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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Borkowski, A. (1970). Etude de la physiologie du cholestérol surrénalien humain (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.
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B R U X E L L E N S IS
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ETUDE
DE LA PHYSIOLOGIE
DU CHOLESTEROL
SURRENALIEN HUMAIN
par A. BORKOWSKIService de Médecine interne et d'investigation clinique, Institut Bordet
Université Libre de Bruxelles
Thèse présentée en vue de l’obtention du titre d’Agrégé de l’Enseignement Supérieur
par
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A. BORKOWSKI.
Service de Médecine interne et d'investigation clinique. Institut Jules Bordet, Université Libre de Bruxelles.
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TABLE DES MATIERES.
INTRODUCTION - p. 8.
METHODES - p. 17.
I. Etude de l'équilibration des cholestérols plasmatiques et surrénaliens, p. 18.
A. Dynamique de cette équilibration dans les conditions "normales" ou de contrôle - p. 18.
Introduction générale.- p. 18. Techniques de laboratoire - p, 20.
1. Fractionnement du cholestérol surrénalien - p. 20. 2. Fractionnement du cholestérol sanguin - p. 22. 3. Dosages divers - p. 23.
4. Techniques chirurgicales et préparation des malades - p. 24.
5. Comparaison au cours du temps des activités spécifi ques du cholestérol libre et du cholestérol estérifié
surrénaliens : analyse en termes de relation précurseur- produit - p. 24.
6. Comparaison au cours du temps des activités spécifiques des cholestérols libres et estérifiés, plasmatiques et surrénaliens : analyse multicompartimentale de l'ensem ble des résultats expérimentaux - p. 26.
B. Influence de l'ACTH sur l'équilibration des cholestérols plasmatiques et surrénaliens - p. 2 9.
C. Influence de la frénation hypophysaire sur l'équilibration des cholestérols plasmatiques et surrénaliens - p. 30.
4
-III. Etude in vitro de la synthèse du cortisol, de la corticostérone et de l'aldostérone - p. 32,
A. Introduction - p, 32.
B. Dosage du cortisol, de la corticostérone et de l'aldostérone - p. 33.
C. Dosage des protéines tissulaires - p. 33.
D. Etude de l'incorporation de l'acétate marqué dans les hormones de synthèse ; comparaison de la synthèse des hormones à la synthèse de cholestérol - p. 34.
IV. Etude in vivo de la transformation du cholestérol plasmatique en hydrocortisone - p. 35.
A. Introduction - p. 35.
B. Mesure des activités spécifiques du tetrahydrocortisol et de la tetrahydrocortisone - p. 35.
C. Mesure de l'activité spécifique du cholestérol plasmatique - p. 37.
D. Comparaison au cours du temps des activités spécifiques du cholestérol plasmatique à celles des métabolites urinaires de l'hydrocortisone - p. 37.
RESULTATS - p. 38.
I. Etude de l'équilibration des cholestérols plasmatiques et surréna liens. - p. 39.
A. Dynamique de cette équilibration dans les conditions " normales " ou de contrôle - p. 39.
1. Distribution du traceur au niveau des lipoprotéines
plasmatiques et des membranes des globules rouges - p.39. 2. Concentrations du cholestérol libre et du cholestérol
estérifié surrénaliens - p, 41.
4. Distribution du traceur dans les constituants subcellu laires du cortex surrénalien - p. 44.
5. Distribution du traceur dans chacun des esters de cholestérol surrénalien - p. 49.
6. Comparaison au cours du temps des activités spécifiques du cholestérol libre et du cholestérol estérifié surréna liens : analyse en termes de relation précurseur-produit- p. 51.
7. Comparaison au cours du temps des activités spécifiques du cholestérol libre et du cholestérol estérifié plasma tiques à celles du cholestérol libre et du cholestérol
estérifié surrénaliens ; valeurs des paramètres du modèle compartimentai complet - p. 54.
B. Influence de l'ACTH sur la dynamique de l’équilibration des cholestérols plasmatiques et surrénaliens - p. 60.
1. Concentrations du cholestérol libre et du cholestérol estérifié surrénaliens - p. 60.
2
.
3.
Excrétion des métabolites de l'hydrocortisone - p. 61. Distribution du traceur dans le cholestérol libre et cholestérol estérifié des zones "réticulée" et "fase
le iculée p. 61.
4. Distribution du traceur dans les constituants subcellulaires du cortex surrénalien - p. 64.
5. Distribution du traceur' dans chacun des esters de cholestérol surrénaliens - p. 64.
6. Comparaison au cours du temps des activités spécifiques du cholestérol plasmatique et du cholestérol surrénalien : analyse des modifications consécutives à l'administration d'ACTH - p. 66.
C. Influence de la dexamethasone sur la dynamique de l'équili bration des cholestérols plasmatiques et surrénaliens - p.69.
1. Concentrations du cholestérol libre et du cholestérol estérifié surrénaliens - p. 69.
6
-3. Distribution du traceur dans les constituants subcellu laires du cortex surrénalien - p. 72.
4. Distribtition du traceur dans chacun des esters de cholestérol surrénaliens - p. 72.
5. Comparaison au cours du temps des activités spécifiques du cholestérol plasmatique et du cholestérol surrénalien : analyse dans le cadre d'un modèle compartimentai des modifications consécutives à la frénation hypophysaire - p. 72.
II. Etude in vitro de la synthèse du cholestérol par le tissu surréna lien - p. 75.
A. Introduction - p. 75.
a) Validité du procédé de purification des pi'oduits de synthèse - p. 75.
b) Choix de la concentration d'acétate froid ajouté au milieu d'incubation - p. 75.
B. Synthèse du cholestérol par le tissu surrénalien normal - p. 78. C. Influence de l'ACTH sur la synthèse du cholestérol surré
nalien - p. 78.
D. Influence de la dexamethasone sur la synthèse du cholestérol surrénalien - p. 81.
E. Etude qualitative de l'estérification in vitro du cholestérol de synthèse - p. 81.
F. Equilibration du cholestérol de synthèse dans les diverses fractions subcellulaii-es - p. 83.
G. Quelques remarques sur l'importance quantitative absolue de ces synthèses in vitro du cholestérol surrénalien - p. 87. III. Etude in vitro de la synthèse des hormones stéroïdes par le
cortex surrénalien - p. 89.
DISCUSSION POINT PAR POINT DES OBSERVATIONS EXPERIMEN TALES - p. 97.
I. Distribution physiologique du cholestérol dans le sang et distribution correspondante du traceur - p. 98,
II. Distribution physiologique du cholestérol dans la cellule siirré- nalienne - p. 101.
III. Distribution physiologique du cholestérol dans les diverses zones du cortex surrénalien - p. 105.
IV. Influence de l'ACTH sur la physiologie du cholestérol surrénalien p. 110.
V, Synthèse in vitro du cholestérol surrénalien - p. 114.
VI. Transformation du cholestérol plasmatique en hydrocortisone - p. 120.
VU. Etude in vitro de la synthèse des hormones stéroïdes par le cortex surrénalien - p, 122.
DISCUSSION GENERALE - p. 12 4.
RESUME - p. 134.
La physiologie du cholestérol surrénalien est mal connue. Cela est particulièrement vrai pour les surrénales humaines où le choles térol s'accumule en concentrations très élevées sans que l'on connaisse les mécanismes de cette accumulation et sans que l'on comprenne bien l'utilité de concentrations aussi importantes. Notre ignorance de la physiologie du cholestérol surrénalien tient à un certain nombre de difficultés :
1. - Une première difficulté résulte de l'hétérogénéité chimique du cholestérol surrénalien, lequel existe à la fois sous forme libre, c'est-à-dire non estérifiée,et sous forme estérifiée. La forme estéri- fiée est de loin la plus abondante (90 à 95% du cholestérol total); elle est représentée par une variété d'esters de cholestérol dont la compo sition en acides gras est spécifique aux glandes surrénales, et où l'oléate de cholestérol domine largement (réf. 32-99-103).
2. - Cette hétérogénéité se double d'une complexité dans la distribution intracellulaire. Le cholestérol libre surrénalien est essentiellement associé aux structures membranaires et à ce titre se retrouve dans tous les organelles de la cellule. Le cholestérol estérifié quant à lui
se localise surtout dans les gouttelettes de lipides ou liposomes du cytoplasme (réf. 2-81-88).
10
-L'on ignore jusqu'à quel point ces diverses formes du cholestérol surrénalien sont interchangeables ou interconvertibles de sorte que chacun des esters de cholestérol, le cholestérol libre situé au niveau de chacun des organelles sub cellulaire s, au niveau du cytoplasme ou des liposomes, pourrait à priori constituer un compartiment physio logiquement distinct ayant un devenir métabolique ou une fonction de structure ou les deux à la fois qui lui soient propres.
