- - -
- - -
Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Haulotte, E. (2007). Biosynthèse d'alcaloïdes défensifs de Coccinellidae (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des Sciences – Chimie, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/210612/5/935e47ef-eed9-41ef-8c3e-a64d96ea4636.txt
(English version below)
Cette thèse de doctorat a été numérisée par l’Université libre de Bruxelles. L’auteur qui s’opposerait à sa mise en ligne dans DI-fusion est invité à prendre contact avec l’Université ([email protected]).
Dans le cas où une version électronique native de la thèse existe, l’Université ne peut garantir que la présente version numérisée soit identique à la version électronique native, ni qu’elle soit la version officielle définitive de la thèse.
DI-fusion, le Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles, recueille la production scientifique de l’Université, mise à disposition en libre accès autant que possible. Les œuvres accessibles dans DI-fusion sont protégées par la législation belge relative aux droits d'auteur et aux droits voisins. Toute personne peut, sans avoir à demander l’autorisation de l’auteur ou de l’ayant-droit, à des fins d’usage privé ou à des fins d’illustration de l’enseignement ou de recherche scientifique, dans la mesure justifiée par le but non lucratif poursuivi, lire, télécharger ou reproduire sur papier ou sur tout autre support, les articles ou des fragments d’autres œuvres, disponibles dans DI-fusion, pour autant que :
Le nom des auteurs, le titre et la référence bibliographique complète soient cités;
L’identifiant unique attribué aux métadonnées dans DI-fusion (permalink) soit indiqué;
Le contenu ne soit pas modifié.
L’œuvre ne peut être stockée dans une autre base de données dans le but d’y donner accès ; l’identifiant unique (permalink) indiqué ci-dessus doit toujours être utilisé pour donner accès à l’œuvre. Toute autre utilisation non mentionnée ci-dessus nécessite l’autorisation de l’auteur de l’œuvre ou de l’ayant droit.
--- English Version ---
This Ph.D. thesis has been digitized by Université libre de Bruxelles. The author who would disagree on its online availability in DI-fusion is invited to contact the University ([email protected]).
If a native electronic version of the thesis exists, the University can guarantee neither that the present digitized version is identical to the native electronic version, nor that it is the definitive official version of the thesis.
DI-fusion is the Institutional Repository of Université libre de Bruxelles; it collects the research output of the University, available on open access as much as possible. The works included in DI-fusion are protected by the Belgian legislation relating to authors’ rights and neighbouring rights.
Any user may, without prior permission from the authors or copyright owners, for private usage or for educational or scientific research purposes, to the extent justified by the non-profit activity, read, download or reproduce on paper or on any other media, the articles or fragments of other works, available in DI-fusion, provided:
The authors, title and full bibliographic details are credited in any copy;
The unique identifier (permalink) for the original metadata page in DI-fusion is indicated;
The content is not changed in any way.
It is not permitted to store the work in another database in order to provide access to it; the unique identifier (permalink) indicated above must always be used to provide access to the work. Any other use not mentioned above requires the authors’ or copyright owners’ permission.
D 03497
vfvfvcn«9f f c UC BRUXELLES
FACULTÉ DES SCIENCES Service de Chimie Organique
BIOSYNTHESE D’ALCALOÏDES DEFENSIFS DE COCCINELLIDAE.
Thèse présentée en vue de
l’obtention du grade de
UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES FACULTÉ DES SCIENCES
Service de Chimie Organique
BIOSYNTHESE D’ALCALOÏDES DEFENSIFS DE COCCINELLIDAE.
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de
Docteur en Sciences
Eveline HAULOTTE
Décembre 2007
Thèse de doctorat présentée en décembre 2007 devant le jury composé de :
Mr Jean-Claude Braekman Mr Yves Geerts
Mr Michel Luhmer
A mon père
Remerciements
Au terme de ce travail, je tiens à remercier tout particulièrement le Professeur Jean-Claude Braekman de m’avoir accueillie au sein de son laboratoire et de m’avoir soutenue tout au long de ma thèse. Toujours disponible et avide du dernier résultat du jour, il m’a permis de réaliser ce travail dans d’excellentes conditions, tant au niveau scientifique que personnel. Après un début de retraite assez animé, je lui souhaite pour la suite un repos bien mérité.
Je voudrais également exprimer ma gratitude à Monsieur Michel Kaisin pour tout ce qu’il réalise au jour le jour au laboratoire, pour le temps qu’il a consacré à la compréhension des spectres de masse, pour ses conseils avisés lors de ma rédaction et surtout pour toutes les discussions agréables que nous avons eues. Bonne continuation, tant au niveau scientifique que philatélique ;)
Je remercie tout particulièrement
Monsieur Michel Luhmer, Directeur du CIREM, et Madame Rita D ’Orazio pour le relevé de spectres de Résonance Magnétique Nucléaire.
Monsieur Marc Pamart pour l’enregistrement des spectres de masse en ionisation électronique et chimique. Membre effectif de la nouvelle équipe, je lui souhaite beaucoup de réussite scientifique.
Messieurs Robert Flammang, Pascal Gerbaux et Michaël Boiilvin du Service de Chimie Organique de l’Université de Mons-Hainaut pour le relevé des spectres de masse électrospray.
Mesdames Rita Lareppe, Jacqueline Bastianelli et Dorkas Musabyimana, les secrétaires et technicienne du service.
Tous les biologistes du service voisin, en particulier Gilles San Martin, qui m’ont permis de me familiariser avec le monde des coccinelles.
L’ambiance au sein du laboratoire a toujours été conviviale et studieuse. En effet, toutes
les personnes qui s’y sont succédé ont apporté leur petite touche personnelle. Les pauses thés
de 16h, les midis grecs, méditerranéens, croque-monsieur ou autres, les soupers de Noël, les
repas au restaurant, le petit déjeuner libanais (une vraie découverte...), et même les
expéditions dans les grands magasins, ... tous ces moments inoubliables et exceptionnels sont
des éléments caractéristiques de ce service si agréable.
Je n’oublie pas non plus tous les membres de l’équipe braekmaniste : Anissa, Cédric, Christophe, Dominique, François, sans oublier Pascal impressionnant au départ et pourtant tellement pédagogue, pour leurs commentaires inestimables, souvent encourageants, parfois critiques, toujours constructifs.
Après le départ à la retraite de Jean-Claude Braekman, l’organisation du laboratoire a été un peu perturbée mais le Professeur Ivan Jabin a repris les rennes du service avec brio. Merci Ivan de nous avoir permis de terminer notre thèse sans trop de soucis et bon vent aux calixarènes ;)
Je remercie aussi ces autres français qui nous ont « envahis » avec sourire : Angélique, Mélanie, Mickaël et Stéphane. Nos discussions interculturelles ont contribué à l’atmosphère agréable du service.
Merci également à tous les mémorants qui se sont succédé au laboratoire et qui ont collaboré à l’excellente ambiance qui y a toujours régné.
Je voudrais de même adresser mes remerciements à la Bourse Suzanne Maraite, à la Bourse Lucien De Bay et à la Fondation David et Alice Van Buuren pour leur soutien financier.
Une attention particulière pour tous mes ami(e)s qui m’ont permis de décompresser à tout moment et surtout dans les moments difficiles. Merci également à tous les membres du Waterloo Philatélie Club et du Waterloo Badminton Club pour l’intérêt qu’ils ont porté à mon travail.
Je terminerai par une pensée pour les personnes les plus proches de moi : mes amis les plus chers Catherine et Laurent d’abord, mes grands-parents, mon frère et son adorable petite famille ensuite, et enfin ma maman qui a supporté au jour le jour mes humeurs sans (trop) m’en tenir rigueur. Merci pour leurs encouragements et leur patience lors des bons moments mais également dans les instants délicats.
A toutes ces personnes et aux autres que je n’ai pas nommées ; un grand merci !!
