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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Debourg, A. (1993). La régulation des flux métaboliques au travers des voies de biosynthèse des acides aminés branchés chez Saccharomyces cerevisiae (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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SECTION INTERFACULTAIRE D'AGRONOMIE LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

La régulation des flux métaboliques au travers des voies de biosynthèse des acides aminés

branchés chez Saccharomyces cerevisiae.

Thèse présentée pour l'obtention du grade scientifique de Docteur en Sciences Agronomiques

par

Alain Debourg

Mars 1993

Thèse annexe présentée par A. Debourg pour l'obtention du grade de Docteur en Sciences Agronomiques:

"L'analyse de la préséquence N-terminale de l'aldéhyde déshydrogénase, l'identification de son précurseur et la localisation subcellulaire de celui-ci devrait permettre de préciser le rôle de l'aldéhyde déshydrogénase dans la transformation des composés carbonylés chez

Saccharomyces cerevisiae".

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

SECTION INTERFACULTAIRE D'AGRONOMIE LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE

La régulation des flux métaboliques au travers des voies de biosynthèse des acides aminés

branchés chez Saccharomyces cerevisiae.

Thèse présentée pour l'obtention du grade scientifique de Docteur en Sciences Agronomiques

par

Alain Debourg

Mars 1993

Au terme de ce travail, je tiens à exprimer toute ma gratitude à Monsieur le Professeur André Piérard pour m'avoir permis d'effectuer cette thèse dans son laboratoire. Je lui suis aussi reconnaissant pour les encouragements et les précieux conseils qu'il m'a apportés tout au long de mes recherches ainsi que lors de la rédaction de cette thèse.

Je tiens également à remercier Monsieur le Professeur C. A. Masschelein d'avoir suivi avec intérêt mes travaux dont certaines manipulations ont été effectuées dans son laboratoire.

Ma reconnaissance s'adresse tout particulièrement à Fernando Ramos pour m'avoir guidé lors de mes premières expériences ainsi que pour sa disponibilité tout au long de ce travail.

Je remercie Evelyne Dubois, André Feller, Francine Messenguy, Catherine Tricot et Victor Stalon pour les discussions que nous avons eues ensemble et pour les conseils qu'ils m'ont prodigués.

Je remercie Marc Termonia de m'avoir accueilli à l'Institut de Recherches Chimiques (Tervuren), ainsi que Monsieur le Professeur Jean Hanuise pour m'avoir permis de synthétiser certains composés au Laboratoire de Chimie Organique de l'Institut Meurice.

Je remercie également tous les membres de l'Institut de Recherches du CERIA et de l'Institut Meurice de la sympathie qu'ils m'ont témoignée et en particulier Jean-Pierre Ten Hâve pour avoir réalisé les analyses de pools d'acides aminés et les photographies contenues dans ce travail.

Mes derniers remerciements, mais non les moindres,

s'adressent à mes parents, mon épouse et mes enfants pour la

compréhension dont ils ont fait preuve lors de ce travail.

RESUME DU TRAVAIL 1

CHAPITRE 1: INTRODUCTION

1. Préliminaires... 4

2. Contrôle du métabolisme... 5

2.1. La théorie du contrôle des réseaux métaboliques... 6

2.1.1. Les coefficients de contrôle... 6

2.1.2. Les coefficients d'élasticité... 7

2.2. Etudes expérimentales du contrôle du métabolisme... 9

2.2.1. Contrôle du flux dans la voie de biosynthèse de l'arginine chez Neurospora crassa...9

2.2.2. Contrôle du flux glycolytique chez la levure... 11

2.2.3. Utilisations de séries de souches tétraploïdes de levure... 11

2.2.3.1. Etude du flux dans la voie de biosynthèse de... l'arginine chez la levure... 12

2.2.3.2. Etude du flux dans la voie de biosynthèse du tryptophane chez la levure... 13

3. Le transport des protéines mitochondriales...15

3.1. Caractéristiques générales des protéines mitochondriales...15

3.2. Localisation submitochondriale des protéines...16

3.3. Les mécanismes impliqués dans l'entrée des précurseurs dans les mitochondries... 18

4. Les différents mécanismes de régulation du flux dans une vole métabolique chez les eucaryotes... 20

4.1. La rétroinhibition...20

4.2. La régulation de l'expression génétique... 20

4.2.1. Les promoteurs de levure... 21

4.2.1.1. La "TATA box"... 21

4.2.1.2. Les éléments d'initiation...22

4.2.1.3. Les éléments promoteurs en amont...22

4.2.2. Les protéines régulatrices... 22

4.2.2.1. Le domaine de fixation à l'ADN...23

4.2.2.2. Les régions d'activation...26

4.2.2.3. Les mécanismes de régulation transcriptionnelle... 27

4.2.3. Contrôle spécifique... 28

4.2.4. Le contrôle général de la biosynthèse des acides

aminés... 28

4.2.4.1. Gènes de régulation du contrôle général... 28

4.2.4.2. Enzymes soumis au contrôle général... 30

5. Voies de biosynthèse de l'isoleucine, de la valine et de ia leucine chez Saccharomyces cerevisae... 31

5.1. Régulation de la biosynthèse des acides aminés branchés chez S. cerevisae... 33

5.1.1. La rétroinhibition... 33

5.1.1.1. Régulation de l'activité enzymatique thréonine désaminase...33

5.1.1.2. Régulation de l'activité enzymatique AL synthase ... 34

5.1.1.3. Régulation de l'activité enzymatique a-IPM synthase... 34

5.1.2. Le contrôle général de la biosynthèse des acides aminés... 36

5.1.3. La répression "multivalente"... 36

5.1.4. Mécanisme de régulation par la protéine LEU3... 37

5.1.5. Mécanisme de régulation par la protéine REB1... 40

5.2. Localisation des gènes codant pour les enzymes des biosynthèses des acides aminés branchés... 41

5.3. Localisation subcellulaire des enzymes des chaînes de biosynthèse de l'isoleucine-valine-leucine chez S.cerevisiae... 41

5.3.1. La thréonine désaminase... 42

5.3.2. L'acétolactate synthase... 42

5.3.3. L'AHA isoméroréductase... 43

5.3.4. L'a-IPM synthase... 43

5.4. La résistance au sulfométuron méthyle... 44

5.5. Formation des dicétones vicinales dans le cadre de la biosynthèse des acides aminés branchés chez S. cerevisiae... 45