3. - A cette multiplicité de compartiments intracellulaires possibles s'ajoute le fait que les diverses cellules du cortex surrénalien ne sont pas équivalentes les unes aux autres ainsi qu'en témoigne l'architecture générale de la glande avec ses zones réticulée, fasciculée et gloméru laire. Il faut noter ici que la zone fasciculée dont la fonction exacte par rapport à la zone réticulée reste par ailleurs obscure, a la particularité intéressante d'être nettement plus riche en esters de cholestérol. Cette particularité souligne combien il est indispensable de tenii’ compte de la zonation corticale dans toute investigation de la physiologie du cholestérol surrénalien (réf, 62).
4. - Une quatrième difficulté résulte de l'observation que la surrénale comme la plupart des tissus peut synthétiser du cholestérol mais est aussi capable de puiser dans le cholestérol sanguin. L'importance relative de ces deux sources de cholestérol n'est pas connue. Bien plus, le cholestérol produit in situ et le cholestérol d'origine sanguine pourraient se distribuer dans la cellule et y être métabolisés de manière distincte ajoutant ainsi une dimension fonctionnelle au problème déjà complexe de la multiplicité des compartiments du cholestérol surrénalien (réf. 12-23-40-113).
composition en acides gras des esters de cholestérol sanguins est très différente de celle qui se trouve dans les surrénales puisque c'est le linoléate de cholestérol qui domine dans le plasma (réf, 56). Le cholestérol sanguin est véhiculé par les globules rouges et par des lipoprotéines dont les coéfficients de flottaison sont caractéristiques. Seul le cholestérol libre s'échange aisément entre les membranes des globules rouges et les diverses lipoprotéines, les esters de cholestérol étant solidement ancrés sur ou à l'intérieur de ces dernières. Si l'on admet généralement que le cholestérol libre plasmatique s'échange ou s'équilibre de même avec le cholestérol libre tissulaire, la question reste posée de savoir si le cholestérol estérifié plasmatique ne pourrait pas néanmoins se déposer dans les quelques organes qui sont pb.is riches en esters de cholestérol. Dans cette optique, le cholestérol estérifié surrénalien résulterait de l'accumulation différentielle des esters de cholestérol plasmatiques (réf. 2-57-58-63).
Le nombre de compartiments de cholestérol pouvant exister dans la glande surrénale est donc considérable. Ces compartiments se distinguent les uns des autres par leurs propriétés chimiques, physi ques et fonctionnelles. Ils doivent dans une certaine mesure s'équilibrer entre eux et s'inter convertir (réf. 89-107-108). Ils disposent chacun de deux sources de renouvellement : le cholestérol synthétisé sur place et le cholestérol sanguin (réf. 91-113-120).
12
-du cholestérol libre il est difficile d'apprécier si l'uptake net de cholestérol d'origine sérique contribue de manière significative à l'accumulation de cholestérol dans la cellule surrénalienne " (réf. 2). Quant aux mécanismes de régulation de cette synthèse et de cet
" uptake ” ils ne sont pas connus. On admet généralement que l'ACTH accélère la transformation du cholestérol en pregnenolone et ne sti mule pas directement la synthèse du premier (réf. 68-78). Néanmoins, les observations de Savard et de son groupe (réf. 102) paraissent
indiquer qiie l'hormone hypophysaire serait également capable d'agir sur la synthèse du cholestérol surrénalien lui-même à partir de
l'acétate. Par ailleurs, les travaux de Sayers et al. (réf. 103) démon trent que l'ACTH n'est pas du tout indispensable au maintien ni à l'accumulation de concentrations élevées de cholestérol dans le cortex surrénalien puisque ces concentrations ne tombent pas chez l'animal hypophysectomisé et que des surrénales préalablement délipidées peuvent reconstituer leurs réserves de cholestérol en l'absence totale d'ACTH. Néanmoins, là encore l'équipe de Liddle (réf. 39) fait une observation qui peut paraître contradictoire et selon laquelle l'ACTH est capable d'augmenter la concentration du cholestérol surrénalien lorsque la transformation de ce dernier en hormones stéroïdes est bloquée par l'aminogluthétimide. Il faut ajouter que ni les études de
Sayers, ni celles de Liddle, ne précisent l'origine du cholestérol surrénalien, cholestérol dont le mécanisme d'accumulation paraît donc être à la fois indépendant et sous la dépendance de la corticotro- phine.
esters de cholestérol diminue rapidement (réf. 87), Cet effet de l’hormone hypophysaire s'explique-t-il simplement par une transfor mation accélérée du cholestérol surrénalien en hormones stéroïdes ? Les expériences de Davis et Garren paraissent le démontrer (réf. 38). Ces auteurs constatent effectivement que lorsqu'ils inhibent la transformation du cholestérol en hormones par l'administration de cycloheximide au rat, l'ACTH devient incapable de modifier la concentration du cholestérol surrénalien. L'ACTH ne stimulerait donc pas directement la fuite du cholestérol surrénalien vers le sang. Il existe cependant, à ce sujet, des observations troublantes. Tout d'abord, les mêmes auteurs, dans un autre travail, constatent aussi que l'ACTH est capable de stimuler directement l'hydrolyse du cholestérol estérifié surrénalien et par conséquent de convertir c e dernier en une forme potentieUement plus échangeable avec le cholestérol sanguin, en d'autres termes, en une forme plus à même de quitter spontanément la surrénale pour le sang (réf. 37). Il faut rappeler ensuite cette observation déjà ancienne selon laquelle une seule dose d'ACTH administrée au rat diminue son cholestérol sur rénalien d'un tiers ou de moitié endéans les 3 heures (réf, 87-103) : une sécrétion hormonale accrue peut-elle rendre compte d'une déplé tion aussi considérable ou bien ne faut-il pas invoquer, une fois encore, l'hypothèse d'une ” sécrétion " directe de cholestérol surré nalien vers le sang ? (réf. 2).
14
-avec le cholestérol plasmatique et n'aurait pas tendance à quitter spontanément la cellule surrénalienne. Enfin, il est frappant que l'ACTH ne diminue la concentration du cholestérol estérifié surréna lien qu'à condition d'augmenter la production hormonale. Cependant, plusieurs faits curieux méritent d'être signalés. Tout d'abord, ainsi que nous venons de le signaler, le cholestérol surrénalien du rat peut tomber de moitié 3 heures après l'administration d'une dose unique d'ACTH. Or, le cholestérol surrénalien du rat est particulièrement abondant. Une production équivalente d'hormones stéroïdes paraît dès lors exorbitante. Chez l'homme aussi, la chute du cholestérol
surrénalien sous l'influence de l'ACTH n'est pas du tout proportionnelle à la production concomitante d'hormones stéroïdes (réf. 99). Dans des expériences in vitro, on constate également que lorsque le tissu surrénalien est incubé en présence d'acétate-C^^, des hormones mar quées peuvent être synthétisées sans que du cholestérol marqué ne soit détectable, comme s'il existait une " voie directe " permettant de court-circuiter le cholestérol ou comme si les réserves énormes de cholestérol estérifié en place n'étaient pas impliquées dans la synthèse hormonale (réf. 67). Il est par ailleurs surprenant de constater que la concentration du cholestérol dans les glandes surrénales est très
variable d'une espèce à l'autre et que certains m_ammifères sont prati quement dépourvus d'esters de cholestérol surrénalien (réf. 28). Enfin, les surrénales humaines qui disposent pourtant de ” réserves " abon dantes, puisent aisément dans la circulation sanguine où le cholestérol se trouve en quantité illimitée (réf. 12). Toutes ces observations suggèrent qu'il n'y a pas de corrélation nécessaire entre le
renouvellement ou l'utilisation du cholestérol surrénalien et la synthèse des hormones stéroïdes.
formuler brièvement comme suit :
1. - Quel est le nombre de compartinaents fonctionnellement distincts dans chaque cellule surrénalienne compte tenu de l'ubiquité intra cellulaire du cholestérol et de sa diversité chimique ; comment par ailleurs, ces compartiments s'articulent-ils entre eux ? 2. - Quelle est la cause de la distribution zonale du cholestérol surré
nalien avec accumulation privilégiée au niveau de la zone fasciculée ? 3. - Quel est le compartiment de cholestérol surrénalien qui dans
chaque cellule est à l'origine des hormones stéroi’des et quelle est la contribution relative des zones réticulée et fasciculée à cette production hormonale ? Ces deux sous-questions constituent un peu des corollaires aux deux questions précédentes ; elles soulèvent en outre le problème de la " voie directe " et celui plus -général de l'utilité d'une accumulation importante de cholestérol estérifié dans les cellules du cortex surrénalien.