Table des matières
Table des matières...i
Abréviations... vi
RESUME... vii
INTRODUCTION...0
I. La défense chez les insectes... 1
II. Les alcaloïdes défensifs des insectes... 2
III. Etudes biosynthétiques d’alcaloïdes d’insectes... 3
III. 1. Les dytiques... 3
111.2. Les staphylins... 4
111.3. Les chrysomèles... 7
111.3.1. Alcaloïdes pyrrolizidiniques... 7
111.3.1.1. Oreina... 8
111.3.1.2. Platyphora...9
111.3.2. Défense chez Chrysomela tremulae... 10
111.4. Les lépidoptères...11
111.4.1. Les alcaloïdes chez les Lepidoptera... 11
111.4.2. Absorption des alcaloïdes pyrrolizidiniques dans les glandes défensives chez les Lepidoptera... 13
111.5. Les fourmis...15
111.5.1. Les fourmis Solenopsis...15
111.5.2. Les fourmis Tetraponera...16
111.6. Les Coccinelles... 19
III.6.1. Généralités sur la défense des coccinelles... 19
111.6.1. La coccinelle mexicaine Epilachna varivestis...21
111.6.2. La coccinelle Cryptolaemus montrouzieri... 23
111.6.3. Les coccinelles Subcoccinella 24-punctata et Epilachna borealis... 24
111.6.4. La coccinelle européenne Coccinella septempunctata...25
IV.2. Les réactions biosynthétiques... 33
IV.2.1. Réactions d’aldolisation ou de Claisen... 33
IV.2.2. Réaction de Mannich...35
IV.2.3. Réactions d’oxydation et de réduction...37
1 V.2.3.1. Déhydrogénases...37
IV.2.3.2. Oxydases... 38
IV.2.3.3. Mono-oxygénases... 39
IV.2.3.4. Di-oxygénases...39
IV.3. Utilisation des isotopes...40
IV.3.1. Isotopes stables... 40
IV.3.2. Isotopes radioactifs...41
BUT DU TRAVAIL...43
RESULTATS ET DISCUSSION...45
PARTIE 1 : SYNTHESE DES ACIDES GRAS SPECIFIQUEMENT MARQUES... 46
1. Synthèse de l’acide [14-^H]myristique... 47
1.1. Méthylation du diacide en C-13...48
1.2. Monohydrolyse du diester en C-13...49
1.3. Allongement de chaîne... 50
1.4. Réduction de la cétone...52
1.5. Hydrolyse de l’ester... 53
1.6. Synthèse du dérivé marqué... 54
2. Synthèse de l’acide [16-^H]palmitique... 55
2.1. Premier schéma de synthèse...55
2.2. Deuxième schéma de synthèse...61
2.2.1. Méthylation du diacide en C-15...62
2.2.2. Monohydrolyse du diester en C-15...62
2.2.3. Allongement de chaîne... 63
2.2.4. Réduction de la cétone...64
2.2.5. Hydrolyse de Tester... 64
2.2.6. Synthèse du dérivé marqué... 65
3. Synthèse de Tacide [18-^H]stéarique... 66
3.1. Réaction avec Tacide de Meldmm [62]...67
3.2. Réduction des fonctions énols de [76]...68
Table des matières ii
3.3. Hydrolyse et décarboxylation de [77]...69
3.4. Méthylation du diacide [78]... 70
3.5. Monohydrolyse du diester [79]... 72
3.6. Allongement de chaîne... 73
3.7. Réduction de la cétone et hydrolyse de l’ester...73
3.8. Synthèse du dérivé marqué...74
4. Synthèse de l’acide [18-*^C]stéarique... 75
4.1. Halogénation du [*^C]méthanol... 75
4.2. Allongement de chaîne...76
4.3. Réduction de la cétone...76
4.4. Hydrolyse de l’ester... 77
5. Synthèse de l’acide [11,11,12,12,13,13,14,14,15,15,16,16, 17, 17,18,18,18-^H]stéarique = [^H17] stéarique...78
5.1. Halogénation du 1-octanol...79
5.2. Protection de l’alcool...80
5.3. Réaction avec Li-C=CH : formation de l’alcyne [93]... 81
5.4. Alkylation de l’alcyne [93]...83
5.5. Hydrogénation de l’alcyne [95]... 87
5.6. Déprotection de l’alcool... 89
5.7. Oxydation de l’alcool... 89
5.8. Synthèse du dérivé marqué...91
PARTIE 2 ; INCORPORATION IN VITRO DES ACIDES GRAS SPECIFIQUEMENT MARQUES... 94
1. Incorporations chez Adalia bipunctata... 95
1.1. La coccinelle Adalia bipunctata... 95
1.2. Incorporations des acides gras en C-14, C-16 et C-18 marqués au tritium...96
1.3. Incorporations des acides gras deutériés...101
2. Incorporations chez CoccineUa septempunctata... 102
2.1. Généralités sur CoccineUa septempunctata... 102
3.1. Généralités sur Harmonia axyridis...110
3.2. Incorporations radioactives... 111
3.3. Incorporations d’acide stéarique spécifiquement deutérié... 112
CONCLUSION... 116
PARTIE EXPERIMENTALE... 119
1. Généralités... 120
1.1 Remarques préalables... 120
1.2. Techniques chromatographiques...120
1.3. Appareillage... 120
1.4. Sources biologiques...121
1.5. Mesure de la radioactivité et calculs... 121
1.6. Erreurs sur les mesures de la radioactivité... 122
2. Modes opératoires et propriétés spectroscopiques...123
2.1. Synthèse de l’acide [14-^H]myristique... 123
2.1.1. Diacide enC-13 [54]... 123
2.1.2 Méthylation du diacide [54]...124
2.1.3. Mono-hydrolyse du diester [55]... 125
2.1.4. Allongement de chaîne...126
2.1.5. Réduction de la cétone... 127
2.1.6. Hydrolyse de l’ester... 129
2.1.7. Synthèse du dérivé marqué...130
2.2. Synthèse de l’acide [16-^H]palmitique (l®*^ schéma)... 131
2.2.1. Acide de Meldrum (commercial)... 131
2.2.1. Réaction du chlorure d’acide [57] avec l’acide de Meldrum [62]...131
2.2.2. Réduction de la fonction énol...132
2.2.3. Hydrolyse et décarboxylation...134
2.3. Synthèse de l’acide [16-^H]palmitique (2® schéma)...135
2.3.1 Diacide en C-15... 135
2.3.2 Méthylation du diacide en C-15... 136
2.3.3. Mono-hydrolyse du diester en C-15... 137
2.3.4. Allongement de chaîne...138
2.3.5. Réduction de la cétone...139
2.3.6. Hydrolyse de l’ester... 140
Table des matières
IV2.3.7. Synthèse du dérivé marqué... 140
2.4. Synthèse de l’acide [18-^H]stéarique...141
2.4.1. Réaction du chlorure d’acide [75] avec l’acide de Meldrum... 141
2.4.2. Réduction des fonctions cétones...142
2.4.3. Hydrolyse et décarboxylation...143
2.4.4. Méthylation du diacide en C-17... 144
2.4.5. Mono-hydrolyse du diester [79]... 146
2.4.6. Allongement de chaîne... 147
2.4.7. Réduction de la cétone et hydrolyse de l’ester...148
2.4.8. Synthèse du dérivé marqué...148
2.5. Synthèse de l’acide [18-'^C]stéarique... 149
2.5.1. Halogénation du méthanol...149
2.5.2. Allongement de chaîne... 149
2.5.3. Réduction de la cétone... 150
2.5.4 Hydrolyse de l’ester... 151
2.6. Synthèse de l’acide [11,11,12,12,13,13,14,14,15,15,16,16,17,17,18,18,18- ^H]stéarique...152
2.6.1. Bromation de l’octanol... 152
2.6.2. Protection de l’alcool... 153
2.6.3. Réaction avec Li-C=CH : Formation de l’alcyne [93]... 154
2.6.4. Alkylation de l’alcyne [93]... 155
2.6.5. Hydrogénation de l’alcyne [95]...157
2.6.6. Déprotection de l’alcool dans [96]... 158
2.6.8. Synthèse du dérivé marqué...160
3. Incorporations in vitro chez les coccinelles... 162
3.1. Expérimental...162
3.2. Propriétés spectroscopiques... 163
3.2.1. Adaline [32]...163
3.2.2. Coccinelline [29]... 163
Abréviations
Techniques :
AS : activité spécifique AT : activité totale Cl : ionisation chimique El : ionisation électronique ESI : ionisation électrospray GC ; Chromatographie Gazeuse IR : Infrarouge
lUPAC : International Union of Pure and Applied Chemistry
Papier WA : filtre hydrophobe MACHEREY-NAGEL (MN 616 WA %) Rf : facteur de rétention
RMN : Résonance Magnétique Nucléaire Rt : temps de rétention en GC
SM : Spectrométrie de Masse
V
; nombre d’onde
TIS : taux d’incorporation spécifique RMN:
bm ; multiplet élargi bs : singulet élargi d : doublet
dt : doublet détriplé J : constante de couplage m : multiplet
s : singulet t : triplet
td : triplet dédoublé ô : déplacement chimique Solvants / Réactifs :
Acide myristique : acide tétradécanoïque Acide palmitique : acide hexadécanoïque Acide stéarique : acide octadécanoïque DH P : dihydropyrane
DMF : diméthylformamide
DMPU : N,N’-diméthylpropylurée DMSO : diméthylsulfoxyde Gin : glutamine
Glu : acide glutamique
HMPT ; hexaméthylphosphotriamide
PMSF ; fluorure de phénylmethylsulfonyle ou fluorure d’a-toluènesulfonyle PPTS : p-toluènesulfonate de pyridinium
p-TsOH : acide p-toluènesulfonique THF : tétrahydrofurane
THP : tétrahydropyrane
Tri-Sil : réactif PIERCE composé d’hexaméthyltrisilazane HMDS (10-20%) et de
triméthylchlorosilane TMCS (7-10%) dans la pyridine (65-80%)
Dans le cadre de ce travail, nous avons poursuivi l’étude de la biosynthèse d’alcaloïdes défensifs des coccinelles. Trois espèces ont été plus particulièrement étudiées : Adalia bipimctata (qui produit l’adaline [32]), Coccinella septempunctata (contenant la coccinelline [29]) et Harmonia axyridis (produisant l’harmonine [34]).