5.5.1. L'origine des dicétones vicinales... 45

5.5.2. Comment réduire la production de dicétones vicinales... 47

5.5.2.1. Les technologies classiques... 47

5.5.2.2. Les technologies modernes... 47

6. Intérêt et but du travail... 50

CHAPITRE 2: MATERIELS ET METHODES

1. Liste des souches et plasmides utilisés... 52

1.1. Escherichia coli...52

1.2. Saccharomyces cerevisiae... 52

1.3. Plasmides...52

2. Milieux de culture...53

2.1. Composition des milieux utilisés pour les cultures de Escherichia coli... 53

2.1.1. Milieu 853...53

2.1.2. Milieu 856...53

2.1.3. Ampicilline...53

2.2. Composition des milieux utilisés pour les cultures de Saccharomyces cerevisiae... 53

2.2.1. Solution de traces minérales...53

2.2.2. Solution de vitamines... 53

2.2.3. Milieu minimum ammonium (milieu M.am.)... 54

2.2.4. Milieu minimum ammonium + leucine ou valine ou isoleucine...54

2.2.5. Milieu minimum ammonium + isoleucine,valine et leucine... 54

2.2.6. Milieu minimum ammonium + aspartate...54

2.2.7. Milieu riche... 54

2.2.8. Milieu sans azote... 54

2.2.9. Milieu de sporulation... 54

3. Dosages des activités enzymatiques... 55

3.1. Préparation des extraits acellulaires de Saccharomyces cerevisiae pour les dosages enzymatiques... 55

3.2. Dosage de la thréonine désaminase... 55

3.2.1. Principe du dosage... 55

3.2.2. Solutions...55

3.2.3. Mode opératoire...55

3.3. Dosage de l'acétolactate synthase ...56

3.3.1. Principe du dosage... 56

3.3.2. Solutions...56

3.3.3. Mode opératoire...56

3.4. Dosage de l'AHA isoméroréductase... 57

3.4.1. Synthèse organique de l'éthyl a-acéto a-

acétoxylbutyrate... 57

3.4.2. Méthode de dosage... 57

3.4.3. Solutions...58

3.4.4. Mode opératoire...58

3.5. Dosage de la dihydroxyacide déshydratase... 58

3.5.1. Synthèse organique de l'a,p-dihydroxyisovalérate de sodium... 58

3.5.2. Principe du dosage... 59

3.5.3. Solutions... ...59

3.5.4. Mode opératoire...59

3.6. Dosage des activités valine, isoleucine ou leucine aminotransférase... 60

3.6.1. Principe du dosage... 60

3.6.2. Solutions...60

3.6.3. Mode opératoire...61

3.6.4. Electrophorèse à haute tension... 61

3.7. Dosage des activités valine, isoleucine ou leucine aminotransférase dans l'autre sens... 61

3.8. Dosage de l'argininosucdnate lyase...61

3.8.1. Principe du dosage... 61

3.8.2. Solutions...62

3.8.3. Mode opératoire...62

3.9. Dosage des protéines... 62

4. Sélection de mutants ilv de la souche X1278b...62

4.1. Principe de la sélection de mutants par enrichissement à la nystatine...62

4.2. Solutions...63

4.3. Milieux de culture... 63

4.4. Mode opératoire... 63

4.4.1. Préparation de la souche...63

4.4.2. Action de l'agent mutagène... 63

4.4.3. Elimination de l'EMS... 63

4.4.4. Revitalisation des survivants... 63

4.4.5. Privation de source d'azote... 63

4.4.6. Enrichissement à la nystatine...64

5. Construction d'une série de souches tétraploïdes...64

6. Obtention et caractérisation de mutants déficients

respiratoires de 11278b... 66

6.1. Mutagénèse au bromure d'éthidium...66

6.1.1. Solution... 66

6.1.2. Mode opératoire...66

6.2. Test au chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC)... 66

6.2.1. Principe...66

6.2.2. Solution... 66

6.2.3. Mode opératoire...66

7. Préparation d'un extrait ceiiuiaire pour ia détermination des poois d'acides aminés...67

7.1. Solution...67

7.2. Mode opératoire... 67

8. Méthode de dosage des métabolites intermédiaires des voies de biosynthèse des acides aminés branchés... 67

8.1. Récolte des cellules et extraction des métabolites...67

8.1.1. Solutions...67

8.1.2. Mode opératoire ...67

8.2. Préparation des échantillons... 68

8.2.1. Solutions...68

8.2.2. 0-méthyloximation des cétoacides...68

8.2.3. Transformation des acides en sels de tétrabutylammonium... 68

8.2.4. Estérification... 68

8.3. Conditions chromatographiques...68

9. Méthode de dosage des dicétones vicinales par chromatographie en phase gazeuse...69

9.1. Matériel utilisé...69

9.2. Conditions chromatographiques... 69

9.3. Mode opératoire... 69

10. Techniques de biologie moléculaire... 69

10.1. Solutions courantes...69

10.2. Extraction de l'ADN au phénol... 69

10.2.1. Solutions...69

10.2.2. Mode opératoire...70

10.3. Précipitation de l'ADN à l’éthanol...70

10.3.1. Solutions...70

10.3.2. Mode opératoire...70

10.4. Traitement à la phosphatase alcaline...70

10.4.1. Solutions...70

10.4.2. Mode opératoire...70

10.5. Formation d’extrémités blunt de fragments d'ADN ...70

10.6. Utilisation des enzymes de restriction...71

10.7. Extraction de plasmides de Escherichia coli...71

10.7.1. Solutions...71

10.7.2. Mode opératoire pour une mini extraction... 71

10.7.3. Mode opératoire pour une maxi extraction... 71

10.8. Gels d'agarose et séparation de fragments d'ADN...72

10.8.1. Solutions...72

10.8.2. Mode opératoire... 72

10.8.3. Purification de fragments d'ADN... 72

10.9. Séquençage de fragments d'ADN...72

10.9.1. Obtention d'ADN simple brin...72

10.9.2. Obtention d'ADN double brin... 72

10.9.3. Gels d'acrylamide dénaturant pour séquence ...72

10.9.4. Détermination des séquences... 73

10.10. Transformation... 73

10.10.1. Transformation d'Escherichia coli... 73

10.10.2. Transformation de Saccharomyces cerevisiae... 73

10.11. Méthode d'extraction d'ARN messager de levure ... 74

10.11.1. Solutions... 74

10.11.2. Protocole expérimental... 74

10.11.2.1. Récolte des cultures...74

10.11.2.2. Extraction des ARN messager... 74

10.12. Northern blotting...75

10.12.1. Solutions... 75

10.12.2. Gel d'agarose pour ARN... 75

10.12.3. Préparation d’une sonde d'ADN marqué...75

10.12.4. Northern blotting... 76

10.13. Mutagénèse in vitro...76

10.13.1. Solutions... 76

10.13.2. Préparation d'ADN simple brin en grande quantité... 76

10.13.3. Purification des oligonucléotides... 76

10.13.4. Phosphorylation des oligonucléotides...77

10.13.5. Réactions de mutagénèse in vitro...77

CHAPITRE 3: RESULTATS EXPERIMENTAUX

1. Effet de la dose des gènes ILV sur la biosynthèse de

l'isoleucine et de la vallne chez S. cerevisiae... 78

1.1. Construction et analyse des séries de souches de levures tétraploïdes ... 78

1.1.1. Obtention et caractérisation des différents mutants ilv ...78

1.1.2. Obtention de souches isogènes de ZI 278b résistantes au sulfométuron méthyle... 79

1.1.3. Construction des séries de souches de levures tétraploïdes ... 80

1.2. Influence de la dose de gène sur les activités enzymatiques ... 81

1.2.1. Influence de la dose de gène ILV1 ...81

1.2.2. Influence de la dose de gène/L1/2 ...84

1.2.3. Influence de la dose de gène ILV5 ...85

1.2.4. Influence de la dose de gène ILV3 ...86

1.2.5. Influence de la dose de gène SMR... 88

1.3. Influence de la dose de gène sur la production de dicétones vicinales... 90

1.4. Discussion... 91

2. Les différents mécanismes de régulation dans les voies de biosynthèse des acides aminés branchés chez S. cerevisiae... 95

2.1. Le contrôle général de la biosynthèse des acides aminés ... 95

2.2. Influence de l'isoleucine, de la valine et de la leucine sur l'expression des gènes ILV ... 97

2.3. Influence de la leucine sur l'expression des gènes ILV ... 100

2.4. Discussion... 103

3. Influence de la localisation subcellulaire des enzymes des voies de biosynthèse des acides aminés branchés sur les flux au travers de celles-ci... 106

3.1. Essais de séparation et de quantification des métabolites intermédiaires des voies de biosynthèse de l'isoleucine, de la valine et de la leucine...106

3.2. Influence de la localisation subcellulaire des enzymes sur les

pools de métabolites intermédiaires...108

3.3. Influence de la mutation rho- sur l'activité des enzymes des voies de biosynthèse des acides aminés branchés chez S.

