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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Douat, N. (1969). Induction par une acridine de mutations defectives du prophage lambdoïde 434hy (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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laboratoire de Génétique

INDUCTION PAR UNE ACRIDINE

DE MUTATIONS DEFECTIVES DU

PROPHAGE LAMBDOÏDE 434hy

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B

1

I

Thèse présentée pour 1 obtention du grade légal

de Docteur en Sciences Zoologiques (Section B)

NICOLE DOUAT

Epouse LEFÈBVRE 1969

UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES

FACULTÉ DES SCIENCES LABORATOIRE DE GÉNÉTIQUE

31 OCI. 1969

9ép;...

INDUCTION PAR UNE ACRIDINE

DE MUTATIONS DEFECTIVES DU

PROPHAGE LAMBDOÎDE 434hy

Thèse présentée pour l’obtention du grade légal

de Docteur en Sciences Zoologiques (Section B)

2

)

NICOLE DOUAT

sollicitude qu'il m'a accordée durant toute la réalisation de cette thèse.

J'ai eu la chance inestimable de trouver en

Madame A. Toussaint une compagne de recherche idéale qui, par sa cordiale et efficace collaboration, a permis un travail dyna­ mique et des discussions suggestives.

Le laboratoire de génétique a constitué pour moi un environnement agréable où j'ai toujours trouvé aide et compré­ hension.

L'induction de mutations d'un prophage lambdoîde, par un dérivé d'une acridine, a permis l'isolement de 50 mutants défectifs dont on a pu déterminer qu'il s'agissait très proba­ blement de mutants de phase.

Trois mutations ont été localisées dans le bras droit (de N à R) du chromosome du bactériophage (1 P, 1 S, 1 R), dix- huit dans le bras gauche (de A â J).

Des expériences de surinfection hétéroimmune des bac­ téries portant un prophage défectif acridine, par différents mu­ tants amber ont permis de montrer que certaines des mutations acridine exerçaient un effet polaire sur les gènes distaux par rapport au sens de la transcription (B->C —>D ; E_>F). Cet ef­

fet paraît à la fois moins fréquent et moins accusé dans le cas de souches lysogènes pour un prophage portant une mutation amber dans ces mêmes cistrons.

I, INTRODUCTION

Chaque cellule est capable, dans une certaine mesure, de contrôler et de coordonner ses synthèses protéiques en fonc­ tion de ses besoins et des conditions extérieures de telle sor­ te qu’un rendement maximum soit obtenu avec un minimum d'énergie et de matériel. Ce pouvoir de régulation déterminé par les gè­ nes cellulaires implique une haute organisation ; il est le ré­ sultat de nombreuses mutations et constitue un système économi­ que d'un grand avantage sélectif d'autant plus important que la cellule se reproduit rapidement.

La régulation d'exerce à la fois au niveau de la répli­ cation et de la transcription du D.N.A., contrôlant ces deux acti­ vités par un réseau d'interactions moléculaires spécifiques.

C'est chez les bactéries que les mécanismes de régula­ tion sont les mieux connus ; chez ces organismes, les gènes d'une même chaîne métabolique sont fréquemment groupés en unités de ré­ gulation ou opérons. Leur transcription est sous le contrôle d'un gène régulateur. Ce gène synthétise un répresseur qui, suivant le système dans lequel il agit (anabolique ou catabolique) est activé ou inhibé de manière stéréospécifique par des molécules extérieu­ res (effecteurs). Rendu actif, le répresseur bloque toute expres­ sion de l'opéron. Inactivé, il n'empêche plus la transcription de l'opéron qui est alors déréprimé.

bios3mthétiques : la rétroinhibition. Le produit final, une fois synthétisé, inhibe allostériquement et de façon spécifique et ré­ versible le premier enzyme de la chaîne.

Toutes les protéines ne sont pas soumises à ces contrô­ les bien que certaines soient dans la cellule en quantités très différentes. Il faut donc supposer l'existence d'autres mécanis­ mes qui en fixent le taux de synthèse.

1. L'opéron et la mise en évidence de la polarité

Nous présentons ici le schéma de l'opéron lactose de Escherichia Coli tel qu'il a été élaboré par Jacob et Monod

(1961 a et b) puis modifié par Ippen et coll. (1968).

i : gène de régulation

P : site d’initiation de la transcription

p’: V .. traduction

O : opérateur

Z,Y,Ac: gènes de structure des enzymes catabolisant le lactose

Z : B galactosidase Y : perméase Ac : transacétylase

Le modèle de Jacob et Monod ne comprenait que deux élé­ ments de la régulation : le gène i et l'opérateur. Leur interpré­

(qu'il soit ou non un métabolite) inactive le répresseur de 1

!

sorte que l'opéron est transcrit. L'isolement du répresseur de i lac par Gilbert et MUller-Hill (1966) qui ont montré la liaison spécifique avec le DNA de l'opérateur (1967) apporte une confir­ mation de ce schéma. En 1964, Jacob et coll. suggèrent l'exis­

tence d'un site supplémentaire localisé entre l'opérateur et le premier gène de structure qui initie la transcription ou la tra­ duction : le promoteur.

En 1968, Ippen et coll. montrent, en étudiant des dé­ létions, que le site d'initiation de la transcription est situé entre le gène de régulation et l'opérateur. Ils le baptisent "promoteur" et suggèrent que l'ancien promoteur de Jacob et coll. serait en fait un initiateur de la traduction ("starter").

Quand le répresseur est présent, la transcription com­ mencée en P, s'arrêt au niveau de l'opérateur. Déréprimé, l'opé­ ron est transcrit depuis p jusqu'à son extrémité distale et la traduction début en p'.

Jacob et Monod avaient défini l'opéron comme une unité de transcription sans spécifier toutefois si à un opéron corres­ pondait un ou plusieurs m-RNA. En 1963, Attardi et coll. pour l'opéron lac et Martin pour l'opéron his ont montré expérimenta­ lement l'existence d'un seul m-RNA polycistronique.

Lors de l'élaboration du système, il existait un certain nombre de mutants déficients pour toutes les synthèses spécifiques de l'opéron lactose. Comme on donnait à l'opérateur le rôle mul­ tiple de site d'action du répresseur et de point de départ de la transcription et de la traduction, ils ont été dénommés 0° en rai­ son de leur absence d'activité.

étu-diant des délétions de la région opérateur, il conclut que les ^

mutations 0° sont situées dans Z, très près de l'opérateur et |

qu'elles représentent un cas extrême de polarité telle qu'elle ' avait déjà été mise en évidence par Franklin et Luria (1961) d'une part et par Jacob et Monod (1961 b) d'autre part : ces auteurs qui avaient observé un taux réduit de perméase chez certains mutants du gène Z avaient dénommé polarité la diminution du taux de syn­ thèse des protéines des gènes distaux, par rapport à l'opérateur, de celui qui porte la mutation.

En 1965, Brenner et Beckwith montrent que les suppres­ seurs bactériens qui corrigent les 0° sont des suppresseurs de mutations nonsense dont on sait qu'elles entraînent une terminai­ son de chaîne polypeptidique (Stretton et Brenner 1965). Les mu­ tants 0® sont donc des mutants nonsense.

En 1966, Whitfield etcoll. isolent dans l'opéron histidine de Salmonella thyphimurium des mutants de phase et montrent qu'ils sont polaires. Ils pensent que la polarité de ces mutants est causée par la génération d'un triplet nonsënse au cours du dépha­ sage. Cette hypothèse est confirmée en 1967 par Martin qui mon­ tre qu'en présence d'un suppresseur bactérien, la polarité des mu­ tants frameshift est supprimée. Les mutants missense qui résul­ tent du remplacement d'un acide aminé par un autre ne sont pas po­ laires.

La polarité a été clairement mise en évidence : - chez les bactéries :

Dans l'opéron histidine de S. typh. (Martin et coll. 1966 a) Dans l'opéron tryptophane de S. typh. (Bauerle et Margolin 1966) Dans l'opéron tryptophane de E. Coli (Yanofsky et Ito 1966) Dans l'opéron galactose de E. Coli (Jordan et Saedler 1967)

2. La polarité au niveau moléculaire

Une première interprétation de la polarité a été donnée en 1963 par Ames et Hartman à partir de l'étude de mutants de l'o- péron his de Salmonella typhimurium.