Afin d’identifier le (ou les) acide(s) gras précurseur(s) de ces alcaloïdes, nous avons dans un premier temps synthétisé des acides gras spécifiquement marqués. Nous avons ainsi préparé les acides [14-^H]myristique, [16-^H]palmitique, [18-^H]stéarique, [18-’^C]stéarique et [11,11,12,12,13,13,14,14,15,15,16, 16,17,17,18,18,18-^Hjstéarique.
Les différents acides gras marqués au tritium sur le méthyle terminal ont ensuite été incorporés successivement chez les trois espèces de coccinelles mentionnées ci-dessus, en utilisant la technique d’incorporation in vitro mise au point par Laurent et al.
Les incorporations chez Adalia bipimctata ont montré que l’acide myristique est incorporé préférentiellement dans l’adaline.
Chez Coccinella septempunctata par contre, l’acide stéarique est incorporé dans la coccinelline environ 25 fois plus efficacement que les acides myristique et palmitique.
Enfin, les incorporations chez Harmonia axyridis ont établi que l’acide stéarique est le
précurseur de l’harmonine. De plus, grâce à l’incorporation de l’acide
[11,11,12,12,13,13,14,14,15,15,16,16,17,17,18,18,18-^H]stéarique, le mécanisme de
formation de l’amine secondaire a été précisé.
INTRODUCTION
I. La défense chez les insectes.
Les insectes sont une classe d'invertébrés de l'embranchement des Arthropodes. Ils représentent environ 75 % des espèces animales, soit plus d’un million d’espèces décrites.
Leur corps est composé de trois parties (tête, thorax, abdomen) et se caractérise par la présence de trois paires de pattes, deux paires d'ailes et une paire d'antennes.
A l’instar de nombreux autres animaux, deux types de modes de défense peuvent être distingués chez les insectes : les modes de défense primaires qui agissent en l’absence de l’ennemi, et les modes de défense secondaires qui agissent en sa présence.
On distingue trois types de défense primaire :
• le cryptisme, c’est-à-dire la possibilité qu’ont certains insectes à se fondre dans leur environnement.
• l’aposématisme qui est la présence d’une coloration vive signalant à l’ennemi que l’insecte est défendu chimiquement.
• le mimétisme qui consiste à adopter les caractéristiques morphologiques d’une espèce sans posséder les capacités défensives de celle-ci.
Le phasme Lonchodes amaurops, un insecte
cryptique.
La chrysomèle Lilioceris lilii, un insecte
aposématique.
Le syrphe Syrphus ribesii, un insecte mimétique.
Les modes de défense secondaires opèrent, quant à eux, en présence du prédateur et ont
pour but d’augmenter les chances de survie en cas d’attaque. Ils regroupent divers
mécanismes tels que la capacité d’envols brusques, de sauts violents mais également la
présence de défenses physiques (mandibules, carapaces, dards, ...) et chimiques (substances
irritantes ou toxiques). Ce dernier mode de défense est très répandu chez les insectes et nous
nous y intéresserons plus précisément dans ce travail.
Les substances impliquées dans les mécanismes de défense chimique chez les insectes sont généralement des métabolites secondaires (alcaloïdes, terpènes, acétogénines, ...) possédant des structures très diversifiées. Ces molécules sont souvent caractéristiques d’une espèce en particulier et contribuent efficacement à l’aptitude de survie de celle-ci.
Dans le cadre de cette introduction, nous nous limiterons aux substances défensives appartenant à 1a classe des alcaloïdes.
II. Les alcaloïdes défensifs des insectes.
Durant de nombreuses années, il était considéré que la capacité à produire des alcaloïdes se limitait au règne végétal (les plantes à fleurs essentiellement). Il est maintenant clairement établi que certains animaux sont aussi capables de biosynthétiser ce type de métabolites secondaires, même si l’incroyable diversité de structures rencontrées chez les plantes est loin d’avoir un parallèle dans le règne animal. Chez ce dernier, on retrouve des alcaloïdes essentiellement chez les batraciens, les invertébrés marins et les insectes.
Chez les insectes, la majorité des alcaloïdes sont produits par des espèces appartenant à l’ordre des Coleoptera, des Lepidoptera et des Hymenoptera (essentiellement les fourmis). De nombreuses revues ont déjà été consacrées à la distribution à la structure et à la synthèse de ces métabolites secondaires.
Détailler tous les alcaloïdes isolés d’insectes serait fastidieux et surtout inutile, puisque de
telles listes existent déjà Nous nous contenterons donc de résumer ici quelques
exemples d’études biosynthétiques réalisées sur ces dérivés.
III. Etudes biosynthétiques d’alcaloïdes d’insectes.
L’étude de la biosynthèse de substances défensives d’insectes produites de novo n’a fait l’objet, jusqu’à présent, que de quelques travaux seulement. Dans la plupart de ces investigations, des expériences d’incorporation de molécules marquées ont permis de déterminer le précurseur biogénétique probable. Mais, en général, ni les enzymes responsables de la biosynthèse de la substance défensive, ni les intermédiaires métaboliques n’ont été caractérisés.
III.1. Les dytiques
Les dytiques sont des coléoptères aquatiques et carnassiers, aux élytres lisses chez le mâle et striées chez la femelle. A partir de leurs glandes défensives, ils produisent généralement des stéroïdes. Cependant, un alcaloïde, le 8-hydroxyquinoléine-2-carboxylate de méthyle [1], a été isolé des glandes prothoraciques défensives d'IIybius fenestratus. Bien que sa fonction en tant que toxine n’ait pas été prouvée, cet alcaloïde possède une activité antiseptique puissante et pourrait être utilisé par ces insectes contre les micro-organismes et autres parasites.
un exemple de dytique
Il a été montré que cet alcaloïde est biosynthétisé au départ du tryptophane.
L’incorporation de tryptophane marqué au sur le carbone du carbonyle conduit au marquage de la substance défensive uniquement sur le carbonyle de l’ester. En effet, une décarboxylation mène à la formation de la quinoléine [2] inactive.
