Disponible à / Available at permalink :

(1)

Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Malaisse, W. (1968). Etude de la sécrétion insulinique in vitro (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.

Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/215203/1/9bb5e1ce-4c04-4f9b-ac4e-b875faee988c.txt

(English version below)

Cette thèse de doctorat a été numérisée par l’Université libre de Bruxelles. L’auteur qui s’opposerait à sa mise en ligne dans DI-fusion est invité à prendre contact avec l’Université ([email protected]).

Dans le cas où une version électronique native de la thèse existe, l’Université ne peut garantir que la présente version numérisée soit identique à la version électronique native, ni qu’elle soit la version officielle définitive de la thèse.

DI-fusion, le Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles, recueille la production scientifique de l’Université, mise à disposition en libre accès autant que possible. Les œuvres accessibles dans DI-fusion sont protégées par la législation belge relative aux droits d'auteur et aux droits voisins. Toute personne peut, sans avoir à demander l’autorisation de l’auteur ou de l’ayant-droit, à des fins d’usage privé ou à des fins d’illustration de l’enseignement ou de recherche scientifique, dans la mesure justifiée par le but non lucratif poursuivi, lire, télécharger ou reproduire sur papier ou sur tout autre support, les articles ou des fragments d’autres œuvres, disponibles dans DI-fusion, pour autant que :

Le nom des auteurs, le titre et la référence bibliographique complète soient cités; L’identifiant unique attribué aux métadonnées dans DI-fusion (permalink) soit indiqué; Le contenu ne soit pas modifié.

L’œuvre ne peut être stockée dans une autre base de données dans le but d’y donner accès ; l’identifiant unique (permalink) indiqué ci-dessus doit toujours être utilisé pour donner accès à l’œuvre. Toute autre utilisation non mentionnée ci-dessus nécessite l’autorisation de l’auteur de l’œuvre ou de l’ayant droit.

--- English Version ---

This Ph.D. thesis has been digitized by Université libre de Bruxelles. The author who would disagree on its online availability in DI-fusion is invited to contact the University ([email protected]).

If a native electronic version of the thesis exists, the University can guarantee neither that the present digitized version is identical to the native electronic version, nor that it is the definitive official version of the thesis.

DI-fusion is the Institutional Repository of Université libre de Bruxelles; it collects the research output of the University, available on open access as much as possible. The works included in DI-fusion are protected by the Belgian legislation relating to authors’ rights and neighbouring rights. Any user may, without prior permission from the authors or copyright owners, for private usage or for educational or scientific research purposes, to the extent justified by the non-profit activity, read, download or reproduce on paper or on any other media, the articles or fragments of other works, available in DI-fusion, provided:

The authors, title and full bibliographic details are credited in any copy;

The unique identifier (permalink) for the original metadata page in DI-fusion is indicated; The content is not changed in any way.

It is not permitted to store the work in another database in order to provide access to it; the unique identifier (permalink) indicated above must always be used to provide access to the work. Any other use not mentioned above requires the authors’ or copyright owners’ permission.

(2)

UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES

LABORATOIRE DE MÉDECINE EXPÉRIMENTALE Professeur P. A. Bastenie

ÉTUDE

DE LA

SÉCRÉTION INSULINIQUE

IN VITRO

PAR W. MALAISSE

THÈSE PRÉSENTÉE EN VUE DE l’oBTENTION DU GRADE

d’agrégé de l’enseignement SUPÉRIEUR

ÉDITIONS ARSCIA S.A. Bruxelles

(3)

1. Les perfusions glucosées de longue durée représentent un modèle expérimental pour l’étude du coma hyperosmolaire.

2. L’effet biologique de l’insuline n’est pas proportionnel à sa liaison tissulaire.

(4)

ÉTUDE

DE LA

(5)

LABORATOIRE DE MÉDECINE EXPERIMENTALE Professeur P. A. Bastenie

ÉTUDE

DE LA

SÉCRÉTION INSULINIQUE

IN VITRO

PAR W. MALAISSE

THÈSE PRÉSENTÉE EN VUE DE l’oBTENTION DU GRADE

d’AGRÉGÉ DE l’enseignement SUPÉRIEUR

ÉDITIONS ARSCIA S.A.

60, RUE DE l’Étuve — Bruxelles

(6)

Tous droits de traduction, d’adaptation et de reproduction par tous procédés, y compris la photographie et les microfilms,

réservés pour tous pays.

D. 1968/0227/17

(7)

! dérant qu’il a joué dans ma formation scientifique. C’est dans son service que, dès 1957, j’ai été initié, sous la conduite du Pro fesseur V. CONARD et du Dr f.R.M. FRANCKSON, aux foies de la recherche. Depuis lors, le Professeur BASTENIE m’a cons tamment apporté l’aide de ses conseils et encouragements. Qu’il

trouve ici l’expression de ma gratitude. Celle-ci s’adresse également au Professeur V. CONARD et au Dr f.R.M. FRANCKSON pour la sollicitude et la confiance qu’ils m’ont toufours témoignées.

La partie initiale du présent travail a été réalisée, sous la con duite des Professeurs J. ASHMORE et P.H. WRIGHT, au Dépar tement de Pharmacologie de l’Université d’Indiana. Ce travail a

largement bénéficié de leurs suggestions et critiques. Je leur expri me ma profonde reconnaissance.

Mes remerciements vont également à tous ceux qui apportèrent leur précieuse collaboration, et notamment :

— au Professeur P. LACY (Department of Pathology, Washing

ton University, St Louis, Mo.) et ses collaborateurs qui m’ont appris la technique d’isolement enzymatique des ilôts de Lan gerhans,

— aux Dr s D.L. COLEMAN (The Jackson Laboratory, Bar Har-

bor, Maine), A.A. LIRE (The Joslin Research Laboratory, Har vard Medical School, Boston, Mass.), G.C. GERRITSEN et

W.E. DULIN (Metabolic Diseases Research, The Upjohn Com pany, Kalamazoo, Mich.) qui ont contribué à l’exploration de leurs précieux animaux diabétiques,

— au Dr D. LEMONNIER (Laboratoire de Nutrition Humaine,

Hôpital Bichat, Paris) qui a préparé les rats soumis à un régime gras et a contribué à leur étude,

— au Dr A. LAWRENCE (Department of Medicine, University

(8)

— aux Drs Ed. G. McCRAW (Deparment of Medicine, Alabama LJniversity, Birmingham, Ala.) et J. FLAMENT-DURAND (Service d’Anatomie Pathologique, Université Libre de Bru xelles ) à qui est due la préparation des animaux thyroidectomi- sés, surrénalectomisés et hypophysectomisés,

— et à M. D.A. MAYHEW, Ph.D. (Medical Research Laborato

ries, Pfizer, Groton, Conn.) qui contribua à certaines expé riences.

Ma plus vive reconnaissance s’adresse également à Mesdemoi

selles S. KING et M. WYNGAERDEN pour leur excellente

assistance technique; et à Mademoiselle S. PROCUREUR qui des sina les illustrations.

Je remercie également Al. A. CHRISTIAENS, le Dr C. PIRSON et M. V. GUELTON qui ont apporté leur concours à l’édition de ce mémoire.

Enfin, le présent travail n’eut pas été possible sans la constante collaboration du Dr F. MALAISSE-LAGAE (Service d’Anatomie Pathologique, Université Libre de Bruxelles) à qui il est dédié.

Nous tenons à remercier les Institutions qui ont apporté à la réalisation de ce travail les appuis suivants :

— U .S. Public Health Service International Postdoctoral Fellow-

ship (F03-TW-865; N.I.H., Bethesda, Md),

— Bourse de la Fondation Universitaire (Bruxelles) réservée aux

Lauréats du Concours Universitaire.