cerevisiae...109

3.4. Influence de la mutation rho- sur la production de dicétones vicinales...112

3.5. Discussion...113

4. Caractérisation des activités aminotransférase des voies de biosynthèse des acides aminés branchés chez S. cerevisiae...115

4.1. Recherche de mutants pour l’activité aminotransférase des chaînes de biosynthèse des acides aminés branchés chez Saœharomyœs cerevisiae ...115

4.2. Dosage des activités aminotransférase ILV dans la souche ZI 278b...116

4.3. Etude des mécanismes de régulation de l'activité aminotransférase des chaînes de biosynthèse de l'isoleudne, valine et leucine chez Saccharomyces cerevisiae ...117

4.3.1. Influence du contrôle général de la biosynthèse des acides aminés ... 117

4.3.2. Influence des mécanismes de régulation spécifiques au voies de biosynthèse de l'isoleudne, valine et leucine... 117

4.3.3. Dosage des activités valine, leucine, isoleucine et aspartate aminotransférase dans les souches Zl278b et 8523a...119

4.4. Purification des aminotransférases des chaînes de biosynthèse des acides aminés branchés chez S. cerevisiae ... 119

4.5. Discussion... 123

5. Séquençage et analyse de la région de contrôle du gène iLV3... 125

5.1. Clonage et carte de restriction du gène ILV3... 125

5.2. Séquence nucléotidique du gène ILV3... 125

5.2.1. Analyse de la région 5' non-codante... 126

5.2.2. Analyse de la région 3’ non-codante... 131

5.3. Analyse du transcript du gène ILV3...132

5.4. Séquence en acides aminés du produit du gène ILV3... 133 5.4.1. Usage des codons et expression du gène ILV3... 133 5.4.2. Composition en acides aminés de la chaîne

polypeptidique ILV3... 134 5.4.3. Hydrophobicité...135 5.5. Comparaison des séquences en acides aminés des

dihydroxyacide déshydratase de Saccharomyces cerevisiae

et û'Escherichia coli... 136 5.6. Analyse de la région de contrôle du gène ILV3...138

5.6.1. Influence de la régulation par REB1 sur l'expression du

gène ILV3... 138 5.6.2. Influence de la régulation par LEU3 sur l'expression du

gène ILV3... 140

CHAPITRE 4: CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES...143

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES... 148

Chez Saccharomyces cerevisiae, la biosynthèse de l'isoleucine est catalysée par cinq enzymes dont quatre sont communs avec la chaîne parallèle de biosynthèse de la valine. C'est au niveau du précurseur direct de celle-ci, l'a-cétoisovalérate, que se branche la voie anabolique de la leucine.

Le flux métabolique au travers des chaînes de biosynthèse de ces acides aminés branchés est contrôlé par différents mécanismes de régulation.

Un seul d'entre eux agit au niveau même de l'enzyme, la rétroinhibition par l'acide aminé final de la chaîne. Trois autres mécanismes contrôlent le taux d'expression des gènes codant pour les enzymes de ces voies biosynthétiques: le contrôle général de la biosynthèse des acides aminés, la répression "multivalente" dont le mécanisme n'est pas connu à ce jour et la régulation par la protéine LEU3.

Au cours de ce travail, nous avons étudié l'influence de la dose de gène sur les activités enzymatiques ainsi que sur les flux au travers de ces chaînes métaboliques. De plus, nous avons examiné le rôle de différents mécanismes de régulation et l'influence de la localisation subcellulaire des enzymes intervenant dans ces voies de biosynthèse sur le flux global au travers de celles-ci.

Dans les quatre séries de souches tétraploïdes ILV que nous avons construites, la dose de gène peut être réduite de 75% sans modifier de façon significative la vitesse de croissance ou les pools d'isoleucine, valine et leucine.

Deux types de relations entre la dose de gène et l'activté enzymatique correspondante ont été obtenus.

- Dans les séries tétraploïdes ILV1, ILV2e\ ILV3, les doses de gènes et les

activités enzymatiques sont directement proportionnelles. Cependant,

dans la série tétraploïde ILV3, une dérépression de l'AHA

isoméroréductase (ILV5) est observée lorsque la dose de gène ILV3 est

réduite. Etant donné que ni les autres activités enzymatiques ni les pools

d'acides aminés ne sont modifiés, ce résultat suggère que l'expression

du gène ILV5 est soumise à un contrôle spécifique différent des autres

mécanismes de régulation des voies de biosynthèse de l'isoleucine,

valine et leucine.

- Dans la série tétraploïde ILV5,' l'activité spécifique de l'AHA isoméroréductase par allèle sauvage ILV5 augmente lorsque la dose de gène diminue. Dans la souche tétraploïde Q51 (+—) n'ayant qu'un allèle ILV5, ni la vitesse de croissance, ni les pools d'isoleucine, valine et leucine, ni les autres activités enzymatiques ILV ne sont modifiés. De plus, la dérépression de la synthèse de ce seul enzyme permet d'éviter toute limitation du flux dans ces voies de biosynthèse.

Le fait que la dérépression de l'AHA isoméroréductase dans les souches tétraploïdes Q31 et Q51 soit abolie par l'addition de L-valine 1mM au milieu de croissance confirme l'existence d'un mécanisme de régulation qui dans ces souches tétraploïdes contrôle le niveau d'expression du gène ILV5.

Nous avons mis en évidence que l'addition de L-leucine 0.2mM seule conduit à une répression des activités enzymatiques ILV à un niveau semblable à celui obtenu après addition simultanée des trois acides aminés branchés.

Dans nos souches, la notion de répression multivalente comme étant un mécanisme de régulation spécifique aux voies de biosynthèse de l'isoleucine, de la valine et de la leucine n'est donc plus valable.

De plus, l'influence de la mutation Ieu3 sur les activités enzymatiques suggère que le mécanisme de régulation par la protéine LEU3 n'influence pas directement l'expression des gènes ILV. Cependant, la délétion de la séquence GCGGAACCGG en amont du gène ILV3 entraîne une importante réduction de l'activité dihydroxyacide déshydratase, ce qui indiquerait un rôle éventuel de la protéine LEU3 dans l'expression du gène ILV3.

Malheureusement, au vu de l'ensemble de nos résultats, le mécanisme exact de cette régulation qui contrôle le niveau d'expression des gènes ILV et en particulier le gène ILV5 dans les séries tétraploïdes ILV5 et ILV3 reste hypothétique et pourrait impliquer d'autres facteurs non identifiés à ce jour.

Outre l'influence des mécanismes de régulation, nous avons

également montré, grâce à l'étude des activités enzymatiques ILV dans des

mutants à déficience respiratoire, l'importance de la localisation subcellulaire

de ces enzymes sur leur niveau d'activité. Bien que les taux d'ARN messager

ne soient pas modifiés dans les mutants "petites", les activités enzymatiques

ILV y sont réduites, ce qui semblerait indiquer qu'il s'agit d'un problème

d'importation des protéines dans les mitochondries. Il est intéressant de noter

que seule l'activité aminotransférase ILV ne semble pas être affectée par la

mutation petite, ce qui confirmerait une localisation cytoplasmique de

l'enzyme. Notre travail ne nous a cependant pas permis d'isoler des mutants

3 touché dans l'activité aminotransférase ILV. Ceci pourrait s'expliquer par

l'existence de plusieurs isoenzymes capables de catalyser ces trois réactions de transamination. En effet, une chromatographie sur CM-Sephadex nous a permis de séparer deux formes d'aminotransférase ILV.

