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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Werenne, J. (1969). Mode d'action des acridines: Perturbation par la Proflavine des fonctions de l'acide ribonucléique de transfert (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

FacultÉ des Sciences

Service de Chiniie Biologique

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COMMUNiCATiON AUTORISEE

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I

MODE D'ACTION DES ACRiOINÉS ;

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Perturbation par la Prollavine des tonctions de

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l'acide ribonuciéique de transfert

Mémoire présenté pour l'obtention du

grade de Docteur en Sciences Chimiques

Service de Gliimie Biologique

COMMUNICATION AUTORISEE

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MODE D'ÂCTION DES ACRIDINES ;

Perturbation par la Prollavine des tonctions de

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l'acide ribonucléique de transfert

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Mémoire présenté pour l'obtention du

grade de Docteur en Sciences Chimiques

WERENNE John

Nous tenons à exprimer toute notre reconnaissance à Monsieur

le Professeur Chantrenne f tout au long de ce travail, il n'a

cessé, par ses conceils judicieux, de nous encourager à pour­

suivre cette étude, dans la voie qu'il nous a laissé choisir

en toute liberté.

Nous remercions Messieurs les Professeurs Brachet, Errera,

Jeener, Thomas et Schram de nous avoir permis de profiter de

l'équipement de leur laboratoire. Bien souvent aussi, nous avons

pu emprunter dans le service de Monsieur le Professeur Wiame

l'un ou l'autre produit qui nous manquait ; nous le remercions

bien sincèrement de sa bienveillance.

Nous avons pu effectuer certaines expériences dans le labo­

ratoire du Professeur Desreux à l'Université de Liège où le Pro­

fesseur Fredericq nous a toujours accueilli avec une extrême ama­

bilité dont nous le remercions vivement ; nous avons pris grand

plaisir à travailler dans ce laboratoire en collaboration avec

Monsieur Houssier dont l'expérience des techniques utilisées et

la gentillesse, nous ont toujours facilité la tâche.

Nous remercions Monsieur le Professeur Ebel de nous avoir

proposé d'effectuer un stage de recherche dans son laboratoire.

Les expériences effectuées à Strasbourg ont été réalisées en

collaboration avec Madame Befort que nous tenons à remercier tout

spécialement ; nous avons bénéficié en outre de l'expérience et

des conseils de tous les chercheurs de ce laboratoire, ainsi que

de toute l'aide technique souhaitable en dépit des événements de

mai 1968 pendant lequel ce séjour fut effectué» Nous avons au cours de ce séjour, également eu d'intéressantes discussions

avec Messieurs les Professeurs Daune et Chambron ; nous les re­

encoura-retiré beaucoup de profit des nombreuses discussions que nous

avons eues et des expériences que nous avons effectuées en col­

laboration avec lui.

Que tous nos camarades du laboratoire et tout spécialement

Charlier, Lurquin, Van Humbeeck et Verhulst qui se sont intéres­

sés de près à l'étude des fonctions du tRNA, sachent combien il

nous fut agréable de passer de nombreuses heures de travail en

leur compagnie.

Au cours de ce travail nous avons bénéficié de l’appui maté­

riel de l’Institut pour l’Encouragement de la Recherche Scienti­

fique dans l’Industrie et l’Agriculture (l,R.S,I,A.), de l’Eu-

ropean Molecular Biology Organization (E.M.B.O,) et du Fonds Na­

tional de la Rechehche Scientifique (F.N.R.S.),

aa acide aminé

RNA acids ribonucléique

R RNA RNA ribosomial

m RNA RNA messager

s RNA RNA soluble

t RNA RNA de transfert

aa tRNA aminoacyl-tRNA tRNA aa,tRNA

1

2

tRNA spécifique de 1'aa^

tRNA spécifique de 1 • aa^^ acylé par 1 ' aa^^

tRNA spécifique de 1 * aa^^ acylé par l'aa^

acide désoxyribonucléique

TCA acide trichloroacétique

Tris tris hydroxyméthyl aminométhane

EDTA ethylène diamine tetraacétate de Na

I.P.M. impulsions par minute (dosage de la radio

activité),

tic

me millicurie

D.O. densité optique

S

poly A Acide polyadénylique

poly U Acide polyuridylique

poly UG copolymère acide polyuridylique - poly-

guanylique.

pHMB parahydroxymercuribenzoate

PEP phosphoenolpyruvate

DNA se desoxyribonucléase

Enz aa^ aa AMP Enz aa.AMP Enz

1

Enzyme d'activation spécifique de 1 ' aa^^

complexe aminoacyladénylate-Enzyme

complexe aminoacyl^^adénylate-Enzyme d'ac­

tivation spécifique de 1 '

complexe aminoacylgadénylate-Enzyme d’ac­

tivation spécifique de 1 ' aa^^ extrait enzymatique brut

extrait enymatique purifié par passage sur

colonne de DEAE cellulose

extrait enzymatique purifié par 1 préci­ pitation au (NH^)gSOj^

extrait enzymatique purifié par 2 préci­ pitations au (NH^)gS02^

RESUME

Les principales acquisitions de ce travail peuvent se résumer

comme suit t

l)

Les acridines n*ont pas pour seul effet d'inhiber la

synthèse du RNA. L'inhibition de la synthèse des protéines par

ce type de colorants, que nous avons décelée dans des conditions

où elle ne peut pas être une conséquence de l'épuisement du RNA

messager, met l'accent sur les Interprétations erronnées qui

pourraient résulter de l'emploi des acridines dans la détermina­

tion de la durée de vie du RNA messager.