Figure 1 : Schéma de dégradation du
8-hydroxyquinoléine-2-carboxylate de méthyle marqué.
111.2. Les staphylins
Les Staphylinidae sont des coléoptères carnassiers très répandus qui vivent dans les milieux humides. Ces insectes, mesurant entre 0,5 et 30 mm, se reconnaissent par leur abdomen allongé très mobile et leurs élytres très courts qui laissent à découvert une partie de celui-ci. Les larves et les adultes sont des prédateurs souvent utiles en agriculture car ils peuvent se nourrir de ravageurs agricoles.
L’hémolymphe des staphylins du genre Paederus contient une cytotoxine puissante, appelée pédérine [3], possédant des propriétés antitumorale et antivirale. Si l’insecte est écrasé accidentellement sur la peau, cette substance provoque une maladie appelée
« dermatitis linearis » caractérisée par des démangeaisons et des lésions de l’épiderme. En plus de cette propriété vésicante, elle bloque la mitose apparemment par inhibition de la synthèse des protéines et de l’ADN sans affecter celle de l’ARN, ce qui pourrait mener au traitement de cancers. Chez l’insecte, la production de la pédérine est limitée aux femelles adultes ; les larves et les mâles ne renferment que de la pédérine acquise par voie maternelle (c’est-à-dire provenant des œufs) ou par ingestion.
Le staphylin Paederus fuscipes. Pédérine [3]
Une étude biogénétique préliminaire de la pédérine a été réalisée ; elle consiste en
l’incorporation de précurseurs radioactifs tels que le [l-'^'C]acétate de sodium, le
de 50% de la radioactivité de la pédérine. En outre, les expériences d’incorporation avec les acétates de sodium marqués en C-1 ou C-2 montrent que le carbone C-4a provient exclusivement du carbone C-2 de l’acétate. L’ensemble de ces résultats indique une origine polycétide pour une partie du squelette carboné de la pédérine.
Il a été démontré ultérieurement que la pédérine n’est pas produite par l’insecte lui-même mais bien par un endosymbiote bactérien présent chez ces Paederus. Seulement environ 90%
des femelles contiennent de la pédérine. Lorsque les 10% de femelles restantes sont nourries avec des œufs porteurs de pédérine, elles possèdent alors l’alcaloïde et le transmettent à leur descendance. Le traitement des œufs contenant l’amide 13] par des antibiotiques ou la soumission de ceux-ci à des conditions extrêmes (refroidissement à -30°C ou chauffage à 80°C) entraîne la disparition de la production de pédérine, ce qui s’expliquerait par la présence d’une bactérie. L’isolement de l’ADN de l’endosymbiote responsable de cette biosynthèse a montré qu’il s’agissait d’une bactérie proche de Pseudomonas aeruginosa, un pathogène humain bien connu. (20,21,22)
Les bactéries symbiotiques ont souvent été proposées comme étant responsable de la
production d’un grand nombre de produits naturels isolés d’invertébrés, mais les études qui y
sont associées sont souvent rendues difficiles suite à des limitations techniques. En effet,
certains polycétides complexes sont exclusivement connus chez des microorganismes où ils •
sont biosynthétisés par des méga-enzymes multifonctionnelles appelées polycétide synthases
(PKS). LFne analyse détaillée de l’ADN bactérien de l’endosymbiote présent chez Paederus a
permis d’identifier un large système PKS contenant onze gènes et de proposer une hypothèse
biosynthétique qui est résumée dans la Figure 2.
Figure 2 : Proposition d’un chemin biosynthétique pour la pédérine [3].
111.3. Les chrysomèles
La famille des Chrysomelidae est une des plus importantes de l’ordre des Coleoptera puisqu’elle comporte plus de 32000 espèces. Les chrysomèles sont des insectes phytophages vivement colorés qui forment des agrégats denses sur leur plante hôte. Il n’est donc pas surprenant que des mécanismes de défense chimique très diversifiés se soient développés chez ces insectes. Structurellement, les substances défensives de chrysomèles adultes sont essentiellement des cardénolides, des glycosides triterpéniques, des dérivés d’acides aminés, des glycosides stéroïdiques polyoxygénés, des alcaloïdes pyrrolizidiniques et des glucosides d’isoxazolinone. Nous présenterons ci-dessous quelques exemples de chrysomèles dont les sécrétions contiennent des alcaloïdes.
III.3.1. Alcaloïdes pyrrolizidiniques
Pour leur défense contre les prédateurs, certaines chrysomèles séquestrent, de leurs plantes hôtes {Senecio, Betula, Alnus, Salix, Ipomoea, ...), des alcaloïdes pyrrolizidiniques dérivés de la nécine (hydroxyméthylpyrrolizidine), comme par exemple des esters de rétronécine [4]. En fonction de la nature de la plante-hôte et de la saison, la composition de la sécrétion défensive peut varier. Ces alcaloïdes existent sous deux formes interconvertibles ; l’amine tertiaire (c’est-à-dire la base libre) toxique et son N-oxyde non-toxique.
Chez les plantes, ces alcaloïdes pyrrolizidiniques sont exclusivement synthétisés dans les
racines et accumulés sous forme de N-oxydes. Les incorporations de traceurs effectuées par
Robins et Spencer ont permis d’établir une séquence biosynthétique plausible pour ces
alcaloïdes au départ de putrescine [5l (voir Figure 3).
esters de rétronécine [4| (-)-trachelanthamidine
Figure 3 : Séquence biosynthétique proposée pour les alcaloïdes pyrrolizidiniques chez les végétaux.
III.3.1.1. Oreina
Certaines espèces de chrysomèles du genre Oreina produisent, comme sécrétion défensive, des alcaloïdes pyrrolizidiniques, stockés sous leur forme N-oxyde, ainsi qu’éventuellement des cardénolides. Ainsi, par exemple, les N-oxydes de sénécionine [6] ou de sénéciphylline [8j ont été isolés chez ces espèces.
La chrysomèle Oreina cacaliae
[6] sénécionine N-oxyde [7] sénécionine (base libre)
Chez Oreina cacaliae, l’incorporation de sénécionine [7] et de son N-oxyde [6], marqués
au '"*C, montre que ces chrysomèles ont développé, outre un mécanisme qui empêche la
III.3.1.2. Platyphora
Chez les espèces du genre Platyphora, les sécrétions défensives se composent de saponines triterpéniques pentacycliques ou d’alcaloïdes pyrrolizidiniques. Dans ce deuxième cas, la défense chimique basée sur ces alcaloïdes diffère remarquablement de celle décrite chez Oreina. En effet, des dérivés de la lycopsamine |9J ou des esters de rétronécine |4] ont été isolés, exclusivement sous leur forme amine tertiaire.
Ainsi, Platyphora boucardi séquestre de sa plante hôte, Prestonia portobellensis, des alcaloïdes pyrrolizidiniques tertiaires de type lycopsamine [9] et synthétisent leurs propres alcaloïdes au départ de rétronécine [10] exogène et de 2-hydroxyacide aliphatique.
L’utilisation de traceurs, comme la [''*C]rindérine [11] et son N-oxyde, révèle que P. boucardi séquestre les deux formes alcaloïdiques avec la même efficacité mais qu’elle accumule exclusivement l’alcaloïde tertiaire dans ses glandes défensives.
[9] lycopsamine [ iq ] rétronécine IH] nndérine
[12] intermédine [13] 0^-lactyl-0^-(2-hydroxyisovaleryl)-retronécine
De plus, l’incorporation d’alcaloïdes pyrrolizidiniques marqués tels que les
[^H][''*C]rindérine [11] et [^H]['‘^C]rétronécine [10] montre que les chrysomèles P. boucardi
épimérisent spécifiquement la rindérine [11] au niveau du C-7 en ses stéréoisomères
lycopsamine [9] et intermédine [12] et synthétisent de nouveaux alcaloïdes en estérifiant la
rétronécine [10] en, par exemple, 0^-lactyl-0^-(2-hydroxyisovaleryl)-retronécine [13].^^*^ Des
incorporations similaires chez P. eucosma et P. bella ont confirmé les résultats obtenus chez
P. boucardi.
III.3.2. Défense chez Chrysomela tremulae
Les adultes de la sous-tribu Chrysomelina libèrent, de leurs glandes élytrales et pronotales, des glucosides de A^-isoxazolin-5-one [14] estérifiés par une ou plusieurs unités acide 3-nitropropanoïque |15] (Figure 4), par exemple [16J et [17].