Enfin, nous avons étudié l'influence de la dose des différents gènes ILV

sur la production des dicétones vicinales. En effet, lors de la fermentation

alcoolique en brasserie, certains métabolites intermédiaires de ces voies de

biosynthèse des acides aminés branchés sont excrétés dans le milieu et

transformés chimiquement en composés néfastes aux qualités

organoleptiques de la bière: le diacétyle et la 2,3-pentanedione. Nos résultats

indiquent clairement que l'activité AHA isoméroréductase est le facteur

limitant responsable de la production de diacétyle et 2,3-pentanedione.

4

CHAPITRE 1 : INTRODUCTION

1. Préliminaires

La levure Saccharomyces cerevisiae est, depuis de nombreuses années, étudiée en tant qu'organisme eucaryote modèle. En effet, cette cellule est structurée de la même façon que celle des eucaryotes supérieurs:

elle contient des mitochondries, des ribosomes, un réticulum endoplasmique, un appareil de Goigi, des vacuoles et un noyau. Ce dernier contient l'ADN organisé en 16 chromosomes qui représente le patrimoine génétique.

Comme dans toutes les cellules, l'information génétique de l'ADN est transcrite en ARN, puis traduite en protéine et divers mécanismes contrôlent

le niveau d'expression des gènes en fonction des conditions de croissance.

Outre la régulation des gènes proprement dite, la localisation subcellulaire de certaines voies métaboliques influence le fonctionnement global de la cellule eucaryote.

Bien que de très nombreux travaux décrivent les mécanismes de régulation au niveau moléculaire, il est souvent difficile de préciser le rôle de ceux-ci dans la régulation globale du flux d'une voie métabolique. En effet, le métabolisme cellulaire est un ensemble complexe de voies anaboliques et cataboliques interdépendantes où une perturbation en un point particulier peut se répercuter sur tout le système. Par exemple, une variation d'activité enzymatique peut entraîner un changement de concentration en substrats et en produits, ce qui, à son tour, peut modifier la vitesse des réactions voisines.

Ainsi, l'étude de la régulation du métabolisme est liée non seulement aux propriétés individuelles des enzymes, mais aussi et surtout aux contraintes imposées par le réseau métabolique. Celui-ci est en effet formé de différentes étapes enzymatiques reliées entre elles par l'intermédiaire de pools de métabolites. Pour tester la sensibilité du système à des changements de concentration en l'un de ces enzymes, nous pouvons grâce à la génétique classique et à la technologie de l'ADN recombinant, augmenter ou diminuer l'activité enzymatique considérée et en mesurer les conséquences sur les flux métaboliques.

Nous essayerons de développer ces différents points dans le cadre de

l'étude détaillée des voies de biosynthèse de l'isoleucine, valine et leucine

5 chez Saccharomyces cerevisiae. Ce travail précisera l'influence de la dose de gène sur les activités enzymatiques ainsi que sur les flux au travers de ces chaînes métaboliques. Il ne s'agit donc pas d'une étude moléculaire des mécanismes de régulation agissant au niveau de ces voies biosynthétiques.

Cependant, nous examinerons le rôle de ceux-ci ainsi que l'influence de la localisation subcellulaire des enzymes intervenant dans ces voies de biosynthèse sur le flux global au travers de celles-ci.

De plus, ce travail trouve une possible application au niveau industriel.

En effet, lors de la fermentation alcoolique en brasserie, certains métabolites intermédiaires de ces voies de biosynthèse des acides aminés branchés sont excrétés dans le milieu et transformés chimiquement en composés néfastes aux qualités organoleptiques de la bière: le diacétyle et la 2,3-pentanedione.

Aussi, mieux comprendre pourquoi certains de ces métabolites s'acumulent lors de la fermentation nous permettra-t-il d'envisager différentes stratégies visant à réduire le taux de production de diacétyle et de 2,3-pentanedione.

2. Contrôle du métabolisme

A ce jour, la plupart des transformations biochimiques impliquées dans le métabolisme cellulaire sont connues et de nombreux enzymes ont été purifiés et caractérisés. Aussi, les biochimistes tentent-ils d'intégrer l'ensemble de ces connaissances dans l'étude globale du réseau métabolique, de sa régulation et de son dérèglement.

L'étude de la régulation du métabolisme est liée directement à la notion d'étape limitante qui déterminerait le flux dans une voie métabolique.

Cette notion repose principalement sur l'étude in vitro de l'activité des

enzymes et de leur régulation. Cependant, un ensemble de voies

métaboliques possède d'autres propriétés que celles des enzymes isolés. En

effet, les caractéristiques d'un système multienzymatique sont le résultat non

seulement des propriétés des enzymes qui le composent, mais aussi de

l'organisation des voies métaboliques, c'est-à-dire des relations existant entre

les différentes étapes par l'intermédiaire des pools de métabolites. Au cours

de ce travail, nous parlerons de pool d'un métabolite comme étant la

concentration intracellulaire totale de ce composé dans des conditions de

croissance exponentielle.

6 2.1. La théorie du contrôle des réseaux métaboliques

Kacser et Burns (1973) et Heinrich et Raporport (1974) ont proposé une analyse rigoureuse du rôle joué par une étape donnée dans une voie métabolique. Cette théorie et son application expérimentale à des systèmes métaboliques intacts est appelée : "analyse du contrôle" (Fell, 1992; Burns et al., 1985).

On se demande souvent quelle est l'influence d'un enzyme, coenzyme ou substrat sur le métabolisme. Cela provient du fait que l'on se pose essentiellement des questions qualitatives au sujet du contrôle métabolique.

En fait, il faudrait se poser des questions quantitatives:

- quelle variation dans un flux particulier ou

- quelle variation dans la concentration d'un métabolite donné résultera d'un changement d'activité d'un enzyme précis?

Cette théorie tente donc d'établir des relations entre les propriétés globales d'un réseau métabolique et les caractéristiques des composantes de celui-ci, en particulier, les enzymes. Deux paramètres de contrôle rigoureusement différents permettent de préciser l'importance relative de différentes étapes individuelles dans le contrôle de n'importe quelle voie métabolique.

2.1.1. Les coefficients de contrôle

Nous considérons chaque système métabolique comme un ensemble, les étapes individuelles n'étant pas isolées. Les coefficients de contrôle décrivent comment une propriété du système tel que le flux métabolique répond à une variation d'une composante, la concentration en enzyme.

Ainsi, la réponse 9J, du flux J à travers le système, à une faible variation 3[E|] de la concentration d'un enzyme i de cette voie métabolique est appelé coefficient de contrôle du flux.

^ a J [E|] ^ a In J

' “ a[Ej ■ J = ain[E,]

7

In (concentration en enzyme, Ej)

Figure 1 : Le coefficient de contrôle du flux (d'après Fell, 1992)

Nous avons donc autant de coefficient de contrôle du flux qu’il y a d'enzymes dans le système envisagé. Les valeurs de ces coefficients sont soumis à certaines relations telles que le théorème de sommation:

IC,J =1

La somme de tous les coefficients de contrôle d'un flux donné J pour les n enzymes du système considéré est égale à l'unité. Ceci indique, qu'en général, plusieurs enzymes contrôlent le flux et qu'une variation de l'activité d’un enzyme ne modifie pas nécessairement le flux de manière significative.

Plusieurs exemple seront développés dans le paragraphe 2.2. illustrant cette théorie.

2.1.2. Les coefficients d'élasticité

En plus des coefficients de contrôle, un autre paramètre joue un rôle

important: les coefficients d'élasticité. Ceux-ci ne sont plus une propriété du

réseau métabolique mais bien des composantes de celui-ci, à savoir, les

enzymes. Le fonctionnement de chaque enzyme dans un système

8 métabolique peut être estimé en le considérant comme isolé, mais entouré par tous ces substrats, produits et autres effecteurs.