4. - Quelles sont les importances absolues et relatives de la S3mthèse surrénalienne de cholestérol et de l'échange avec le cholestérol plasmatique ?
16
-1. - L'étude in vivo de l'équilibration du cholestérol plasmatique et des divers compartiments de cholestérol surrénalien.
2. - L'étude in vitro dans chaque zone du cortex surrénalien de la synthèse du cholestérol.
3. - L'étude in vitro dans chaque zone du cortex surrénalien de la synthèse des hormones glucocorticoi'des et minéralocorticoi'des. 4. - L'étude in vivo de la transformation du cholestérol plasmatique en
18
-I. ETUDE DE L'EQUILIBRATION DES CHOLESTEROLS PLASMA TIQUES ET SURRENALIENS.
A. Dynamique de cette équilibration dans les conditions " normales " ou de contrôle.
INTRODUCTION GENERALE.
14
De 15 à 50 |iC de cholestérol -4- C furent administrés par voie intraveineuse à vingt quatre patients en préparation de surrénalectomie bilatérale pour cancer du sein généralisé afin de pouvoir suivre au
cours du temps et de pouvoir comparer l'évolution des activités spéci fiques du cholestérol plasmatique et du cholestérol surrénalien, l'administration du traceur se situant à intervalles de temps variables de l'ablation des glandes surrénales^ L'étude globale a porté sur une durée ne dépassant pas sept jours, temps maximum nécessaire pour la mise au point du dossier médical.
Les échantillons sanguins furent prélevés dans l'heure précédant la surrénalectomie ainsi que vingt-quatre heures après la fin de l'admi nistration du traceur. Des échantillons de sang furent également obtenus dans la mesure du possible à des temps intermédiaires.
afin d'en isoler successivement les noyaux avec débris cellulaires, les mitochondries, les microsomes, le surnageant et les gouttelettes de lipides. Les activités spécifiques du cholestérol surrénalien dans ces fractions subcellulaires furent comparées à celles obtenues globalement dans les zones '' réticulée " et " fasciculée ” de la surrénale opposée. Enfin, chez onze patients, nous avons séparé les uns des autres les divers esters de cholestérol de la zone " fasciculaire ”, cette sépara tion s'effectuant en fonction du degré de désaturation de l'acide gras
attaché à la molécule de cholestérol. 14
Le cholestérol-4- C fut obtenu d'Amersham.. Son activité spécifique fut successivement de 55, 8 et de 5 9, 2 nC par milligramme et sa pureté radiochimique estimée à 99-101%. Ce dernier point put être vérifié dans notre laboratoire. A cette fin, nous avons ajouté du carrier froid et mesuré l'activité spécifique de ce cholestérol avant et après purification poussée. Après purification par chromatographie sur couche mince, suivie de deux dibrominations successives et de deux cristallisations dans le méthanol, nous avons constaté que l'activité spécifique du cholestérol restait identique à celle que nous obtenions avant toute purification.
3
Le traceur fut dissous dans 10 cm d'éthanol et dilué ensuite dans un baxter de 500 cm de glucosé 5% en eau distillée. Cette solution fut administrée par voie intraveineuse en une perfusion de 3 heures. Vu l'insolubilité virtuelle du cholestérol en solution aqueuse, nous avons analysé la distribution du marqueur dans le sang. A cette fin, nous
14
avons investigué l'équilibration du cholestérol- C avec les formes libres et estérifiées du cholestérol de chaque lipoprotéine plasmatique ainsi qu'au niveaix du cholestérol libre des globules rouges, ceci
20
-TECHNIQUES DE LABORATOIRE.
Les glandes surrénales furent traitées endéans l'heure suivant leur extirpation chirurgicale.
1. Fractionnement du cholestérol surrénalien.
a) F£af^^ii^nîiej^ji1^d^£orte3^er^^e_s_zone_s_ccm£tJL^ : Les glandes surrénales furent recueillies en salle d'opération sur de la glace, soit dans du sérum physiologique, soit dans du Krebs-Ringer- bicarbonate à pH 7, 4. Elles furent ensuite ouvertes comme une gousse de pois et débarrassées de leur tissu médullaire, ces manipulations et les suivantes s'effectuant en chambre froide. Le cortex fut ensuite étalé en petits fragments de moins de 1 cm de côté pour être découpé enfin, au moyen d'un slicer, en couches concentriques du dedans vers le dehors ; la capsule et le tissu surrénalien qui lui adhèrent, c'est-à-dire l'essentiel de la zone glomérulée, furent rejetés. Ce mode de fraction nement fournit en général trois couches dont la premièi'e très pigmentée est surtout constituée par du tissu réticulé et les deux autres, beaucoup plus claires constituent l'essentiel de la zone fasciculée. Les vérifica tions au microscope optique révèlent cependant que la zone dite
” réticulée " comprend le plus souvent sa limite externe et qu'elle est contaminée de façon non négligeable par du tissu fasciculaire, La contamination de la zone '' fasciculée " par les deux autres zones est beaucoup moins importante.
b) Fra£_tmnnmneji'^de_]£_cej.!^]£_a^rér£ali£nne_er£S£SjmnatR _su^£llu]£ij'_e£_(^ré^._
noyaux et débris cellulaires furent obtenus par une centrifugation de 10 minutes à 1000 x g ; les mitochondries furent isolées par une centrifugation de 10 minutes à 10. 000 x g tandis que les microsomes furent centrifugés pendant 60 minutes à 104. 000 x g. Chaque fraction fut resuspendue dans du sucrose et centrifugée une seconde fois. Toutes les centrifugations s'effectuèrent à une température de 4° C. Un culot de mitochondries et un autre de microsomes furent recentrifugés sur gradient de sucrose (0, 74 - 2, 05 M) afin d'en analyser le contenu en protéines et en RNA par la mesure de l'absorption U. V. à 280 et 260 m(i, analyse effectuée aimablement par le Dr. P. Drochmans. Dans trois autres surrénales, nous avons dosé l'azote protéique, le DNA, le RNA, les phospholipides et la cytochrome-oxydase dans les divers constituants subcellulaires afin d'estimer le degré de contamination d'une fraction par l'autre. Il faut ajouter que le surnageant fut dialysé, lyophilisé et redissous ensuite dans 1 à 2 cc d'eau distillée.
A plusieurs reprises nous nous sommes efforcés d'isoler le surnageant des " gouttelettes de lipides '' en l'aspirant avec précaution ma.is une certaine contamination du surnageant " proprement dit " par la phase lipidique reste inévitable vu la labilité de cette dernière.
c) Séj^rati^jdu_cJio]^^té£olJ.ibre_et_d^i^£^qlesjté^ ; Cette séparation et ce fractionnement furent obtenus par chroma tographie sur couche mince selon la technique de Christophe et Matthys
22
-phie en couche mince dont la silice est imprégnée de 5% de A NO^ , tandis que la phase mobile ascendante est constituée par du benzène - hexane (1 : 1 v/v). Dans les devix sj^stèmes de chromatographie, les lipides furent élués des plaques d'abord au moyen de 15 cc de chlorure de méthylène, ensuite à chaud, au moyen de 40 cc de benzène-éther éthylique (1 : 1 v/v) comme décrit par Goodman et Shiratori (réf. 56). Les différences d'activités spécifiques entre ces divers esters de cholestérol furent soumises à une analyse statistique de variance. 2. Fractionnement du cholestérol sanguin.
a) Sé]mr^i^_jIu_cJi£lÆ£^r(^J.^j^e_et_du_£holes_tér^ :
Cette séparation fut effectuée par chromatographie en couche mince comme décrit ci-dessus. L'activité spécifique et la concentration du cholestérol total furent également déterminées par précipitation directe sous forme de digitonide selon la technique de Sperry et Webb (voir rubrique 3-a).
b) Sépa£atm^£të£^lobules rouges et fractionnement des
3. Dosages divers.
a) rmû^Uo^n_de_^ccm£e^r^i^^
Les concentrations du cholestérol libre et du cholestérol total furent mesurées par la méthode de Sperry et Webb (réf. 112), Les activités spécifiques correspondantes ainsi que celles du cholestérol estérifié furent obtenues de même à partir du digitonide précipité selon la méthode de Sperry et Webb : une fraction du précipité fut réservée
3
pour les colorimétries, une autre dissoute dans 2 cm de méthanol et 3
18 cm de liquide de scintillation fut réservée pour les comptages de radio-activité comme décrit par Chobanian et Plollander (réf. 23). Les comptages furent effectués dans un compteur à scintillations du type Nuclear-Chicago avec correction par standard externe pour le calcul de l'efficience.
b ) P O sag£ _d£
L'azote protéique fut minéralisé et dosé par la méthode de Kjeldahl (réf. 1).
c ) P£sag£_d£^
Les phospholipides furent extraits selon le procédé de Schmidt- Thannhauser (réf. 104), qui permet l'extraction séquentielle des lipides, du RNA, du DNA et des protéines. Ils furent dosés ensuite par la méthode de Bartlett (réf, 6).
d) posag£_duJRN^.