Dans le cas du fonctionnement normal de l'opéron, les ribosomes pénètrent du côté de l'opérateur et progressent le long du m-RNA, Au début de chaque gène existe un triplet "modulateur" dont le rôle est de limiter le nombre de ribosomes qui passent. Il existe donc au niveau du messager un mode de régulation supplé­ mentaire qui permet à la cellule de synthétiser la quantité néces­

saire d'enzymes. Cette interprétation explique que l'ordre des différents gènes de synthèse de l'histidine ne soit pas celui de leur apparition mais soit déterminé par les besoins cellulaires. La polarité résulterait de l'apparition, par mutation, d'un triplet modulateur au milieu d'un gène. Etant donné la dégénérescence du code, on peut supposer que plusieurs triplets jouent ce rôle ; ils peuvent dès lors apparaître fréquemment.

En 1965, la connaissance de la signification des triplets nonsense (Amber : UAG, Ochre : UAA, Sarabhai et coll. 1964 ; opale UGA : Brenner et coll. 1967) modifie l'interprétation de la polarité. Brenner et coll. (1965) émettent l'hypothèse qu'un triplet nonsense, le triplet ochre (qui est mal supprimé par les suppresseurs bacté­ riens) pourrait être le triplet normal d'arrêt de traduction présent à la fin de chaque gène.

résul-tats sont confirmés en 1967 par Zipser et Newton qui montrent que des délétions entre l'opérateur et la mutation ne modifient pas la polarité, tandis qu'entre la mutation et la fin du gène, elles la diminuent.

La présence de deux mutations dans un même gène n'aug­ mente pas la polarité qui reste celle de la mutation la plus pro­

che de l'opérateur. Par contre, les effets polaires s'addition­ nent dans le cas où les deux mutations sont dans des gènes diffé­ rents (Yanofsky et Ito 1966).

Selon Yanofsky et Ito (1966), les ribosomes s'associent au messager du côté de l'opérateur. Dès qu'ils rencontrent un triplet fin de chaîne (normal ou apparu par mutation), la chaîne polypetidique se détache et ils continuent à glisser le long du mRNA sans traduire jusqu'à ce qu'ils atteignent un triplet d'ini­ tiation. Pendant tout le temps de leur glissement muet, ils peu­ vent tomber du messager ce qui explique le gradient de polarité en fonction de la distance.

First messogs of polycislronic ir.RNA Direction of ribosome trovel

I--- 1

---Nonsense Noturol codon stop-stcrt

or nbosomol ccmponent denslt/ of octivc leaves the messenger ribosomes

Interprétation of ribosomo travol on the initial portion of a polycialronio mossonger KNA with a single introcluced nonsense codon.

Martin et coll. (1966 b) proposent un modèle fort sem­ blable : constatant la polarité des mutants frameshift, ils don­ nent au triplet d'initiation présent au début de chaque gène, le rôle supplémentaire de "remetteur" en phase. De plus, en gardant l'hypothèse du modulateur de Ames et Hartman, ils placent entre les deux signaux normaux de fin et de début de chaîne une séquen­ ce stabilisatrice.

En 1966, Imamoto et coll. étudiant la production de luRNA par des mutants polaires à divers degrés, observent la présence de petits segments de messager chez les mutants très polaires, tandis que les mutants moins polaires font des messagers de taille normale. Ils concluent à l'existence d'un couplage transcription-traduction tel que l'avait imaginé Stent en 1964. En même temps, Contesse et coll. (1966) montrent que des mutants polaires de lac synthétisent un mRNA qui s'arrête à l'endroit de la mutation nonsense (rappelons les résultats d'Attardi et coll. (1963) qui avaient aussi montré l'absence de messager chez les 0° mais dans un autre but qui était de prouver que les 0° étaient des mutants opérateur). Ils. n'ex­ cluent pas la possibilité d'une dégradation du messager par une nu- cléase.

Des différentes théories que nous venons d'énoncer, '

trois modèles ressortent : '

1. Les ribosomes s'accrochent au messager du côté de l'opérateur et le parcourent jusqu'à son extrémité.

2. Les ribosomes pénètrent au début de chaque gène sur le mRNA en des sites qui doivent préalablement avoir été démasqués.

3. Il y a un couplage transcription-traduction.

Des résultats, pour la plupart non publiés, de divers au­ teurs permettent une interprétation nouvelle et fort satisfaisante de la polarité. Elle nous a été exposée par Gussin lors d'un séminaire (Gand, 1969).

On sait actuellement que les triplets AUG et GUG sont les signaux d'initiation de la traduction. A leur niveau, les riboso­ mes, sous forme dissociée, s'accrochent au messager : il s'établit primitivement un complexe particule 30 S - formyl methionyl tRNA^ - mRNA auquel vient s'ajouter la particule 50 S complétant ainsi le ribosome (Nomura et Lowry, 1967, Nomura et coll. 1967).

Dans un opéron, la traduction débute du côté opérateur. La progression consécutive des ribosomes détache le messager du DNA et le déroule en démasquant le site d'entrée situé au début du gène suivant. A l'arrêt normal fin de chaîne, les ribosomes immédiatement remis en présence du triplet d'initiation voisin se dissocient partiellement avant de recommencer la traduction

(Webster et Zinder 1969).

le démasquage de ce site et une entrée ribosomiale à son niveau. Le messager n'est donc plus détaché du DNA au-delà de la muta­ tion nonsense et les transcriptions ultérieures de l'opéron ne peuvent progresser, ce qui explique les petits fragments de mRNA mis en évidence par Imamoto et coll.

Fonctionnement d'un opéron

3. La polarité absolue

Certains auteurs ont mis en évidence des mutations po­ laires absolues.

En 1968, Jordan et coll. ont montré que les mutants po­ laires absolus de l'opéron gai qu'ils avaient isolés résultaient de l'insertion de DNA étranger dans le gène muté. Il existe vrai semblablement dans ces inclusions de nombreux signaux parmi les­ quels des signaux d'arrêt de transcription.

B. LES MUTATIONS FRAMESHIFT

1. Les acridines et le code génétique

Les acridines, dont le noyau est figuré ci-dessous, et particulièrement la proflavine (3-6 diarainoacridine) et l'acridine orange (3-6 bisdiméthylaminoacridine) ont été utilisées comme agents mutagènes sur divers organismes (virus, bactéries, levures, Neuro-

spora et drosophiles) bien avant qu'on en connaisse le mécanisme d'action.

Noyau__ Acridine

8 9 1

Freese (1959 b) en observant que les mutations induites à la proflavine n'étaient pas réversibles par un analogue de base alors que celles provoquées par le bromouracil l'étaient, a sug­ géré l'induction de transversions (changement d'une purine en une pyrimidine et vice versa) par l'acridine.

En 1961, Brenner et coll. s'appuyant d'une part sur la constatation de la spécificité des sites de mutation et d'autre part sur les travaux de Lerman (1961) qui semblaient démontrer l'intercalation des acridines entre deux paires de bases adjacen­ tes du DNA ont proposé le modèle suivant :

la présence d'acridine entraîne l'addition ou la délé­ tion d'une paire de nucléotides dans la molécule de DNA.

Les travaux de Crick et coll, (1961) sur des mutants acridines de la région r^^ du bactériophage ont permis, en partant de l'hypothèse de Brenner et coll. (1961) de vérifier l'ac tion des acridines au niveau du DNA et surtout de prouver que le mécanisme de transfert de l'information génétique depuis le DNA

jusqu'aux protéines se faisait â partir de triplets. Ils ont, dans cette étude, appelé (+) les mutations qui résultaient de l'ad dition d'une paire de nucléotides et qui entraînaient un décalage du message vers la gauche et (-) celles qui résultaient d'une délé tion et entraînaient un décalage vers la droite. Ils ont ensuite dénommé arbitrairement (+) et (-) les deux groupes de mutants qu'ils avaient obtenus.