La chrysomèle Chrysomela tremulae
[16] R=C0-(CH2)2N02 ; R’=H [17] R=R’=C0-(CH2)2N02
Ces composés n’étant pas présents dans la plante hôte des insectes, ils sont synthétisés de novo par l’insecte. L’incorporation d’acide L-[U-'‘*C]aspartique, chez des adultes de Chrysomela tremulae, démontre que cet acide aminé est un précurseur de la A^-isoxazolin-5-one [14] et de l’acide 3-nitropropanoïque [15], Le schéma de biosynthèse proposé nécessite une série d’étapes d’oxydation et la décarboxylation de l’acide L-aspartique (voir Figure 4).
/ COOH HOOC-CH-CH
''
nh.
[O]
/ COOH HOOC-CHj-C-" H
^NO,
H00C-CH^CH^NH2
JO]
COOH HOOC-CH-C " H
^NHOH -CO,
-CO2
III.4. Les lépidoptères
Les lépidoptères, plus communément appelés papillons, sont un ordre d’insectes caractérisés par deux paires d’ailes recouvertes d’écailles. Ils sont majoritairement phytophages mais quelques espèces sont zoophages ou saprophages. Les papillons sont diurnes, crépusculaires ou nocturnes selon la famille à laquelle ils appartiennent. Ils ont une grande importance comme insectes pollinisateurs, cependant plusieurs sont considérés comme des ravageurs.
III.4.1. Les alcaloïdes chez les Lepidoptera.
Le lépidoptère Callimorpha [Tyria] jacobaeae, papillon diurne brillamment coloré, utilise un alcaloïde d’origine exogène comme substance défensive. En effet, il séquestre, entre autres, de la sénécionine [7] des plantes du genre Senecio dont il se nourrit, pour la transformer en callimorphine [18]. Cet alcaloïde pyrrolizidinique n’est pas présent dans la plante hôte à partir de laquelle les larves se nourrissent. Chez ces larves, l’incorporation de ['"^CJrétronecine [10] a permis d’obtenir de la callimorphine [18] exclusivement marquée sur la partie bicyclique, et celle de ['“^CJisoleucine a mené à l’alcaloïde marqué sur la chaîne latérale. Ceci démontre la transformation, par l’insecte, de l’alcaloïde présent dans la plante en sa substance défensive (hydrolyse de l’ester de l’alcaloïde végétal suivie d’une réestérification).
Le lépidoptère Callimorpha jacobaeae [18] callimorphine
Alors que les lépidoptères femelles produisent principalement des phéromones sexuelles dérivées d’acides gras, les papillons mâles émettent des substances possédant une grande diversité de structures. La plupart du temps, ces molécules dérivent de produits naturels provenant de l’alimentation des larves ou de composés séquestrés de la plante par l’adulte.
Ainsi, l’hydroxydanaidal [191 isolé chez le lépidoptère mâle Creatunotos transiem dérive de l’héliotrine [20].
li
Le lépidoptère Creatonotos transiens
[19] R-(-)- hydroxydanaidal
L’incorporation d’héliotrine [20] et d’épihéliotrine, spécifiquement deutériés sur le C-7,
chez des larves de Creatonotos transiens a permis d’établir le mécanisme par lequel ce
papillon réalise l’inversion de configuration au niveau du C-7 lors de la biosynthèse de la
phéromone mâle R-hydroxydanaidal au départ de S-héliotrine.
Dans la même étude des larves d'Utetheisa ornatrix sont soumises à une diète exempte d’alcaloïdes afin qu’elles ne produisent plus le R-hydroxydanaidal [19], Ensuite, l’injection de R-monocrotaline [21], de chlorhydrate de R-monocrotaline ou de S-héliotrine [20] dans ces larves a montré que seule la R-monocrotaline [211 et son chlorhydrate mène à la production de l’alcaloïde défensif [19]. Dans la nature, ces papillons ont un régime leur apportant uniquement des alcaloïdes pyrrolizidiniques possédant une configuration 7R (monocrotaline, usaramine). L’incapacité à utiliser la S-héliotrine pour biosynthétiser l’alcaloïde défensif pourrait donc être l’illustration d’un manque d’exposition aux alcaloïdes de configuration 7S durant l’évolution.
Le lépidoptère Utetheisa ornatrix.
III.4.2. Absorption des alcaloïdes pyrrolizidiniques dans les glandes défensives chez les Lepidoptera.
Pour expliquer l’absorption des alcaloïdes pyrrolizidiniques chez les insectes qui les séquestrent, deux mécanismes sont possibles :
(a) l’existence d’un transporteur spécifique qui favorise la captation des N-oxydes comme suggéré par Wink et al
(b) la réduction du N-oxyde dans l’intestin, la captation de l’alcaloïde tertiaire sous sa forme non-protonnée par simple diffusion (intestin ^ hémolymphe) suivie par une rapide re-N-oxygénation dans l’hémolymphe.
La différence entre ces deux mécanismes a pu être mise en évidence par des
incorporations de senecionine N-oxyde [6[ doublement marqué ('"^C et '*0) chez des larves de
papillons du genre Creatonotos et Arctia et chez des adultes de sauterelles du genre
Zonocerus. Ces expériences ont montré que l’'®0 était totalement remplacé par du '^O
dans le senecionine N-oxyde isolé dans l’insecte, ce qui est en accord avec le second
mécanisme. La N-oxydation de l’amine dans l’hémolymphe est catalysée par une monooxygénase spécifique (SNO : sénécionine N-oxygénase).
[6] senecionine N-oxyde hémolymphe [7] senecionine - hydrophile, très polaire - lipophile, non polaire
- incapable de traverser les membranes - capable de traverser les membranes
- non toxique - potentiellement toxique
111.5. Les fourmis
Classées au sein de l’ordre des hyménoptères, comme les abeilles et les guêpes, les fourmis (famille des Formicidae) sont des insectes sociaux formant des colonies appelées fourmilières. Celles-ci sont parfois extrêmement complexes et contiennent de quelques dizaines à plusieurs millions d’individus. Les fourmis présentent une incroyable diversité de régimes alimentaires, puisqu’elles tirent parti de tout ce qui peut être consommable.
III.5.1. Les fourmis Solenopsis.
Les fourmis du genre Solenopsis, également appelées « fourmis de feu » (originaires d’Amérique du Sud), sont plus agressives que la plupart des autres fourmis et se distinguent par leur piqûre douloureuse. Elles se servent de leurs mâchoires pour s’accrocher et injectent leur venin à l’aide d’un dard situé à l’extrémité de l’abdomen. Ce venin est composé d’un mélange de 2-méthyl-6-alkylpipéridines [22] à [27] accompagné dans certains cas de dérivés N-méthylés, imino ou ayant une chaîne latérale insaturée. Ces alcaloïdes pipéridiniques ont été appelés solénopsines et diffèrent l’un de l’autre par la configuration relative des substituants, la longueur et les insaturations de la chaîne latérale.
La fourmi Solenopsis geminata
(CH2)„CH3
[22) : n=10, c/s-solénopsine A [23] : n=12, CK-solénopsine B
|24] : n=14, c«-solénopsine C
[25| : n=10, lra«5-solénopsine A [26) : n=12, /ra«5-solénopsine B [27] : n=14, /ram-solénopsine C
Figure 6 : Structures de solénopsines naturelles.