24
-le dosage s'effectuant ensuite par ]a mesure de l'absorption à 260 mjx (24 D. O. correspondant à 1 mgr d'acide nucléique).
e) Dos^e_du_DN^
Le DNA précipitant lors de l'extraction du RNA mentionnée
ci-dessus, fut redissous dans de la potasse et dosé par la méthode de Ceriotti (réf. 21).
f) Dos^e^jd£
Une fraction connue des mitochondries et des microsomes hit réservée pour le dosage de la cytochrome-oxydase selon le procédé de Lucile Smith (réf. 111), le cytochrome C étant réduit au préalable par passage sur colonne de Duolite S 10 comme décrit par Chantrenne (réf. 22).
4. Techniques chirurgicales et préparation des malades.
Les deux glandes surrénales furent enlevées en un seul temps, c'est-à-dire au cours de la même intervention chirurgicale, la voie d'accès étant soit abdominale, soit lombaire. Ces interventions furent toutes pratiquées dans le service de chirurgie de l'Institut Bordet par le Professeur W. Smets et le Dr. W. Mattheiem. Deux heures avant la surrénalectomie, les patients reçurent 100 mgr de cortisone par voie intra-musculaire et durant l'opération ils furent maintenus sous perfusion intraveineuse de 100 mgr d'hydrocortisone.
5. Comparaison au cours du temps des activités spécifiques du choles térol libre et du cholestérol estérifié surrénaliens : analyse en termes de relation précurseur-produit.
laquelle le cholestérol libre surrénalien est le précurseur du cholesté rol estérifié surrénalien. Toutes les données expérimentales furent normalisées à une même activité spécifique du cholestérol total plas matique à 24 heures et comparées les unes aux autres. La courbe du cholestérol libre surrénalien fut tracée à partir de la courbe moyenne du cholestérol total plasmatique en tirant parti de la dilution constante d'activité spécifique observée expérimentalement, cette dilution étant de 23% dans la zone " réticulaire " et de 35% dans la zone ” fasciculaire ” La courbe du cholestérol total plasmatique fut simulée empiriquement par une fonction linéaire durant les 9 premières heures et par une fonction multiexponentielle ensuite. Cette fonction multiexponentielle fut ajustée aux valeurs expérimentales par la méthode des moindres carrés, c'est-à-dire en imposant une valeur minimum pour
ou Y expj constitue la valeur expérimentale à tout instant, j et Y thj la valeur théorique correspondante sur la courbe ajustée.
Le processus de renouvellement du cholestérol estérifié surrénalien à partir du cholestérol libre surrénalien est illustré par le schéma suivant
26
-où f (t) est l'activité spécifique du cholestérol libre telle qu'on l'observe expérimentalement à tout moment ; a^(t) est l'activité spécifique du cholestérol estérifié tandis que est la taille du compartiment de cholestérol estérifié ; Pest la quantité de cholestérol entrant ou quit tant Sj coéfficient de renouvellement fractionnel de Sj.
L'équation de conservation est aJ.ors :
= k f(t) - k a (t) dt ^ ^ ^
_X^t
avec f (t) = bt durant les 9 premières heures et f (t) = A^e - A^e par la suite.
Le coéfficient de renouvellement fractionnel du cholestérol estérifié surrénalien ainsi calculé fut également ajusté aux valeurs expérimenta les par la méthode des moindres carrés.
6. Comparaison au cours du temps des activités spécifiques des cholestérols libres et estérifiés plasmatiques et surrénaliens ; analyse multicompartimentale de l'ensemble des résultats expéri- mentaux.
Toutes les données expérimentales furent normalisées comme décrit en 5.
Le modèle multicompartimental est décrit par le schéma ci-dessous :
Ce modèle sera justifié dans la discussion mais il faut noter ici que c'est le modèle le moins arbitraire possible. Il ne préjuge pas de la taille des compartiments 1 et 2, qui représentent respectivement le cholestérol libre et le cholestérol estérifié surrénaliens. Il ne préjuge pas davantage des sources du cholestérol estérifié surrénalien, lequel peut aussi bien provenir d'une estérification du cholestérol libre sur rénalien : que de l'accumulation directe de cholestérol estérifié plasmatique : P^q. Les sources du cholestérol libre surrénalien sont quant à elles le cholestérol libre plasmatique : R. „ et la synthèse
/ /
locale : La synthèse locale Pj^^ de même d'ailleurs que tous les autres débits doivent être bien entendu positifs ou nuis. Ils ne peuvent être négatifs. Il faut encore noter ici que les soi'ties des compartiments 1 et 2 vers le plasma ( P.,, et P._ ^
01 02 ) s'effectuent sous forme d'hormones stéroi'des ou bien directement sous forme de cholestérol non métabolisé.
Comme on peut le constater, ce modèle est d'un point de vue physiologique extrêmement libre. La seule contrainte qu'il impose c'est que le cholestérol estérifié plasmatique ne peut avoir accès au compartiment de cholestérol libre surrénalien qu'au ti'avers du com partiment de cholestérol estérifié surrénalien.
- 28
-avec :
“ • - a^ - f (t) - g (t) : activités spécifiques respectives des cholestérols libre et estérifié surrénaliens, libre et estérifié plasmatiques.
• : débit ou flux de j vers i (MT ~ ^).
• S. : taille du compartiment (l'état j pouvant être caractérisé soit «)
par un site, soit par un état biochimique, soit par les deux).
: renouvellement fractionnel du compartiment 1. kg2 • renouvellement fimctionnel du compartiment 2.
• K *r r ^01 21 P + P 12 M32 !o2- = k Sg 02
renouvellements fractionnels particuliers des compartiments 1 et 2 Les équations de conservation du " tracé ” sont
dS. ___ I dt dS^ dt
fi
dt 2. R. 1 11 avec ^10 ^12 ^10 " ^21 " ^01 n J. P _ P _ P ^20 21 12 02 A l'équilibre du système dS^ dt = 0 de sorte que P = P + P / P - 10 21 01 (10 P + P — *20 12 ^02 21+ R
.2)En ce qui conceiuie les fonctions d'évolution du cholestérol libre plasmatique : f (t) et du cholestérol estérifié plasmatique ; g (t), elles furent ajustées à une somme de deux exponentielles (remarque : ces fonctions ne préjugent d'aucun modèle et constituent simplement un mode de description et d'interpolation des données des précurseurs). Ceci permet au moyen de la Transformation de Laplace (méthodologie mathématique) de calculer la forme analytique des cholestérols surré naliens en fonction des cinq paramètres cités plus haut. Ces fonctions non linéaires sont ajustées au moyen d'un ordinateur par un sondage itératif combiné avec un sondage par Monte Carlo. Le critère d'ajus tement est le critère des moindres carrés relatifs, lequel est préférable dans notre cas au critère des moindres carrés absolus car l'importance relative des données des cholestérols surrénaliens libre et estérifié doit être équilibrée.
La grandeur à minimiser est :
B. Influence de l'ACTH sur l'équilibration des cholestérols plasmatiques et surrénaliens.
2 2
e
avec :
a. , = valeur de a. obtenue par expérience à l'instant i 1 1 exp. 1
a
i 1 th valeur de calculée à l'instant i.
30
-fonction surrénalienne fut stimulée par l'administration journalière de 40 à 120 U d'ACTH (cortrophine Z -Organon) pendant les 3 à 4 jours
14
précédant l'intervention chirurgicale. Le cholestérol- C fut adminis tré comme décrit en A, et l'évolution relative des activités spécifiqiies du cholestérol plasmatique et du cholestérol surrénalien fut comparée aux observations contrôles,
C. Influence de la frénation hypophysaire sur l'équilibration des cholestérols plasmatiques et surrénaliens.
Une étude semblable à celle décrite en A fut menée chez 12 patient dont les surrénales furent mises au repos (réf. 114) par l'administra tion préalable de dexaméthasone ou d'un glucocorticoïde équivalent. La dose de dexaméthasone administrée fut de 1 mgr toutes les 6 heures ou davantage, ce traitement débutant au moins un jour avant l'admi nistration du traceur et n'étant plus interrompu jusqu'au moment de la surrénalectomie.