Séquence de triplets chez le sauvage ABC ABC ABC ABC

délétion (-) ABC “ BCA BCA BCA

---^

addition (+) ABC AAB CM CAB

<---Ils ont posé et démontré que deux mutations de signe opposé se compensaient et que leur présence simultanée donnait fréquemment un individu de type sauvage ou pseudo-sauvage, alors que deux mutations de même signe croisées entre elles ne donnaient aucun révertant. Ils en concluent que la phase modifiée par l'ad­ dition (ou la délétion) d'une base peut être rétablie par la dé­ létion (ou l'addition) d'une seconde base dans un site voisin. Ceci n'est vrai que si le déphasage dans l'intervalle entre les deux mutations ne mène pas à l'apparition d'un triplet n'ayant pas de signification ou une signification d'arrêt. La protéine codée par ce message ne sera fonctionnelle qu'à condition que la séquen­ ce d'acides aminés modifiée ne se situe pas dans une partie essen­ tielle de la molécule.

Terzaghi et coll. (1966) ont vérifié expérimentalement ces théories en analysant des mutants acridines du gène de struc­ ture du lysozyme de et en 1967, Crick et Brenner ont pu montrer que leurs mutants conventionnellement désignés (+) et (-) résul­ taient par chance les premiers de l'insertion, les seconds de la délétion d'une paire de nucléotides.

Whitfield et coll. (1966) ont isolé des mutants frame- shift, induits par un dérivé de l'acridine, de l'opéron his de Salmonella typhimurium et en ont étudié les différentes caracté­ ristiques en les comparant à des mutants nonsense, amber et ochre, et à des mutants missense.

Les caractéristiques des mutants frameshift sont définies comme suit :

1. Ils ne sont réversibles ni par les analogues de base, ni par la nitrosoguanidine (NG) qui agit en faisant soit des tran­

2. Ils sont réversibles par lesacridines.

3. Ils ont un taux de réversion spontanée très faible. 4. Ils ne sont pas phénotypiquement supprimés par la streptomycine, la néomycine et la kanamycine.

5. Ils ne sont pas supprimés par des suppresseurs exter­ nes (une exception :Riyasaty et Atkins (1968). En étudiant des mutants frameshift du gène de l'antiiranilate synthétase de l'opéron his de Salm. Thyph. ils ont montré la possibilité, dans certaines circonstances qui permettent la réinitiation de la synthèse proté­ ique, de corriger ces mutants par un suppresseur d'opale).

6. Ils exercent un effet polaire (cf. chapitre précédent).

2. Mécanisme de formation des mutants frameshift

Les mutations frameshift apparaissent spontanément ou par l'action d'acridines et de dérivés apparentés.

Un premier modèle du mécanisme de formation de ces muta­ tions a été avancé par Brenner et coll. (1961). En se basant sur l'augmentation de la distance entre deux paires de base (qui passe

O O

Intercalation d'une acridine dans la double hélice de DNA (d'après Lerman, 1963).

Selon lui, l'erreur se produirait à la recombinaison : l'apparie­ ment des deux molécules de DNA serait perturbé par la présence de

1'acridine ; lors de la rupture, puis de la réassociation des chromosomes homologues, il y aurait perte dans une fibre et addi­ tion dans l'autre d'une paire de base (cf. schéma ci-dessous).

Interprétation de la conséquence de l'intercalation d'une

acridine dans la molécule de DNA ( ® : acridine);ex Waring 1968 d'après Lerman 1963.

Des études faites sur par Drake (L964) ont montré que des mutations apparaissaient dans des régions hétérozygotes lors de la recombinaison et non lors de la réplication. Chez Saccharomyces Cerevisiae, Magni (1963) et Magni et coll. (1964) ont montré qu'elles se produisaient lors de la méiose pendant un crossing-over inégal.

Cependant, les résultats de Drake montrent que, contrai­ rement à la prédiction de Lerman, on n'obtient pas les deux mutants

(+) et (-) réciproques et que l'augmentation de la recombinaison par irradiation aux U.V. ne favorise pas la mutagénèse à 1'acridine. On peut éventuellement arguer que l'un des deux parents est éliminé

D'autres faits expérimentaux semblent confirmer l'im­ portance de la recombinaison dans l'apparition des mutations frameshift. On sait que la proflavine agit peu chez X

(Brenner, commun, pers. à Drake, 1964) pour lequel la recorabi- naison est plus lente que pour et n'agit pas chez les bacté­ ries et les organismes supérieurs (Orgel, 1965) sauf dans des conditions où la recombinaison est favorisée (Dr. H. Boyer, comm. pers. à Ames et Whitfield, 1966). En outre, la proflavine est active chez les bactéries dans les régions diploïdes de zygotes obtenus par conjugaison (Sesnovitz-Horn et Adelberg, 1968). Streisinger et coll., en 1966, à partir de l'analyse de mutants frameshift du gène de structure du lysozyme de et des résul­ tats précédemment obtenus proposent une version modifiée du mé­ canisme de formation de ces mutations. Elles apparaissent dans des régions riches en bases identiques dans lesquelles à la suite de la formation d'un trou, il y aurait simultanément une nouvelle synthèse et un mauvais appariement. Les erreurs se produiraient principalement durant la recombinaison lors de la formation de molécules hétérozygotes partielles (cf. chapitre C). Chez T^,

a)

TG’TffTTcÂGGTÂGT

.AC» ArÂ'A a'a! GTCCATCA » T G Trij T i • T ...AC .AAAAAGTÇÇATÇA ÏÜÏÏÜÏTG iffTffcÀGGTÂGT •T • ••• . . • • • «oACoAAAAAGTCCAoooo U «■«MnaatiBiaKaa ...JQ XXXTTC40ST oooo «T (n) Origin of a frameshift mutation at tho end of a molécule. Line 1 shows tho normal end of a molécule, line 2 shows an end in which one chain has been digested by an exonuclease followed by mispairing, and line 3 shows tho appearance of the molécule after resynthesis of the digested chain.

(b) Origin of a frameshift mutation in a heterozygous région. The lengths of tho varions régions of overlap are raeant to bo indicated schematically only. The contribution of the two parental DXA molécules to the hétérozygote are dis- tinguished by light vs. heavy print and nowly synthesized material is indicated by smallcr print. The hétérozygote is shown as a joint molécule with a set of mispaired bases in the first line and, after .synthesis, as a hybrid molécule in which a mutation has occurred, in the second line.

Interprétation du mécanisme de formation d'une mutation frameshift (tiré de Streisinger et coll. 1966).

Etant donné les résultats précédemment énumérés, ces auteurs supposent que de semblables erreurs ne se produisent que pendant la synthèse de petits morceaux de DNA sur une seule fibre et non lors de la réplication.

Ils expliquent l’action des acridines par une stabilisa­ tion de la molécule de DNA après la liaison acridine-DNA ; cette stabilisation maintiendrait plus longtemps les régions mal appa­ riées avec pour conséquence une plus grande probabilité d'erreurs.

des mécanismes de réparation.

I

C. LA RECOMBINAISON |

I

I L'étude de la recombinaison n'intervenant pas en ordre principal dans ce travail, nous ne rendrons compte que des con­ naissances actuellement admises la concernant.

La recombinaison se ferait par rupture, en des endroits différents de chacune des deux fibres de DNA et réassociation des fragments par appariement des chaînes complémentaires (Anraku et Tomizawa, 1965, Meselson, 1964). Il en résulterait la forma­ tion d'une molécule hétérozygote partielle (x) qui s'éliminerait lors de la première réplication (voir schéma ci-dessous reproduit avec l'autorisation du Dr. S. Mousset).

Les enzymes impliqués dans la recombinaison seraient : - Une endonucléase qui rompt les fibres de DNA

- Une ou plusieurs exonucléases qui enlèvent les mor­ ceaux excédentaires lors de la réassociation.

- Une polymérase qui resynthétise les parties manquan­ tes à partir de la chaîne complémentaire.

- Une ligase (bactérienne - Gellert, 1967) qui lie de façon covalente les deux fibres.

Les bactériophages tempérés : le cycle de -X

Deux situations totalement différentes peuvent résulter de l'infection d'une bactérie par un bactériophage tempéré :

- Après une période de latence, la bactérie est lysée et libère une centaine de phages mûrs.

- La bactérie continue de croître et de se multiplier normalement, mais elle devient immune vis à vis de l'infection par

des phages du même type (homoimmun) et potentiellement capable de produire du phage, caractères qu'elle transmet à sa descendance.