2)

Les acridines forment un complexe avec les RNA de

transfert. La fixation se fait par deux mécanismes différents t

- intercalation entre paires de bases des réglons

en double hélice.

- fixation extérieure.

Les propriétés particulières du complexe Proflavine-tRNA que nous

avons mises en évidence, nous ont permis de définir certains

critères caractérisant la structure du tRNA, Pour rendre compte

de l'ensemble de nos observations, les divers tRNA devraient

avoir une structure asymétrique t cette structure loin d'ôtre

figée, pourrait fluctuer autour de conformations privilégiées.

3)

La proflavlne

(3t6~diamlnoacrldlne), peut être consi­

dérée comme un nouvel outil dans l'étude des interactions du tRNA

avec différentes enzymes et particulièrement avec l'aminoacyl-

tRNA- synthétase.

Les particularités cinétiques de la fixation de proflavine sur

le tRNA sont probablement partiellement responsables de la spé­

cificité d'action de l'inhibiteur que nous avons mise en éviden­

ce ; cette spécificité dépendant du tRNA et de la fonction bio­

logique étudiée, indique qu'une structure totalement définie et

rigide de l'acide nucléique, n'est pas essentielle à l'accomplis

INTRODUCTION = = sss: = ss:=:ss=:=s:

MECANISME DE LA BIOSYNTHESE DES PROTEINES

Avant d’aborder la description des problèmes qui ont fait

l’objet de notre travail, nous retracerons brièvement le chemi­

nement qui a conduit à l’élaboration du schéma général de la

biosynthèse des protéines qui est aujourd’hui connu dans ses

grandes lignes, La compréhension du mécanisme fondamental de la

biosynthèse des protéines a nécessité une succession d’études

s’échelonnant sur un bon nombre d’années.

1 Théorie du messager génétique.

S’il est établi depuis les expériences de transformation

bactérienne (AVERY et al 19^^) que c’est le DNA qui contient

l’information génétique nécessaire à la synthèse des protéines,

il apparaissait déjà auparavant que la présence du DNA n’est

pas indispensable à la synhtèse des protéines. Dès 19^1»

BRACHET et CASPERSON, ont indépendamment conclu à l’interven­

tion du RNA dans la synthèse des protéines. Ces auteurs obser­

vèrent en effet que les cellules synthétisant d’importantes

quantités de protéines contenaient dans leur cytoplasme une

grande quantité de RNA. La proposition d’intervention du RNA

dans La synthèse des protéines impliquerait donc que cette

synthèse se réalise dans le cytoplasme. L’exactitude de cette

svqpposltion fut abondamment démontrée par la suite, notamment

par l’observation de la synthèse des protéines dans le cyto­

des ribosomes, particules contenant 60 ^ de RNA et 40 ^ de pro­

téines et constituant la partie principale des microsomes, que

se forment les protéines (SIEKEVITZ et PALADE I96O - Mc QUILLEN et al 1959).

Ces dernières observations, bien que mettant clairement en évi­

dence l'importance du RNA dans le processus d'élaboration des

protéines, ont conduit à assimiler le RNA des ribosomes à l'in­

termédiaire transférant l'information du DNA aux chaînes poly-

petidiques.

La multiplication des virus à RNA étant arrêtée par l'incorpora­

tion d'analogues de bases (JEENER et ROSSEELS 1953) et l'induc­

tion d'enzymes dans la levure (CILVNTRENNE 1956a) étant accompa­

gnée par l'incorporation d'Adénine dans le RNA, il était clair

à cette époque que la synthèse des protéines paraissait étroi­

tement associée à la synthèse d'un nouveau RNA possédant une struc

ture définie. Par contre, le bloquage de la synthèse de DNA par

des doses de lumière ultraviolette insuffisantes pour arrêter la

synthèse de RNA, n'entraîne pas l'arrêt de la synthèse des pro­

téines (ILINAZIR et ERRERA 1954). Ainsi l'idée émise dès 1951 par

CHANTRENNE (l952) selon laquelle c'est le RNA qui assurerait

l'arrangement correct des acides aminés dans les protéines re­

çoit ses premières indications expérimentales.

Mais la confusion, née de l'identification du porteur d'informa­

tion au RNA des ribosomes^a certainement retardé l'élaboration

de la théorie permettant d'interpréter avec exactitude ces ob­

servations .

C'est seulement en 1956 que l'idée d'un RNA porteur d'informa­

tion distinct de l'ensemble du RNA ribosomial a pu naître ;

VOLKIN et ASTRACHAN (1956) ont en effet montré que lors de l'in­

fection de bactéries par un phage, le RNA qui se forme a une

composition en base différente du RNA bactérien dont la majeure

en base voisine de celle d^^ DNA du phage. Ces auteurs ont montré

de plus, que dans les bactéries non infectées, une petite frac­

tion du RNA est instable et se renouvelle rapidement. Un tel RNA

qui se marque rapidemment fut peu après mis en évidence chez la

levure (YCAS et VINCENT i960). RILEY et al (l96c) lors de l'étu­ de du systèmede la -galactosidase, ont été conduits à consi­

dérer qu'un intermédiaire instable était nécessaire au transfert

d'information du DNA aux ribosomes ; le candidat susceptible de

remplir cette fonction ne peut être ni le RNA ribosomial ni le

4"i

les sont chimiquement stables.