— Bourse dti Ministère de l’Education Nationale (Bruxelles) aux

Lauréats du Concours des Bourses de Voyage,

— Contrat Euratom-Universités de Pise et de Bruxelles (0 26-63

BIAC),

— Crédit aux Chercheurs du Fonds National de la Recherche

Scientifique (Bruxelles),

— et grants-in-aid de Eli Lilly Research Laboratories (Indiana-

(9)

Pages

INTRODUCTION...13

CHAPITRE I UNE NOUVELLE MÉTHODE DE MESURE DE LA SÉCRÉTION PANCRÉATIQUE DTNSULINE IN VITRO A. Destruction de l’insuline par le tissu pancréatique... 18

B. Effets du tissu pancréatique sur l’insuline et le sérum anti-insulinique . 22 C. Dosage des anticorps libres ou partiellement neutralisés .... 25

D. Mesure de la sécrétion d’insuline endogène...28

E. Conditions expérimentales et sécrétion d’insuline... 31

F. Spécificité de la méthode...34

G. Reproductibilité de la méthode... 37

H. Sécrétion d’insuline par des fragments pancréatiques et des ilôts isolés . 38 J. Sécrétion d’insuline et contenu en insuline du tissu pancréatique . 41 CHAPITRE II LE CONTROLE METABOLIQUE DE LA SÉCRÉTION D’INSULINE A. Effets du glucose et d’autres sucres... 46

B. Le passage membranaire et la phosphorylation du glucose dans les cellules bêta...48

C. Effets des inhibiteurs du métabolisme glucidique... 53

D. Effets des métabolites glucidiques... 57

E. Effets des métabolites non glucidiques...59

(10)

10

TABLE DES MATIÈRES

Pages

CHAPITRE III

LE CONTROLE HORMONAL DE LA SÉCRÉTION D’INSULINE

A. Effets des agents adrénergiques... 74

B. Le système de l’adénylcyclase dans les cellules bêta... 77

C. Effet du glucagon endogène sur la sécrétion d’insuline .... 90

D. Effets des hormones gastro-intestinales...98

E. Effets des agents cholinergiques... 101

F. Effets d’autres hormones...104

G. Effet de l’insuline...107

CHAPITRE IV LA FONCTION INSULAIRE AU COURS DU DIABÈTE A. La fonction insulaire du hamster chinois...112

B. La fonction insulaire du rat des sables...121

C. La fonction insulaire de la souris db...128

D. La fonction insulaire au cours du diabète expérimental .... 133

E. Faits et hypothèses...136

CHAPITRE V EFFETS DES FACTEURS DIABÉTOGÈNES SUR LA FONCTION INSULAIRE A. La fonction insulaire au cours de la croissance... 140

B. Effets de l’hormone de croissance...141

C. La fonction insulaire au cours de la grossesse...147

D. Effets des hormones glucocortocoïdes...151

E. La fonction insulaire dans l’infection...155

F. La fonction insulaire dans l’obésité... 158

G. Effets du régime gras...163

H. Effets du jeûne... 167

J. Effets de l’hyperinsulinisme... 171

K. Effets des hormones thyroïdiennes... 173

L. Effets de l’hyperglucagonisme... 176

(11)

Pages

CHAPITRE VI

PHARMACOLOGIE DE LA SÉCRÉTION DTNSULINE

A. Effets des sulfamides hypoglycémiants... 182

B. Effets des biguanides... 192

C. Effets du diazoxide et du chlorothiazide...193

CONCLUSIONS...197

RESUME...201

(12)

(13)

(14)

(15)

contrôlée par la concentration du glucose dans le plasma de l’artère pancréatique (Metz, 1960). Toutefois l’examen détaillé de l’effet du glu cose sur la cellule bêta et l’étude d’autres facteurs susceptibles d’influen cer la sécrétion d’insuline n’ont été rendues possibles que grâce à l’intro duction des méthodes d’incubation pancréatique. Le développement de ces méthodes a lui-même été dépendant de l’avènement au cours des dernières années de techniques fidèles pour le dosage de l’insuline (Vallance-Owen et Wright, 1960). Dès que de telles techniques per

mirent de détecter les faibles quantités d’insuline présentes dans le sang circulant (environ

1

m[i,g/ml), on s’est efforcé de mesurer les variations de l’insulinémie consécutives à l’administration de glucose ou d’autres substances. De telles investigations continuent à être largement prati quées. Leurs limitations sont cependant nombreuses. En premier lieu, les modifications que l’on peut imposer à la composition du sang artériel venant baigner les cellules bêta sont limitées dans leur nature, leur am pleur et leur durée. En second lieu, les variations enregistrées dans la concentration sanguine en insuline ne permettent pas de définir le débit de la sécrétion pancréatique d’insuline. Enfin, l’insulinémie, sauf si elle est directement mesurée au niveau de la veine pancréatique, peut être influencée par la diffusion de l’insuline dans les espaces liquidiens de l’organisme, par sa fixation à diverses structures, et par son inactivation au niveau de certains parenchymes (Williams et Ensinck, 1966). Ces critiques tombent lorsque le débit sécrétoire insulinique est mesuré in

vitro par incubation de fragments pancréatiques dans un milieu de com

position connue.

(16)

16

INTRODUCTION

turent le canal pancréatique et incubent les fragments pancréatiques lors que le tissu acineux est atrophié (Mialhe et Meyer, 1963). Enfin, un nombre restreint d’informations fut collecté par incubation d’ilôts de Langerhans isolés par une technique micro-chirurgicale (Keen, Sells et Jarrett, 1965).

En 1966, lorsque fut entrepris le présent travail, aucune de ces métho des ne semblait entièrement satisfaisante en raison de leur difficulté tech nique et aucune d’entre elles ne fournissait des résultats reproductibles. Le but du présent travail est de décrire une méthode originale (Malaisse, Malaisse-Lagae et Wright, 1967 a) de mesure de la sécrétion d’insuline

in vitro, et son application à l’étude de la régulation de la sécrétion insulini-

que. La méthode consiste à incuber des fragments de üssu pancréatique en présence de sérum anti-insulinique. Dans ces conditions, l’insuline sécré tée se He rapidement aux anticorps, avant que l’effet peptidasique exercé par le tissu acineux n’ait l’occasion de se manifester. La réducüon du pouvoir de liaison insuhnique des anticorps correspond à la quantité d’insuline sécrétée. Nous comparerons dans certains cas les résultats obtenus par cette méthode à ceux obtenus par incubation d’ilôts de Langerhans isolés par procédé enzymatique.

(17)

UNE NOUVELLE MÉTHODE DE MESURE

DE LA SÉCRÉTION PANCRÉATIQUE

(18)

TOUS avons rappelé dans l’introduction du présent travail les difficultés que rencontre la mesure de la sécrétion pancréatique d’insuline in vitro. La méthode que nous avons utilisée obvie à ces difficultés. Nous sou haitons l’exposer et en analyser la fidélité (Borth, 1952) dans ce premier

chapitre.

A. DESTRUCTION DE L’INSULINE PAR LE TISSU PANCRÉATIQUE

Matériel et méthodes

1. Rats.

Sauf mention spéciale, les expériences rapportées dans cette section et les sections suivantes sont réalisées sur des rats albinos (Holtzman, Wisconsin ; Wistar, Rega, Heverlee), de sexe mâle, et pesant de 200 à 300 g. Les rats ont libre accès à leur eau et nourriture (Wayne Lab Blox, Allied Mills Inc., Chicago ; Lab Chow, Ralston Purina Co., St Louis ; ou Aliments Protector, Bruxelles) jusqu’au moment du sacrifice.

2. Milieu d’incubation

Le milieu d’incubation est un tampon (pH 7,4) bicarbonaté (Na+139 ; K+5 ; Ca++2 ; Mg + +2 ; CE124 ; C

03

H

“24

mEq/1), enrichi en albu mine (0,5 à 1,0%, pds/vol ; Bovine Albumin, Fraction V ; Sigma Chemical Co., St Louis), et équilibré avec un mélange Ü

2

(

95

%) —COg (5%). Pour les expériences rapportées dans cette section, le milieu est additionné, selon les cas, d’insuline bovine, de sérum anti-insulinique, d’inhibiteur de la kallikréine et de différentes protéines marquées. L’in suline bovine (23,6 U/mg, Batch CB1978X ; Boots Pure Drug Co., England) est d’abord mise en solution (100 U/ml) dans de l’acide acétique dilué (0,3% glacial) et ensuite diluée en tampon albuminé (Wright et Malaisse, 1966 a). Le sérum anti-insuhnique est obtenu par immuni sation de cobayes à l’aide d’insuline bovine par la méthode de Wright

(19)

de liaison insulinique. Les lots utilisés (N° 270, 335 et 404) lient entre 1.5 et 2.5 unités d’insuline par ml de sérum. L’inhibiteur de la kallikréine (250 et 675 KlU/ml ; Trasylol, Bayer) est un don du Dr. R. Goesswald (FBA Medical Research, New York). En présence de cette drogue, la teneur en NaCl du milieu d’incubation est modifiée afin d’en maintenir l’iso-osmolarité. Les protéines marquées sont l’insuline-l bovine, le glucagon-L®i bovin et porcin, la somatotrophine-l^^® humaine, la serumalbumine-P^® humaine et la y-globuline de cobaye.

3. Incubation des fragments pancréatiques

Les rats sont décapités et saignés. Leur pancréas est immédiatement prélevé dans son entièreté et placé dans une boîte de Pétri contenant une solution tampon glacée (0 à 4'^C). La glande est libérée des ganglions lymphatiques et du tissu adipeux que l’on peut y identifier par transillu mination. Elle est ensuite coupée au rasoir en petits fragments (environ 80 fragments) pesant chacun de

8

à 12 mg. Les fragments sont délicate ment séchés sur papier filtre et, saut mention spéciale, placés par groupes de 4, pris au hasard, dans des fioles contenant le milieu d’incubation (2,0 ml). Les fioles sont placées dans un bain d’incubation (type Dubnofï), équilibrées pendant 5 minutes avec un mélange Oj (95%) — CO

2

(5%), et incubées à 36°C pour des périodes allant de 15 à 180 minutes. Après incubation, les fragments pancréatiques sont retirés des fioles. Leur poids humide est alors rapidement mesuré.