II. ETUDE IN VITRO DE LA SYNTHESE DU CHOLESTEROL PAR LE TISSU SURRENALIEN.
Le cortex surrénalien fut découpé en fines tranches comme décrit en I, puis incubé pendant 3 heures, à 37° C, sous agitation continue , dans un incubateur métabolique. Chaque flacon d'incubation contenait
3
de 200 à 300 mgr de tissu dans 3 cm d'un milieu Krebs-Ringer-14 bicarbonate à p^^ 7, 4 ; il contenait en outre 60 nC d'acétate-2~ C et
L'incubation fut conduite dans une atmosphère de 95% d'oxygène et de 5% de COg. Le milieu fut oxygéné pendant 10 minutes peu avant la mise en route de l'incubation, mais chaque flacon fut réoxygéné
ensuite pendant 1 minute immédiatement avant et exactement au milieu des 3 heures d'incubation. L'incubation fut stoppée en plaçant les fla cons dans de la glace. Les tissus furent ensuite homogénisés dans de l'eau distillée puis extraits dans 12, 5 à 25 volumes d'acétone-éthanol, le rendement d'extraction du cholestérol étant le même dans les deux cas.
Les protéines précipitant au cours de cette extraction furent séparées par centrifugation et transférées dans un ballon de Kjeldahl pour dosage, tandis que la concentration correspondante du cholestérol tissulaire libre et total fut mesurée dans une fraction précise de l'extrait acétone- éthanol. L'extrait lipidique après prélèvement pour la mesure des
concentrations globales, fut évaporé dans im ballon sous vide, repris dans du chloroforme ou de l'éther et chromatogi'aphié sur couche mince afin de séparer le cholestérol libre du cholestérol estérifié et de dé - terminer leurs activités spécifiques respectives. Le produit des activités
spécifiques du cholestérol libre et du cholestérol estérifié par leur concentration par milligramme d'azote donne bien entendu la synthèse in vitro exprimée en dpm par milligramme d'azote. Les activités spécifiques furent obtenues de la manière suivante :
3
a) Cholestérol libre : celui-ci fut dissous dans 10 cm d'acétone-3
éthanol dont 2x1 cm furent prélevés pour mesure de la concentration 3
32
-b) Cholestérol estérifié : Celui-ci fut d'abord hydrolysé dans l'acétone- éthanol au moyen de potasse alcoolique, évaporé dans un ballon sous vide, repris ensuite dans du chloroforme ou de l'éther, filtré, évaporé
3
à nouveau, dissous enfin dans 10 cm d'acétone-éthanol dont 2 x 250X 3
furent prélevés pour mesure de la concentration et 9 cm pour mesure de la radioactivité ; cette dernière fut déterminée comme décrit
ci-dessus après l'addition de 8 mgr de carrier, deux dibromurations successives, et correction pour les pertes résultant de la purification. c) Divers esters de cholestérol : ceux-ci furent séparés les uns des autres par chromatographie sur couche mince imprégnée de nitrate d'argent (voir 1) ; les divers esters furent ensuite purifiés et leurs activités spécifiques déterminées comme décrit ci-dessus.
III. ETUDE IN VITRO DE LA SYNTHESE DU CORTISOL, DE LA CORTICOSTERONE ET DE L'ALDOSTERONE.
A. Introduction.
De 100 à 300 mgr de tissu furent incubés comme décrit ci-dessus, mais l'incubation fut subdivisée en deux phases : une pré-incubation de une heure suivie d'une incubation proprement dite de deux heures pour laquelle le tissu fut changé de milieu et de flacon. A la fin de la p r é - incubation, le tissu fut rapidement rincé dans du Krebs-Ringer-bicar- bonate, le liquide de rinçage étant ajouté quantitativement au milieu
B. Dosage du cortisol, de la corticostérone et de l'aldostérone. Les milieux de pré-incubation et d'incubation, ainsi que les liquides de rinçage des flacons correspondants furent transférés quantitativement dans des cristallisoirs, lyophilisés, redissous dans
3
5 cm d'eau et extraits au moyen de 7 volumes de chlorure de méthy lène.
Les tissus quant à eux furent d'abord homogénisés, puis extraits par le chlorure de méthylène.
Les hormones ainsi extraites furent dosées par acétylation au moyen d'anhydride tritié obtenu d'Amersham et dont l'activité spécifique de 100 nC par fiM fut encore diluée 4 fois au moment de l'acétylation, La méthode de dosage choisie fut celle de Kliman et Peterson (réf. 79) avec les modifications apportées par le groupe de Bartter (réf. 35) ; en outre, après l'oxydation des stéroïdes à l'acide chromique, nous avons pratiqué une chromatographie supplémentaire en utilisant soit le système E 1, soit le système E 4 (réf. 45) ou bien encore un
système de couche mince acétate d'éthyle-cyclohexane 70 : 30 v/v, ce qui porte donc à 6 le nombre de chromatographie s de la méthode. Dans le but de permettre un calcul de la récupération, nous avons ajouté un
14 14
nombre connu de dpm de cortisol-4- C, cortisone-4- C et aldos- 14
térone-4- C (de l'ordre de 7500 dpm) aux cristallisoirs de lyophili sation des milieux et aux tubes d'homogénisation des tissus. Les activités spécifiques des hormones traçantes marquées au C. étaient
14 , ^ 14 les suivantes : cortisol-4- C : 56, 8 mC/mM, corticostérone-4- : C : 56, 7 mC/mM, aldostérone-4-^"^C : 56, 7 mC/mM.
Ces hormones traçantes furent purifiées par chromatographie en système B^ avant usage.
C. Dosage des protéines tissulaires.
34
-Par ailleurs, les protéines qui précipitent lors de l’extraction au chlorure de méthylène furent dosées par la méthode de Kjeldahl (réf.
1) dans les tissus et les milieux d'incubation. La concentration et la production hormonale purent donc être estimées par unité de poids et par mgr d'azote protéique tissulaire.
D. Etude de l'incorporation de l'acétate marqué dans les hormones de synthèse ; comparaison de la synthèse des hormones à la synthèse de cholestérol.
Le tissu surrénalien fut divisé en deux moitiés égales :
a) Une première moitié fut préincubée puis incubée comme décrit 3 ci-dessus mais en présence de 1, 115 |iM d'acétate froid par cm seulement, afin de connaître la sécrétion hormonale par milligramme d'azote protéique tissulaire dans les milieux d'incubation proprem.ent dits.
b) La seconde moitié du tissu surrénalien fut transférée apr è s la préincubation dans un flacon d'incubation contenant en outre 20 mC
14 3
d'acôtate-2- C par cm . Cette incubation de 2 heures terminée, le tissu fut séparé du milieu. La synthèse du cholestérol fut mesurée dans le tissu tandis que l'incorporation de l'acétate marqué était déterminée dans l'hydrocortisone du milieu. Pour la mesure de cette incorporation, l'hydrocortisone fut purifiée par chromatographie sur système (réf. 19) suivie d'une acétylation avec de l'anhydride acétique froid et une nouvelle chromatographie sur système cyclo- hexane-benzène-méthanol-eau (4 : 3 : 4 : 1).
L'incorporation d'acétate marqué put alors être calculée par gamma d'hydrocortisone en se référant à la sécrétion hormonale par milli gramme d'azote protéique mesurée dans la première moitié du tissu surrénalien.
IV. ETUDE IN VIVO DE LA TRANSFORMATION DU CHOLESTEROL PLASMATIQUE EN HYDROCORTISONE.
A. Introduction.
Cette étude fut effectuée chez deux patients atteints l'un d'une maladie de Cushing, l'autre d'un astrocytome frontal, ce deuxième patient étant traité quant à lui par l'ACTH.
Le cholestérol-4-^"^C (respectivement 25 et 50 ^C) fut administré comme décrit en I. L'administration d'ACTH (2 x 30 U d'ACTH gel par jour) débuta chez le second patient 2 4 heures avant l'administra tion du traceur.
Les activités spécifiques du cholestérol plasmatique furent déterminées à intervalles constants durant les 7 jours qui suivirent l'administration du cholestérol marqué.
Les urines de 12 à 24 heures furent collectées parallèlement afin de comparer les activités spécifiques du cortisol urinaire, ou plus précisément de ses métabolites, à celles du cholestérol plasmatique correspondant.