Le coefficient d'élasticité du substrat S sur la vitesse Vj d'une réaction enzymatique i est la variation 3V|/Vj de la vitesse de la réaction pour un changement 3[S]/[S] de la concentration du substrat, tous les autres effecteurs étant maintenus à leur concentration initiale.

i _ i^L [S] _ a In V|

* a[s] ' V| ain[s]

Il y a autant de coefficients d'élasticité pour chaque enzyme qu'il y a de métabolites associés à l'enzyme dans une relation dépendant de la concentration et donc déterminant l'activité de l'enzyme. La valeur absolue d'un coefficient d'élasticité est donc un paramètre enzymologique. Elle est fixée pour des conditions précises. Les coefficients d'élasticité ont des valeurs positives pour les métabolites qui stimulent la vitesse de réaction et des valeurs négatives pour ceux qui ralentissent la réaction.

Comme l'indique la figure 2 ci-dessous, la vitesse d'une réaction enzymatique est fonction de la concentration en substrat. Lorsque la concentration de S est inférieure au K^p de l'enzyme pour ce substrat S, la vitesse est directement proportionnelle à la concentration de S et la valeur du coefficient d'élasticité est proche de l'unité. Par contre, lorsque la concentration de S est de loin supérieure au K^p, la vitesse de la réaction est relativement indépendante de la variation de concentration en substrat et le coefficient d'élasticité est très faible.

Figure 2: Le coefficient d'élasticité pour un enzyme michaëlien

9 A titre d'exemple, pour un enzyme michaëlien, comme indiqué à la figure 2, le coefficient d'élasticité sera égal à 1 pour des concentrations très inférieures au Km et égale à 0 pour des concentrations très supérieures au Km.

Schématiquement, les coéfficients d'élasticité connectent les différentes étapes d'un réseau métabolique et permettent de prédire comment les changements en un point peuvent se transmettre à tout le système.

2.2. Etudes expérimentales du contrôle du métabolisme

Etant donné que les coefficients de contrôle décrivent comment le flux métabolique répond à une variation de la concentration en enzyme, la seule méthode directe pour en déterminer les valeurs est de modifier l'activité enzymatique et de mesurer les conséquences au niveau du flux.

Lorsqu'on étudie le comportement d'une voie anabolique, se pose toujours le problème de connaître l'activité in vivo des enzymes de cette voie de biosynthèse. En effet, les activités de ces enzymes in vivo ne peuvent être déduites d'essais effectués in vitro. C'est pourquoi, afin de mettre en évidence tous les mécanismes de régulation au niveau des enzymes d'une chaîne de biosynthèse et de déterminer la ou les étapes limitantes de cette voie, il est intéressant d'étudier l'influence de la dose de gène sur les activités enzymatiques.

Les méthodes de génétique classique de croisement de souches homozygotes et hétérozygotes pour différents gènes permettent d'altérer la concentration et l'activité d'un enzyme donné. Bien que ces techniques n'induisent pas des variations infinitésimales de l'activité enzymatique, les résultats obtenus permettent de déterminer l'ordre de grandeur des coefficients de contrôle.

Nous allons développer ci-dessous, à titre d'exemple, quelques études expérimentales du contrôle du métabolisme.

2.2.1. Contrôle du flux dans la voie de biosynthèse de l'arginine chez Neurospora crassa

Chez Neurospora, il est possible de moduler la concentration des

différents enzymes dans des hétérocaryons. Ceux-ci peuvent en effet contenir

des rapports différents de deux types de noyaux: l'un contient un allèle non-

10 fonctionnel du gène codant pour un enzyme donné, alors que l'autre type de noyau contient le gène sauvage. Plusieurs travaux ont étudié le contrôle du flux dans la voie de biosynthèse de l'arginine par cette méthode (Flint et al., 1980; Flint étal., 1981; Stuart étal., 1986).

En imposant des variations des activités enzymatiques correspondant à quatre étapes de cette voie de biosynthèse, différents états stationnaires ont été obtenus. La mesure des concentrations en produit final et en métabolites intermédiaires a permis non seulement de calculer les flux en différentes parties du système, mais aussi d'établir les relations enzyme/flux dont la pente nous donne la sensibilité du flux à la variation de concentration en un enzyme.

Figure 3: Relation entre l'activité enzymatique et le flux dans la voie de biosynthèse de l'arginine chez Neurospora crassa (d'après Flint étal. ,1981)

Les coefficients de contrôle du flux de ces quatre enzymes sont tous

relativement faibles et aucun d'entre eux ne contrôle donc seul le flux. Ce

n'est que pour de très faibles activités que les coefficients de contrôle sont

proches de l'unité et que les enzymes correspondants deviennent limitants.

2.2.2. Contrôle du flux glycolytique chez la levure

Un des avantage offert par la technologie de l'ADN recombinant est la possibilité d'augmenter le niveau d'activités enzymatiques par amplification plasmidique des gènes correspondants.

Chez la levure, plusieurs enzymes de la glycolyse ont été longtemps considérés comme les enzymes contrôlant le flux dans cette voie métabolique. Ainsi, les réactions catalysées par la 6-phosphofructo-1-kinase (EC.2.7.1.11.) et la pyruvate kinase (EC.2.7.1.40.) étaient considérées comme les étapes limitantes (Hess et Boiteaux, 1971). La 6-phosphofructo-1-kinase est le moins abondant des enzymes de la glycolyse (Fraenkel, 1982).

Cependant, Heinisch (1986) n'observa aucun effet de la surexpression de cet enzyme sur le flux glycolytique. Ces résultats ont été confirmés et étendus à d'autres enzymes de la glycolyse par Schaaf et al. (1989). Leurs travaux suggèrent que l'augmentation d'activité de différents enzymes glycolytiques tels que la 6-phosphofructo-1-kinase, la pyruvate kinase, la pyruvate décarboxylase (EC.4.1.1.1.) et l'alcool déshydrogénase (EC.1.1.1.1.) n'a pas d'effet sur le flux de cette voie métabolique. Dans une expérience similaire, Davies et Brindle (1992) ont montré qu'une amplification de l'activité 6- phosphofructo-1-kinase n'a aucun effet sur le flux en anaérobiose et stimule très faiblement le flux glycolytique en aérobiose, mais que le coefficient de contrôle du flux reste petit.

Aussi, une augmentation du flux dans la glycolyse nécessitera probablement une amplification de la plupart voir de tous les enzymes glycolytiques.

2.2.3. Utilisations de séries de souches tétraploïdes de levure

Pour chaque gène codant pour un enzyme d'une voie métabolique, une série de souches tétraploïdes peut être construite et génétiquement contrôlée selon la procédure décrite par Hilger (1973) et résumée au paragraphe 6 du chapitre Matériels et Méthodes de ce travail.

Chaque série comprend 4 souches tétraploïdes qui pour une paire

allélique donnée +/- auront les doses de gènes suivantes: 4/4 (type sauvage,

++++), 3/4 (+++-), 2/4 (++“) et 1/4 (+—). Si l'allèle mutant (-) est inactif, la série

fournit 4 souches tétraploïdes pour lesquelles le nombre d'allèle sauvage

décroît linéairement de 4 à 1.

12 Considérons un enzyme catalysant une étape non limitante dans une voie de biosynthèse, la dose du gène codant pour cet enzyme peut décroître jusqu'à une certaine limite sans entraîner de perturbation du flux. Il y aura dans ce cas proportionnalité entre l'activité enzymatique et la dose de gène.