4. Estimation de la dénaturation des protéines

La dénaturation des protéines en cours d’incubation est généralement appréciée par précipitation à l’acide trichloracétique (

10

%, pds/vol). Dans le cas de l’insuline, on a également utilisé l’adsorption sur cellulose, les produits de dénaturation de l’insuline ayant perdu la propriété d’être adsorbés par une suspension de cellulose (Wright et Mai.aisse, 1966a).

Résultats

(20)

20

SÉCRÉTION D’INSULINE IN VITRO

Temps d'incubation (minutes)

Fie. I-l. La quantité de radioinsuline précipitée par l’acide trichloracétique ou adsorbée par la cellulose est exprimée en pour cent de la quantité initiale d’hormone. Le milieu d’incubation (20 ml) contient de l’insuline bovine ordinaire (26 mU) et radioactive (4 mU), et du tissu pancréatique (685 mg). Chaque point est la moyenne de 2 observations.

de 100 à pratiquement 0% des témoins. Incubée en l’absence de tissu pancréatique la fraction de radio-insuline précipitable par l’acide trichlor acétique ou adsorbée sur cellulose n’est pas sensiblement modifiée.

Incubés durant 90 minutes dans la solution tampon albuminée (

2,0

ml) contenant les protéines marquées, les fragments pancréatiques (environ 40 mg) ne détruisent pas la somatotrophine (0,2 mjjtg), l’albumi ne (20,0 mpg), la y-globuline (0,1 m|i.g), ou l’insuline (24,0 mjjtg) préala blement liée au sérum anti-insulinique (Tableau I-l). Par contre, le glucagon (0,1 mpig) est, comme l’insuline (24,0 mpg), partiellement détruit par le tissu pancréatique dans ces conditions d’incubation. Il convient de souligner que deux de ces radio-protéines (somatotrophine et albu mine humaine) sont incubées en l’absence de la protéine correspondante non marquée, mais que de l’albumine bovine (

1

,

0

%, pds/vol) est présente dans tous les milieux.

(21)

TABLEAU I-l

Effet protéolytique du tissu pancréatique

Protéine marquée (*) Radioactivité précipitée

Insuline-U^t bovine (1/10) 21,4 ± 1,4(8) Glucagon-I'^t bovin/porcin (2/10«) 47,8 ± 1,1 (8) Somatotrophine-U25 humaine _(1/0) 103,1 ± 0,4(9) Albumine-1'25 humaine (1/0) 99,2 ± 0,8(12) y-Globuline-U^â de cobaye

Sérum anti-insulinique (12 pi)

(1/105) 98,7 ± 0,7(8) + insuline-U^‘ bovine (1/10) 99,0 ± 1,2(8)

La valeur moyenne de matériel radioactif précipitable par l’acide trichloracétique apres 90 minutes d’incubation en présence de tissu pancréatique normal (environ 40 mg) est exprimée en % de la valeur témoin observée après incubation en l’absence de tissu. Le rapport (*) entre les concentrations des protéines homologues, radio actives et non marquées, et le nombre d’observations (entre parenthèses) sont indiqués dans chaque cas.

TEMPS D INCUBATION (Minutes)

(22)

22

SÉCRÉTION D'INSULINE IN VITRO

Commentaires

Ces résultats indiquent que l’insuline est rapidement détruite en cours d’incubation avec du tissu pancréatique. Dans nos conditions expérimen tales, 40 mg de tissu pancréatique sont capables de détruire en 90 minutes 5 mU d’insuline soit, comme nous le verrons ultérieurement, autant d’hormone qu’ils peuvent sécréter durant la même période en présence de concentrations maximales de glucose. La nature de la substance lytique n’est pas connue (Coore et R.^ndle, 1964a ; Bakker et Bouman, 1965), mais elle a les propriétés d’une peptidase. Elle détruit des poly peptides de petit poids moléculaire, tels l’insuline et le glucagon, mais ne semble pas agir sur les protéines de poids moléculaire plus élevé, telles l’albumine et la globuline. De même, elle semble inactive sur l’in suline préalablement liée aux anticorps du sérum anti-insulinique de cobaye. C’est cette propriété que nous avons exploitée pour la mesure de la sécrétion d’insuline in vitro.

L’inhibition partielle du phénomène lytique par l’inhibiteur de la kallikréine nous a permis, par ailleurs, d’étudier les effets sur la sécrétion d’insuline de certaines hormones polypeptidiques, telles le glucagon. En l’absence d’inhibiteur de la kallikréine, ces hormones seraient trop rapidement détruites et ne pourraient extérioriser leurs effets sur la sécré tion d’insuline.

B. EFFETS DU TISSU PANCRÉATIQUE

SUR L’INSULINE ET LE SÉRUM ANTI-INSULINIQUE

Nous rapportons ici les expériences démontrant que le sérum anti- insulinique protège l’insuline exogène contre l’effet peptidasique du tissu pancréatique.

(23)

sérum anti-insulinique est ajouté avant ou pendant l’incubation, une aliquote du milieu (

1,0

ml) est prélevée en fin d’incubation pour dosage des anticorps. Sinon, l’antisérum(0,5 ml ; 0,25%, vol/vol) est ajouté en fin d’incubation à une aliquote (0,5 ml) du milieu. Le dosage des anticorps n’est alors réalisé qu’après réaction entre milieu d’incubation et antisérum pendant 30 minutes à température ambiante. Les anticorps sont dosés par la technique de Wright et Malaisse (1966 a) que nous exposerons à la section suivante.

TABLEAU 1-2

Effets du tissu pancréatique et de l’insuline sur le pouvoir de liaison insulinique de l’antisérum Ligne n« Période d’incubation Pouvoir de liaison insulinique Tissu

pancréatique Insuline Antisérum

1 Néant Néant 0-90 10,0 ± 0,1 (2) 2 Néant Néant 4.5-90 9,9 ± 0,1 (4) 3 Néant Néant 90 10,0 ± 0,1 (2) 4 0-90 Néant 90 9,9 ± 0,1 (4) 5 0-45 Néant 45-90 10,0 ± 0,1 (8) 6 0-90 Néant 0-90 9,5 ± 0,3(4) 7 Néant 45-90 90 4,3 ± 0,1 (4) 8 Néant 45-90 0-90 4,1 ± 0,1 (4) 9 0-90 45-90 90 9,8 ± 0,3(10) 10 0-45 45-90 90 9,2 ± 0,2(8) 11 0-90 45-90 0-90 4,4 ± 0,2(10)

(24)

24

Résultats

En l’absence d’insuline et de tissu pancréatique, l’incubation d’anti sérum à 36° C pendant 90 minutes ne modifie pas son pouvoir de liaison insulinique. Celui-ci est le même que l’antisérum soit ajouté avant, pen dant ou après l’incubation (Tableau 1-2, lignes 1, 2, 3). L’antisérum con serve également son pouvoir de liaison insulinique lorsqu’il est ajouté à un milieu ayant contenu du tissu pancréatique (Tableau 1-2, lignes 4 et 5) ou lorsqu’il est incubé en présence de tissu pancréatique (Tableau 1-2, ligne

6

). Dans cette dernière condition, toute réduction du pouvoir de liaison pourrait d’ailleurs être attribuée, comme nous le verrons ulté rieurement, à la sécrétion de petites quantités d’insuline endogène. Ces expériences indiquent que l’effet peptidasique du tissu pancréatique ne modifie pas la réactivité immunologique des anticorps.

Par contre, l’adjonction d’insuline, en l’absence de tissu pancréati que, provoque une nette réduction du pouvoir de liaison insulinique des anticorps. Cette réduction est la même que l’antisérum soit ajouté avant ou après l’insuline (Tableau 1-2, lignes 7 et

8

). Une telle réduction ne s’observe pas lorsque l’insuline est incubée en présence de tissu pancréa tique avant l’addition d’antisérum (Tableau 1-2, ligne 9). Au contact du tissu pancréatique, l’insuline exogène perd donc son pouvoir de neutra lisation des anticorps. L’insuline est également détruite lorsqu’elle est ajoutée à un milieu d’incubation ayant préalablement contenu du tissu pancréatique (Tableau 1-2, ligne 10). Le pancréas libère donc dans le milieu d’incubation une substance peptidasique dont l’effet reste démon trable après que les fragments pancréatiques aient été retirés du milieu. Cependant lorsque l’antisérum et le tissu pancréatique sont simultané ment présents dès le début de l’incubation, l’addition d’insuline exogène provoque une réduction du pouvoir de liaison insulinique comparable à celle observée dans les mêmes conditions en l’absence de tissu pancréa tique (Tableau 1-2, ligne 11). Cette dernière expérience indique que la substance lytique agit trop lentement pour empêcher la liaison de l’insu line exogène avec les anticorps.

Commentaires

(25)

ments pancréatiques soient retirés de ce milieu. Quelle que soit sa nature, cette substance ne modifie pas l’aptitude de l’antisérum à lier l’insuline. De plus, son action est trop lente pour altérer la liaison de l’insuline exogène et des anticorps. Ces observations suggèrent que la réduction du pouvoir de liaison insulinique des anticorps pourrait servir à l’esti mation de la quantité d’insuline ajoutée ou sécrétée dans un milieu d’incubation.