B. Mesure des activités spécifiques du tétrahydrocortisol et de la tétrahydrocortisonc.
36
-freezer. Les glucuronides du tétrahydrocortisol (THF) et de la tétrahydrocortisone (THE) furent hydrolysés par une incubation des urines de 5 jours, à 37° C et à pH 4, 5 en présence de 300 unités de
3
pglucuronidase par cm . Les urines furent extraites ensuite deux fois au moyen de deux volumes d'acétate d'éthyle distillé. Les volumes combinés d'acétate d'éthyle furent lavés 3 fois au moyen de 0,0 5 volumes de carbonate de sodium saturé et 3 fois au moyen de 0,0 5 volumes d'eau distillée. Ils furent alors acidifiés au moyen de quel ques gouttes d'acide acétique glacial et clarifiés par l'addition d'éthanol. Les extraits furent évaporés ensuite dans un ballon sous vide, repris au moyen de chlorure de méthylène-méthanol 2 : 1 et chromatographiés sur papier Whatman n° 1 d'une largeur de 20 cm.
Deux systèmes de chromatographie furent utilisés successivement : d'abord le système au chlorure d'éthylène-formamide de Burton, Zaffaroni et Keutmann (réf. 18) (développement de 4 à 5 jours), et ensuite le système Bush 5 (développement de 2 à 3 jours) dans des bacs de 1 m de haut. Un second passage sur Bj. fut parfois jugé néces
mentale près. Ces activités spécifiques furent corrigées en fonction du poids moléculaire afin de pouvoir être comparées aux activités spécifiques du cholestérol sangxiin sur une base molaire : elles furent dès lors exprimées en dpm par milligramme de cholestérol.
C. Mesure de l'activité spécifique du cholestérol plasmatique. Cette mesure s'effectua comme décrit précédemment : voir I. D. Comparaison au cours du temps des activités spécifiques du
cholestérol plasmatique à celles des métabolites iirinaix-es de l'hydrocortisone.
I. ETUDE DE L'EQUILIBRATION DES CHOLESTEROLS PLASMA TIQUES ET SURRENALIENS.
A. Dynamique de cette équilibration dans les conditions " normales " ou de contrôle.
i^ug^ •_
Ce problème fut investigué chez trois patients au cours des trois 1^1
heures d'une perfusion continue de 12 jiC de cholestérol-4- C ainsi que dans les heures qui suivirent. Les activités spécifiques du choles térol libre et du cholestérol estérifié au niveau des diverses lipopro téines plasmatiques et des globules rouges témoignent de la distribution du traceur dans le sang et de son équilibration avec le cholestérol en place. Ces activités spécifiques du cholestérol sanguin figurent au Tableau l. On peut constater tout d'abord que le cholestérol plasmatiqeie non estérifié s'équilibre rapidement entre les trois lipoprotéines : les activités spécifiques du cholestérol libre plasmatique sont déjà très semblables les unes aux autres durant la perfusion elle-même. On constate ensuite d'après l'évolution des activités spécifiques du choles térol estérifié que l'estérification du cholestérol plasmatique marqué est la plus rapide dans les lipoprotéines de densité élevée (d > 1, 063) et la plus lente dans les lipoprotéines de densité intermédiaire (1, 06 3 >d >1, 019) ; on constate aùssi que toutes les activités spécifiques du cholestérol estérifié plasmatiqiie se rejoignent et s'égalisent un à deux jours après l'administration du traceur. Enfin, pour ce qui est de l'équilibration complète du cholestérol libre plasmatique avec le cho lestérol libre des globules rouges, elle est réalisée endéans les 16 heures.
Tableau 1.
DISTRIBUTION DU TRACEUR SUR LES LIPOPROTEINES PLASMATIQUES ET LES GLOBULES ROUGES , *
Etude Temps
Activités spécifiques du cholestérol, dpm/mgr.
d < 1, 019 1, 063 > d > 1, 019 d > 1, 063 globules rouges libre estérifié libre estérifié libre estérifié libre Ve - 1 hr 781 51 930 21 733 85 178 Vt - 1 hr 1. 159 54 841 22 1.248 97 207 Cn + 4 hr 1. 700 365 1. 668 234 1.699 570 834 + 16 hr 1. 735 641 1.796 558 1. 842 982 1. 702 + 18 hr 1. 443 862 1. 456 787 1.512 995 1. 438 + 52 hr 1. 091 902 1. 135 903 1. 157 920 1. 146 * Temps zéro = fin de l'administration du traceur ; - et + signifient respectivement avant et après la fin
Nous pouvons donc conclure que la distribution du traceur dans le
sang est semblable à celle du cholestérol endogène (réf. 57-63). L'ana lyse subséquente de l'équilibration de ce même traceur avec le choles térol surrénalien paraît dès lors physiologiquement justifiée.
2. Çorm£n^r^ion£_du £urr£n^mn^._
La concentration du cholestérol libre mesurée dans 32 glandes surrénales s'élève en moyenne à 0, 37 mgr pour 100 mgr de tissu (extrêmes : 0, 22 - 0, 59 ; D. S. : 0, 08 mgr/100 mgr. ) tandis que la moyenne correspondante du cholestérol estérifié est de 7, 1 mgr pour 100 mgr de tissu (extrêmes : 3, 3 - 13, 7 ; D. S, : 2, 5 mgr/IOC mgr). La moyenne des rapports de concentration de la forme estéi'ifiée sur la forme libre est de 19, 2 (extrêmes : 8, 3 - 27 ; D. S. : 4).
Afin d'éliminer les fluctuations de concenti'ations résiiltant d'une imbibition variable des tranches de tissu par les solutions de rinçage,
les concentrations du cholestérol total dans chacune des zones du cortex surrénalien furent aussi déterminées par rapport à l'azote protéique . La moyenne des concentrations du cholestérol total par mgr d'azote protéique dans 8 zones " réticulées " investiguées de la sorte est de 1, 43 (extrêmes : 0, 61 - 1, 86) ; la moyenne pour les zones " fasciculées " correspondantes est de : 2, 26 (extrêmes : 0, 85 - 2, 86). Les concentra tions de cholestérol total obtenues dans les zones fasciculées sont très
42
-Nous avons fait les constatations suivantes : durant les sept jours de l'étude les activités spécifiques du cholestérol libre sont toujours plus élevées que celles du cholestérol estérifié. Elles sont aussi
sys-II II
tématiquement plus élevées dans la zone réticulée que dans la zone Il II
fasciculée, sauf chez deux patients pour lesquels la différence observée entre les deux zones est cependant inférieure à 5%.
Les activités spécifiques du cholestérol estérifié sont de même Il II
toujours plus élevées dans la zone réticulée à l'exception de trois surrénales dans lesquelles la différence entre les deux zones est respectivement de 4, 7 et 23%.
Les activités spécifiques des cholestérols libre et estérifié de chaque zone du cortex sont très semblables dans la surrénale droite et la surrénale gauche. Une analyse statistique par le test de Student ne révèle en effet aucune différence significative dans les huit paires de surrénales ainsi analysées, ceci bien que la glande opérée en second lieu soit soumise au stress chirurgical deux fois plus longtemps que la glande extirpée la première.