Une étude biosynthétique réalisée chez les fourmis Solenopsis geminata (produisant
majoritairement les cA/tram-solénopsines A) montre que la solénopsine A est un polyacétate
aminé. En effet, l’incorporation de [l-'^C]- et [2-’'*C]acétate de sodium, suivie d’une
dégradation des alcaloïdes radioactifs obtenus, démontre que les solénopsines sont
biosynthétisées au départ d’une chaîne polyacétate à 18 carbones selon une des deux voies
décrites dans la Figure 7.
O
Figure 7 : Hypothèse biosynthétique des cis et irons solénopsines A.
III.5.2. Les fourmis Tetraponera.
Originaire de Papouasie Nouvelle-Guinée, la fourmi du genre Tetraponera est
exceptionnelle par son comportement défensif particulier. En effet, en cas d’attaque, elle
badigeonne la cuticule de son adversaire de sa sécrétion défensive, au moyen de son aiguillon
en forme de tire-ligne. Cette sécrétion a des propriétés neurotoxiques et insecticides, ce qui
entraîne une fuite désordonnée de la victime suivie d’une paralysie partielle.
L’analyse de cette sécrétion par chromatographie gazeuse montre qu’elle est composée de huit alcaloïdes, appelés tétraponérines 1 à 8 (Tl à T8). D’un point de vue structural, ces alcaloïdes se répartissent en deux familles basées sur deux squelettes différents :
• la 5-alkyldécahydro-5H-pyrido[l,2-c]-pyrrolo[r,2’-a]-pyrimidine (squelette ‘6-6-5’)
• la 5-alkyldécahydro-5H-dipyrrolo[l,2-a: 1 ’,2’-c]-pyrimidine (squelette ‘5-6-5’)
Dans chaque famille, les composés diffèrent par la longueur de la chaîne latérale et/ou par la configuration de l’atome de carbone qui la porte.
R=n-C3H7 (+)-T4 R=n-CsH„ (+)-T8
R=n-C3H7 (+)-T3 R=n-CsH,, (+)-T7
R=n-C3H7 (+)-T2 R=n-C,H„ (+)-T6
R=n-C3H7 (+)-T1 R=n-C5H,, (+)-T5 Figure 8 : Structures des tétraponérines naturelles.
Une étude réalisée sur T8 (‘6-6-5’), majoritaire dans le venin, a permis d’établir une
origine biogénétique mixte pour ce composé. L’administration de [1-'"^C]- et de [2-''*C]acétate
de sodium, d’acide L-[U-'"^C]glutamique, d’acide y-amino-[U-’''C]butyrique, de chlorhydrate
de L-[U-''^C]omithine et de dichlorhydrate de [l,4-'‘*C2]putrescine chez ces fourmis a permis
de démontrer que le cycle pyrrolidinique dérive de l’acide L-glutamique via la L-omithine et
la putrescine [5], alors que les douze atomes de carbone restants dérivent d’une chaîne
polyacétate formée au départ de six unités d’acétyl CoA. (Figure 9)
COOH COO NHax
1
!
2 V.
acide L-glutamique L-ornithine
H N
H H
^5^11
putrescine
[5] T8
Figure 9 : Schéma biosynthétique proposé pour T8.
H>0
Par contre, les mêmes expériences d’incorporation suivies d’une dégradation de la tétraponérine T6 (‘5-6-5’) marquée montrent que la putrescine [5] est le précurseur des deux cycles pyrrolidiniques de cet alcaloïde tandis que les atomes de carbone restants proviennent d’une chaîne polyacétate à 8 carbones. (Figure 10)
Figure 10 : Schéma biosynthétique proposé pour T6.
Ces résultats montrent que deux chemins différents sont utilisés chez le même organisme
pour la biosynthèse des deux types d’alcaloïdes.
III.6. Les Coccinelles.
III.6.1. Généralités sur la défense des coccinelles
Les coccinelles constituent notre sujet de travail, c’est pourquoi nous nous attarderons plus longuement sur leur mode de défense.
La famille des Coccinellidae, appartenant à l’ordre des Coleoptera, comporte plus de 5200 espèces répandues dans le monde entier. Elle est subdivisée en sept sous-familles : Sticholotidinae, Chilocorinae, Scyminae, Coccidulinae, Ortaliinae, Coccinellinae et Epilachninae. Bien qu’il existe des espèces phytophages et d’autres mycophages, la plupart des coccinelles sont prédatrices. Grâce à leur régime alimentaire, elles sont au cœur d’une lutte biologique contre les insectes ravageurs tels que les pucerons ou les cochenilles.
Comme pour de nombreux insectes, le cycle de vie des coccinelles débute par un œuf qui éclot pour donner une larve. Celle-ci évolue ensuite en pupe puis se métamorphose en adulte (Figure 11 et Figure 12).
Figure 11 : cycle de vie de
Coccinella septempunctata. Figure 12 : les différents stades morphologiques de la coccinelle mexicaine Epilachna varivestis
(oeuf, larve, pupe, adulte).
Si on exclut les coccinelles de couleurs ternes qui peuvent facilement se camoufler, un bon nombre de ces insectes est caractérisé par des couleurs vives allant du rouge-orange au jaune. En dépit de ces caractéristiques à priori défavorables à leur survie, elles sont rarement
la proie des prédateurs (oiseaux, insectes, araignées, coccinelles, ...).
Dès qu’elles se sentent attaquées, les coccinelles s’immobilisent et adoptent l’attitude d’un individu mort (thanatose). Elles sécrètent alors de petites gouttelettes jaunâtres, à l’odeur âcre, au niveau des articulations tibio-fémorales de leurs pattes. Ce processus est appelé « saignée réflexe ». L’odeur caractéristique de ce fluide est due à la présence de méthoxypyrazines [28], des composés volatils qui servent à la fois d’allomones et de phéromones d’agrégation 46,47,48)^ tandis que des alcaloïdes répulsifs, et dans certains cas toxiques, confèrent au liquide un goût amer très désagréable.
^N^^OMe [28]
R = i-Pr, s-Bu, i-Bu
Pratiquement, chaque espèce de coccinelles synthétise un mélange d’alcaloïdes qui lui est propre. Jusqu’à présent, une cinquantaine d’alcaloïdes de coccinelles ont été isolés et caractérisés. Structurellement, ils se rattachent à des squelettes très différents ; perhydroazaphenalène (ex. la coccinelline [29]), pipéridine (ex. la calvine [30]), azamacrolide (ex. l’épilachnène [31]), homotropane (ex. l’adaline [32]), 3-oxaquinolizidine (ex.
l’hyperaspine [33]) ou diamine acyclique (ex ; l’harmonine [34])
H
[29] coccinelline [30] calvine [31] épilachnène
[32] adaline [33] hyperaspine [34] harmonine {Adalia bipunctata) (Hyperaspis campestris) {Harmonia axyridis)
L’efficacité de ces alcaloïdes vis-à-vis des prédateurs potentiels a fait l’objet de différentes études sur des araignées, des cafards, des fourmis, des oiseaux et d’autres coccinelles.
A l’heure actuelle, il est donc clairement établi que les coccinelles doivent leur protection, du moins en partie, à la présence de ces alcaloïdes répulsifs et parfois toxiques dans leur hémolymphe. Ceux-ci n’ont jamais été mis en évidence chez leurs proies, ce qui suggère qu’ils sont biosynthétisés de novo. Des études réalisées à l’Université de Comell (New York) et à l’Université de Bruxelles ont permis de démontrer que la biosynthèse de plusieurs de ces alcaloïdes est liée au métabolisme des acides gras.
III.6.1. La coccinelle mexicaine Epilachna varivestis.
La coccinelle phytophage Epilachna varivestis produit un grand nombre d’alcaloïdes défensifs de structures très différentes. Par exemple, l’épilachnène ]31] est l’azamacrolide majoritaire sécrété par les cheveux glandulaires des pupes tandis que l’euphococcinine [35]
représente 90% des alcaloïdes présents dans l’hémolymphe de l’adulte.