C. DOSACxE DES ANTICORPS

I.IBRES OU PARTIELLEMENT NEUTRALISÉS

Nous venons de suggérer que l’estimation du pouvoir de liaison insulinique des anticorps pourrait servir de base à une méthode de mesure de la sécrétion d’insuline in vitre. La section présente est destinée à décrire la technique utilisée pour mesurer le pouvoir de liaison insulinique des anticorps. Cette technique a été décrite en détail dans des publications antérieures (Wright et Malaisse, 1966a ; Malaisse et Wright, 1966a ; Wright, Malaisse et Reynolds, 1967). Elle repose sur les observations suivantes. Lorsqu’ils sont mis en présence d’un excès d’insuline et de radio-insuline, les anticorps lient rapidement l’hormone au pro rata de leur concentration. L’excès d’insuline non lié aux anticorps peut être extrait de solution par adsorption sur cellulose. La quantité d’insuline et de radio-insuline qui demeure en solution est alors directement fonc tion de la quantité d’anticorps initialement présente dans l’échantillon.

1. Dosage des anticorps libres

(26)

26

Macherey, Nagel et Company, Düren) en tampon phosphate. Après une deuxième période de 30 minutes à température ambiante, la cellulose est déposée par centrifugation, et une aliquote (

1,0

ml) du surnageant exa minée pour son contenu en radioactivité (Cg). Celle-ci est comparée à la radioactivité retrouvée dans les surnageants de

2

tubes témoins qui con tiennent respectivement (i) un excès de sérum anti-insulinique tel que l’entièreté de la radioactivité (C,,,^,;) se lie aux anticorps et reste en solu tion après traitement par la cellulose ; et (ii) le même volume de réactifs mais en l’absence complète d’antisérum, la radioactivité retrouvée dans le surnageant de ce dernier tube (Cbi) correspondant à de la radio-insu line dénaturée et, de ce fait, non adsorbée par la cellulose. Le pouvoir de liaison insulinique de l’échantillon est calculé selon la formule suivante:

,■ Cs — Cbi ,

insuline liee = -^:=;---X J ns

C„ Cbi

formule dans laquelle Ins représente la quantité totale d’insuline ordinaire et marquée ajoutée à l’échantillon.

2. Dosage des anticorps partiellement neutralisés

Afin de reproduire les conditions propres à l’incubation du tissu pancréatique, des volumes constants d’antisérum dilué dans le tampon phosphate albuminé sont d’abord mis en présence pour 60 minutes à 36° C de quantités croissantes d’insuline de rat (Lot n° R564 ; 19,5 ±2,0 U/mg ; don du Dr. Schlichtkrull, Novo Research Institute, Copenhagen). Les anticorps partiellement neutralisés sont ensuite dosés selon la technique décrite au paragraphe précédent.

Résultats

La figure 1-3 illustre la relation linéaire existant entre la quantité d’insuline liée et les volumes croissants de sérum anti-insulinique. On remarque que la proportionnalité directe disparaît pour des volumes d’an tisérum liant plus de 70% de la quantité totale d’insuline présente.

(27)

d’antisé-Fig. 1-3.

Les volumes croissants de sérum anti- insulinique (0 à 100 jrl ; lot n° 270)

sont mis pendant 30 minutes en présence d’un mélange d’insuline bovine ordi naire (100 mU) et marquée (0,1 mU). La quantité d’insuline liée est calculée d’après la radioactivité restant en solu tion après adjonction de cellulose (voir texte). Chaque point est la moyenne de 5 observations.

Fig. 1-4.

Pouvoir de liaison insulinique (mU d’in suline bovine) d’une quantité constante de sérum anti-insulinique (1,35 p.1 ; lot n° 270) préincubée (60 minutes, 36° C) en présence de quantités croissantes d’insuline de rat (0 à 1,2 mU). La droite théorique de neutralisation est repré sentée en trait interrompu. Chaque point est la moyenne de 2 observations.

rum non neutralisé. On constate également (fig. 1-4) que, dans les con ditions expérimentales utilisées, la droite définissant la chute du pouvoir de liaison insulinique est voisine de la droite théorique.

Commentaires

(28)

28

d’antisérum. Cette difficulté est particulièrement évidente lorsqu’on s’adresse à une espèce animale nouvelle dont la capacité insuLino-sécré- toire n’est pas aisément prévisible. La méthode a cependant été appliquée avec succès au rat, à la souris, au hamster, à la gerboise, au lapin, au chien et à l’homme (observations inédites). A cet égard, notons que, dans les conditions expérimentales que nous venons de définir, la réaction entre les anticorps et l’insuline utilisée pour la préneutralisation partielle ne montre pas de spécificité d’espèce, du moins pour les diverses insulines mammifères (Wright, Malaisse et Reynolds, 1967).

D. MESURE DE LA SÉCRÉTION D’INSULINÉ ENDOGÈNÉ

Les résultats acquis jusqu’à présent suggèrent que toute réduction du pouvoir de liaison insulinique d’un antisérum incubé en présence de tissu pancréatique est attribuable à un processus de neutralisation. Cette neutralisation a été démontrée précédemment (Chapitre I, section B), pour l’insuline exogène ajoutée au milieu. Nous la démontrons ici pour l’insuline endogène sécrétée par les fragments pancréatiques.

(29)

Résultats

La figure 1-5 montre qu’en présence d’une concentration glucidique élevée (300 mg/100 ml), l’incubation de tissu pancréatique pendant 90 minutes détermine une nette réduction du pouvoir de liaison insulinique de l’antisérum présent dans le milieu d’incubation (104

±8

gU d’insuline/mg de tissu/90 minutes). Une telle réduction ne s’observe pas (3 ±5 [i,U/mg/90 min) si l’anüsérum est ajouté au milieu après la période d’incu bation.

En l’absence de glucose, le contenu en insuline des fragments pan créatiques est le même avant et après incubation (différence par paires = —0,01 +0,03U/g). Par contre,en présence deglucose(500mg/100 ml), on enregistre une réduction significative du contenu (Tableau 1-3). La quantité d’insuline sécrétée par les cellules bêta sous l’influence du glucose est la même (P<0,5) qu’on l’estime par l’appauvrissement des réserves tissulaires (0,10 T 0,03 U/g) ou par l’enrichissement du milieu d’incuba tion (0,08 ±0,01 U/g). INCUBATION GLUCOSE 00<f\ o\ Aïs DOSAGE

y

aïs neutralisé Fig. 1-5.

(30)

30

SÉCRÉTION DTNSUUNE IN VITRO

TABLEAU 1-3

Débit et contenu insuliniques des fragments pancréatiques

Insuline (U/g) Concentration glucidique (mg/100 ml) Différences par paires 0 500

Sécrétée durant

incuba-tion (90 min.) 0,01 ± 0,01 (12) 0,09 ± 0,01 (12) 0,08 ± 0,01 Extraite après

incuba-tion 1,89 ± 0,14(12) 1,79 ± 0,14(12) 0,10 ± 0,03

Chaque résultat individuel se rapporte à un animal. Les valeurs moyennes sont suivies des écarts-types de la moyenne.

Commentaires

Les données illustrées à la figure 1-5 indiquent que l’antisérum protège l’insuline sécrétée contre les effets lytiques du tissu pancréatique. Dans toutes les expériences ultérieures, des quantités connues d’antisérum se ront donc ajoutées au milieu avant l’incubation. Dans ces conditions, toute réduction dans le pouvoir de liaison insulinique de l’antisérum est attribuée à la sécrétion d’insuline par les fragments pancréatiques.

La destruction rapide de l’insuline sécrétée que l’on note en l’absence d’antisérum a également été observée par Mialhe et Meyer (1963),

Bakker et Bouman (1965), et Telib, Ammon, Melani, Ditschuneit

et Pfeiffer (1965). Aucun de ces auteurs ne fut capable de déceler une

sécrétion d’insuline par le tissu pancréatique de rats normaux. Le tissu pancréatique d’autres espèces peut cependant exercer un effet lytique moins net. Par exemple, celui du lapin (300 mg) ne détruit en 30 minutes d’incubation qu’un tiers de l’insuline exogène (2,5 mU), et la sécrétion d’insuline endogène peut être mesurée par des méthodes classiques au cours de cette courte période (Coore et Randle, 1964 a). Dans le cas du rat

(31)

Reich et Creutzfeldt (1965) selon lequel le phénomène de lyse insulinique est minime et le tissu pancréatique normal est capable de sécréter l’insuline à un débit atteignant 230 pU/mg/OO minutes. Il convient cepen dant de noter que ces auteurs ont utilisé une méthode biologique, donc peu spécifique, pour la mesure du contenu insulinique de leurs milieux.