L'ensemble de ces données a permis l'élaboration par JACOB e t"; r

MONOD (1961) de la théorie du messa-g^ar génétique qui a eu le^ ' ^ mérite d'unifier les interprétations des phénomènes observés

aussi bien lors de l'infection de bactéries par un phage que lors

de l'induction d'enzymes.

Les propriétés que l'on peut attendre d'un tel porteur d'infor­

mation sont dès lors clairement posées ;

- les messagers sont des polynucléotides certainement très

hétérogènes quant au poids moléculaire, et ils sont as­

sociés au moins temporairement aux ribosomes.

- la composition en base du messager devrait mimer celle du

DNA.

- il devrait se renouveler rapidement dans la cellule.

Ces deux dernières caractéristiques bien qu'elles ne soient pas

rigoureusement exactes, ont contribué dans une large mesure à

mettre le RNA messager en évidence, notamment par la technique

d'hybridation de RNA rapidement marqué avec le DNA, mise au point

par SPIEGELMAN.

On sait aujourd'hui que la totalité des deux fibres du DNA n'est

pas transcrite ; il n'y a dès lors aucune raison de penser que

D'autre part,il ne paraît pas justifie d'inclure la notion de

durée de vie brève dans la définition du mRNA 5 en effet, bien que le mRNA se marque généralement plus rapidement que les au­

tres espèces de RNA en présence d'un précurseur marqué, son ins­

tabilité métabolique ne semble pas être nécessaire à sa fonc­

tion. Les problèmes relatifs à la durée de vie du mRNA seront

discutés plus amplement dans l'introduction du chapitre I

Mis à part ces restrictions, la théorie du messager génétique

a été jusqu'à présent confirmée dans ces grandes lignes, La

mise en évidence de polyribosomes (MARKS et al, I962) dans les réticulocytes de lapin et par la suite, dans toute une série de

cellules (voir CHANTRENNE 1965a) a permis de visualiser le messa­

ger génétique et d'identifier celui-ci à la fibre de RNA unissant

les ribosomes entre eux. Le sujet ayant été abondamment discuté,

(cf. revue par SINGER et LEDER I966) nous n'approfondirons pas plus cette question.

2, Théorie de l'adaptateur et code génétique

Avant même que l'idée du messager génétique ne soit bien é-

tabljfi, CRICK (1958-1969) émit l'hypothèse prémonitoire que le transfert de l'Information contenue dans les acides nucléiques

vers les protéines, se fait par l'intermédiaire d'un adaptateur.

Sa vision du mécanisme qu'il proposait, laissait prévoir que

chaque acide aminé devrait se combiner sous l'action d'un enzy­

me particuJder avec une petite molécule capable de former des liens

hydrogènes spécifiques avec l'acide nucléique modèle.

Cette conception, basée uniquement sur des considérations d'or­

dre logique, reçut peu après une première confirmation par la

découverte des RNA de transfert qui peuvent fixer les acides ami­

L’acceptation de l'hypothèse de l'adaptateur, permit d'aborder

de façon valable l'étude du mécanisme de la traduction du lan­

gage des acides nucléiques (combinaison de quatre nucléotides)

dans le langage des protéines (combinaison de vingt acides ami­

nés ) .

Le problème fondamental du déchiffrement du code génétique avait

déjà fait couler beaucoup d'encre (cf. ¥OESE

1967) ©t de nou­

velles données permirent d'abandonner définitivement les méca­

nismes proposant une interaction directe de l'acide aminé avec

la séquence de l'acide nucléique imposant son arrangement dans

les protéines (ce qui fut appelé "codon" par la suite). L'obten­

tion de "chimères" d'aminoacyl-tRNA (tRNA estérifié par un aci­

de aminé différent de celui dont il est l'adaptateur) par vole

chimique (CHAPEVILLE et al, I

962) ou par une erreur d'estérifi­

cation enzymatique dans un système hétérologue, (BARNETT et

JACOBSON 1964 - JACOBSON et BARNETT I

966) permit de démontrer

que c'est le tRNA qui possède dans sa structure la clef du code

génétique,

La spécificité de la formation des amlnoacyl tRNA est ainsi fon­

damentale pour la synthèse correcte des protéines ; parmi les

macromolécules biologiques, le tRNA est donc probablement la

molécule dont la détermination de la structure et des fonctions

peut nous apprendre le plus au sujet de la nature fondamentale

du code génétique et de son évolution, La taille du codon, ou

ensemble de nucléotides, du mRNA spécifiant la nature d'un aci­

de aminé défini, a été également déterminée par CRICK et ses

collaborateurs (

1961),

tation, et l’expression de cette partie du gène ne peut plus s'ex­

primer .

La combinaison d'un mutant "délétion" avec un mutant "addition"

provoque la remise en phase du message après la seconde mutation,

et la fonction du gène est restaurée. En combinant trois muta­

tions d'un même type on observe le même effet, ce qui démontre

que les codons sont constitués par un triplet de nucléotides.

A côté de cette importante conclusion, ces élégantes expériences

apportèrent une précision fondamentale sur la nature du code

génétique, en établissant son haut degré de dégénérescence ; en

effet, pour que l'expression de la fonction du gène puisse être

restaurée, il faut que la séquence déphasée entre les mutations

extrêmes, ait une signification et permette la synthèse d'une

protéine complète.

Les méthodes qui ont permis d'établir in vitro le code génétique

par fixation d'aminoacyl-tRNA sur les ribosomes sous la stimu­

lation de trinucléotides (NIRENBERG ET LEDER 1964) ou par la syn­

thèse de polypeptides sous la stimulation de polynucléotides syn­

thétiques de séquence définie et répétée (KHORANA et al I966) ont amplement confirmé les résultats de CRICK.