1/ Le cycle lytique

Une fois injecté dans la bactérie, le DNA phagique se circularise (Young et Sinsheimer, 1964). Sous cette forme, il synthétise les protéines nécessaires à sa réplication (protéines précoces) et se réplique. La formation de protéines de structure de tête et de queue, d'éventuels enzymes nécessaires à leur as­ semblage et à la coupure des cercles de DNA phagiques et des pro­ téines qui interviennent dans la lyse de l'hôte constituent les différentes étapes du cycle lytique. La carte génétique végéta­ tive du bactériophage tempéré -X représentée ci-dessous montre l'emplacement des différents gènes et leur fonction.

tête queue

AWBCDE FZUVGTHMLK

lysogénisation

-I

J b2int exo B Cm N rexci x y Cn 0 P Q S R

bout collant permettant la circularisation (Bode & Kaiser, 1965)

recombinaison \ !//■' fonctions précoces 4 \ I \l lyse inducteur des fonctions tardives (Dove ,1966)

= région de reconnaissance bactérienne int = intégrase

exo ='gène de structure de l'exonucléase B = gène de structure de la protéine 13

rex = gène de restriction des bactéries (A ) aux phages -T pairs Cj = gène de synthèse du répresseur

, C : gènes nécessaires à l'établissement de la lysogénie II III

R = gène de synthèse du lysozyme

J = gène de synthèse de l'antigène de queue.

2/ La lysogénisation

Le DNA de bactériophage s'intégre à l'état de prophage dans le chromosome bactérien pour former avec celui-ci une asso­ ciation stable. Le prophage perd temporairement son autonomie et est soumis au rythme de réplication de la bactérie. Il la pro­

I tège de l'infection par un phage homoimmun en synthétisant un i

^ I

répresseur qui empeche la production ultérieure de protéines phagiques spécifiques. L'immunité peut être levée après trai­ tement par divers agents (U.V., mitomycine) qui interfèrent

avec la synthèse du DNA bactérien (Goldthwait et Jacob, 1964) ou, à haute température dans le cas où le répresseur est thermolabile.

Il existe des revues qui font le point des connaissances actuelles sur les mécanismes qui interviennent dans la lysogénisa­ tion par le bactériophage A . Nous nous bornerons à les rappe­ ler brièvement.

a/ In^é^r^t^on £t_exc^s^on (Signer 1968)

Le modèle proposé par Campbell en 1962 pour expliquer la lysogénisation s'est révélé, dans ses grandes lignes, exact : le DNA phagique sous forme circulaire s'apparie avec le chromosome bactérien par une région dite de reconnaissance (une partie de b^). Un enzyme viral, l'intégrase, agit spécifiquement dans cette ré­ gion en y permettant une recombinaison réciproque. L'incorporation du génome phagique dans le DNA bactérien qui en résulte entraîne une permutation circulaire des marqueurs. L'excision du prophage se fait, en partie, par le processus inverse.

b/ Ré£r£S£i£n_d^s_f£nc_ti^ons_v^r^le^s (Dove, 1968 ; Echols et Jo}mer, 1968).

type de phage. Le phage A possède deux opérateurs, eux aussi spécifiques, situés de part et d’autre de (Jacob et Monod, 1961 a ; Ptashne et Hopkins, 1968). La fixation du répresseur sur ses opérateurs empêche à la fois la transcription de N et

celle d'un opéron groupant les gènes x, y, 0 (Pereira da

Silva et Jacob, 1967) et sans doute P. Par l'intermédiaire de cette double répression, la réplication, la synthèse des enzymes impliqués dans la lysogénisation et la recombinaison, ainsi que toutes les synthèses tardives sont bloquées :

- la réplication qui nécessite les produits des gènes 0 et P et la levée de l'immunité.

- l'expression des gènes int, exo, f3 et qui re­

quiert le produit du gène N et également la levée de l'immunité (Signer et coll. 1968).

- l'expression des fonctions tardives qui est sous le contrôle du gène Q (Dove, 1966) lui-même activé par le produit de N.

La complémentation par le prophage c'est-à-dire ,1a pos­ sibilité pour un phage défectif dans les fonctions tardives surin­ fectant une bactérie lysogène hétéroimmune d'arriver à maturité , a permis de montrer que la répression de ces fonctions était in­ directe (Thomas, 1965 a et b, 1966).

Dans ce système cependant, il n'y a qu'un seul exemplaire du prophage : il ne complémentera bien la fonction mutée du phage surinfectant que si elle n'est nécessaire qu'en faible quantité

(fonction catalytique). Les fonctions comme les protéines de structure de tête et de queue qui doivent être présentes en même nombre que les répliques seront mal complémentées par le prophage •

III. BUT DU TRAVAIL.

Le groupement de gènes en opéron a été clairement mis en évidence chez les bactéries. Par contre, chez les virus, il y a extrêmement peu d'indications nettes de l'existence d'unités de régulation. C'est, en particulier, le cas pour les bactério­ phages tempérés.

L'objet de ce travail est de contribuer à l'étude du mode d'organisation des gènes chez les phages tempérés en recher­

IV. t-îATERIEL ET METHODES.

A. Matériel

1/ Agents mutagènes

L*ICR-191 A [3chloro-7 methoxy - 9 (3 chloroéthyl) amino propylamino acridine dihydrochloride] nous a généreusement été fournie par le Dr. H.J. Creech.

La Nméthyl-N'nitro-Nnitrosoguanidine (NG) provient du Koch Light Laboratory.

2/ Milieux

Les milieux courants utilisés au cours de ce travail sont ceux décrits par Kaiser (1955). Le milieu liquide tryptoné (T) est additionné de vitamine (1 mg/ml) pour la croissance des cultures bactériennes et de MgSO^ 0,01 M pour les dilutions de bactériophages

(TM).

- MiHeu_EMB^ pour 1.000 cc d'eau distillée tryptone 8 g yeast extract _{1 g} NaCl 5 g K^H PO^ 5 g éosine y 0,4 g bleu méthylène 0,06 g agar 15 g

Le milieu EMB permet de distinguer les bactéries lysées des O

non-lysées. La lyse de la cellule laisse pénétrer le colorant qui lui donne une teinte violette (teinte rose pour les autres).

3/ Souches bactériennes

3/ Souches bactériennes

(

Souches bactériennes Caractéristiques Origine

C600 f" t" l" Appleyard 1954

594 dérivé Sm^ de W3350 Su , gal^, gal^ Campbell 1961

CA 244

(Weigle)

Su Hfr H [lac try ] amber (X ) Bramer et Beckwith 1965

CA 244.1

N 100

dérivé X de CA 244; a perdu son carac­ tère Hfr

dérivé Rec^ Sm^ de W 3102 Su , gal2>

Thomas

Yarmolinsky via Meselson

CR 63

QR 14

uv"

“h “H "f" suJ, lac , gai

adsorbe uniquement les A portant une mutation de spécificité d'hôte (Xh ) +

Su , cryptique ayant le marqueur h^ : un

ref Gottesman et Yarmolinsky 1968

Signer et Weil 1968

^30

“f"

phage red h^ qui l'infecte peut récu-J pérer le marqueur h par recombinaison et s'adsorber sur CR63

dérivé Hfr H Su portant un prophage dé- Jacob et coll. 1957

'^31’

fectif d'immunité X muté dans le gène R

dérivés de ( A ) portant un prophage _{Eisen et coll._ 1968 _}

^68*

défectif du gène P

porte un prophage défectif iX muté dans Fuerst et Mount 1966

* T„_r, T et T _ sont origiiielleraent Su”*", mais il en existe

31 67 6o

des dérivés Su .

- Dérivés lysogènes pour 434 hy et différents 434 hy sus de C600, 594, CA244.1 et NlOO isolés au laboratoire (Toussaint et Lefebvre)

- Dérivés lysogènes pour 434 hy ts de 594 (Toussaint) - Dérivés lysogènes pour \ et divers X sus de C600.

Nomenclature

F : souche ne possédant pas le facteur sexuel F.

Hfr : souche ayant le facteur F intégré dans le chromosome Gai : souche ne fermentant pas le galactose

lac : souche ne fermentant pas le lactose T : souche exigeant la thréonine

L : souche exigeant la leucine : souche exigeant la thiamine Try : souche exigeant la trytophane

r

Sm : souche résistante à la streptomycine Su : souche ne possédant pas de suppresseur

+ + +

Rec : souche déficiente dans une des étapes de la recombinaison,

g

UV : souche sensible aux ultra-violets.