Même en présence d’anticorps dans le milieu d’incubation, on pour rait imaginer qu’une fraction de l’insuline sécrétée par les ilôts soit dé truite durant son passage au travers du tissu acineux et avant qu’elle ne se lie aux anticorps. Les données du tableau 1-3 suggèrent que ce phénomène, s’il existe, ne joue qu’un rôle mineur.

E. CONDITIONS EXPÉRIMENTALES ET SÉCRÉTION D’INSULINE

On envisagera dans la section présente les variations de la sécrétion insulinique in vitro en fonction du poids du tissu incubé et de la durée d’incubation.

Résultats

Lorsque de petits fragments (environ

8

mg chacun) de tissu pancréa tique sont incubés en nombre croissant (4,

8

et 20 fragments par fiole) en présence de glucose (150 mg/100 ml), la quantité d’insuline sécrétée durant 90 minutes d’incubation augmente en proportion directe du poids total de tissu incubé (fig. 1-6). Si par contre l’augmentation de poids est réalisée en augmentant la taille de chacune des pièces, le débit sécrétoire n’est proportionnel au poids du fragment incubé que pour les pièces pesant moins de

100

mg ; au delà de cette valeur, la quantité d’insuline sécrétée est constante et indépendante du poids du üssu pancréatique.

(32)

32

Fig. I -6.

Débit d’insuline (mU/90 min.) par (i) des fragments pancréatiques uniques de taille croissante (rectangles ombrés), ou (ii) par de petits fragments pancréatiques (envi ron 8 mg chacun) incubés en nombre croissant (rectangles clairs). Le mi lieu d’incubation contient du glucose (150 mg/100 ml). Chaque rectangle cor respond à 9 observations et représente les valeurs moyennes ( ± écart-type de la moyenne) pour le débit insulinique (en ordonnées) et le poids total de tissu pan créatique (en abscisses).

(33)

Commentaires

Ces résultats indiquent que l’emploi de petits fragments permet d’ex plorer la fonction insulaire dans des conditions métaboliques favorables, tandis que l’incubation de fragments plus grands entraîne une réduction apparente de la riposte insuünique probablement due à une diffusion insuffisante de l’oxygène et des métabolites vers les ilôts et de l’insuline sécrétée vers le milieu (Frerichs, Reich et Creutzfeldt, 1965). Cette

réduction apparente de l’activité métabolique en présence de fragments tissulaires de grande taille s’observe d’ailleurs in vitro avec d’autres tissus (Moyson, 1956 ; Malaisse et Franckson, 1965). Dans toutes les expé riences ultérieures, quatre fragments pancréatiques

(8

à

12

mg chacun) sont incubés dans chaque fiole, et les débits insuliniques sont exprimés par mg de tissu incubé.

De même, pour explorer la fonction insulaire dans des conditions satisfaisantes de viabilité, la durée d’incubation ne dépassera jamais

120

minutes. L’absence de sécrétion décelable durant les 15 premières minutes d’incubation peut paraître inconciliable avec les observations montrant une élévation rapide de l’insulinémie après administration intraveineuse de glucose chez l’homme (Cahill, FIerrera, Morgan, Soeldner, Steinke, Levy, Reichard et Kipnis, 1966) et le rat (Rasio, Soeldner

et Cahill, 1965). Nous pensons cependant pouvoir l’expliquer à la

lumière des expériences de Grodsky (Grodsky et Bennett, 1968 ;

(34)

34

ces explorent un phénomène de sécrétion soutenu se développant sur des périodes de 60 à

120

minutes, contrairement à la majorité des expé riences in vivo qui n’envisagent que la riposte immédiate aux stimuli injectés dans le torrent circulatoire. Comme le suggèrent les observa tions de Grodsky, à cette différence méthodologique pourrait corres pondre une différence biologique concernant les processus intimes de sécrétion insuhnique. Ainsi, un délai de 15 minutes, tel qu’il est observé dans nos conditions expérimentales, correspond au temps nécessaire pour la migration des granules d’insuline vers la périphérie des cellules bêta et leur passage au travers des membranes les séparant du milieu interstitiel au cours du processus d’émiocytose décrit par Lacy (1961).

F. SPÉCIFICITÉ DÉ LA MÉTHODÉ

La spécificité de la méthode de mesure de la sécrétion insuhnique

in vitro est examinée sous deux angles. Il s’agit d’abord de s’assurer que la

neutrahsation des anticorps ne s’observe pas en incubant d’autres tissus que le pancréas ou en présence de tissu pancréatique dont les cellules bêta ont été préalablement détruites. Par ailleurs, il convient de vérifier si les ilôts de Langerhans ne sécrètent pas dans le milieu un matériel qui aurait l’effet métabolique de l’insuline mais ne réagirait pas avec les anti corps. Un tel matériel a en effet été identifié dans le sérum de l’homme (Froesch, Burgi, Ramseier, Bally et Labhart, 1963), du chien (Samaan, Fraser et Dempster, 1963), et du rat (Rasio et Conard, 1968).

Ce matériel est habituellement qualifié, selon la terminologie anglaise, de « non suppressible insuhn-like acüvity ». Sa nature exacte demeure l’objet de controverses.

1. Rats alloxanisés

(35)

2. Ilôts isolés

Pour isoler des ilôts de Langerhans « intacts », nous avons utilisé la technique décrite par Lacy et Kostianovsky (1967). Elle consiste,

chez le rat anesthésié, à injecter sous pression

8,0

ml de solution de Hanks au travers d’un fin cathéter introduit dans le canal biliaire dont l’extrémité distale est préalablement clampée. La solution injectée reflue dans les canaux pancréatiques et provoque un oedème interstitiel. Le tissu pancréatique est ensuite prélevé, fragmenté aux ciseaux, et incubé durant 18 à 25 minutes à 36'’C dans une solution de Hanks (5,0 ml) enrichie en collagénase (60 mg par 2,5 g de tissu pancréadque oedématié ; Worthington Biochemical Co., Freehold, N.J.). Les ilôts sont concentrés par sédimentations répétées et spontanées, le surnageant contenant les fragments de tissu acineux étant chaque fois rejeté. Les ilôts sont ensuite collectés individuellement, sous contrôle du microscope à dissection, à l’aide d’une anse en verre filé, et distribués dans des fioles contenant le milieu d’incubation. Après incubation, une aliquote du milieu est aspirée à la pipette Pasteur, sous contrôle microscopique afin d’éviter le prélève ment d’ilôts.

3. Mesure de P effet biologique de P insuline sécrétée par les ilôts

Cent ilôts de Langerhans, isolés selon la technique que nous venons de décrire, sont incubés pendant 90 minutes dans un milieu (2,5 ml) enrichi en glucose (300 mg/100 ml). Après incubation, 2 aliquotes (1,0 ml) de ce milieu, — à l’une desquelles est ajouté un excès de sérum anti-insulinique (0,1 ml ; lot 270, pouvoir neutralisant = 1,5 U d’insuline/ml) —, sont diluées dans un milieu tampon bicarbonaté (19,0 ml) contenant du glucose

(200

mg

/100

ml), distribuées dans des fioles (

2,0

ml par fiole), et ensuite incubées pendant 150 minutes avec des fragments de graisse épididymaire de rat. Un milieu témoin qui avait été initiahement incubé en l’absence d’ilôts est traité de manière identique. L’effet insulinique de ces différents milieux est estimé en mesurant la captation de glucose par le tissu adipeux, selon la technique décrite par Bellens (1961).

Résultats

(36)

36

TABLEAU 1-4

Incubation de fragments pancréatiques et d’autres tissus

Tissu incubé Débit insulinique ([xU/mg/90 min.)

Pancréas normal 79,4 ± 10,5(9) Pancréas de rats alloxanisés 1,6 ± 3,2 (9) Diaphragme — 2,5 ±1,0 (4) Graisse épididymaire — 0,2 ± 0,3 (4)

Foie — 5,5 ± 0,7 (4)

Rein — 2,3 ± 0,9 (3)

Thymus 0,8 ± 0,4 (6)

Concentration glucidique du milieu d’incubation = 200 mg/100 ml.

Valeurs moyennes (± écarts-types de la moyenne) et nombre d’observations (entre parenthèses).

Par ailleurs, les résultats illustrés à la figure 1-8 indiquent que l’insuline préalablement sécrétée par les ilôts de Langerhans provoque un net ac croissement de la captation glucidique par la graisse épididymaire. Cet effet insulinique ne s’observe plus en présence d’antisérum. Il n’y a pas de différence significative entre les captations glucidiques enregistrées dans le milieu témoin ne contenant pas d’insuline et le milieu contenant à la fois l’insuline sécrétée et un excès d’antisérum.

TÉMOINS Insuline antisérum SÉCRÉTÉE ImsÛlInE SÉCRÉTÉE

Fig. 1-8.

(37)

Commentaires

Ces résultats établissent clairement la spécificité de la méthode de mesure de la sécrétion insulinique in vitro. Par ailleurs, ils confirment de manière directe la notion que l’insuline est sécrétée par les cellules bêta sous un forme « typique », c’est à dire dont l’effet biologique est entière ment supprimé par un excès de sérum anti-insulinique (Samaan, Fraser

et Dempster, 1963). La réduction du pouvoir de liaison insulinique de

l’antisérum correspond donc bien à la quantité, et toute la quantité, d’in suline sécrétée.