Depuis que NIRENBERG et MATTHAEI (1961) ont établi que la syn­ thèse de polyphénylalanine était stimulée in vitro par le poly

U, indiquant par là que l'un des codons correspondant à la phé-

nylalanine était UUU, un grand nombre de travaux ont permis de

déchiffrer totalement le code génétique (cf. Cold Spring Harbor

Symp. Quant. Biol.

21.*

été établi par des expériences effectuées in vitro } on a pu

démontrer depuis pour la plupart des codons, que ces triplets

étaient effectivement utilisés 1n vivo. Cette confirmation

provient pour une part de la comparaison des séquences des pro­

téines normales et des protéines mutées soit spontanément soit

de ce type connus, ce sont les mutants du t^'-pe acridine qui ont

le plus éléêP-nmesiit confirmé l'exactitude du catalogue de codon ;

STREISINGER et al (1966) en étudiant les mutants du lysozyme du phage et YANOFSKY et al (1967) en déterminant la séquence de mutants similaires de E, coli dont la tryptophane synthétase

est affectée, ont montré que le déphasage dans la séquence de

nucléotides, conduisait à des remplacements d'acides aminés

compatibles avec le code tel qu'il fut déterminé in vitro.

Les évidences de la dégénérescence du code, et la connaissance

de la séquence du tRNA de l'Alanine contenant selon toute vrai­

semblance de l'inosine dans le triplet de nucléotides constitu­

ant l'anticodon, (HOLLEY et al I965) ont permis à CRICK de pré­ dire que certains tRNA pouvaient reconnaître plus d'un codon.

CRICK (1965) postule un mécanisme particulier d'interaction co­ don - anticodon par lequel les appariements des deux premières

bases se feraient strictement selon le schéma de VATSON-CRICK

tandis qu'une certaine fluctuation d'appariement de la troisiè­

me base serait possible.

Ainsi selon cette hypothèse du "VOBBLE", l'appariement dans la

troisième position du codon se ferait respectivement avec G, U,

A ou G, U ou C, UouC ouA, selon que la base correspondante de

l'anticodon est C, A, U, G, I,

L'étude de la spécificité du tRNA dans la reconnaissance du co­

don à fourni des données entièrement en accord avec l'idée du

"VOBBLE" (SOLL et al. I967), mais tout récemment REEVES et al, (1968) ont purifié un tRNA alanine de levure ne contenant pas d'Inosine et se fixant aux ribosomes sous la stimulation de qua­

tre triplets différents, ce qui est contraire aux prévisions de

CRICK.

Il faut encore signaler une exception à l'hypothèse du wobble,

qui se rencontre chez E. coli dans les tRNA spécifiques de la

Bien que l’anticodon de ces tRNA soit constitué par la séquence

CAU qui permettrait selon l'hypothèse de CRICK l'appariement

avec GUA et GUG, le forraylmethionyl-tRNA s'apparie avec le co­

don AUG et GUG. La fluctuation d'appariement pour ce tRNA ini­

tiateur aurait lieu pour la première base et non pour la troi­

sième, Il faut signaler également que l'on suppose que ce tRNA

ne se fixe pas au même site du ribosome que les autres aminoa-

cyl-tRNA, et qu'il ne possède pas de base modifiée à côté de

l'anticodon, La première de cette propriété permet de comprendre

l'absence d'ambiguité que l'on s'attendrait à observer puisque

GUG code également pour la Valine, Quant à la seconde proprié­

té, on a imaginé qu'elle était à mettre en relation avec la

fonction d'initiation, ce qui laisserait supposer que le tRNA

spécifique de la Valine de levure qui n'a pas de base modifiée

à côté de l'anticodon non plus, serait l'initiateur dans cet

organisme.

Ces spéculations intéressantes méritent d'être envisagées de plu

près,mais nécessiteront encore bien des études avant de permet­

tre une discussion plus approfondie.

3• Aminoacyl-tRNA-synthétase - Activation des acides aminés et

formation des aminoacyl-tRNA.

Bien avant la découverte du RNA de transfert, on savait que

la synthèse des liaisons peptidiques nécessite de l'énergie. L'é

nergie cellulaire est fournie par l'ATP } LIPMANN (1949) et CHAN

TRENNE (1951) supposèrent que c'est l'acide aminé activé par phosphorylation qui serait l'intermédiaire indispensable à la

synthèse des protéines.

une fraction enzymatique (qu’il appela "enzyme d'activation")

32

qui catalyse un échange ATP-PP^ . Ce résultat, suggérait que

l'entité activée était constitué par un aminoacyl AMP, Cet

aminoacyl ^ AMP semble protégé vis-à-vis de 1'hydroxylaminoly-

S6 } HOAGLAND et al, (1956) supposent donc que l'acide aminé activé reste lié à l’enzyme avant de réagir avec un accepteur

cellulaire naturel qui pourrait être "un transporteur nucléoti­

dique ou l'acide nucléique du microsome". L'accepteur de l'aci­

de aminé activé n'est autre que l'adaptateur de CRICK identifié

par la suite au RNA de transfert (HOAGLAND et al 1958),

Le complexe aminoacyl-adénylate-Enzyme d'activation fut isolé

plus tard dans le cas de la thréonine (ALLENDE et al 1964) et

de l'isoleucine et valine (NORRIS et BERG 1964), ce qui con­

firmait les idées de HOAGLAND. L'étape initiale de la synthèse

des protéines est dès lors connue ; il s'agit de la formation

de 1'aminoacyl-tRNA qui se fait en deux étapes successives :

1° Activation de 1'acide.aminé. Mg^'*’

aa + ATP + Enzyme ° ^ Enzyme , , . . aa-AMP + PP^

2°

adénylate-enzyme au tRNA _

Enzyme ... aa-AMP + tRNA aa-tRNA + AMP + Enz.