Si l'on compare au fil du temps les activités spécifiques du choles térol libre et du cholestérol estérifié surrénalien les unes aux autres
et qu'on les compare de même à celles des cholestérols plasmatiques libre, total et estérifié, on obtient les rapports de valeurs qui figurent au Tableau 2. Les intervalles de temps mentionnés se réfèrent à la fin de la
perfusion du traceur. Il apparaît clairement de l'évolution de ces rapports que les activités spécifiques du cholestérol libre surrénalien
COMPARAISON ENTRE ELLES DES ACTIVITES SPECIFIQUES DU CHOLESTEROL PLASMATIQUE ET SURRENALIEN . TEMPS , JOURS . 0 - 7 ( N = 24 ) 0 - 0, 5 ( N = 4 ) 0, 5 - 1 ( N = 7 ) 1 - 2 ( N = 5 ) 2 - 3 ( N = 4 ) 3 - 5 ( N = 3 ) 5 - 7 (N = 4) Lr/Lp Extrêmes Moyenne 0, 59 0, 21 - 0, 32 0, 28 0, 22 - 0. 80 0, 44 0, 46 - 0, 55 0, 51 0, 66 - 0, 86 0, 75 0, 71 - 0. 85 0, 79 0. 57-1. 14 0. 86 Lr/Tp Extrêmes Moyenne D.s' 0, 77 0, 1 5 0, 50 - 0, 85 0, 74 0, 16 0, 45 - 1, 05 0, 78 0, 21 0, 63 - 0, 96 0, 80 0, 12 0. 67 - 0, 86 0, 75 0, 08 0, 71 - 0, 81 0, 75 0. 05 0. 58-1. 08 0, 80 0, 23 Lr/Ep Extrêmes Moyenne 1, 04 0, 86 - 2, 66 1,85 0. 72 - 1, 97 1, 23 0, 66 - 1, 71 1, 10 0, 68 - 0, 86 0, 77 0. 71 - 0. 80 0, 74 0, 50-0, 99 0. 74 I-f/Tp Extrêmes Moyenne DS 0, 65 0, 1 1 0, 46 - 0, 67 0, 61 0. 10 0, 47 - 0, 82 0, 65 0, 13 0, 48 - 0, 81 0, 66 0, 12 0, 57 - 0. 76 0, 64 0, 08 0. 66 - 0. 72 0, 68 0. 03 0, 47-0, 88 0. 68 0. 19 Er/I.r Extrêmes Moyenne 0, 35 0, 03 - 0, 09 0, 06 0, 07 - 0, 18 0. 13* 0, 10 - 0, 31 0, 23 0, 39 - 0, 52 0, 48 0. 59 - 0, 76 0, 69 0. 55-0. 83 0, 71 Ef/I.f Extrêmes Moyenne 0, 33 0, 03 - 0, 11 0, 07 0, 05 - 0, 15 0, 12 » 0, 12 - 0, 33 0, 22 0, 34 - 0, 46 0, 40 0. 60 - 0, 79 0, 68 0. 53-0. 76 0. 64
Symboles : L = activités spécifiques du cholestérol libre : Lr dans la reticularis, Lf dans la fasciculata, I^p dans le plasma,
E = activités spécifiques des esters de cholestérol : Er dans la reticularis, Ef dans la fasciculata, Ep dans le plasma. T = activités spécifiques du cholestérol plasmatique total.
44
-ont tendance à rejoindre peu à peu celles du cholestérol libre plasma tique et qu'elles sont supérieures à celles du cholestérol estérifié plasmatique durant les deux premiers jours de l'étude.
Il est également frappant que pendant toute la durée de l'étude le cholestérol libre surrénalien reste en équilibre isotopique avec le cholestérol total plasmatique à la réserve d'une " dilution " moyenne constante au cours du temps, de 2 3% dans la zone " réticulaire " et de 35% dans la zone " fasciculaire
Pour ce qui est des esters de cholestérol surrénalien, leurs activités dans les deux zones augmentent progressivement au cours de l'étude, du moins pendant les 5 à 6 premiers jours, pour tendre vers celles du cholestérol libre surrénalien (Tableau 2 - Fig. 2 et 3),
a) Généralités : Le cholestérol surrénalien, libre et estérifié fut analysé dans les divers constituants subcellulaires, le surnageant et
mitochondries povir s'élever à 3, 63 dans la fraction microsomiale . Ainsi donc la majeure partie du cholestéi'ol extrait des mitochondries est encore sous forme estérifiée alors que dans les microsomes la forme libre domine nettement.
Afin d'estimer le degré de contamination mutuelle des mitochon dries et des microsomes, les culots correspondant à chacune de ces fractions furent recentrifugés sur gradient continu de sucrose ainsi que décrit au chapitre des méthodes. L'enregistrement de leur écoulement est reproduit sur la Fig. 1, On peut constater d'après la migration des protéines (courbes d'absorption à 280 mji ) que l'on a bien affaire à deux populations distinctes ; néanmoins le pic des mitochondries n'est pas parfaitement symétrique : il s'élève trop lentement au départ témoignant ainsi d'un certain recouvrement par les microsomes les moins denses.
Les diverses fractions s ub cellulaire s isolées par centrifugations différentielles furent également définies par le dosage de leurs consti tuants caractéristiques. Les résultats de ce travail figurent au Tableau 3. On peut constater que si chaque fraction est manifestement contaminée par ses voisines, les concentrations en RNA, DNA et cytochrome-oxydase par milligramme d'azote protéique sont très différentes et sont de loin les plus élevées respectivement dans les microsomes, les noyaux et les mitochondries. Ces diverses populations sont donc assez homogènes.
choies-Fig. 1. Centrifugation des mitochondries et des microsomes sur gradient dé sucrose continu (0, 74—>>2, 05 M) ; écoulement continu de 0, 2 cc par minute avec enregistrement conco
CARACTERISTIQUES DES FRACTIONS SUECELLULAIRES ( N = 3 ) ^.
Fractions RNA DNA Protéines Phospho- Cytochrome-(mgr). (mgr). (mgr. N^) lipides (-yp) oxydase Homogénat complet : 2, 866 1. 677 17, 150 761 /mgr. Ng 0, 161 0, 104 0, 043 Noyaux : 0, 221 1. 157 2, 790 51 0, 024 /mgr. N2 0, 079 0, 405 0, 019 0, 010 Mitochondries : 0, 167 0, 121 1, 930 119 0, 199 /mgr. N2 0, 097 0, 056 0, 064 0, 113 Microsomes : 1, 633 0, 092 4, 535 432 0, 099 /mgr. N., 0, 348 0, 017 0, 094 0, 016 Surnageant : 0, 377 0, 069 8, 087 41 /mgr. N2 0, 060 0, 015 0, 006 Récupération : 84% 88% 94% 83%
Tableau 4.
DISTRIBUTIOX DU TRACEUR ENTRE LES DIVERSES FRACTIONS SUBCELLULAIRES.
Cas Cor Seu Bar Ket Bou Her Ver Vnb Bosq
Libre Ester Libre Ester Libre Ester Libre Ester Libre Ester Libre Ester Libre Ester Libre Ester Libre Ester Liljre EsTer
Noyaux 2. 072 162 504 38 2, 162 446 2. 170 570 3. 195 1, 300 2. 043 981 1. 694 943 765 582 1, 921 1, 024 462 204 Mitochondries 1, 8.50 177 352 41 1, 619 409 1, 994 649 2. 646 1, 308 2. 200 1, 279 t 930 833 546 1, 682 980 422 200 Microsomes 1, 987 199 589 71 2, 222 539 1. 988 903 2. 709 1,297 2, 256 1, 924 1, 653 1, 375 824 556 1. 794 1. 221 488 413 Surnageant
\
t t 2. 046 1. 352 1, 466 t 770 t 1. 508 t 460 t C.out. lipides 1 932 141 567 34 1, 232 413 993 545 f t t t t 1. 025 967 641 526 1. 090 937 225 182 Reticularis ^ 2. 225 1 75 544 38 2. 601 475 2, 468 753 2. 858 1. 475 tr
1. 698 1. 286 880 664 1. 782 057 485 215 l'a.sciculata + 1, 765 140 570 29 2, 186 372 2. 002 519 2, 630 1. 208 t t 1, 510 982 904 481 1. 689 857 270 161 Temps ° 0, 50 0, 90 1 1, 5 2, 6 2, 9 4, 75 1 4, 5térol libre des organelles tandis que dans les gouttelettes lipidiques elle s'apparente davantage à l'activité spécifique du cholestérol estérifié en place. Ces observations relatives au cholestérol libre non corpuscu laire se confirment dans deux autres études, l'une sous ACTH, l'autre sous dexamethasone (Tableau 4 ; Vnb et Bosq).
11 faut noter enfin que l'activité spécifique du cholestérol libre des corpuscules s ub cellulaire s est semblable à celle du cholestérol libre des zones réticulée et fasciculée de la glande contralatérale non frac tionnée. Cette observation confirme que le cholestérol libre corpusculaire constitue la majexire partie du cholestérol libre surrénalien et qiie les deux glandes surrénales d'un même individu se comportent de manière identique.
c) Cholestérol estérifié surrénalien : Le Tableau 4 démontre que le cholestérol estérifié ne se distingue dans aucune des fractions sub cellulaires à l'exception des microsomes où son activité spécifique est systématiquement et significativement plus élevée qu'ailleurs (p < 0, 001). Il faut rappeler cependant que d'un point de vue quantitatif le cholestérol estérifié des microsomes ne constitue qu'une proportion négligeable du cholestérol estérifié surrénalien global et que sa concentration au niveau de ces corpuscules est même très inférieure à celle du choles térol libre.
surrémlien^
Tableau 5.
ACTIVITES SPECIFIQUES DES DIVERS ESTERS DE CHOLESTEROL [ en dpm/mgr. ).