G. REPRODUCTIBILITÉ DE LA MÉTHODE

L’étude de la reproductibilité de la méthode permet de prévoir la précision des résultats en fonction du nombre de déterminations indivi duelles.

Résultats

Sur une période de 5 mois, 107 mesures de la sécrétion d’insuline sont effectuées dans des fioles individuelles contenant du tissu pancréa tique normal incubé pendant 90 minutes en présence de la même concen tration de glucose (150 mg/100 ml). Les valeurs individuelles se distribu ent symétriquement autour d’une valeur moyenne de 47,2 [xU/mg/90 minutes (fig. 1-9). L’écart quadratique moyen (15,7 (i.U/mg/90 min.) correspond à un coefficient de variation de 33%.

n= 107

m = 47.2 /â = 15.7 C.V. = 33 %

Fig. 1-9.

(38)

38

Commentaires

Ces résultats suggèrent qu’une valeur moyenne obtenue au départ de

10

observations individuelles comportera probablement une écart-type de la moyenne d’environ 10% de cette valeur (33%/^fô)' Compte tenu de cette constatation, au moins 9 déterminations individuelles sont réali sées pour chaque condition expérimentale.

H. SÉCRÉTION D’INSULINE PAR DES

FRAGMENTS PANCRÉATIQUES ET DES ILOTS ISOLÉS

A cause de l’effet lytique exercé par le tissu pancréatique, la sécrétion d’insuline par ce tissu n’est détectable qu’en présence d’antisérum. Par contre, les ilôts isolés n’exercent pas d’effet lytique sur l’insuline. La figure I-IO, empruntée à une publication antérieure (Malaisse, M.a.laisse- Lagae, Lacy et Wright, 1967), illustre cette absence d’effet lytique des

(MINUTES (

TEMPS DINCUBATiON

(39)

ilôts (10 ilôts/ml) incubés en présence d’insuline bovine ordinaire (0,54 mU/ml) et marquée (0,06 mU/ml). Par contre, les fragments de tissu acineux ou les milieux ayant contenu de tels fragments au cours d’une préincubation de 45 minutes détruisent rapidement l’insuüne exogène. Il est donc possible de mesurer la sécrétion d’insuline par les ilôts isolés incubés en l’absence d’antisérum. Les résultats obtenus par les deux méthodes sont ici confrontés.

1. Mesure de la sécrétion et du contenu insuliniques des ilôts isolés

La technique d’isolement et d’incubation des ilôts a été exposée antérieurement (Chapitre I, section F). Les milieux d’incubation ne contenant pas d’antisérum, ce dernier est ajouté au milieu à l’issue de l’incubation. Après réaction durant 30 minutes à 36° C, la teneur en anti corps résiduels est mesurée selon la technique décrite au Chapitre I, section C. La méthode de mesure du contenu insulinique des ilôts est une adaptation (Malaisse, Malaisse-Lagae, Mayhew et Wright, 1967) de

celle décrite précédemment pour la mesure du contenu insulinique des fragments pancréatiques (Chapitre I, section D).

2. Nombre et taille des ilôts

Afin de comparer les contenus et débits insuliniques des fragments pancréatiques et ilôts isolés, il convient de connaître la taille et le nombre moyens des ilôts par mg de tissu pancréatique. De nombreuses études ont été publiées sur ce sujet (Hellman, 1959a et b). Nous avons cependant procédé à une nouvelle estimation car, dans la méthode d’isolement des ilôts, seuls de « gros » ilôts présentant un diamètre de plus de

200

p. sont habituellement collectés. Trois méthodes sont utilisées pour estimer le nombre et la taille de ces « gros » ilôts, (i) La technique de Lacy et

Kostianovsky (1967) d’isolement des ilôts comporte l’injection de la

(40)

40

SÉCRÉTION D'INSU UNE IN VITRO

lame et lamelle. On compte un nombre moyen de 174 d: 9 (n = 20) ilôts de toutes tailles par 100 mg de tissu pancréatique. Cependant, lorsque seuls les « gros » ilôts présentant un diamètre de plus de

200

jr sont identifiés, on en dénombre en moyenne 36 ±2 par 100 mg de tissu pan créatique. Cette valeur est proche de celle trouvée par la première métho de. Les « gros » ilôts représentent 21 ± 1 % de l’ensemble de la population d’ilôts, (iii) Dans des coupes histologiques de tissu pancréatique fixé au Bouin et coloré à l’hématoxyline-éosine, les diamètres des ilôts sont estimés à l’aide d’une grille graduée montée dans l’oculaire du micro scope. On multiplie les valeurs observées par 1,155 (= 1/cos 30“), admet tant que les coupes représentent des sections parallèles équiprobables au travers d’ilôts sphériques. Les « gros » ilôts ayant un diamètre de 200p. représentent à nouveau

21

% de l’ensemble de la population d’ilôts. Ils ont un diamètre moyen de 248 fi lOp, tandis que la valeur moyenne pour l’ensemble de la population d’ilôts s’élève à 151 ±7 p. Tenant compte du rapport entre ces diamètres moyens (151 p/248 p = 0,61), le rapport entre les volumes moyens vaut 0,23 (= 0,6P). Etant donné qu’il y a en moyenne 1,74 ilôt par mg de tissu, les données concernant le contenu et le débit insuliniques des « gros » ilôts peuvent être expri mées par mg de tissu pancréatique en utilisant un facteur de conversion de 0,23 X 1,74 = 0,40.

Résultats

Au tableau 1-5 figurent les débits insuliniques moyens observés à 3 concentrations glucidiques (30, 150 et 300 mg/100 ml) dans des ilôts isolés et des fragments pancréatiques, ainsi que les contenus insuliniques moyens des ces deux types de préparation. De plus, le tableau indique les données calculées par conversion des résultats obtenus sur ilôts à l’aide du facteur de correction (0,40) précédemment établi (voir Matériel et méthodes). La similitude des résultats obtenus par les deux méthodes est très satisfaisante.

Commentaires

(41)

pan-TABLEAU 1-5

Débit et contenu insuliniques des ilôts isolés et des fragments

Tissu incubé

Unité de référence

Ilôts isolés Fragments

/mg

/ilôt /ilôt X 0,4 = /mg

Débit ([j.U/60 min.)

Conc. f 30 mg/100 ml 19 ± 2 (25) 8 ± 1 9 ± 1 (18) 1 150 mg/100 ml 70 ± 3 (27) 28 ± 1 28 ± 1 (120) gluc. [ 300 mg/100 ml 157 ± 9 (33) 63 ± 4 56 ± 2 (136) Contenu (mU) 4,2 ±0,3(6) 1,7 ± 0,2 1,9 ±0,1(18) Débit/contenu (%) Conc. gluc. 300 mg/100 ml 4 ± 1 3 ± 1

Valeurs moyennes (± écarts-types de la moyenne) et nombre d’observations (entre parenthèses).

créatiques ne semble donc détruite en présence de sérum anti-insulinique. De plus, ces résultats suggèrent que la présence d’antisérum dans le milieu d’incubation n’a pas d’effet propre sur le processus de sécréüon. Cette hypothèse sera confirmée ultérieurement (Chapitre III, section G).

J. SÉCRÉTION D’INSULINE

ET CONTENU EN INSULINE DU TISSU PANCRÉATIQUE

(42)

42

Résultats

Il existe une corrélation significative (P <0,01 ) entre le débit d’insuline ([xU/mg/90 min.) provoqué par le glucose (150 mg/100 ml) in vitro et le contenu en insuline (mlJ/mg) des pancréas prélevés chez 33 rats normaux de même sexe (mâle), race (Holtzman, Wisconsin), et âge (poids corporel : 200 à 300 g). Ce fait est illustré à la figure I-ll où les débits et contenus insuliniques sont exprimés en pour cent de leurs valeurs moyennes res pectives. La pente de la droite de régression n’est pas significadvement différente de celle d’une droite théorique basée sur l’hypothèse d’une relation de proportionnalité directe entre ces deux paramètres.

Par ailleurs, le débit d’insuline provoqué par le glucose (200 mg/ 100 ml) dans des fragments pancréatiques (64 ± 4 [i.U/mg/90 min ; n = 9) n’est pas significativement modifié en présence de puromycine

20

p.g/ml (59

±6

jxU/mg/90 min.) ou de d-actinomycine 2 pg/ml (64 ±5 [xU/mg/ 90 min).

Commentaires

Même en présence de concentrations glucidiques élevées, la quantité d’insuline sécrétée au cours d’une incubation de 90 minutes ne dépasse pas 5 % du contenu insulinique du tissu pancréatique. Cette observation suggère que, durant les courtes périodes d’incubation utilisées dans nos expériences, la sécrétion d’insuline pourrait se produire indépendamment

r =0,744

CONTENU iNSULiNiquE ( V. )

Fig. I-ll.