Puisque c'est le même enzyme d'activation spécifique de l'acide

aminé qui catalyse ces deux réactions, il paraît plus logique

de l'appeler désormais amlnoacyl"tRNA-synthétase en raison de la

nature du produit final de la réaction globale dont il catalyse

la formation s

aa+ATP+tRNA -Mg

2

aa-tRNA+AMP+PPi

L'activation des 20 acides aminés par l'une des 20 synthétases spécifiques, et le tranfert de cet acide aminé activé au tRNA,

Jouent donc un rôle primordial dans la biosynthèse des protéines

L'activation des acides aminés ne se fait pas toujours avec une

peuvent parfois activer un acide aminé erroné § c’est le cas no­

tamment pour 1’isoleucyl-tRNA synthétase qui peut former un com­

plexe Valyl-AMP-Enz^^^^ (NORRIS et BERG 1964) et pour la valyl-

tRNA synthétase capable d'activer la thréonine (BERGMANN et al

1961).

Par contre, les seules aminoacylations enzymatiques erronnées

qui ont été observées jusqu'à présent résultaient de l'emploi

de conditions très peu physiologiques s fixation de la phényl-

alanine sur les tRNA de E. coli spécifiques de la valine ou de

l'Alanine par la phénylalanyl-tRNA-synthétase de Neurospora

(JACOBSON et BARNETT 1Q66) et formation à très haute températu­

re, de valvl'tRNA.. dans un système de Bacillus stearothermo-lleu ---philus (ARCA et al 196?).

Le transfert de l'acide aminé au tRNA, à part ces cas très par­

ticuliers, manifeste une spécificité quasi absolue ; ainsi lors

de l'addition de tRNA au complexe erroné Valyl-AMP-Enz^^^^^,

celui-ci est rapidement hydrolysé sans donner lieu à la forma­

tion d'un valyl-tRNA, Les erreurs éventuelles commises lors de

l'activation de l'acide aminé peuvent donc être corrigées par

la présence du tRNA.

Dans tous les cas où il a pu être mis en évidence, le complexe

aminoacyl-tRNA-synthétase - tRNA s'est avéré être très spécifi­

que (LAGERKVIST et al 1966 - YARUS et BERG 1967 - OKAMOTO et KAWADE 1967 - SEIFFERT et al I968).

Cette interaction très spécifique entre le tRNA et son enzyme

d'activation, en plus d'assurer la conservation de la fidélité

de la réaction, pourrait avoir une fonction de régulation,

A ce propos LOFTFIELD et EIGNER (1965) ont montré que la présen­ ce du tRNA spécifique de l'Isoleucine supprimait l'activation

de la valine par 1'isoleucyl*tRNA-synthétase, tout en accélérant

le tRNA vis-à-vis de la synthétase.

L'activation de la Glutamine (RAVEL et al, I965 - DEUTSCIIER

1967) et de l'arginine (MITRA et MEHLER I966 et I967) dépend de

s'interpréter par une modification de configuration de l'enzyme

induite par le tRNA, suggèrent fortement un mécanisme du type

allostérique.

Mc ELROY et al. (1967) introduisent le terme d'homostérie pour décrire les propriétés de toute une série d'acyladénylate syn­

thétase, ce terme indiquant que la modification de configuration

de l'enzyme résulte, comme leurs données le suggèrent, de la fi­

xation du substrat ou d'un composé de structure similaire^à l'en

droit même du site catalytique de l'enzyme. Quoiqu'il en soit,

le problème de l'élucidation du mécanisme de la reconnaissance

du tRNA par les enzymes d'activation est certainement d'impor­

tance fondamentale, car c'est de cette étape que dépendra l'éla­

boration de protéines actives. C'est pourquoi ce problème a re­

tenu toute l'attention de notre laboratoire. Dans ce travail,

nous avons voulu définir la nature des sites du tRNA responsa­

bles de l'efficacité de 1'arainoacylation (cf. Introduction

chapitre III) ; les résultats que nous avons acquis, sont indis­

sociables d'une étude effectuée conjointement par H, GROSJEAN en

vue de préciser le mécanisme d'action des enzymes d'activation.

4, Transfert des acides aminés dans les protéines

Depuis les résultats de DINTZIS (1961) il est établi que la synthèse des protéines se fait séquentiellement à partir de 1 • ex

trémité NH^ terminale.

L'intervention des aminoacyl-tRNA dans l'arrangement des acides

mécanls-me de mise en phase de la lecture du mécanls-message génétique.

La détermination des acides aminés N terminaux des protéines syn­

thétisées dans un système acellulaire de E. coli indique que 47^

des protéines commencent par de la méthionine (WALLER - 1963)9 ce qui suggère que le tRNA spécifique de la méthionine, joue un

rôle dans l'initiation de la formation de liens peptidiques.

