* (Van Meirvenne et al., 1975a). En réponse, le système immunitaire de l’hôte infecté synthétise des anticorps spécifiques neutralisants. Chaque vague contient cependant des VAT mineurs dits
"hétérotypes"* continuant à se multiplier durant l’élimination de l’homotype. La croissance d’un de ces hétérotypes va l’emporter sur celle des autres variants et donner lieu à un nouveau pic de parasitémie dont il sera l’homotype. Ce processus se répète, aboutissant à l’infection chronique décrite dans la figure 1.2.4. La variation antigénique est un processus spontané se déroulant avec une fréquence élevée dans le flux sanguin (2.0-9.3 10"3 variation/cellule/génération) (Turner et Barry, 1989). Près d’un trypanosome sur cent exprimerait un nouveau VAT à chaque génération. Pour des souches transférées de nombreuses fois dans des animaux de laboratoire par injection à la seringue, le nombre de trypanosomes exprimant à chaque génération un VAT différent serait cent à mille fois inférieur (Van Meirvenne et al., 1975a et b; Doyle et al., 1980). Le répertoire antigénique exprimé par un sérodème* comprendrait entre 100 et 1000 types de variant différents (Van der Ploeg et al., 1982).
En étudiant la séquence d’apparition des différents types antigéniques chez des animaux infectés, Gray suggère que durant les premières étapes de l’infection, certains variants "prédominants" sont toujours exprimés dans un ordre prévisible (Gray, 1965).
Des résultats semblables ont été obtenus pour Trypanosoma b. gambiense (Gray, 1975) et Trypanosoma congolense (Nantulya et al., 1980). Cette hypothèse d’existence d’un programme d’expression d’antigènes va à l’encontre d’une théorie mutationnelle pouvant expliquer l’apparition d’une telle diversité d’antigènes. Une analyse similaire menée par Miller et Turner a permis de redéfinir cette hypothèse comme suit "si la variation antigénique ne suit pas une séquence prédéterminée stricte et rigide, il existe cependant un groupe prédominant de VAT ayant une grande probabilité d’être exprimés précocement dans un ordre de priorité statistiquement déterminable et différent pour chaque souche" (Miller et Turner, 1981).
Combien de types antigéniques différents sont inoculés par la mouche? En utilisant des méthodes d’agglutination, plusieurs groupes proposaient l’existence, pour une souche donnée, d’un seul type de variant antigénique métacyclique (M-VAT) injecté par la mouche (Gray, 1965; Cunningham, 1966; Gray, 1975; Hudson et al., 1980). Quel que soit le variant prélevé, l’insecte inoculerait toujours ce type antigénique de "base"
parfois accompagné du variant ingéré. Cette hypothèse ouvrait les portes à la production d’un vaccin dirigé contre cet antigène spécifique de la phase précoce d’infection.
L’apport de méthodes plus raffinées d’immunofluorescence et de trypanolyse faisait
* voir définition en annexe
s’effondrer ce "rêve thérapeutique" (Van Meirvenne et al., 1975a). Le répertoire de M- VAT comprendrait 12 antigènes différents pour un sérodème de Trypanosoma congolense (Crowe et al., 1983), entre 9 et 27 pour un sérodème de Trypanosoma b. rhodesiense (Turner et al., 1988) et sans doute du même ordre de grandeur pour un sérodème de Trypanosoma b. brucei (Le Ray et al., 1978; Barry et al., 1979; Hajduk et al., 1981).
L’instabilité du répertoire de M-VAT, rapportée pour Trypanosoma b. rhodesiense au cours de longues périodes de transmissions cycliques et se traduisant par la disparition de certains M-VAT et l’apparition de nouveaux types, pourrait encore augmenter le nombre d’antigènes métacycliques exprimés par un sérodème (Barry et al., 1983).
La variation antigénique ne semble pas être induite par la présence d’anticorps spécifiques. Au contraire, l’apparition spontanée de nouveaux variants a été observée in vitro, en absence d’anticorps (Doyle et al., 1980; Luckins et al., 1986). D’autre part, la mise en contact in vitro de trypanosomes et d’un antisérum homologue montre en immunofluorescence indirecte une redistribution ou "capping" des antigènes variables dans la région de la poche flagellaire, profonde invagination de la membrane plasmique d’où émerge le flagelle (Barry, 1979). A ce stade, plus aucun anticorps spécifique du VAT ne se fixe à la surface des trypanosomes. Trois heures après le "capping", réapparaissent à la surface des protozoaires les antigènes homologues au VAT initial. Le rôle du système immunitaire ne semble donc pas être l’induction de la synthèse de nouveaux VAT mais plutôt la sélection de ceux-ci par élimination de l’homotype associé au pic de parasitémie.