4/ Bactériophages

type sauvage provenant du croisement de .X h et (Kaiser 1957)

Xh : (Appleyard et coll. 1956) mutant de spécificité d'hôte capable de pousser sur une souche résistante à X . Ce phage provient de l'induction de la souche 112 ( X h)

(Weigle).

X clairs mutants ne lysogénisant pas (C^) ou mal (C^^) isolés

au laboratoire par induction aux U.V.

XCoc_ : mutant thermoinductible dont le represseur est actif à o57

30° et pas à 40° (Sussman et Jacob 1962)

X sus : mutants amber décrits par Campbell (1961) et par Thomas et coll. (1967)

At^^ : mutant amber du gène Q de Fuerst et Siminovitch corrigé par le suppresseur Su^^^ (Thomas et coll. 1967)

X ts

mutant défectif absolu du gène S (Fuerst et Mount 1966) : mutant thermosensible capable d'accomplir un cycle

complet à 30° mais pas à 42° (Bro^vn et Arber 1964)

int red ; mutant incapable de recombiner deux marqueurs

l'intégration et de l'excision du phage (Zissler 1967,

Gottesman et Yarmolinsky 1968). La mutation ^ ®té iso­

lée au laboratoire par S. Mousset par traitement à la NG du

phage \ Cq red de Signer. Différents dérivés sus red„

03/ J 3

intfoz ont été obtenus par croisement entre ce mutant et des A sus (Toussaint et Lefèbvre) (cf. méthodes).

- 434 hy : (Kaiser et Jacob 1957) provient de croisements succes­

sifs entre \ et 434. Il est isogénique à sauf pour un

petit segment qui comprend la région immunité. Le bactério­ phage utilisé ici a été décrit par Thomas (1964) sous le nom de 434hy2h.

434hysus • mutants amber isolés au laboratoire par croisements entre 434hy et différents \ sus.

434hytsB^ : obtenu au laboratoire en croisant X ts et

434hyC (A. Toussaint) II

434hyC^^„ : Kaiser et Jacob 1957. i i y

21 hy b2 : hybride entre 21 et X b2 (Signer 1966). Il est isogéni­

que de X 62 sauf pour la région immunité (Brenner). Ce phage est utilisé pour curer des bactéries lysogènes hétéroimmunes : ne possédant pas la région il ne peut s'apparier avec le

chromosome bactérien ni s'y intégrer, mais il fournit l'intégrase nécessaire à l'excision du prophage.

B. Méthodes

1. Isolement de bactéries lysogènes défectives induites à l'ICR-191 A.

On dépose sur un tapis de bactéries lysogènes à une con- 9

centration de 10 bactéries un cristal d'ICR-191 A. Après une nuit d'incubation à l'obscurité, à la température de 37°, le tapis bactérien a parfaitement poussé, sauf sur une auréole entourant le cristal où la croissance a été inhibée. Les bactéries reprises à la limite de cette zone d'inhibition sont réétalées sur agar tryp- toné et incubées à 37° jusqu'à la formation de colonies isolées.

Celles-ci sont repiquées sur 434 hy C^, et sur un tapis de

bactéries indicatrices C 600 qui est ensuite irradié aux U.V.

(780 ergs/mm2). Les colonies qui poussent sur 434 hy ne poussent pas sur A Cj et ne donnent pas de lyse sur C600 sont reprises com­ me bactéries lysogènes défectives. On en trouve environ 1 °L .

2

.

Des mutants Su amber ont été isolés à partir de souches CA 244.1 lysogènes pour un prophage 434 hy défectif acridine en

cou-9

on y dépose une goutte de phage 434 hy et A sus N afin de véri­ fier :

1°/ l'immunité de la souche, 2°/ son caractère Su”*^.

^ar^a£té^ris^ti^on ^n_s\^£re^s^e^r. La bactérie Su"^ lysogène défective est curée par 21 hy en déposant une goutte de suspension de ce phage sur le tapis bactérien et en reprenant les colonies qui ont poussé au centre de la plage de lyse (Pour le principe : voir maté- rielrbactériophages).

-3/ Nomenclature des mutations induites à 1'acridine et des I I

souches lysoRènes défectives. i

Les mutations induites à l'ICR-191 A ont été numérotées dans l'ordre de leur isolement, en commençant à ac^ pour celles

du prophage 434 hy porté par 594 et pour celles du prophage

434 hy porté par CA 244.1. Les souches lysogènes correspondantes

sont appelées 594 (434 hy ac^^) ... et CA 244.1 (434 hy ...)

ou, plus simplement. Su (ac^) ..., Su ••• dérivés Su"^

isolés à partir des CA 244.1(ac ) sont appelés Su'*'(ac ).

n n

/

4/ Réversion des mutations induites à 1'acridine par l'ICR-191 A et la N.G. (cf Principes de l'analyse).

Le mode opératoire est le même que celui utilisé pour l'in­ duction des mutations. Après avoir repris la limite de la zone d'in­ hibition, on l'ensemence en milieu T jusqu'à une concentration de

0

2.10 bactéries/ml. La culture est centrifugée, resuspendue dans 1/3 du volume initial en MgSO^ M/100 irradiée aux U.V. (520 ergs/mm2) et après sédimentation des bactéries, elle est mise en suspension dans un volume égal au volume initial de milieu T frais. Après 30 min. d'aération à 37°, à l'abri de la lumière, on titre les cen­ tres infectieux (c.i.) en coulant, sans adsorber, la dilution appro­ priée sur un tapis de bactéries indicatrices.

5/ Surinfection et infection mixte

de 2,10 bactéries/ml. On centrifuge la culture, on la suspend dans 1/3 du volume initial de milieu MgSO^ 0,01 M, on l'irradie éventuellement aux U.V. (520 ergs/mm2) pour induire le prophage et on ajoute le phage surinfectant à une multiplicité d'infection de 3 phages par bactérie. On adsorbe 15 min. à 37°, on dilue en

"H”

milieu Mg , on sédimente les bactéries et on les resuspend dans un volxime égal au volume initial en milieu T frais. Après 30

_2

min. d'aération à 37°, on fait une dilution 10 en TM et on laisse à 37° pendant 90 min. A ce moment, on ajoute du chloro­ forme et on coule les dilutions appropriées sur les bactéries

in-J dicatrices.

b. I,n_fe£ti^on^ mixt£. On procède de la même manière que pour la surinfection en partant d'une bactérie non lysogène et en l'in­ fectant simultanément avec deux phages, chacun à une multiplicité de 3. On irradie aux U.V. (520 ergs/ram2) après l'infection quand on désire favoriser la recombinaison entre les bactériophages. Les éventuelles modifications opératoires apportées au cours des expériences seront précisées dans le travail.

6/ Spot tests

9

On dépose sur un tapis de 1.10 bactéries Su lysogènes g

7/ Complémentation par gouttes

0,2 cc de bactéries Su en milieu MgSO^ M/100 sont in­ fectées par un phage défectif conditionnel à une concentration de l.lO^. Après 15 min, d'adsorption à 37°, le tapis est coulé, sur une boîte d'agar tryptoné, avec du milieu TA . Des gouttes

8

d'une dilution de phages (UO phages/ml) portant une mutation sus dans différents gènes sont déposées sur ce tapis. On obser­ vera une lyse du tapis bactérien à l'endroit où sont déposées les gouttes des phages surinfectants qui complémentent le phage primi­ tivement adsorbé.

8/ Lysogénisation d'une bactérie par un bactériophage défectif (cf Principes de l'analyse)

On induit aux U.V. (520 ergs/mm2) une suspension en g

MgSO^ 0,01 M de 2.10 bactéries lysogènes défectives et on la sur­ infecte avec une multiplicité de 3 par un phage homoimmun incapa­ ble de lysogéniser (C^). Après 90 min., le lysat est chloroformé, centrifugé et titré sur C 600. On infecte alors une suspension de

9

1.10 bactéries à lysogéniser, carencées (1 heure à 37° en MgSO^ M/lOO) avec le lysat à multiplicité de 1. On incube durant 30 min.