La mise en évidence de formylmethionyl-tRNA dans les extraits

de E. coli (MARCKER et SANGER 1964) et son incorporation dans

les positions aminoterminales des peptides (CLARK et MARCKER I965) a permis d'identifier le triplet AUG au codon d'initiation. Dès

19639 NAKAMOTO et al. ont montré que la formation des liens pep­

enzymatiques au moins. Depuis ces premières données, de nombreu­

ses études ont permis de définir la succession d'événements né­

cessaires à l'allongement des polypeptides avec plus de précision.

Tout d'abord il se formerait un complexe initial entre le mRNA,

le formylmethéonyl tRNA et la sous-particule rlbosomlale 30

S

(NOMURA et LOVRY 196?). Une fois le complexe d'initiation formé

une sous-unité 50 S vient s'y ajouter afin de former un ribosome

70 S attaché au mRNA dont le codon d'initiation AUG interagit

La présence simultanée d'un peptldyl-tRNA et d'un aminoacyl-tRNA

sur le ribosome en fonctionnement, conduit WATSON (1964) à pos­

tuler l'existence de deux sites de fixation du tRNA sur le ribo­

some ;

1) le site de décodage où se fixe 1'aminoacyl-tRNA,

2) le site de condensation où reste attaché le tRNA maintenant

Le RNA messager est fixé au 30 S (TAKANAMI et OKAMOTO I963) ©t le peptldyl-tRNA, lors de la dissociation des ribosomes, reste

associé au 50 S (GILBERT I963) dont un composant a été identifié

à la formation des liaisons peptidiques. Juste après la formation

de la liaison peptidique, le peptidyl-tRNA allongé d'un acide

aminé, doit être maintenu temporairement par le tRNA fixé au site

de décodage.

Pour que le cycle de réactions puisse continuer, le peptidyl-tRNA

doit nécessairement être déplacé vers le site de condensation, et

le messager doit avancer par rapport au ribosome, de façon à met­

tre un nouveau codon vis-à-vis du site de décodage.

Ce mécanisme nécessite la présence d'une fraction enzymatique

(HERSHEY et THACH I967) et de GTP qui est hydrolysé au cours du processus. Les propriétés particulières du formylméthlonyl-tRNA,

lui permettent de se fixer au site de condensation avant que la

première liaison peptidique ne se soit formée.

Ce mécanisme d'initiation, démontré chez les bactéries et d'une

manière générale dans les organismes possédant des ribosomes 70 S

comme les mitochondries par exemple (SMITH et MARCKER I968), ne peut pas à l'heure actuelle être généralisé aux organismes supé­

rieurs, En effet, aucune activité de transformylase n'a été dé­

celée ni chez les mammifères ni dans le cytoplasme de levure ;

le formylméthionyl“tRNA obtenu in vitro avec des tRNA de ces

organismes a toujours nécessité l'emploi d'une fraction enzyma­

tique de E. coli (CASKEY et al I967 - TAKEISHI et UK ITA I968), Des modèles mécaniques du déplacement relatif des sous-unités

ribosomiales permettant l'avancement du messager ont été propo­

sés récemment (BRETSCHER 1968 - SPIRIN I968), Ces modèles sché­ matiques, permettent de visualiser le mécanisme de l'initiation

qui est aujourd'hui compris dans ses grandes lignes.

Les élégantes expériences de reconstitution des ribosomes 30 S

à partir de leurs protéines et de leur RNA dissociés, ont per­

mis à TRAUB et NOMURA (1968) d'identifier les protéines du ri­ bosome responsable de diverses fonctions biologiques t fixation

d'acides aminés dans les protéines.

Le mécanisme de la terminaison de chaîne et la libération de la

protéine complète n'est pas encore élucidé.

L'existence de tRNA suppresseurs permettant l'incorporation d'a­

cides aminés aux endroits où des mutations non-sense ont provo­

qué l'apparition de triplets UAG (Amber) - UAA (Ochre) ou UGA

(opale) au sein d'un message, a conduit à supposer pendant un

temps qu'il existait un tRNA particulier capable de lire les

codons de terminaison de chaîne, et de provoquer par un proces­

sus particulier la libération de la protéine. BRETSCHER (1968) ayant montré que ce n'était pas le cas, on suppose aujourd'hui

que c'est une protéine mise en évidence il y a quelques années

déjà (GANOZA 1966) et purifiée par CAPECCHI (1967) qui est im­ pliquée dans le processus de terminaison de chaîne.

En fait deux facteurs différents semblent nécessaires, le pre­

mier actif en présence des triplets UAA ou UAG et le second en

présence des triplets UAA ou UGA (SCOLNICK et al I968),

Si l'on commence à pouvoir se faire une idée assez précise de la

séquence d'événements nécessaires à la formation des protéines dans

Ja cellule , bien des points restent à éclaircir.

Parmi les problèmes qui retiennent particulièrement l'attention

de bon nombre de laboratoires, il faut citer l'étude des propri­

étés des composants des ribosomes 50 S et notamment du RNA 5 S

dont la fonction reste mystérieuse bien que sa structure primai­

re soit déterminée (BROWNLEE et al. I967 - FORGET et VEISSMAN

1967). Signalons encore le rôle Inconnu de l'extrémité pCpCpA

servée avec le tRNA en présence de phosphorylase, et de l'addi­

tion de l'A final du RNA de phage après le processus de réplica­

reconnaissance du tRNA par 1'aminoacyl-tRNA synthétase.

5« Utilisation des acridines dans l'étude du mécanisme de la

biosynthèse des protéines.

Tout au long de ce travail nous avons été amené à utiliser la

Proflavine pour préciser certains aspects du mécanisme de la bio­

synthèse des protéines.