Par contre, dans le cas d'un enzyme catalysant une étape limitante, une diminution de la dose de gène codant pour cet enzyme résultera en une carence en métabolite final et éventuellement en une inhibition de la croissance et une dérépression du taux de synthèse de certains enzymes de cette voie métabolique.

2.2.3.1. Etude du flux dans la voie de biosvnthèse de l'arginine chez la levure Une analyse de l'effet du dosage de gène sur le flux biosynthétique a été présentée par Hilger et al. (1973) dans le cadre de l'étude de la voie de biosynthèse de l'arginine chez la levure. Des séries de souches tétraploïdes ont été construites pour les gènes ARGB (codant pour l'acétylglutamate kinase, EC.2.7.2.3.), ARGF (codant pour l'ornithine transcarbamylase, EC.2.1.3.3.), ARGH (codant pour l'argininosuccinase, EC.4.3.2.1.) et pour CPA1 (codant pour la carbamoylphosphate synthétase, EC.6.3.5.5.).

Deux type de relations entre la dose de gène et l'activité spécifique totale de l'enzyme correspondant ont été observées.

Primo, pour les séries tétraploïdes ARGF et ARGH, les activités enzymatiques sont directement proportionnelles à la dose de gène et la vitesse de croissance demeure constante. Ceci indique que ces deux enzymes sont non-limitants et que leur niveau, in vivo, est au moins quatre fois supérieur à celui nécessaire à un flux biosynthétique normal d'arginine.

Secundo, pour les séries tétraploïdes ARGB et CPA1, une réduction de la dose d'un de ces gènes résulte en une dérépression de l'enzyme correspondant de même qu'en la dérépression de l'ornithine transcarbamylase qui n'est pas limitante. Ceci suggère que l'acétyl glutamate kinase et la carbamoylphosphate synthetase soient les enzymes limitants de la biosynthèse de l'arginine, bien qu'aucune variation de la vitesse de croissance n'ait été observée.

L'absence de mesure de pools de métabolites intermédiaires ou d'arginine

dans ces différentes souches empêche une étude plus détaillée de l'influence

de la dose de gène sur le flux biosynthétique. Cependant, le temps de

génération restant constant dans toutes les souches tétraploïdes envisagées.

13 il est vraisemblable que le flux d'arginine ne subisse pas de variation importante.

Figure 4: Effet de la dose de gène sur les activités enzymatiques de la voie de biosynthèse de l'arginine chez S. cerevisiae (d'après Hilger et al., 1973)

—Activité spécifique totale

—a-a— Activité spécifique par allèle sauvage correspondant

— 0 — 0 — Activité spécifique totale ornithine transcarbamylase

2.2.3.2. Etude du flux dans la voie de biosvnthèse du trvDtophane chez la ifiyuiÊ

Dans cette étude entamée par Miozzari et al. (1978) et poursuivie par Niederberger et al. (1992), des séries de souches tétraploïdes ont été construites pour les différents gènes TRP.

Pour tous les enzymes de cette voie de biosynthèse, sauf pour

l'anthranilate phosphoribosyltransférase (EC.2.4.2.18.) (codée par le gène

G fo w th rate (% o f w ild iy p e l

14 TRP4), la diminution de l’activité enzymatique est directement proportionnelle à la réduction de la dose de gène. Comme l'illustre la figure 5, la dose de gène peut être réduite de 75% sans modification du temps de génération. De plus, la réduction de la vitesse de croissance dans la souche tétraploïde ayant un seul allèle TRP4 sauvage (figure 5b), ainsi que dans le mutant leaky anthranilate syntase (figure 5a,«), est abolie par l'addition de tryptophane au milieu de croissance. Ceci indique donc que ces réductions d'activités enzymatiques affectent le flux de tryptophane et donc la vitesse de croissance.

Figure 5: Vitesse de croissance en fonction des activités enzymatiques de la voie de biosynthèse du tryptophane chez S. cerevisiae (d'après Niederberger étal., 1992)

(a) anthranilate synthase (TRP3C), (b) phosphoribosyltransférase [TRP4),

(c) phosphoribosylanthranilate isomérase {TRP1) (d) indoleglycérol phosphate synthase {TRP3B) (e) tryptophane synthase (TRP5A)

La figure 5 permet également de calculer les coefficients de contrôle de

l'activité enzymatique sur la vitesse de croissance. Bien que ceux-ci soient

estimés dans le cas de la souche sauvage (100% d'activité), les valeurs

faibles de ces coefficients suggèrent que le flux de tryptophane est

relativement insensible à la variation d’une seule activité enzymatique.

Ces résultats ont été confirmés par des expériences d'amplification de différentes activités enzymatiques TRP, par transformation avec des plasmides multicopies portant les différents gènes TRP. Ainsi, une augmentation d'une seule des activités enzymatiques de 10 à 50 fois résulte en de très faibles accroissement du flux en tryptophane. Par contre, lorsque les cinq activités enzymatiques sont amplifiées simultanément, une augmentation de 9 fois du flux en tryptophane est observée.

3. Le transport des protéines mitochondriales

L'étude de la régulation d'une voie métabolique est liée, comme nous venons de le voir, à l'organisation de celle-ci.

Les cellules eucaryotes se caractérisent par une compartimentation des fonctions biochimiques dans diverses organelles (noyau, vacuoles, mitochondries, ...). La localisation correcte des enzymes catalysant les réactions qui s'y déroulent permet une répartition des flux métaboliques qui influence le bon fonctionnement de la cellule. Nous décrirons donc, dans ce paragraphe, les mécanismes de transport des protéines mitochondriales.

3.1. Caractéristiques générales des protéines mitochondriales Les protéines mitochondriales sont souvent synthétisées sous forme de précurseurs cytoplasmiques qui diffèrent des protéines matures, soit par une préséquence N-terminale, soit par une différence de structure tertiaire.

Certains précurseurs portent une préséquence aminoterminale de 15 à 70 acides aminés. La comparaison de celles-ci a permis de mettre en évidence certaines caractéristiques nécessaires au transfert dans les mitochondries (Vassarotti étal., 1987):

- absence totale de résidu acide avant la position 23

- une prépondérance d'acides aminés arginine, lysine, thréonine et sérine

- ces résidus chargés positivement étant susceptibles de former une hélice a amphiphile en présence d'une bicouche lipidique (Baker et Schatz, 1991).

Ces préséquences sont clivées par une ou plusieurs protéases de la matrice

mitochondriale pour produire la protéine mature (Hendrick et al. , 1989). Par

exemple, la sous-unité 5 de la cytochrome oxydase de Saccharomyces cerevisiae possède une séquence leader de 20 acides aminés qui est clivée lors du transport dans la matrice mitochondriale (Koerner et al., 1985).

Cependant, tous les précurseurs ne portent pas de préséquence aminoterminale. Ils peuvent probablement aussi différer des protéines matures par leurs structures tertiaires. En effet, différents travaux ont montré qu'une stabilisation de la structure tertiaire des précurseurs par des liaisons de ligands à haute affinité (Eilers et Schatz, 1986) ou par des ponts disulfures intrapolypeptidiques réduit fortement leur transport dans les mitochondries.

3.2. Localisation submitochondriaie des protéines

La mitochondrie possédant une double membrane, les protéines importées doivent être dirigées vers leur site spécifique au sein de l'organelle:

la matrice, l'espace intermembranaire, la membrane interne ou externe. La figure 6 reprend les différentes voies d'entrée des précurseurs en fonction de leur localisation submitochondriale (Glover et Lindsay, 1992).

Il n'y a pas de préséquence indispensable dans le cas de protéines localisées dans la membrane externe (figure 6a) où leur intégration (stade 1) est réalisée grâce à un récepteur (R). Ces précurseurs deviennent ainsi résistants aux protéases (stade 2) et adoptent leur structure quaternaire dans la bicouche lipidique (stade 3).