à 37° et on étale les bactéries sur agar afin d'obtenir, après une nuit d'incubation à 37°, des colonies isolées. On vérifie enfin que ces colonies sont bien lysogènes défectives (cf. méthode n° 1).

9/ Isolement des phages sus red int

obte-I

nues à partir du lysat provenant d'une infection mixte de C600 I

par un \ sus Ch et un \ C„ red int h incubé à 30°. i

I o57

Les plages ainsi repiquées sont testées pour leurs différentes mutations :

1°/ sus : en les déposant sur une souche Su"^ et sur une souche Su"

2°/ red : en vérifiant qu'elles ne poussent pas sur un mélange (2 vol/1 vol) de CR63 et QR14 (cf. matériel : souches bacté­ riennes) .

3°/ int : en incûbant le phage à tester avec une bactérie Su”*^ pendant une heure à 37°, puis en déposant une goutte de cette suspension sur une boîte d'EMBo ensemencée avec un phage ^ Cj int , On incube 36 heures à 30°. Si le phage est int il n'aura pu lysogéniser les bactéries et les colonies lysées apparaîtront violettes.

10/ Titration de l'activité du lysozyme

V. PRINCIPES DE L'ANALYSE DES MUTANTS DEFECTIFS.

A. Isolement de mutants défectifs absolus d'un bactériophage tempéré.

Il est possible, après traitement mutagène de popula­ tions bactériennes lysogènes, d'isoler des bactéries encore immu­ nes mais incapables cependant de produire du phage mûr. Cette si­

tuation est due, le plus souvent, à la présence d'une mutation du prophage affectant l'un des gènes essentiels au développement viral

(mutation défective). Meme s'il s'agit d'une mutation défective absolue, elle peut être perpétuée dans un prophage car la réplica­ tion entièrement passive de cette structure ne requiert pas l'ex­ pression de ses gènes.

Malgré sa mutation, un prophage défectif peut être trans­ féré dans une autre souche bactérienne. On induit la bactérie qui le contient et on la surinfecte par un phage hétéroimmun pouvant complémenter la fonction déficiente du prophage mais incap.able de lysogéniser (CI). Le lysat provenant de cette surinfection contient des phages mûrs de type surinfectant, aisément titrahies et des par­ ticules mutées non détectables. Il est utilisé pour infecter la bactérie à lysogéniser préalablement carencée. On teste, parmi les bactéries survivantes celles qui portent un prophage ayant les ca­ ractéristiques du mutant défectif initial.

B. Analyse des mutants défectifs

1. In^u£ti^on aux U.V.

Campbell a montré en 1961 que les mutations affectant le

n’empêchent pas la lyse de la cellule hôte. Par contre, les bac-' I téries infectées par un mutant défectif du bras droit (de N à R) ' ne sont pas ou peu lysées.

Cette distinction s'applique également aux bactéries lysogènes défectives induites et donne une première indication de la localisation de la mutation,

La lyse de la bactérie par des mutants du bras gauche ne libère pas ou peu de particules mûres : ces mutants capables de se répliquer ne peuvent arriver à maturation à la suite d'une altéra­ tion de l'une ou l'autre des protéines dans la formation de la coque protéique.

Les produits de deux des gènes du bras droit, les gènes S et R, sont impliqués directement dans le mécanisme de lyse. Les mutations des autres gènes essentiels du bras droit affectent la

lyse de manière indirecte : elles réduisent sensiblement le taux de synthèse des produits S et R soit par un effet de dosage de gène en empêchant la réplication du chromosome viral (mutations des gènes 0 et P), soit par un effet de régulation (mutations dans les gènes N et Q). Dans ces deux cas, c'est le caractère limitant du produit S - nécessaire en quantité stoechiométrique - qui empê­ che la lyse bactérienne.

lyse spontanée + CHCl^ + CHCl^ + lysozyme production de phages mûrs

Mutants du bras gauche + +

-Mutants du bras droit :

gène S - + + +

" R - - + +

autres gènes - -

-Les lysats contiennent quelques particules mûres de géno­ type normal (révertant) qui se titrent aisément sur une souche bac­ térienne sensible. La production de particules mûres à génome dé­ fectif (leakiness) varie d'un gène à l'autre et dépend de multiples raisons que nous n'analyserons pas ici. Comme nous l'avons vu, les virions défectifs sont absents ou extrêmement rares dans le cas des mutants de gènes des fonctions "préréplicatives" ou de maturation ; ils sont, par contre, nombreux dans le cas des mutants qui n'affec­ tent que la lyse cellulaire.

Les phages mûrs défectifs ne peuvent être titrés par les techniques habituelles. On peut cependant les mettre en évidence avec une efficacité variable, sur une souche lysogène pour un phage hétéroimmun apparenté. Ceci est dû, partiellement, à la complémen­

des gènes P, R, F et K du prophage sont inductibles par surinfec-| tion et catalytiques, d'où la bonne efficacité d'étalement (en- ' viron 1) sur la souche lysogène hétéroimmune, essentiellement due à la complémentation par le prophage. D'autres fonctions sont in­ ductibles mais non catalytiques ; l'e.o.p. des mutants de ces

fonc--2 -1

tions reste basse (10 , 10 ) sur les souches lysogènes ; elle

résulte des deux effets. Enfin, dans le cas des gènes non inductibles (N), elle est le reflet de la recombinaison.

La titration d'un lysat de particules mûres défectives sur une souche lysogène ne fournit donc une bonne mesure de la production de particules mûres à génome défectif que dans le cas où le gène muté

est à la fois inductible et catalytique.

Sans perdre de vue la complexité de la situation, la com­ paraison du titre d'un lysat sur une souche non lysogène et sur une souche lysogène pour un phage hétéroimmun et ses dérivés défectifs peut servir, dans la plupart des cas, de test fonctionnel. Récipro­ quement, on peut titrer des mutants défectifs connus sur les sou­ ches bactériennes lysogènes pour les mutants défectifs hétéroimmuns à analyser.

Les deux autres moyens d'analyse (test fonctionnel et mapping) des mutants défectifs absolus expliqués ici, ont pu être ré­

alisés grâce à l'existence de mutants défectifs conditionnels dont on peut aisément obtenir un stock concentré en conditions permissives et qu'on peut titrer sur une souche Su .

2/ Tests fonctionnels

être réalisés : surinfection homo- ou hétéroimmune par des mutants défectifs conditionnels en conditions non permissives, avec ou ' sans induction de la souche lysogène défective. En absence de levée de l'immunité, on mesure la complémentation par le prophage ; en levant l'immunité, on étudie la complémentation classique entre deux gènes.

Afin d'éviter l'apparition de recombinants, qui pourraient masquer la complémentation, on peut travailler dans des souches dé­

ficientes dans leur système de recombinaison (rec ) avec des phages eux-mêmes incapables de se recombiner (red) et de s'intégrer (int). Les souches rec étant non inductibles, seule la complémentation par le prophage peut être étudiée dans ces conditions (à moins que le prophage ne soit thermoinductible).

3/ Mapping

On induit et on surinfecte les dérivés Su”^ des bactéries lysogènes pour des prophages défectifs par des mutants amber clairs (Thomas 1966). Les recombinants non défectifs sont titrés

- +

sur une souche Su . Le rapport plages C/plages C parmi les recom­ binants permet de localiser les mutations situées dans le bras droit

(Eisen et coll. 1966). Malheureusement, dans les expériences de sur­ infection, le rapport [C/c"*"] recombinants n'apporte aucune précision quant à la localisation des mutants du bras gauche, sans doute à cause de l'efficacité de la fonction int qui recombine les phages entre les deux bras, et de l'avantage sélectif que semblent avoir les surinfectants clairs (même quand on laisse au prophage le temps de s'induire avant la surinfection). Dès lors, seules les fréquen­ ces de recombinaison obtenues en calculant le rapport recombinants/ population totale (titrée sur une souche Su ) ont pu être utilisées

pour tenter de localiser les mutations défectives par rapport aux mutations connues.