L’orientation de notre étude fut en fait double. D'une part,

certains de nos résultats ont rais en évidence des propriétés

biologiques inattendues du colorant (cf. Chapitre l). D'autre

part, ces propriétés particulières, nous ont incité à utiliser

la Proflavine en tant qu'outil permettant d'aborder par une voie

nouvelle l'étude des relations existant entre la structure du

tRNA et certaines de ses fonctions biologiques (cf. Chapitre III ) ,

La liaison entre ces deux problèmes de nature différente, n'a pu

être faite que grâce à la caractérisation des interactions Pro-

flavine-tRNA qui fait l'objet du chapitre II de ce travail. Les

colorants basiques du type acridine, doués de propriétés chimi­

ques particulières (cf. ALBERT I966), dont les solutions colorées sont souvent fluorescentes, manifestent, en raison de la tendance

à l'association des molécules entre elles à forte concentration,

une déviation à la loi de Beer-Lambert, Ces composés mutagènes

et bactérlostatiques, peuvent être antimitotiques ou bien au con­

traire cancérogènes (dans le cas des benzacridines)

5 ce vaste

éventail de propriétés chimiques et biologiques, dont nous n'a­

vons donné qu'un aperçu, suffit à mettre en évidence la comple­

xité du mécanisme d'action de ces substances et l'intérêt de

l'étude de leur action au niveau moléculaire, A côté de ses pro­

d’avoir contribué à la compréhension d'importants aspects de la

biologie moléculaire ; il en est de même pour des substances

apparentées comme 1'Actinomycine ou l'Ethidium (Fig l) qui ont pour cette raison été bien souvent associées aux acridines dans

les conclusions de la littérature.

Fig, 1 Structure des composés affectant la fonction des

a-cides nucléiques

Actinomycine

Ethidium (bronmre) : 2,7 diamino - 9 “ phényl -10 - ethyl phenan-tridine Proflavine : 3.6 diaminoacridine

Acridine orange R

3.6 bis dimethylamino - 9 phényl-acrldine.

En remontant dans le temps, nous pourrons nous remettre en

mémoire certains faits marquants qui évoqueront la contribu­

tion de l’emploi de ces agents chimiques à la compréhension de

toute une série de caractéristiques cellulaires.

Depuis l’introduction en 19^0 de la tedmique permettant 1’ob -

servation de la fluorescence sous le microscope (STRUGGER 19^0) ,

l’acridine orange (3»6-bisdimethylaminoacridine) est utilisée

comme colorant histologique. Cette méthode permit dès cette épo­

que de différencier les cellules vivantes des cellules mortes.

La combinaison de l’acridine aux acides nucléiques, in vivo.

permit également de différencier dans une certaine mesure le DNA

du RNA (KRIEG 195^) grâce aux propriétés métachromatiques du co­

lorant (production de plusieurs couleurs par un colorant pur).

THOMAS (195^) lors de la caractérisation de la dénaturation du DNA constata que la coloration de l’acide nucléique par un colo­

rant histochimique dépend du degré de structure secondaire du DNA ;

la chute de l'affinité du colorant pour le DNA put dès lors être

attribué à la perte d'un espacement régulier et approprié des

fonctions acides phosphoriques.

La relation entre la structure secondaire du DNA et l’affinité

du colorant permit détablir certains critères auquels devrait

répondre la structure du DNA pour rendre compte de cette obser­

vation.

Bien que ces seules études n’aient pas permis de proposer à cette

époque un modèle de structure cohérent pour le DNA, l’interac­

tion des composés qui nous ont Intéressés avec le DNA, fut d’une

grande utilité par la suite pour déceler les DNA circulaires et

pour déterminer le degré de super structure (super-hélice) pro­

clrcu-laire de DNA sur elle-même (CRAVFORD et ¥ARING 196? - HUDSON et

VINOGRAD 1967 - BAUER et VINOGRAD I968).

L'action mutagène particulière des acridines, a permis l'obten­

tion de toute une série de mutants intéressants pour l'étude fon­

damentale de propriétés génétiques. Très peu d'exemple intéres­

sants de mutation acridine ont été décrites pour les bactéries ;

pour la levure une classe de mutants très importants a été obte­

nue par action de l'acridine s il s'agit des déficients respira­

toires "petites colonies" abondamment décrits par EPHRUSSI (l953).

Cbst dans le domaine de la génétique de phage que les acridines

ont été employées le plus utilement ; l'obtention des mutants

résultant du déphasage de lecture du code génétique a en effet

permis d'identifier le codon à un triplet de nucléotides (CRICK

et al 1961) et plus récemment, a permis de déduire la nature des codons utilisés in vivo (BERGER et al I968), L'affinité particu­ lière de l'acridine pour les épisomes non intégrés dans le géno­

me de l'hôte (CAMPBELL I962) permet d'aborder l'étude du mécanis­ me du tranfert génétique (JACOB et al I963). L'interaction des Acridines, et de composés apparentés , avec le DNA, conduit éga­

lement à l'inhibition de l'activité de la DNA et de la RNA poly­

mérase (HURWITZ et al. 1962) ; cette propriété, malgré certaines

difficultés que nous discuterons au chapitre I, a permis d'éva­

luer, dans certains cas avec succès, la durée de vie du mRNA et

d'analyser les processus de la morphogénèse (BRACHET I968). L'inhibition de la formation de particules virales Infectives

par la Proflavine, peut être observée dans des conditions où la

synthèse de DNA n'est pas affectée (SUSMAN et al. 1965) ; cette observation suffit à montrer qu'il peut être dangereux d'attri­

buer exclusivement les effets biologiques des acridines à l'inhi­

bition de la synthèse des acides nucléiques, comme bien souvent

cela a été fait.

actions Acridine-RNA qui avaient été négligées jusqu'alors j no­

tamment l'interaction des acridines avec les ribosomes (MORGAN

et RHOADS I965) fut étudiée dans l'espoir d'apporter certaines précisions quant à la conformation du RNA au sein des ribosomes

(FURANO et al I966 - COTTER et al I967 - MIALL et VALKER 196? ). Les données obtenues à ce propos sont encore trop fragmentaires

pour permettre des conclusions définitives (cf. Chapitre II).