La grande majorité des précurseurs de protéines localisées dans l'espace intermembranaire, comme par exemple le cytochrome bg, sont importées par un mécanisme particulièrement complexe (figure 6b). Le précurseur est transporté à travers les deux membranes mitochondriales jusque dans la matrice, grâce à la reconnaissance de récepteurs (stade 1), au potentiel de membrane (A\j/) et à l'hélice amphiphile formée par la préséquence (stade 2). Ce type de précurseur possède deux séquences

"signal" (stade 3). La préséquence N-terminale est clivée par une protéase de

la matrice mitochondriale (stade 4); le polypeptide est ensuite ré-exporté vers

l'espace transmembranaire (stade 5).

(a) 17

Figure 6: Les différentes voies d'entrée dans les mitochondries des précurseurs cytoplasmiques en fonction de la localisation submitochondriale de la protéine mature (d'après Glover et Lindsay, 1992)

Comme l'illustre la figure 6c, l'importation de précurseurs dans la

membrane interne se déroule de la même façon, le transfert étant bloqué par

une séquence "stop transfert" présente dans le polypeptide. Par exemple, la préséquence N-terminale du cytochrome C,, une protéine de la membrane interne orientée vers l'espace intermembranaire, contient deux domaines distincts (van Loon et Schatz, 1987). La fusion de la première moitié de cette préséquence (résidu 1 à 35) au gène codant pour la dihydrofolate réductase de souris(enzyme cytoplasmique) permet le transport de cette protéine dans la matrice mitochondriale. Par contre, la seconde moitié de cette préséquence (résidus 36 à 54) contient une séquence de 19 acides aminés non chargés qui joue le rôle de séquence d'arrêt du transfert et empêche le passage du précurseur à travers la membrane interne (van Loon et al. , 1986). Une structure similaire se retrouve dans la préséquence de la cytochrome C peroxydase, une autre protéine de l'espace transmembranaire (Kaput et al. , 1982).

Enfin, les précurseurs des protéines de la matrice mitochondriale sont importés dans celle-ci où ils subissent un clivage protéolytique (stade 3) permettant ainsi à la protéine mature d'adopter sa structure quaternaire (stade 4).

3.3. Les mécanismes impliqués dans l'entrée des précurseurs dans les mitochondries

Bien que la présence d'une préséquence N-terminale soit suffisante pour permettre l'entrée des précurseurs dans les mitochondries, la nature des interactions de cette séquence "signal" avec la membrane mitochondriale ainsi que les mécanismes impliqués dans le transfert au travers de la bicouche lipidique font, actuellement, l'objet de beaucoup de recherches.

Il semble cependant acquis que les récepteurs protéiques à la surface des mitochondries sont nécessaires pour permettre l'entrée des précurseurs.

De nombreuses études tentent aujourd'hui d'isoler des mutants au niveau de la "machinerie" d'importation des précurseurs. Ces travaux s'avèrent fastidieux étant donné la probable redondance de certains récepteurs.

A ce jour, une seule protéine de la membrane mitochondriale est

reconnue comme essentielle pour l'entrée des protéines dans les

mitochondries; ISP42 (Import Site Protein 42) (Vestweber et al. , 1989). Elle

est un des constituants des canaux d'entrée localisés aux points de contact

entre les membranes interne et externe qui semblent être d'une importance

primordiale pour l'entrée des précurseurs (Baker étal. , 1990). D'autres

protéines telles que les protéases MAS1 et MAS2 (Mitochondrial Assembly) de la matrice mitochondriale et certaines "Heat Shock Proteins" sont également essentielles pour l'importation des protéines mitochondriales (Baker et Schatz, 1991).

De plus, différents facteurs cytoplasmiques sont impliqués dans le transport des précurseurs. En effet, ceux-ci doivent atteindre la membrane mitochondriale sous une conformation spatiale particulière. Ainsi, le méthotrexate empêche l'entrée dans les mitochondries de la dihydrofolate réductase de souris fusionnée à une préséquence mitochondriale (22 résidus N-terminaux de la préséquence de la sous-unité IV de la cytochrome oxydase de levure). Le méthotrexate ne bloque pas l'entrée du précurseur dont provient la préséquence, mais stabilise la structure tertiaire de la dihydrofolate réductase. Ceci suggère que la protéine doit être, au moins en partie, déployée pour permettre le transport à travers les membranes mitochondriales (Eilers et Schatz, 1986).

Il est actuellement établi que cette structure déployée des précurseurs est maintenue par des interactions avec des protéines cytoplasmiques du type

"Heat Shock Proteins": HSP70 (Deshaies et al. ,1988; Chirico et al. , 1988).

Dans les années à venir, les recherches devront définir de façon plus précise les interactions entre ces différentes composantes de la "machinerie"

d'importation des protéines dans les mitochondries.

20

4. Les différents mécanismes de régulation du flux dans une voie métabolique chez les eucaryotes

Il existe chez les eucaryotes 3 modes de contrôle pouvant régir le flux dans une voie métabolique.

Deux d'entre eux, agissent au niveau de l'expression des gènes codant pour les enzymes de biosynthèse: le contrôle spécifique et le contrôle général de la biosynthèse des acides aminés. Le troisième, la rétroinhibition, agit au niveau même de l'enzyme.

4.1. La rétroinhibition

La rétroinhibition contrôle finement le flux de métabolites au travers d'une voie métabolique en réduisant temporairement l'activité de certains enzymes. Ainsi, le premier enzyme d'une chaîne biosynthétique, enzyme souvent allostérique, peut être inhibé par le produit final de la chaîne. Lorsque celui-ci s'accumule, cette rétroinhibition est capable d'agir de façon immédiate et donc de contrôler sa propre concentration dans la cellule.

4.2. La régulation de l'expression génétique

Les gènes d'eucaryotes sont régulés par divers mécanismes en réponse à des conditions d'environnement et de croissance particulières.

Cette régulation intervient aux différents stades de l'expression de l'information génétique: transcription, mécanismes post-transcriptionnels et traduction. Chez Saccharomyces cerevisiae, ce contrôle a lieu en général au niveau de la transcription. La régulation transcriptionnelle fait intervenir des protéines régulatrices qui se fixent à une région de l'ADN localisée en amont du gène, le promoteur.

Une partie de notre travail portant sur l'étude de l'expression d'un gène

de Saccharomyces cerevisiae, nous examinerons dans ce paragraphe la

structure générale des promoteurs de levure.

21 4.2.1. Les promoteurs de levure

Les promoteurs de levures comportent différents éléments, illustrés à la figure 7: les éléments d'initiation, la région "TATA box" et les éléments promoteurs en amont.

Tous ces éléments sont nécessaires pour déterminer le taux de transcription ainsi que l'exactitude de l'initiation par l'ARN polymérase II ( Guarente, 1988;

Struhl, 1987 et 1989 ).

-80 à-600 -40 à-120

Figure 7: Structure du promoteur d'un gène de levure.

Cependant, l'initiation de la transcription par l'ARN polymérase II est un mécanisme complexe faisant intervenir, non seulement les facteurs de transcription (TFII), mais aussi les différentes protéines régulatrices agissant au niveau du promoteur (Lillie et Green, 1989).

Un complexe multiprotéique formé des facteurs de transcription (TFII) et de l'ARN polymérase II permet l'initiation de transcription à un niveau basal. Le taux de transcription quant à lui, est déterminé par les interactions entre les protéines régulatrices et les éléments d'activation ou de répression présents dans le promoteur (Struhl, 1989).