4-Schéma explicatif rapport [C/C ] recombinants

bras droit _____ ) prophage ___________SüS~t~______ ^ us^d"*c bras gauche ^ sus+~________ d sus d"*" int c+ j ;--- sus'^cf^:* ---sus"^d'^'c c

C. Isolement et caractérisation des mutants de phase

bac-térienne portant deux mutations amber : lac , try . Les "réver- + +

tants" lac , try se sélectionnent aisément sur milieu minimum :

-f-il s'agit, en fait, de mutants Su amber. Les deux mutations nonsense étant corrigées par les trois suppresseurs d'amber

(Herzog, comm. pers.) on obtient des souches Su , Su et

J. I I II

III•

L'emploi de cette souche dans notre travail présente plusieurs avantages :

- Les expériences de surinfection hétéroiraraune avec des mutants défectifs conditionnels peuvent se faire à volonté, en

conditions non permissives (complémentation) ou permissives (mapping) sans devoir transférer le prophage dans une autre souche bactérienne.

+

- La recherche des revertants Su des bactéries lysogènes défectives permet, dès l'abord, l'élimination des souches contenant un prophage dans lequel le mutagène aurait induit une mutation amber plutôt que frameshift. Dans ce cas, le suppresseur bactérien cor­ rige la mutation portée par le prophage rendant la souche hôte lyso- gène active.

sont sans effet sur les mutations frameshift (Ames et ^^^litfield, 1966). Ils sont, par contre, capables de faire réverser des mutations nonsense.

VI. RESULTATS EXPERIKENTAUX J I A. Isolement et caractérisation des mutants du bactériophage 434 hy

induits à l'ICR-191 A.

Cinquante mutants défectifs ont été isolés à partir de souches bactériennes Su lysogènes pour le bactériophage tempéré 434 hy :

d'abord 17 mutants à partir de 594 (434 hy) puis 33 mutants à partir de CA 244.1 (434 hy)

1/ Induction aux U.V. des souches lysogènes défectives

35 souches ont été analysées. La plupart commencent à se lyser environ 70 minutes après avoir été induites aux U.V.

(dose : 520 ergs/mm2). Dans l'expérience décrite au tableau 1, el­ les ont été traitées au chloroforme après 120 min. afin d'éliminer

les bactéries résistantes. Trois souches : Su Su

Su ac ne se lysent pas après induction ; l'addition de chloro- lo

forme (dans ce cas à 180 min.) lyse l'une d'elles : Su ac , X2 9

Elles seront toutes les trois analysées en détail dans le chapitre suivant. Les résultats des inductions sont présentés dans le tableau 1. Le titre des lysats sur la bactérie non lysogène (C600) est bas

( ^2 par ml pour 12 souches ; 10 par ml pour 12 autres souches),

ce qui montre qu'il y a en général peu de réversion spontanée. Quel-3

ques souches donnent cependant plus de 10 phages par ml et l'une 4

d'elles en libère 1,6 10 .

Tableau 1

Induction aux U.V, des bactéries lysogènes défectives

Souches bactériennes lysogènes défectives

, (*)

Lyse Phages/ml sur

Tableau 1 (suite)

Souches bactériennes lysogènes défectives

TLyse Phages/ml sur

C 600 Phages/ml sur C 600 ( X ) 2 4 “loi 9,8 10 7,4 10 ®"'“102 •f <2 <2 ®“'“103 <2 64 Su“aCio^ - 10 50 ^“'“105 + 6,1 10^ 7,8 10^ + <2 48 2 „ , 2 “lû 7 + 1,7 10 2,7 10 Su ac, 4" 30 48 108 ""'“109 4- <2 <2 Su ac,,^ 4" 2 24 110 _ _{, 4 „ , 4} Su + 1,6 10 3,2 10 ^ , 2 Su ac^^2 4" 32 2,5 10 „ , 2 , , 3 "" “113 + 2,2 10 5,1 10 ""'“ll4 + 2,4 10^ 2,1 10^ 2 SU ac^^3 4* 4 2,2 10 2 , , 4 Su acjj3 + 2,6 10 1,0 10 ""'“121 4“ <2 3,6 10^ ""'""l23 4- _{3,5 10^ 2,9 10}4 2 ^ U U 4 Su ac^24 4* 1,2 10 9,1 10 3 , 8 "" “129 1,2 10 3,7 10

2/ Isolement des dérivés Su des bactéries CA 244.1 lysogènes dé- |

fectives.

J

A partir de la souche Su ac 109, nous avons isolé les

“I* “f“

dérivés Su^, Su^^ et Su^^^. A partir de chacune des autres sou­ ches, nous avons isolé un seul dérivé Su^ qui a été identifié com- me SUj (7 cas), Su^^ et Su^^^ (6 cas chacun). Aucune de ces sou­

ches n'est devenue lysogène active à la suite de l'introduction du suppresseur.

Le même résultat a été obtenu avec deux mutants (ac, et 4 ac^y) initialement sous forme de prophage dans la souche 594 qui ont été transférés dans CA 244.1 Su^^.

Aucun des mutants induits à l'ICR - 191 A testés ici n'est donc de type amber.

3/ Réversion par l'ICR-191 A de mutants induits à Ikcridine.

Nous avons testé la capacité de réversion de nos mutants par traitement à l'ICR - 191 A. Certains d'entre eux ont été trai­ tés à la N.G. Deux mutants amber servent de témoins.

En règle générale, les tests de réversion ont été effec-H"

réver-I Les témoins amber ont été traités dans des souches

Su afin de rester en condition non permissive.

Les résultats présentés dans le tableau 2 montrent que sur 17 mutants testés, 11 réversent à l'ICR (deux d'entre eux testés à la NG ne reversent pas). Les six restants ne réver­ sent pas à l'ICR, mais ils ne réversent pas davantage à la NG (aCi2g n'a pas pu être traité à la NG étant donné les mauvaises conditions expérimentales). Parmi ces mutants, trois n'ont donné aucun révertant dans aucune des conditions testées (voir aussi tableau 1), Les témoins amber ne réversent pas à l'ICR, Celui traité à la NG réverse quoi que faiblement.

Ces résultats suggèrent que la plupart des mutants ob­ tenus par traitement à l'acridine, sinon tous, sont bien de type frameshift.

tants sur les souches possédant un suppresseur. '

Réversion des mutants induits à 1*acridine

Tableau 2

a/ par l'ICR - 191 A b/ par la NG

Souches bact. Lysog. déf. Traitement à l'ICR Traitement â la NG

Témoins 594 (434 hy sus A 1,6 594 (434 hy sus Q2Q3) 3,5 Mutants acr. Su ac-. 16 1,63 0,54 Su ac 101 10 Su^ ac 101 14,5 Su^ ac 102 190

SUj ac 103 pas de prod. de phages pas de prod. de phages

Su " ac 104 1,08

Su_^ ac 104 0,97 1,04

Su^ ac 105 51

Su**" ac 106

X >as de prod. de phages

pas de prod. de phages

Su^ ac 107 52

Su^ ac 108 785

Su^ ac 109 5as de prod. de phages pas de prod. de phages

Su” ac 110 32 Su^ ac 110 23 Su^ ac 111 78 Su^ ac 112 260 Su^ ac 113 6.6 Su^ ac 114 230 0,9 Su^ ac 115 93 0,55 Su ” ac 129 0,75

Tableau 3 I Mutant étudié Lyse observée c 600 C 600 ( ) " C 600(susF^)’* •* C600(susQ2q_{^ C6OO^us}R2^0)* ac 104 + C° - ~ 2,5 1.1 10^ -- 5 8,9. 10^ 1,9 10^ +C+L + ~ 5 6.6 lo'^ ^ 2,5 3,6 10^ 8.2 10^ ac 129 + C + 5 10^ 1.7 10^ 2,3 10^ 1,5 10^ 1,9 10^ +C+L + • 1,9 10^ 1.8 10^ 2,4 10^ 1,9 10^ 2,9 10® AC 16 + C - 5 1.7 10^ _{1,4 10^ 1,4 10^} 7,8 10^ +C+L H- 20 6.7 109 4,5 109 4,6 10^ 6,5 témoins : T 31 + C - 5 3 3 10 <10 - -+C+L + 30 3,2 104 --20 - -P 30 + C » 70 _{9,1 10^} - - _{5,7 10^} +C+L + 2 1,0 10^° - — 7,2 10^

Induction (UV:520 ergs/mm2) des souches lysogènes défectives et titration du lysat après 90 min.