1.4. Identification et localisation des molécules responsables de la variation antigènique.
La présence d’un manteau de surface enveloppant le protozoaire a pu être visualisé par microscopie électronique (figure 1.4.1) (Vickerman, 1969). Ce manteau se présente sous la forme d’une couche dense uniforme de 12 à 15 nm d’épaisseur recouvrant l’entièreté de la membrane plasmique du corps et du flagelle. Il est associé à la membrane plasmique de la majorité des trypanosomes pathogènes africains et cela aussi bien pour les formes longues, trapues et intermédiaires. Le manteau est absent de la surface des trypanosomes morts ou de trypanosomes traités par des protéases telles la trypsine ou la pronase (Vickerman, 1969; Cross, 1975). Les formes épimastigotes extraites des glandes salivaires des mouches tsé-tsé ainsi que certaines formes de culture de Trypanosoma b. rhodesiense ou de Trypanosoma congolense, connues pour ressembler aux formes se développant dans l’intestin de l’insecte (Pearson et al., 1987), ne sont pas enveloppées par ce manteau de surface (Vickerman, 1969). L’acquisition du manteau de surface est donc une étape importante de la transformation de la forme épimastigote en la forme métacyclique infectieuse constituant ainsi une adaptation du protozoaire à sa nouvelle vie dans le flux sanguin (figure 1.4.2).
Figure 1.4.1: Transverse section of bloodstream Trypanosoma rhodesiense to show the continuons dense coat overlying the surface membrane of the body (below) and its attskched flagellum (above) (Vickerman, 1969).
Le caractère protéique de l’enveloppe extérieure du trypanosome avait été suggéré avant la découverte de ce manteau par des études de mobilité électrophorétique du protozoaire intact (Hollingshead et al., 1963). L’évolution de la mobilité électrophorétique des trypanosomes en fonction du pH semblait indiquer la présence de groupements acides et basiques à la surface des formes sanguicoles de Trypanosoma b. rhodesiense.
Les valeurs de pK^ de 5.0 et 9.5 associées à ces fonctions chimiques suggéraient l’existence de groupements carboxyliques et aminés. Les formes de culture de cette sous- espèce, semblables aux formes procycliques, présentaient un comportement électrophorétique en fonction du pH caractéristique des groupements phosphates.
L’utilisation d’anticorps spécifiques d’un variant couplés à la ferritine a permis de localiser par microscopie électronique les antigènes variables au niveau du manteau de Trypanosoma b. brucei (Vickerman et Luckins, 1969). Cross fut le premier à purifier, après marquage spécifique de la surface de Trypanosoma b. brucei, les composants majeurs du manteau et à démontrer que ce dernier est formé de la juxtaposition d’une multitude de copies d’une seule et même glycoprotéine, appelée glycoprotéine variable de surface ou VSG (Cross, 1975). Le protocole de purification établi par Cross est basé sur la facilité avec laquelle cet antigène de surface est libéré sous une forme soluble suite à la lyse des parasites. Les VSG peuvent ensuite être isolées de la fraction soluble par chromatographie sur résine échangeuse d’ions (DEAE-cellulose) et "isoelectric focusing".
IN TSETSE SALIVARY GLANDS Premetacyclic
attached to host mjcrovilli
Epimastigote'
IN TSETSE MIDGUT
Figure 1.4.2: Schematic diagram of Trypanosoma brucei developmental cycle in mammal and tsetse fly, showing changes in cell surface, mitochondrion, glycosomes and receptor mediated endocytosis, also in relative sise of different stages. Stages possessing the variable antigen coat lie to the right, uncoated stages to the left.
The mitochodrion is depicted partly in section to show changes in its cristae. The posteronuclear stumpy (bottom right) is included as an example of a form produced by some stocks but not playing an essential part in the cycle (Vickerman, 1985).
* Division occurs in these stages.