Des incorporations d’acide [^HJoléique (acide (Z)-9-[9,10-^H3]octadecènoïque), de L-[2,3,3-^H3]sérine et de L-[2-'^C, '^NJsérine ont permis d’établir l’origine biogénétique de l’ensemble des atomes du squelette de l’épilachnène [31], Ainsi, la formation de cet alcaloïde implique la perte de quatre atomes de carbone (C-1 à C-4) de l’acide oléique (vraisemblablement via deux p-oxydations) et l’addition des deux carbones du p-aminoéthanol généré au départ de sérine. (Figure 13)
COOH
Ce processus biosynthétique implique une étape d’amination de l’acide gras, par fonctionnalisation du méthylène 15 de l’acide oléique. Des expériences d’incorporation de dérivés deutériés de l’acide oléique (marqués ou non sur le C-15) montrent que seul le méthylène 15 est impliqué dans le mécanisme de formation du lien C-N. L’hydroxylation de l’acide oléique sur le C-15 (ou sur le site correspondant après raccourcissement de la chaîne), l’oxydation en la cétone correspondante, la formation de la base de Schiff par réaction avec la sérine et la réduction stéréospécifique de l’imine fournissent l’alcaloïde après lactonisation. (Figure 14)
/CH, \
CH-OH X=0 ,C=NR .CH-NHR
/ / / /
Figure 14 : mécanisme postulé pour la formation du lien C-N dans l’épilachnène.
III.6.2. La coccinelle Cryptolaemus montrouzieri.
La sécrétion défensive de la coccinelle Cryptolaemus montrouzieri consiste en trois alcaloïdes liés biogénétiquement. Les deux premiers ont été identifiés comme étant la cis-l-(6-méthyl-2-piperidyl)propan-2-one [37] et la l-méthyl-9-azabicyclo[3,3,l]nonan-3-one ou euphococcinine [35]. Le troisième, rapidement isomérisé en [37], pourrait être son isomère trans.
Biosynthétiquement, le dérivé pipéridinique [38], très proche de [39] isolé d'Epilachna varivestis, pourrait être le précurseur des composés [37] et [35].
Figure 15 : relation biogénétique possible entre les alcaloïdes pipéridiniques et homotropane isolés de Epilachna varivestis et de Cryptolaemus montrouzieri.
Il est intéressant de noter que l’alcaloïde [37] a été isolé des pins des genres Pinus et Picea. Chez ces pins, des expériences d’incorporation d’acétate de sodium marqué au '"'C ont démontré que la condensation linéaire de cinq unités acétates conduit au poly-p-cétoacide [40] qui, après réduction, décarboxylation et fixation d’un atome d’azote, génère la pinidine [41] via la 1,2-déhydropinidinone [39], alcaloïde également isolé de Pinus. Cette imine jouerait dès lors le rôle d’intermédiaire clé entre le polyacétate [40] et les alcaloïdes [35],
[37], ]41], [42] et [43].
Figure 16 : biosynthèse des alcaloïdes de Pinus.
III.6.3. Les coccinelles Subcoccinella 24-punctata et Epilachna borealis.
La sécrétion des cheveux glandulaires des pupes de Subcoccinella 24-punctata consiste majoritairement en trois macrocycles (par exemple [44]) qui correspondent aux trois dimères possibles des deux acides 2-hydroxyéthylaniino insaturés [45] et [46|.
Par contre, la sécrétion pupale de la coccinelle Epilachna borealis est composée de plus d’une centaine de polyamines macrocycliques (par exemple [47]). Cette nouvelle famille de produits naturels est caractérisée par des polylactones macrocycliques qui sont formées par oligomérisation des trois homologues acides (2-hydroxyéhylamino) saturés [48], [49] et [50], Ces éléments sont incorporés dans les oligomères de manière aléatoire.
La sécrétion fraîche d’Æ’. borealis ne contient pas d’azamacrolides monomériques, ce qui
indique que l’oligomérisation est un processus bien contrôlé. Ceci est aussi supporté par le fait
que les sécrétions des pupes à'E. varivestis et de Subcoccinella 24-punctata contiennent
III.6.4. La coccinelle européenne Coccinella septempunctata.
Chez Coccinella septempunctata, la coccinelline [29] a été mise en évidence à la fois dans les œufs, les larves et les adultes, sans jamais avoir été détectée dans les pucerons dont cette espèce se nourrit. Elle doit donc être synthétisée par l’insecte lui-même, par exemple au départ d’un groupe amino-donneur et d’une chaîne polyacétate comportant sept unités d’acide acétique (voir Figure 17).
7 CH
3COOH
Figure 17 : hypothèse de hiosynthèse de la coccinelline [29].
Cette première hypothèse de biosynthèse a été étayée par des expériences d’incorporation de précurseurs radioactifs tels que le [l-'^^C]- et le [2-'"*C]acétate de sodium. Les échantillons radioactifs de coccinelline isolés après chaque expérience d’incorporation ont été transformés en leur chlorhydrate puis soumis à une oxydation de Kuhn-Roth (Cr03/H2S04).
Cette dégradation fournit de l’acide acétique isolé sous forme du N-P-naphtylacétamide ]52], lequel contient les carbones C-2 et C-10 de la coccinelline [29].
H
1 ) Kuhn-Roth 2) Dérivatisation . HCl
—--- i
[52] N-P-naphtylacétamide
" 10
Figure 18 : schéma de dégradation de la coccinelline [29].
Dans les deux expériences, le dérivé naphtyle contient environ 16% de l’activité
spécifique totale de la coccinelline, ce qui est compatible avec le schéma de biosynthèse
proposé et permet d’écarter l’hypothèse d’une chaîne à six unités acétate qui aurait subi une
méthylation ultérieure, par la S-adénosylméthionine par exemple.
III.6.5. La coccinelle européenne Adalia bipunctata
La sécrétion défensive de la coccinelle Adalia bipunctata est composée majoritairement d’adaline [32] et d’adalinine [53]
H
H 10
12 14[53] adalinine
Les expériences d’incorporation identiques à celles effectuées chez les coccinelles à sept points ont été réalisées chez Adalia bipunctata. En effet, le schéma de biosynthèse proposé pour la coccinelline [29] pourrait conduire au squelette 9-azabicyclo[3.3.1]nonan-3-one de l’adaline [32] grâce à une cyclisation différente (voir Figure 19).
7 CH
3COOH
*
Figure 19 : hypothèse de biosynthèse de l’adaline [32].
L’incorporation d’acétate marqué au chez Adalia bipunctata fournit de l’adaline
radioactive. Cette dernière est engagée dans un schéma de dégradation qui permet l’isolement
du carbone du carbonyle sous forme d’acide benzoïque.
La distribution de la radioactivité dans l’acide benzoïque (16% lors de l’incorporation de [l-'"*C]acétate et 0% avec du [2-'"^C]acétate) est compatible avec l’hypothèse que l’adaline [32] est formée, comme la coccinelline [29], par condensation de sept unités acétate.
De plus, l’incorporation de (-)-[10,10,l 1,11,12,12,13,13,14,14,14-^Hnjadaline.HCl mène à la (-)-[10,10,l 1,11,12,12,13,13,14,14,14-^Hii]adalinine, ce qui démontre l’existence d’une relation biogénétique entre ces deux alcaloïdes. Par contre, l’incorporation de (+)-adaline deutériée ne fournit pas d’adalinine deutériée, ce qui prouve que la transformation est stéréospécifique. Un schéma biogénétique de transformation de l’adaline en adalinine est présenté dans la Figure 21.
C5H1,
réarrangement sigmatropique [3,3]
N -CgH,,
Figure 21 : chemin biogénétique possible entre la (-)-adaline [32]
et la (-)-adalinine [53].
III.6.6. Incorporations in vitro chez Adalia bipunctata et Coccinella septempunctata.
Les techniques d’incorporation utilisées jusqu’ici consistaient à nourrir les insectes avec des aliments imprégnés de précurseurs marqués. Cette méthode nécessite du temps et aboutit à des taux d’incorporation spécifique assez faibles. C’est pourquoi les chercheurs se sont tournés vers une méthode de production in vitro de substances défensives d’insectes au départ d’une suspension de tissus. Cette technique leur a permis d’explorer de manière plus précise le schéma de biosynthèse des alcaloïdes de coccinelles.