(43)

de toute synthèse de novo d’hormone. Cette hypothèse est corroborée par le fait que la sécrétion d’insuline provoquée par le glucose n’est pas modi fiée par les agents anti-métaboliques, tels que la puromycine et la d-actinomycine.

(44)

(45)

(46)

attribue classiquement au glucose le rôle de stimulateur de la sécrétion d’insuline. Nous souhaitons envisager dans ce deuxième chapitre le mode d’action du glucose, et rechercher si d’autres métabo lites ne partagent pas la propriété de stimuler la sécrétion d’insuline.

A. EFFETS DU GLUCOSE ET D’AUTRES SUCRES

Résultats

Comme l’illustre la figure II-l, le débit d’insuline est minime aux concentrations glucidiques égale ou inférieures à

100

mg

/100

ml.

11

ne peut être décelé qu’en utilisant de faibles quantités d’antisérum (

0,8

pl/

(47)

2,0 ml de milieu). Le débit augmente rapidement lorsque la concentration glucidique s’élève de 100 à 300 mg/100 ml. Le débit maximal (environ 125 [xU/mg/90 min.) est observé aux concentrations glucidiques de 500 à 750 mg/100 ml. Il est 10 fois supérieur au débit basal observé en l’ab sence de glucose.

Le seul autre sucre qui a un effet décelable sur la sécrétion d’insuline est le mannose (Tableau II-l). Le fructose, le galactose, le ribose, le xylose, l’arabinose et le

2

-désoxyglucose n’ont pas d’effet stimulateur. L’effet du mannose est inférieur à celui du glucose quelle que soit la concentration utilisée (fig. II-2).

Commentaires

En l’absence de glucose, une quantité minime d’insuline est libérée dans le milieu d’incubation. Ce débit basal semble correspondre davantage à un processus actif de sécrétion qu’à une diffusion passive d’hormone. Il est en effet inhibé par des poisons cellulaires (Malaisse, Malaisse-Lagae

et Coleman, 1968 a) ou des inhibiteurs du métabolisme glucidique (SussMAN, communication personnelle). Une nette augmentation du

TABLEAU II-l

Effets de différents sucres sur la sécrétion d’insuline

Milieu d’incubation Débit insulinique (p.U/mg/90 min.) Glucose (300 mg/100 ml) 89,3 ± 4,9(18) Glucose (30 mg/100 ml) 16,2 ± 2,6(18) Mannose 66,2 ± 8,2(9) Fructose 10,8 ± 2,5(9) Galactose 10,2 ± 3,0(9) Ribose 10,7 ± 3,8(9) Xylose 5,9 ± 3,1 (9) Arabinose 12,7 ± 3,8(9) 2-Déoxyglucose 8,1 ± 1,5(9)

(48)

48

Fig. II-2.

Débit insulinique ([xU/mg/90 min.) en présence de glucose (cercles noirs et trait continu) et de mannose (cercles clairs et trait interrompu). Chaque point représente la valeur moyenne ( ± écart- type de la moyenne) de 9 à 18 obser vations.

débit ne s’observe que pour des concentrations glucidiques supérieures à 100 mg/100 ml. Le débit maximal est atteint entre 300 et 500 mg/100 ml. Les facteurs qui conditionnent le seuil d’action et l’effet maximal du glucose ne sont pas connus.

D’après diverses études (Grodsky, Bennett, Vcella,

McWilliams et Smith, 1963 ; Sussman, Vaughan et Timmer, 1966 ; Malaisse, Malaisse-Lagae et Wright, 1967 a), le glucose et le mannose sont les seuls sucres qui stimulent la sécréüon d’insuline. Un faible effet peut également être observé avec le fructose. Montague, Howell et Taylor (1967) ont cependant observé une nette stimulation de la sécrétion insulinique par le ribose.

B. LE PASSAGE MEMBRANAIRE ET LA PHOSPHORYLATION DU GLUCOSE DANS LES CELLULES BÊTA

Nous avons étudié dans la présente section le rôle du passage trans- membranaire et de la phosphorylation du glucose dans le processus de sécrétion insulinique.

Matériel

(49)

sirop extrait d’avocats par la méthode de Richtmeyer (1962). Ce sirop ne contient pas de glucose (glucose-oxydase) mais des substances réduc trices, considérées comme mannoheptulose, à raison de 0,8 g/ml. Le sirop est ajouté au milieu d’incubation à des concentrations de 0,50, 0,33 et 0,10% (vol/vol). En présence de concentrations élevées des dif férents sucres, l’iso-osmolarité du milieu est maintenue en réduisant la concentration de NaCl.

Résultats

La sécrétion d’insuline provoquée par le glucose (200 mg/100 ml) n’est pas modifiée par addition de phloridzine ou de 3-0-méthylglucose au milieu d’incubation (Tableau II-2). Elle est inhibée en présence de glucosamine et de mannoheptulose. La sécrétion d’insuline (80,6 ±7,3 ;xU/ mg/90 min., n = 14) provoquée par le mannose (500 mg/100 ml) est également inhibée (18,9 ±2,1 ji,U/mg/90 min., n = 14) en présence de mannoheptulose (26,0 mM).

TABLEAU II-2

Effets de la phloridzine, du 3-0-méthylglucose, de la d-glucosamine et du mannoheptulose

Drogue mM Débit insulinique (gU/mg/90 min.) (i) 60,6 t3,l (29) (ii) Phloridzine 5,0 — 3,9 ± 9,7 (11) 3-0-méthylglucose 10,3 — 8,3 4; 11,1 (10) 3-0-méthylglucose 41,0 — 6,6 i 4,0 (9) D-glucosamine 18,6 — 44,6 ± 8,4» (11) Mannoheptulose 19,5 — 60,2 d=3,6»(ll)

(i) Débit insulinique moyen (± écart-type de la moyenne) en présence de glucose seul (200 mg/100 ml).

(50)

50

Afin d’étudier la réversibilité de l’effet inhibiteur du mannoheptulose, les fragments pancréatiques sont incubés pour des périodes successives en présence ou en l’absence de mannoheptulose (19,5 mM). Nous avons montré précédemment (Chapitre I, section E) qu’en présence de glucose la sécrétion d’insuline n’est pas décelable durant les 15 premières minutes d’incubation. Cette observation est ici confirmée par incubation de fragments pancréatiques en présence de glucose

(200

mg

/100

ml) durant 45 et 90 minutes (fig. II-3, A et B). Le délai d’installation de la sécrétion semble aboli lorsque des fragments préalablement incubés en présence de glucose pendant 45 minutes sont ensuite incubés de la 45® à la 90® minute dans des milieux neufs contenant également du glucose (fig. II-3, E). Le mannoheptulose abolit l’effet stimulateur du glucose (fig. II-3, C). Les fragments pancréatiques préalablement incubés pendant 45 minutes en présence de glucose seul ne sécrètent guère d’insuline pendant les 45 minutes suivantes après l’adjonction de mannoheptulose au milieu (fig. II-3, D). Par contre, lorsque le üssu pancréatique est d’abord incubé avec du glucose et du mannoheptulose (fig. II-3, G) et ensuite transféré dans un milieu neuf ne contenant que du glucose, il sécrète durant cette deuxième période d’incubation autant d’insuline (fig. 11-3, H) que le

TEMPS O’iNCUBATiON (min)

(51)

tissu directement incubé en présence de glucose seul durant la première période d’incubation (fig. II-3, F). Une telle sécrétion d’insuline durant la deuxième période d’incubation n’est pas observée si le milieu contient également du mannoheptulose (fig. II-3, J). Après avoir été exposées au mannoheptulose, les cellules bêta répondent donc normalement au glu cose, avec un délai comparable à celui observé lors de l’incubation directe du tissu pancréatique en présence de glucose. De même qu’f« vivo (Wright, Rivera-Calimlim et Malaisse, 1966), l’effet inhibiteur du mannoheptulose in vitro est donc réversible.

L’effet du mannoheptulose a les propriétés d’une inhibition compé titive. Comme l’illustre la figure II-4, le mannoheptulose à la concentra tion de 13,0 mM abolit complètement l’effet stimulateur du glucose pré sent en concentrations basses (100 et 200 mg/100 ml). L’effet inhibiteur du mannoheptulose est partiellement levé lorsque la concentration glucidique est portée à 1200 mg/100 ml. A une concentration plus basse (3,9 mM), le mannoheptulose inhibe toujours nettement l’effet des concentrations glucidiques basses, mais il n’a plus d’effet significatif à la concentration glucidique la plus élevée.

GLUCOSE (mg/100 ml)

(52)

52

Commentaires

Ces résultats, ainsi que les travaux de Coore et Randle (1964a) et Lazarow, Dixit, Lindall, Moran, Hostetler et Cooperstein (1964), suggèrent que les cellules bêta sont librement perméables au glucose. La phloridzine inhibe dans différents tissus le transport actif de glucose au travers de la membrane cellulaire (Wilbrandt et Rosenberg, 1963). Le 3-0-méthylglucose est utiUsé comme inhibiteur compétitif d’un tel transport actif (Park, Reinwein, Henderson, Cadenas et Morgan, 1959). Ni l’une, ni l’autre de ces substances ne modifie l’effet du glucose sur la sécrétion d’insuline.