Le nombre de glycoprotéines constituant le manteau antigénique est estimé à 1.13 10^ copies/trypanosome, soit environ 10% des protéines cellulaires totales, reparties sur une surface cellulaire estimée à 186.5 (Jackson et al., 1985). Des glycoprotéines similaires à celles de Trypanosoma b. brucei ont été identifiées et isolées de la surface d’autres espèces africaines (Rovis et al., 1978; Gardiner et al., 1987).
Les VSG peuvent être purifiées sous leur forme soluble par différentes techniques. L’utilisation d’anticorps mono ou polyclonaux fixés à une résine est sans conteste une méthode permettant d’obtenir des glycoprotéines d’une grande pureté. La haute spécificité de ces ligands limite cependant leur application au variant correspondant. Une production à grande échelle est difficilement envisageable et de plus, l’affinité des glycoprotéines pour ces anticorps est tellement importante qu’elle nécessite lors de l’élution, l’utilisation d’agents dénaturants (Cross, 1984). Un autre type de chromatographie d’affinité faisant appel à des lectines couplées à une résine a été utilisé par différents groupes (Baltz et al., 1976; Reinwald et al., 1981). L’association des glycoprotéines aux lectines est cependant fortement dépendante de la composition en carbohydrates qui comme nous le verrons, est variable pour les différents antigènes de surface. Une préparation de VSG pures peut également être obtenue par RP-HPLC (reverse-phase high-performance liquid chromatography) (Clarke et al., 1984).
Un facteur compliquant la purification des VSG est la présence de protéases endogènes libérées des compartiments internes lors de la lyse des cellules; la dégradation très rapide du matériel protéique conduit à l’obtention d’une préparation fortement hétérogène (Cross, 1975; Barbet et McGuire, 1982). De nombreuses précautions doivent être prises afin d’inhiber l’action de ces enzymes ou de minimiser leur libération par une lyse incomplète et plus douce des cellules (Barbet et McGuire, 1982).
La libération des VSG sous leur forme soluble après lyse osmotique des cellules à 0°C est dépendante de la température; inhibée à 0°C, elle semble être complète après trois minutes d’incubation à 37“C (Cross, 1984). Elle est de plus inhibée par la présence d’ions Zn^+ (Bowles et Voorheis, 1982; Voorheis et al., 1982). Sur base de ces observations expérimentales. Cross a établi un protocole de purification qui, en modifiant la température, la concentration en zinc et en utilisant des inhibiteurs de protéases, permet de contrôler toutes les étapes d’isolement et d’obtenir un échantillon pur de VSG (Cross, 1984). Cette méthode est la plus couramment utilisée.
Les glycoprotéines purifiées sont fortement immunogéniques. Injectées à une souris, elles permettent d’immuniser l’animal spécifiquement contre le variant homologue (Cross, 1975; Baltz et al., 1977). Cette protection apportée par les VSG confirme leur fonction d’antigène exercée à la surface des trypanosomes. Le manteau protéique constitue également une barrière physique empêchant la fixation d’immunoglobulines sur les composants de la membrane plasmique situés sous le manteau protéique et communs à tous les variants (Cross, 1977).
Durant leur croissance, les formes sanguicoles du trypanosome libèrent lentement leurs VSG sous une forme soluble (Shapiro, 1986). In vitro, des souches monomorphiques se divisant activement relarguent les VSG avec un tj de 32 ± 3 heures (Bülow et al., 1989a). Lors de la différenciation in vitro de la forme sanguicole en la forme procyclique, la synthèse des VSG est réprimée (tj= 30 minutes) et le manteau se détache de la surface du parasite (Overath et al., 1983; Shapiro, 1986; Bülow et al., 1989a). La libération des antigènes variables peut être fortement augmentée in vitro en présence d’ions Ca^+ et d’un ionophore spécifique dans des conditions préservant l’intégrité de la cellule et de ses fonctions respiratoires (Voorheis et al., 1982; Bowles et Voorheis, 1982).
L’analyse chimique des glycoprotéines variables de surface révèle outre la présence d’acides aminés, celle de carbohydrates et d’un lipide. Dans un soucis de clarté, chaque groupement sera étudié individuellement.
I.4.a. Structure primaire des glycoprotéines variables de surface.