Trois points ont été particulièrement étudiés :
1°) l’origine biogénétique de l’atome d’azote dans les alcaloïdes
2°) la distinction entre la voie des acétogénines et celle des acides gras
/ \
HOOC
7 CH3COOH
Acide gras
O
HOOC
Polycétide
Figure 22 : voies de biosynthèse possibles.
3°) l’organe responsable de la synthèse des alcaloïdes (corps gras, hémolymphe, tube digestif, cuticule,...)
Lors d’une incorporation in vitro, des tissus de coccinelles sont plongés dans une solution saline (154mM NaCl, 2.7mM KCl, 2.7mM CaCl2, 0.9mM NaHC03 et 83pM NaH2P04) à 25°C contenant du fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), un inhibiteur de protéases qui minimise la dégradation des protéines et donc des enzymes. Ensuite, un précurseur marqué ([1-'‘*C]- ou [2-'‘^C]acétate de sodium) est ajouté en même temps qu’un réducteur (du NADPH) et une source d’azote. De l’air est introduit dans le milieu tout au long de l’expérience. L’alcaloïde est isolé après filtration et purification par chromatographies successives.
air
air
tissus de coccinelles _ • •
0.9 mM NaHCOj, 83 pM NaH
2PO
4)
air bullé
Pour identifier l’origine de l’atome d’azote, plusieurs acides aminés (L-alanine, L-glutamine, L-acide glutamique, L-lysine) et le NH4CI ont été testés. Les résultats de ces différentes expériences d’incorporation (voir Figure 24) montrent sans équivoque que la L-glutamine est le donneur d’azote dans la biosynthèse de l’adaline.
Concernant la nature du précurseur carboné, des expériences en l’absence d’oxygène et en présence d’acide 2-octynoïque, un inhibiteur de la biosynthèse des acides gras, ont été réalisées. Elles montrent clairement que l’adaline est biosynthétisée selon la voie des acides gras puisque aucun alcaloïde n’est produit dans ces conditions.
Afin de déterminer la nature de l’organe responsable de la biosynthèse, les corps gras des coccinelles ont été séparés du reste de l’insecte. Cet organe, également appelé tissu adipeux, est le siège de nombreux processus métaboliques. C’est au niveau de cet organe que se réalisent les transformations des glucides, des lipides, des acides aminés et des protéines chez les insectes. Il sert également d’organe de stockage de ces molécules qui sont déversées dans l’hémolymphe selon les besoins. Il pourrait donc être l’organe responsable de la biosynthèse des alcaloïdes chez les coccinelles, ce que l’expérience réalisée a prouvé.
Nature du donneur d'azote
TIS (%)
18h - [2-i‘‘C]acetatede sodium - L-glutamine-O2
L-lysine
NH4CI
TIS (%)
Origine "acide gras” de Fadaline
18h - [2-''*C]acetate de sodium - L-glutamine-
en présence d'acide 2-octynoïque
“ W
Organe responsable de la biosvnthèse de la coccinelline chez Coccinelïa septempunctata
Corps gras
L-alanine Acide L-glutamique Sous atmosphère d'azote
18h - [2-^‘HTJacetate de sodium - L-glutamine-
"restes"
Figure 24 : résultats obtenus lors des différentes incorporations in vitro.
En conclusion, ces expériences de production in vitro d’alcaloïdes défensifs de coccinelles
ont permis de montrer que la L-glutamine est la source d’azote, que ces alcaloïdes sont
probablement formés selon la voie des acides gras et que le corps gras est l’organe
responsable de la biosynthèse de ceux-ci. Les taux d’incorporation spécifique obtenu par
cette méthode sont dix fois supérieurs à ceux de la technique dite « alimentaire ».
Grâce à tous ces résultats, une nouvelle hypothèse de biosynthèse de l’adaline [32] et de la coccinelline [29] a été proposée (voir Figure 25).
1. Glutamine amidotransférase 2. [H]
^ Gin
^Glu
1. Glutamine amidotransférase
Gin
2. [H] Glu
HOOC
O
[32[ adahne
l.[H]
' 2. Aldol ' -CO, H
[29] coccinelline
Figure 25 : Hypothèse de biosynthèse de l’adaline [32] et de la coccinelline [29].
IV. Généralités concernant la biosynthèse
Avant d’entamer la description de nos recherches, il nous a paru intéressant de rassembler ici quelques unes des réactions biosynthétiques fondamentales qui interviennent dans la biosynthèse des alcaloïdes de coccinelles, ainsi que de décrire brièvement l’utilisation des marqueurs isotopiques.
IV.1. L’approche biosynthétique
Par définition, la biosynthèse d’un métabolite secondaire est la séquence métabolique qui mène à la formation de ces molécules organiques complexes en milieu biologique au départ des métabolites primaires (carbohydrates, acides aminés, acides gras, bases puriques et pyrimidiques, etc...) (voir Figure 26).
Figure 26 : lien entre le métabolisme primaire et les grandes
classes de métabolites secondaires.
Les métabolites secondaires sont biosynthétisés par une séquence de réactions qui, à quelques exceptions près, sont catalysées par des enzymes. Dans la plupart des cas, un cofacteur (comme le NAD^, le NADPH ou le HSCoA) participe également à la réaction.
L’élucidation de la biosynthèse d’une substance est complète lorsque tous les intermédiaires de la séquence sont connus, lorsque les enzymes qui catalysent chaque étape ont été caractérisées et que les cofacteurs nécessaires ont été identifiés. En outre, la stoechiométrie, la cinétique et le mécanisme de chaque étape catalysée par une enzyme doivent être compris. Cependant, les connaissances actuelles sont loin d’atteindre cet idéal.
En ce qui concerne les alcaloïdes de coccinelles, leur biosynthèse s’appuie essentiellement sur les réactions biosynthétiques suivantes :
les réactions d’aldolisation ou de Claisen qui sont à la base de la formation des chaînes polyacétates.
la réaction de Mannich avec la formation d’une base de Schiff qui conduit à la formation de liens C-N.
les réactions d’oxydations et de réductions.
IV.2. Les réactions biosynthétiques
IV.2.1. Réactions d’aldolisation ou de Claisen
Les réactions d’aldolisation ou de Claisen permettent toutes deux la formation d’une nouvelle liaison carbone-carbone. En catalyse basique classique, ces réactions nécessitent la formation d’un anion énolate stabilisé par résonance.
Y
SCoA
O
+ 3
XO O
SEnz
poly-P-cétoester
acide orsellinique phloracétophenone
Figure 27 : exemple de réaction de Claisen ou d'aldolisation dans la biosynthèse d'une substance naturelle.
Dans la plupart des cas, la réaction biologique fait intervenir des thioesters du coenzyme
A, en l’occurrence l’acétyl-Co A. La présence d’un thioester permet d’augmenter l’efficacité
des réactions de type aldolisation et Claisen. En effet, les hydrogènes du méthylène en a sont
plus acides et facilitent la formation de l’anion énolate. De plus, le thioester est un meilleur
groupe partant qu’un ester classique.
H,C^ ^SCoA
Y O
acétyl-CoA
HS>
H,C. G H®.
,SCoA
NH,
0 O
Il II
O—P—O—P—O—CH
1 I
OH OH
Coenzyme A (HSCoA)
O
HO—P—O OH I
OH
Figure 28 : acétyl-CoA.
Des réactions d’aldolisation et de Claisen inverses peuvent également avoir lieu lors de la modification de molécules naturelles. La réaction de Claisen inverse est une des réactions principales du catabolisme des acides gras par P-oxydation (voir Figure 29). Ainsi, une unité d’acétyl-CoA est clivée de la chaîne d’acide gras, qui perd ainsi deux carbones du côté de l’acide carboxylique.
déshydrogénation FAD FADH,
SCoA R
H^O
déshydrogénation NAD^ NADH
acyl-CoA C,„
SCoA hydratation R stéréospécifique de la double liaison
SCoA
O O
.AA
réaction de Claisen inverse
O
SCoA HSCoA
A...A
SCoA HjCacyl-CoA
^2n-2
SCoA acétyl-CoA