Han Bro Cas Der Cor Seu Par Dho Ket Her Ver Concentrations
^4 48 36 159 77 34 350 585 623 + 1360 + 1098 516 12 + 2, 4 51 32 t 66 t 364 486 + + 973 502 12 + 2, 0 A, 47 30 138 75 34 378 511 661 1460 1032 517 11 + 2. 9 ^1 42 26 130 66 30 372 499 628 1282 964 487 47 5. 5 42 25 123 56 29 363 418 ++ 1177 950 462 1 7 + 4, 6 Fasciculata 42 26 140 66 29 372 519 620 1208 982 481 Temps * 0, 17 0, 40 0, 5 0.7 O O 1.0 1.5 1.5 2. 6 4. 75 7.0
• Valeurs + DS.— + A„ et A, réunis. — ï non mesuré. — Jours.
affectés de deux doubles liaisons par contre, bien que dominant large ment dans le plasma, ne constituent plus que 11% du pool surrénalien.
b) Activités spécifiques des divers esters ; Le Tableau 5 démontre aussi que malgré leurs différences considérables en concentrations relatives, les activités spécifiques des divers esters de cholestérol surrénalien sont très voisines les unes des autres. On peut noter cependant une légère tendance à l'accroissement des activités
spécifiques avec le nombre de doubles liaisons de la fraction acide gras ; l'analyse statistique démontre que l'activité spécifique des esters les plus désaturés est significativement plus élevée que celle des esters saturés du type - A^ (p <0, 05).
6. Çom£^_amj)n_au_cour^des_^J^w^£s_^pé^ £holesjt^_ol^]ibr£_£t£3uj:J}£^£té£q]_e_s;^£;^^_^jrr £n^y^_enJ_erm£i^de_£elatJ.q£_£i^££r_s£ur-£r£du:U._
k .0 .1 .2 .3 * -*
Fig. 2. Coin supérieur droit : c qui représente la somme des carrés des écarts relatifs entre valeurs théoriques et valeurs expé rimentales, est à son minimum quand k, c'est-à-dire le
coéfficient de renouvellement fractionnel des esters de choles térol surrénalien, vaut 0, 153 par jour.
Fig. 3. Mêmes symboles que pour la Fig. 2. pour k = 0, 148 par jour.
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-pour un coéfficient de renouvellement fractionnel de 0, 153 par jour. La partie principale de la Fig. 2 est constituée quant à elle par les données expérimentales et les courbes ajustées. Ces dernières sont tracées à partir des paramètres obtenus par la méthode des moindres carrés (cfr. ci-dessus). Dans un but de représentation graphique, les valeurs théoriques ajustées ont été calculées pour chaque temps expé rimental et sont représentées sur les courbes par les symboles fermés.
Le coéfficient de renouvellement fractionnel des esters de choles térol surrénalien est pratiquement identique dans la zone ” fasciculée k = 0, 148 (avec e= 1, 83). Ceci est illustré par la Fig. 3,
Il est bien entendu que ces paramètres n'apportent qu'un ordre de grandeur. Ils furent en effet calculés à partir de résultats expérimen taux inévitablement dispersés puisque obtenus chacun chez un patient différent.
7. Çom£ar^mon_au_couTSjluJ;£m£^des_^_twii;£i^ _ £ell_esjiujdiol££té r ol_libr£ _e;^ du_ £stÉÎ2
li en£_;_y^eur£ _d££ £ompl£t_(J^g_._4^ £^^)^
cho-4. Les courbes en traits fins correspondent aux précurseurs plasmatiques, c'est-à-dire le cholestérol libre (courbe supérieure) et le cholestérol estérifié (courbe inférieure) ; les courbes en traits épaissis sont celles ajustées respec tivement pour le cholestérol libre surrénalien ( courbe
dpm/mg choUsUrol
lestérol estérifié plasmatique n'accède au compartiment de cholestérol libre surrénalien qu'au travers du compartiment de cholestérol estérifié surrénalien et non par une hydrolyse directe et indépendante. Dans ces conditions, les coéfficients de renouvellement journalier obtenus pour le cholestérol libre surrénalien sont les suivants :
a) dans la zone " fasciculée " :
- coéfficient de renouvellement global : = 10, 24
- renouvellement à partir du cholestérol libre plasmatique : = 3, 34
- renouvellement à partir du cholestérol estérifié surrénalien : k^2 "" 6, 88
- la synthèse locale correspondante : elle vaut la différence kl J - (kio +ki2> = 0,01.
b) dans la zone " réticulée " : les mêmes coéfficients valent respectivement :
- k^^ = 5, 56 - k^Q = 2, 38 - k^^^ “ 2, 90 et la synthèse locale ‘'u - <‘'10 + ^2’ '
58
-Le cholestérol libre surrénalien se renouvelle de même à partir du cholestérol libre plasmatique et c'est encore une fois dans la zone fasciculée que le l'enouvellement est le plus rapide. A noter ici que si l'on fait abstraction du problème de la zonation, le cholestérol libre surrénalien se renouvelle en moyenne 3 fois par jour à partir du plasma ; or, le pool de cholestérol libre présent dans l'ensemble du cortex sur rénalien est de l'ordre de 18 mgr; il faut donc admettre que 3x18 mgr, soit environ 50 mgr de cholestérol libre plasmatique, ont accès chaque jour aux cellules de ce cortex surrénalien. Cette valeur correspond à peu de choses près aux nécessités de la production journalière d'hor mones stéroïdes.
Une troisième source possible au cholestérol libre surrénalien est la synthèse locale. Celle-ci est très faible : pratiquement inexistante dans la zone " fasciculée ", elle dépasse à peine les 10% de la contri bution plasmatique dans la zone " réticulée ".
Les coéfficients de renouvellement journalier du cholestérol estérifié surrénalien sont nettement plus bas que ceux du cholestérol libre ; ceci se comprend si l'on songe à la taille de ce compartiment ; ils valent :
a) dans la zone " fasciculée " : (renouvellement global) = 0, 23 et (renouvellement à partir du cholestérol libre
surrénalien) = 0, 23 de même.
b) dans la zone " réticulée " : k^^ tout comme k^^ = 0, 25.
valent à son renouvellement à partir du seul cholestérol libre surréna lien. On peut dès lors affirmer que bien que le cholestérol estérifié surrénalien soit plus abondant dans la zone fasciculée, il se renouvelle à la même vitesse que dans la zone réticulée. On peut conclure égale ment que la contribution du cholestérol estérifié plasmatique (la différence ^22 " ^21^ nulle, ou, en d'autres termes, que le cholestérol
estérifié surrénalien provient exclusiveinent de l'estérification du cholestérol libre surrénalien. Il est intéressant de noter par ailleurs que les coéfficients de renouvellement du cholestérol estérifié surréna lien, tant globaux qu'à partir du cholestérol libre surrénalien (0, 23 et 0, 25), sont en moyenne 21 fois plus bas que les coéfficients de
renouvellement du cholestérol libre surrénalien à partir du cholestérol estérifié surrénalien (6, 9 et 2, 9). Comme le compartiment estérifié est aussi en moyenne 19 fois plus abondant que le libre, les débits correspondants doivent être à peu près équivalents en valeur absolue. En d'autres termes, l'échange entre les deux compartiments rend assez bien compte en pratique du renouvellement global du cholestérol estérifié
surrénalien lequel, par conséquent, non seulement ne s'alimente pas à la source du cholestérol estérifié plasmatique mais ne doit guère davantage se déverser directement dans la circulation sanguine.
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-hormonale, le retour vers le sang à partir du cholestérol libre surrénalien doit se faire en majeure partie sous forme d'hormones stéroïdes et peu sous forme de cholestérol libre non métabolisé. B. Influence de l'ACTH sur la dynamique de l'équilibration des
cholestérols plasmatiques et surrénaliens.
1. Ç o^_entj‘atJ.orm_c^^J-lkT ® _
£m;r£n^mni^_
La concentration du cholestérol libre déterminée dans 14 glandes surrénales non homologues et préalablement stimulées par l'ACTH pendant 3 à 4 jours s'élève en moyenne à 0, 35 mgr pour 100 mgr de tissu (extrêmes : 0, 19 - 0, 56 mgr) ; cette concentration n'est donc pas significativement différente de la normale correspondante qui est de 0, 37 mgr. La concentration moyenne du cholestérol estérifié surré nalien est par contre considérablement abaissée : elle tombe sous l'influence de l'ACTH à 1, 57 mgr pour 100 mgr de tissu ( extrêmes ; 0, 25 - 3, 79 mgr ) alors que la valeur normale correspondante est de 7, 1 mgr. La moyenne des rapports de concentration de la forme esté- rifiée sur la forme libre est naturellement tout aussi abaissée : elle tombe d'une valeur contrôle de 19, 2 à la valeur de 4, 4 sous ACTH.