Les séquences primaires de plusieurs variants sont actuellement connues soit par analyse directe de la protéine, soit déduites ou confirmées à partir de la séquence des nucléotides du cADN correspondant (revue par Boothroyd, 1985). Selon le variant considéré, la chaîne polypeptidique de la glycoprotéine contient de 450 à 480 acides aminés (masse moléculaire apparente comprise entre 55 et 65 kd). Les différentes VSG peuvent être regroupées en plusieurs classes au sein desquelles une importante homologie est observée dans les 75 à 115 derniers acides carboxy-terminaux, domaine particulièrement hydrophile (Matthyssens et al., 1981; Rice-Ficht et al., 1981; Allen et al., 1982). Ainsi, pour toutes les VSG de la classe I le dernier acide aminé carboxy
terminal est un acide aspartique, une sérine pour la classe II et une asparagine pour la classe III qui ne compte jusqu’ici qu’un seul représentant (tableau 1.4.1) (Rice-Ficht et al., 1981; Majumder et al., 1981).
Au niveau de la région amino-terminale des différents variants, les situations sont très variables. Quatre variants appartenant à un même sérodème présentent des séquences amino-terminales totalement dépourvues d’homologie (Bridgen et al., 1976) alors que récemment. Barbet et ses collaborateurs ont montré que les VSG de quatre variants différents appartenant à un même sérodème possèdent une homologie partielle de la région amino-terminale se traduisant par l’expression d’épitopes communs à la surface du trypanosome (Barbet et al., 1989). D’autres variants appartenant à des sérodèmes différents et connus pour être isotypiques c’est-à-dire sérologiquement identiques, possèdent une région amino-terminale particulièrement conservée (Vervoort et al., 1981). En alignant les séquences amino-terminales de plusieurs variants afin d’obtenir le maximum d’homologie, il est néanmoins possible d’observer une certaine
conservation de séquence primaire reflétant probablement une structure tertiaire commune (figure 1.4.3) (Olafson et al., 1984).
Tableau 1.4.1 C-terminal sequence of VSGs^
Mature
Variant C terminus Hydrophobie tail
Group 1
MITat I.4a (VSG 117) CKWENNACKD SSILVTKKFALTVVSAAFVALLF MITat 1.4b
MITat 1.4BC
.... A... SM... T. . . ...SA—. . . A. . . . MITat 1.6a (VSG 121) ..GET...
MITat 1.6b ...S...
MITat l.lOOOBC EEP.KEK.C. G.F. .N...-M.YDFVSL.A.
AnTat 1.1 .. ..AET.. . ____ L. .N. . .S...L...
AnTat 1.1b ____ GET... ... SL...AS. . . AnTat 1.10 ____ GET... ... SL...AS. . . AnTat 1.8 ....GET.. . ... N. QL. . S... A. . . . ILTat 1.3 ....GET... . .FILN.Q. . .S... A_____
Group 2
ILTat I.I DGKTTNTTGS NSFVIHKAPLFLAFLLF
ILTat 1.1 BC ... L. N... VL...L
MITat 1.2 (VSG 221) N... S ... S.T..W..V...
TxTat 1 .E..S...A. ... N_____L.G_____
X GKTN.S____ ... N.D..L..V...
Group 3
MITat 1.5a (VSG 118) DEPDKEDCRN GSFLTSKQFAFSVVSAAFVALLF MITat 1.5b ... L-M... T. . .
... L-M...T. . . MITat 1.5d ... L-M..S..A....
MITat 1.5BC ... L-M...T. . .
^ The amino acid sequence of the VSG polypeptide is shown for several VSGs with a gap between the mature C-terminal residue and the hydrophobie tail. Three groupa are defined according to their C-terminal homology. The single-letter code is used with dots indicating identity to the prototypal sequence for each group and dashes indicating a deleted residue.
For some variants, the VSG comprising the coat has a historical number as given in parenthèses. Variant X in group 2 indicates this sequence was determinated from a VSG gene from an unnamed serodeme. Asterisks indicate absoluteiy conserved residues (Boothroyd, 1985).
Au coeur de la chaîne polypeptidique, les séquences sont hétérologues et à ce jour, un seul exemple d’alignement partiel a été démontré pour deux variants appartenant à des sérodèmes différents (figure 1.4.4) (Barbet, 1985).
La distinction entre les domaines amino et carboxy-terminaux se retrouve lors du clivage enzymatique de la protéine. Parmi plusieurs protéases testées, seule la trypsine permet un contrôle de la réaction. Elle clive la molécule dans la région charnière séparant les deux domaines, en un grand fragment amino-terminal de 41 à 52 kd, résistant à toute dégradation ultérieure, et un ou plusieurs petits peptides carboxy
terminaux (Johnson et Cross, 1979).