* Les souches sont lysogènes pour X dans le cas des mutants ac qui sont i 434 Les souches sont lysogènes pour 434 hy dans le cas des témoins qui sont i X. ° C = chloroforme - L lysoz3nne.

On_^remarquera que toutes les titrations ont été faites sur des souches Su amber. Dans le cas où le prophage porte une mutation amber, on ne voit pas à priori en quoi les conditions diffèrent de celles d'une bactérie lyso- gène pour un X saunage. On sait cependant qu'un mutant sus du gène R

dans une bactérie Su produit suffisamment de lysozyme pour lyser la bactérie hôte et suffisamment peu pour être décelable par les méthodes habituelles de titration. Il semble donc que la correction par les suppresseurs soit trop peu efficace pour permettre à la fonction mutée de s'exprimer pleinement. Nous avons comparé les titres de ces mêmes lysats sur des souches Su^ et Su

B. Etude des mutants localisés dans le bras droit (mutants qui I t

ne lysent pas après induction aux U.V.) i

1/ 434 hy ac 104

- In^U£ti^on aux U.V.

Nous rappelons (cf. tableau 1) que 180 min. apres l'in­ duction aux U.V. de la souche lysogène pour le mutant 434 hy ac 104, aucune lyse n'est observée. Le lysat tité après avoir été chloro­ formé contient très peu de particules phagiques mûres. L'expérience a été reproduite en ajoutant cette fois,90 min. après l'induction, d’une part du chloroforme, d'autre part du chloroforme et du lysozyme. Les résultats consignés dans le tableau 3 montrent que, quel que soit

le traitement appliqué, le nombre de révertants (titrés sur C 600) et de particules mûres défectives (titrées sur C 600 (X) ) reste le

3

mûme. Notons cependant qu'il y a environ 2,10 fois plus de phages mûrs défectifs à 90 min. qu'à 180 min.

- Localisation

Le lysat a été titré sur des souches lysogènes hétéroim- munes pour des mutants amber du bras droit (tableau 3). La muta­

tion ac 104 semble appartenir au cistron P.

Afin de confirmer cette localisation, nous avons :

a/ calculé l'efficacité d'étalement de mutants défectifs condition­ nels hétéroimmuns sur la souche Su ac 104 (cf. tableau 4)

b/ réalisé des expériences de complémentation en milieu liquide

avec les mutants

X

X

O A sus (cf. tableau 5).

P3 . A sus Q2JJ3 et

Efficacité d'étalement de mutants défectifs conditionnels sur les bactéries lysogènes pour les mutants ac du bras droit

Tableau 4

-Tableau 5

Complémentation hétéroimmune en milieu liquide de ac 104 (U.V. : 520 ergs/mm2)

594 594(434 hy) 594(434 hy SUS N 213) 594(434 hy sus Os) 594(434 hy sus p^) 594(434 hy sus Q \ ^203 ' 594(434 hy SUS 594(134 hy "'^104') X sus N 53 C I 2,4 lO"^ 2,7 4,1 10“^ 2 3,6 1,7 4.6 4 X sus 0 8 C II 6,4 lO"^ 2 1,4 4,7 10~^ 2,2 3,6 3 0,4

X

Les chiffres indiquent la production de phages/bactérie.

!

c/ Surinfecté la souche Su^^ ac 104 induite (520 ergs/mm2) par |

les mutants \ sus 0 , X sus P et X sus '

O 3 Zuj

La fréquence de recombinaison situe la mutation dans le

q-cistron P et le rapport [C/C 1 . . place la mutation ac.

recombinants 104

à droite de sus^ (cf. tableau 6).

Schéma explicatif. i 434 ac I04 (--- jl---) \

\

Croisement à trois facteurs (surinfection de Su^^ (434 hy ac 104 C ) )

Phages surinfectants [C/C*^] Sus"*" ac”*^ Fréquence de recombinaison ( % )

X sus 0 8 C II 0,24 0,42

X sus P 3 C II 0,68 0,26

2/ 434 hy ac 129 ; I

- Induction aux U.V.

PM — M> MP J

L'adjonction de chloroforme suffit à lyser la bactérie lysogène pour la mutation ac 129 induite aux U.V. Que ce soit < 90 min. (cf tableau 3) ou 180 min (cf tableau 1) après l'induc­ tion (520 ergs/mm2) le lysat contient un grand nombre de particu­ les mures défectives (environ 4,5 phages par bactérie) décelables sur G 600 (X ). Ces deux résultats sont caractéristiques des mu­ tants du gène S. Comme, de plus, l'efficacité d'étalement du lysat sur les souches lysogènes pour différents mutants amber du bras droit était la même que sur C 600 (X) nous avons rapproché ac 129 d'un mutant défectif du cistron S : t 68 (Harris et coll. 1967).

Le tableau 7 présente une étude comparée de la lyse des souches Su ac 129 et Su T 68 et de la production de lysoz3ane des deux mutants ; ils se comportent identiquement : ils produisent une quantité normale de lysozyme (un mutant du gène R en produit moins de deux unités pour 100JJ litres de lysat et un mutant du gène Q 10 7o de la quantité synthétisée par le sauvage (Dambly et coll. 1968) et approximativement le même nombre de particules virales après addition de chloroforme (1 à 5 phages par bactérie).

Tableau 7

Induction U.V. (520 ergs/mm2) des souches Su ac 129 et Su T 68 Titration du lysozyme produit.

Mutants Lyse observée Production phag C 600 à 90' es sur C600

(X)

* Lysogène pour 434 hy dans le cas de t 68, pour A, dans le cas de ac 129

Complémentation par gouttes entre le mutant ac 129 et différents mutants défectifs de \ sur la souche Su 594

I t t

- Lo£aH£ajti£n

Les expériences d’efficacité d'étalement (cf. tableau 4)

et de test par gouttes (tableau 8) confirment l'emplacement de la mutation ac 129 dans le cistron S, Il ne nous a pas été possible

de calculer l'e.o.p. de ce mutant sur la souche T 68 à cause du mauvais état du tapis bactérien tué par le phage ac 129.

3/ 434 hy ac 16

In_duc_t£on aux U.V.

Le tableau 3 montre que le traitement au CHCl^ de la sou­ che CA 244.1 Su ac 16 induite aux U.V. libère une moyenne de 0,08 phages défectifs par bactérie (titrés sur C 600 (X) ). La

lyse artificielle (C + L) de la cellule enrichit^d'un facteur 400, le lysat en particules mûres défectives (34 phages par bactérie).

La comparaison des tableaux 1 (titration à 180 min) et 3 (titration à 90 min) montre que le nombre de particules baisse avec le temps : il y a sans doute adsorption de phages à l'intérieur des parois bactériennes. Notons qu'au même temps, le nombre de phages révertants reste le même que la cellule soit lysée artifidellement ou non : ceci est normal puisque tous les révertants ont déjà lyéé spontanément.

Lo£al^is.a_ti£n

lysogène pour A sus R (cf tableau 3) et de mutants sus de

sur Su ac (cf tableau 4) montrent que la mutation ac - se 16 16

trouve dans le gène R. Des mesures de production de lysozyme (moins de deiKî unités par 100^ litres de lysat) confirment cette localisa­ tion.

d'efficacité d'étalement du lysat de Su ac sur la souche C 600

On peut observer^dans le tableau 4^la basse e.o.p. du mutant sUS sur la souche Su acj^^ ■ ; il pourrait s'agir d'un

effet polaire s'exerçant de R sur A. Les expériences de complémen­ tation en milieu liquide (tableau 9) donnent des résultats diffé­ rents : on constate en effet que la production de X. sus A^^ par les deux souches lysogènes pour des mutants (amber et acridine) du gène R est supérieure à celle que l'on obtient sur la souche témoin 594 (434 hy)

Tableau 9

Complémentation en milieu liquide : surinfection des souches

Su ac A 107, Su ac R 16, Su (sus A 11) et Su (sus R 5) induites par

X

X

594 594(434 hy c*) 594(434 hy acAi07C*) 594(434 h y ac ) 594(434 hy sus A^iC') 594(434hy sus RgC')

X

C I 1,3 lO"^ 0,6 5,5 lo"^ 1,9 1,8 lo"^ 3,9 \ sus R 5

C^857 1,6 10~^ 17 66 2,2 22 1 io“^