Par contre, le mannoheptulose, un cétoheptulose présent dans différen tes plantes (Simon et Kraicer, 1966), et la d-glucosamine inhibent l’effet stimulateur du glucose. L’effet inhibiteur du mannoheptulose, déjà démontré antérieurement (Coore, Randle, Simon, Kraicer et Shele- SNYAK, 1963), est réversible et du type compétitif. Coore et Randle

(53)

C. EFFETS DES INHIBITEURS DU MÉTABOIJSME GLUCIDIQUE

Dans la présente section, nous avons tenté de précisier quelles étapes du métabolisme glucidique intracellulaire sont nécessaires à la stimulation de la sécrétion d’insuline par le glucose. Cette étude fait appel à différents inhibiteurs du métabolisme glucidique. Leur mode d’action a été établi sur d’autres tissus, mais n’a pas encore été confirmé au niveau de la cellule bêta. Ce fait impose une certaine prudence dans l’interprétation des résultats.

Les drogues utilisées sont le 2-désoxyglucose (150 à 1200 mg/100 ml), la ménadione (0,6 mM), le synkavit (0,001 à 4,0 mM ; 2-méthyl- 1,4-naph- tohydroquinone-l,4-disphosphate tétrasodique), le phénazine métho- sulfate (1,0 mM), le bleu de méthylène (1,3 mM), la chlorétone (1,4 à 14,1 mM ; l,l,l-trichloro-2-méthyl-2-propanolol), le fluoroacétate (1,0 à 10,0 mM), le 2,4-dinitrophénol (0,3 mM) et le cyanure de potassium (1,0 mM). En présence de 2-désoxyglucose, la concentration en NaCl du milieu est ajustée afin d’en respecter l’iso-osmolarité. Le bleu de méthylène (1,3 mM) cause une réduction (— 12,1 ±2,5 %) du pouvoir de liaison insulinique des anticorps. Il est tenu compte de ce fait dans l’estimation de la sécrétion insulinique en présence de cette drogue. Dans une expérience, le milieu est équilibré avec un mélange N

2

(95%) — CO

2

(5%). Dans une autre expérience, les fragments pancréatiques sont incu bés à 25 au lieu de 36‘>C.

Résultats

(54)

54

2-DESOXYGLUCOSE/GLUCOSE

c

2-DESOXYGLUCOSE (mg/lOOmll

Fig. II-5.

Débit insulinique (^xU/mg/90 min.) à diverses concentrations glucidiques, en l’absence ou en présence de 2-désoxy- glucose. Le rapport entre les concen trations de 2-désoxyglucose et de glu cose est indiqué. Chaque point repré sente la moyenne ( d; écart-type de la moyenne) de 9 à 14 observations.

Fig. II-6.

Débit insulinique (|j.U/mg/90 min.) pro voqué par le mannose (200 mg/100 ml) en présence de concentrations crois santes de 2-désoxyglucose. Chaque point représente la moyenne ( ± écart-type de la moyenne) de 9 observations.

(55)

TABLEAU II-3

Effets des inhibiteurs du métabolisme glucidique

Drogue mM Débit insulinique (p.U/mg/90 min.) (i) 35,5 ± 1,9 (95) (ii) Ménadione 0,6 — 20,1 ± 5,4“ (14) Synkavit 4,0 — 16,0 ± 5,6“ (18) Synkavit 0,7 — 2,9 ± 4,9 (18) Synkavit 0,1 — 2,3 i 4,7 (18) Synkavit 0,01 — 5,8 ± 4,7 (18) Synkavit 0,001 — 2,1 ± 5,5 (18) Phénazine méthosulfate 1,0 — 35,6 i 4,2“ (14) Bleu de méthylène 1,3 — 19,0 ± 3,9“ (18) Chlorétone 14,1 — 25,1 ± 3,7“ (14) Chlorétone 1,4 — 18,6 d 4,1“ (14) Fluoroacétate 10,0 + 0,2 ±7,5 (9) Fluoroacétate 1,0 ± 5,9 ± 9,2 (9)

Même présentation qu’au tableau II-2.

(i) Concentration glucidique du milieu = 150 mg/100 ml. (ii) a -.V < 0,01.

TABLEAU II-4

Effets de l’anoxie, du cyanure, du dinitrophénol et de l’hypothermie

Condition d’incubation Débit insulinique (p.U/mg/90 min.) (i) 63,6 1 4,0 (9) (ii) N2(95 %) —C02(5 %) — 64,2 ± 5,0“ (9) Cyanure (1,0 mM) — 59,8 ± 5,0“ (9) 2,4-dinitrophénol (0,3 mM) — 58,8 ± 4,8“ (9) 25«C — 56,9 ± 5,0“ (10)

(56)

56

Commentaires

Cette étude des inhibiteurs du métabolisme glucidique n’est pas complète. Les données acquises permettent cependant d’évoquer les possibilités suivantes. D’une part, l’effet inhibiteur du 2-désoxyglucose suggère que le glucose-

6

-phosphate per se n’est pas le signal de la sécré tion insulinique. Celle-ci semble tributaire du métabolisme ultérieur du glücose-

6

-phosphate. D’autre part, l’effet inhibiteur de l’anoxie, du cyanure et du dinitrophénol suggère que la sécrétion d’insuline est dépendante du métabolisme oxydatif et énergétique. Il est donc possible, comme l’a suggéré R-Candela (1964), que la sécrétion d’insuline requière la production d’ATP (adénosine triphosphate).

(57)

soit à la réoxydation intracellulaire du NADPHg (forme réduite du tri- phosphopyridine nucléotide). Normalement, la majeure partie du NADPH

2

sert cependant de réducteur dans les processus de synthèse (West, Todd, Mason et Van Bruggen, 1967) ; on n’a pas encore décrit, à notre connaissance, de processus sécrétoire qui fût sous le contrôle

duNADPHa.

En conclusion, l’énergie nécessaire pour la sécrétion d’insuline dé pend du métabolisme intracellulaire du glucose-

6

-phosphate, mais l’étape métabolique servant de signal demeure imprécise.

D. EFFETS DES MÉTABOLITES GLUCIDIQUES

L’étude de l’effet des inhibiteurs du métabolisme glucidique ne nous a pas permis d’identifier le métabolite du glucose qui donne le signal de la sécrétion insulinique. Afin de résoudre ce problème, nous avons alors tenté de reproduire l’effet du glucose en incubant les fragments pancréati ques en présence de divers métabolites glucidiques. Nous rapportons ici les résultats de cette étude qui doit encore être considérée comme incomplète.

Résultats

Fin l’absence de glucose, le fructose-

6

-phosphate, le fructose-1,6- diphosphate, le glycérol, le citrate et l’ATP n’ont pas d’effet décelable sur la sécrétion d’insuline. Le lactate, le pyruvate, l’oxaloacétate et le succinate stimulent significativement la sécrétion d’hormone. L’effet de ces métabolites est cependant faible. Il ne dépasse pas 25% de l’effet stimulant d’une concentration équivalente de glucose (Tableau II-5).

Commentaires

Plusieurs réserves s’imposent dans l’interprétation de ces résultats. La perméabilité des cellules bêta aux composés testés n’est pas connue. L’absence d’effet des fructoses-phosphates, par exemple, pourrait être due à un manque de pénétration cellulaire.

(58)

d’insu-58

TABLEAU II-5

Effets des métabolites glucidiques

Métabolite mM Débit insulinique ([xU/mg/90 min.) 9,8 ± 1,0 (37) Glucose 11,0 ± 40,3 ± 4,0« (15) Fructose-6-phosphate 11,0 + 3,5 ± 3,6 (14) Fructose-1,6-diphosphate 11,0 + 0,3 ± 3,5 (13) Glycérol 20,0 + 2,0 3,6 (9) Lactate 20,0 -b 8,6 ± 2,4>= (18) Pyruvate 20,0 -b 7,9 ± 2,7» (18) Oxaloacétate 20,0 -b 5,2 ± 2,4=^(9) Citrate 20,0 2,3 ± 3,6 (18) Succinate 20,0 -b 9,1 ± 2,7»(9) ATP 5,0 + 0,8 ± 2,9 (14)

(i) Concentration glucidique du milieu = 0 mg/100 ml. {ii) a ; P < 0,05 ; : P < 0,01 ; c : P < 0,005.

line provoquée par le glucose (150 mg/100 ml). Une inhibition compa rable est réalisée par l’omission de calcium du milieu d’incubation (voir Chapitre II, section F). Par contre, à cette même concentration glucidique (150 mg/100 ml), le lactate, le pyruvate et le succinate ne modifient pas la sécrétion d’insuline (observations inédites). Gagliardino et Martin

(1966) ont cependant suggéré que le citrate était capable de vaincre l’effet inhibiteur du

2

-désoxyglucose sur la sécrétion d’insuhne.