4.2.1.1. La "TATA box"

En général, la "TATA box" est nécessaire, mais pas suffisante, pour l'initiation de la transcription. Le rôle de cette séquence est essentiellement de déterminer parmi un certain nombre de sites d'initiation potentiels, celui ou ceux qui seront utilisés par l'ARN polymérase II (Benoist et Chambon, 1981).

Cette "TATA box" est caractérisée par la séquence consensus TATAAA et est localisée entre 40 et 180 paires de bases (pb) en amont du site d'initiation de la transcription (Sentenac et Hall, 1982).

Elle est reconnue par le facteur de transcription TFIID qui s'y fixe (Hahn et al.,

1989). Ensuite,les autres facteurs de transcription TFIIA, TFIIB et TFIIE, ainsi

22 que TARN polymérase II, viennent s'y ajouter et former le complexe d'initiation de la transcription (Buratowski étal., 1989).

4.2.1.2. Les éléments d'initiation

Les éléments d'initiation, localisés à proximité du début de l'ARNm déterminent la position de l'initiation de la transcription, mais ont peu d'effet sur le taux de transcription. La distance entre la "TATA box" et les éléments d'initiation varie quelque peu chez la levure (40 à 120 pb) et il ne semble pas y avoir de séquence spécifique du site d'initiation.

4.2.1.3. Les éléments promoteurs en amont

De nombreux gènes eucaryotiques sont régulés en fonction des conditions de croissance. La régulation de ces gènes dépend de séquences situées en amont de la "TATA box".

On distingue les éléments d'activation amont (LIAS) et les éléments de répression en amont (URS). Ce sont de petites séquences d'ADN de 10 à 30 pb reconnues spécifiquement par des protéines régulatrices (Guarente, 1984). L'UAS est reconnu par une protéine activatrice de la transcription tandis que l'URS permet la fixation d'un répresseur de la transcription.

4.2.2. Les protéines régulatrices

Des études menées sur de nombreuses protéines régulatrices de la transcription ont permis d'établir l'existence de 2 segments protéiques fonctionnellement distincts et en général physiquement séparables.

Un premier domaine permet la fixation de la protéine activatrice au niveau d'une séquence nucléotidique spécifique en amont du gène régulé. Après fixation à l'ADN, un domaine d'activation stimule la transcription (Struhl,

1989).

23 4^.2.1. Le domaine de fixation à l'ADN

Des analyses structurales et fonctionnelles de différentes protéines eucaryotes se fixant à l'ADN indiquent que de petits domaines contenant moins de 100 acides aminés sont suffisants pour une fixation spécifique à l'ADN.

Le rôle de ce domaine de fixation à l'ADN dans le mécanisme de régulation de la transcription est double. Primo, il fixe la protéine à l'ADN ce qui permet au domaine d'activation d'interagir avec un ou plusieurs composants de la "machinerie" transcriptionnelle. Secundo, la grande spécificité des interactions ADN-protéine est à la base du niveau d'expression particulier pour chaque gène (Freemont et a/., 1991 ; Struhl, 1989).

L'étude des séquences primaires et des propriétés biochimiques de ces domaines de fixation à l'ADN suggère l'existence d'au moins 3 motifs distincts.

3)- Le motif " helix-turn-helix"

Le premier et de loin le mieux caractérisé des motifs de fixation à l'ADN est le motif " helix-turn-helix" présent dans les répresseurs Cl et CRO du phage X (Anderson et al. , 1981) et dans la protéine CAP 6'Escherichia coli (Mc Kay et Steitz, 1981).

Figure 8: Structure du motif "hélix - turn - hélix".

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Des analyses par diffraction aux rayons X ont permis de préciser la structure de ce motif: il s'agit comme son nom l'indique, de deux hélices a séparées par un tournant p. La première hélice, appelée hélice de reconnaissance, s'étend à l'intérieur du grand sillon de l'ADN où elle interagit spécifiquement avec les résidus des bases exposées. Par ailleurs, l'autre hélice, orientée en travers du grand sillon, ainsi que le tournant p jouent un rôle essentiellement conformationnel comme montré sur la figure 2.

Chez les eucaryotes, ce motif a été invoqué pour la première fois, dans les produits des gènes homéotiques de Drosophila qui contrôlent l'expression de nombreux gènes durant l'embryogénèse (Mc Ginnis étal., 1984). Ces protéines contiennent un "homéodomaine" d'environ 60 acides aminés plus ou moins conservé. Quelques 80 protéines eucaryotiques possédant un tel

"homéodomaine" ont, à ce jour, été mises en évidence (Brennen et Matthews, 1989; Levine et Hoey, 1988).

b). Le motif " zinc finger "

Il a été identifié pour la première fois dans le facteur de transcription TFIII-A (facteur de transcription pour l'ARN polymérase III) de Xenopus laevis (Miller et al., 1985).

Dans ce motif, une paire de cystéines et une paire d'histidines ou deux paires de cystéines se lient à un atome de zinc pour former une structure tétraédrique. Il se forme ainsi une sorte de doigt dont les chaînes latérales des acides aminés hydrophiles pourraient interagir avec l'ADN comme le montre la figure 9.

Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, des structures potentielles

de type "zinc finger" ont été mises en évidence notamment dans les protéines

ARGRII (Messenguy étal., 1986), GAL4 (Langhon et Gesteland, 1984) et

LEU3 (Friden et Schimmel, 1987).

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Figure 9: Représentation schématique d'une structure de type "zinc finger" composée de deux sous-unités. Les résidus encerclés représentent les acides aminés typiques du motif. Les points noirs représentent les chaînes latérales des acides aminés supposés interagir avec l'ADN. C = cystéine, D = aspartate, F = phénylalanine, H = histidine et Y = tyrosine.

c). Le motif " leucine zipper "

Récemment, un nouveau motif de fixation à l'ADN a été proposé pour certaines protéines (Landschuiz étal., 1988). Parmi celles-ci, on retrouve la protéine régulatrice GCN4 de la levure (Vogt et al. , 1987), les oncoprotéines JUN, FOS et MYC (Turner et Tjian, 1989; Gentz et al. , 1989) et le facteur de transcription C/EBP (Landschuiz et al., 1988).

Il se présente sous la forme d'une hélice possédant un résidu leucine

tous les 7 acides aminés, de sorte que ces leucines se trouvent toutes du

même côté de l'hélice.

Bfsie riçion

Liuetnt riptat

NH.-

•CCCH

/////

SNA oinaing oomrn

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Figure 10: Structure du motif "leucine zipper" et modèle de dimérisation.

Cette structure, représentée à la figure 10, favorise la formation d'un dimère où les chaînes latérales des leucines de chaque monomère s'intercalent. La dimérisation de la protéine amène au contact l'une de l'autre une région basique de chaque chaîne polypeptidique. Cette région basique s'organise alors en hélice a (Shuman étal., 1990).

Les résidus d'acides aminés formant la structure "leucine zipper" doivent probablement jouer un rôle dans la spécificité de reconnaissance entre chaque chaîne polypeptidique.

4_2.2.2. Les régions d'activation

Après fixation à l'ADN, les facteurs de régulation doivent interagir avec d'autres éléments ou avec l'ARN polymérase II elle-même afin de moduler la transcription. Les régions d'activation sont de petits domaines ( 30 à 100 acides aminés ) à caractère acide sans grande ressemblance quant à la séquence en acides aminés ( Struhl, 1987; Ptashne, 1988).

L'importance de ce caractère acide est confirmée, par exemple dans le cas de

GAL4, par l'étude de mutations ponctuelles dans la région d'activation (Gill et

Ptashne, 1987). En effet, les substitutions d'acides aminés qui altèrent le

niveau d'activation sont généralement associées à une diminution de la

charge négative du segment de protéine.