Ainsi, l'emploi de ces substances dans l'étude des mécanismes

cellulaires fondamentaux^ apparaît comme indissociable de la dé­

termination de son mécanisme d'action au niveau moléculaire.

Lorsque le présent travail fut amorcé, les connaissances en bio­

logie moléculaire étaient bien entendu encore plus sommaires qu'au­

jourd'hui, Ainsi, si la théorie du messager génétique était é-

tablie, le problème de sa durée de vie soulevait encore bien des

discussions. Quant au tRNA on ne pouvait encore imaginer à cette

époque aucune hypothèse raisonnable permettant d'expliquer la

spécificité de ses fonctions biologiques ; aucune séquence de

tRNA n'avait été déterminée, et le modèle de structure qui pré­

valait était celui proposé par CANTONI qui attribuait au tRNA la

forme d'une épingle à cheveux. C'est en fait l'intérêt que nous

avons manifesté pour ces problèmes particuliers qui a orienté

MATERIEL ET METHODES

Appareillage et Produits utilisés

Compteurs à Scintillation Nuclear Chicago

Packard TriCarb Beckman Ultracentrifugeuse SPINCO L50 Analytique SPINCO E Spectrophotomètre CARY 15 GILFORD BECKMAN DU et DB

Broyeur de cellules BRAUN

Presse de FRENCH

Extrait de levure (Bacto Yeast Extract DIFCO)

Casamino acids ; (hydrolysat de caséine) DIFCO

Glusulase : Enzÿme d'Hélix pomatia de l'Industrie biologique fran­

çaise .

Le Tris, l'Adénoslne triphosphate (diK) et le pyrophosphate inor­

ganique proviennent de la Sigma Chemical Company.

Le phénol (MERCK) utilisé pour les déprotélnlsation d'acides nu­

cléiques est fraîchement redlstillé avant l'emploi,

La Desoxyrlbonucléase (EC3.1.^.5«) utilisée est fournie par Vor-

thlngton Biochemical Corporation, elle est ensuite purifiée par

Les autres produits utilisés sont des produits commerciaux de

pureté analytique.

Les produits radioactifs utilisés proviennent soit du

RADIOCHE-MICAL CENTER, AMERSHAM, soit de SCHWARZ BioResearch, soit de NEW

ENGLAND NUCLEAR.

32

l’ATP P que nous avons utilisé a été préparé à Strasbourg ;

nous remercions le Professeur Mandel de nous l'avoir aimablement

offert,

LEVURE

Souche de Levure

Saccharomyces cerevisiae Yeast Foam normale

(yf 237)

Conservée à 4° C sur gélose inclinée est repiquée tous les mois.

Culture des levures

2

Le milieu est stérilisé 20' à l'autoclave 2kg/cm (Glucose sté­

rilisé à part pour éviter la formation de bases de Schiff), La

composition de ce milieu a été décrite précédemment (WERENNE 1964),

La préculture est effectuée en boîtes de Roux contenant 50 ml de

milieu,ensemencé6 à l'anse de Pt et agités 24 heures à 30° C,

g

La préculture contient finalement dans ces conditions 1,5 10

cellules/ml. La culture est effectuée en fioles coniques de 100 ml

par inoculation d'I ml de préculture de 24 h, dans 9 ml de milieu.

dioactivité se retrouve dans les acides nucléiques et dans les

composés puriques acido-solubles (CHANTRENNE et DEVREUX I956 _ H. CHANTRENNE 1956).

L'incorporation de ce précurseur permet donc de suivre aisément

la synthèse des acides nucléiques chez la levure. Les prises de

0,5 ml effectuées au cours du temps sont précipitées à 0° C par

- détermination de 1^ radioactivité incorporée dans la somme

RNA+DNA.

Le précipité est filtré après 30 minutes sur membranes Milli

pores (diamètre des pores 0.65^), lavé trois fois par 5 ml TCA 5 contenant de l'Adénine froide ; la radioactivité est déter­

minée au compteur de GEIGER à fenêtre mince,

La majeure partie de la radioactivité ainsi mesurée est due à l4

l'incorporation d'Adénine-8 C dans le RNA, puisque la quanti­

té de DNA ne représente que 5 à 10 ^ des acides nucléiques chez

la levure.

Une détermination précise de la radioactivité Incorporée dans

le RNA nécessite la détermination de la radioactivité du DNA ;

par simple différence de la radioactivité incorporée dans l'en­

semble des acides nucléiques et la radioactivité incorporée dans

le DNA, on obtient la radioactivité incorporée dans le RNA.

- détermination de la radioactivité incorporée dans le DNA

Après 30' le précipité TCA est centrifugé (lO' à 2000 tours/mln.) j le culot obtenu est incubé 15 heures à 37® G dans

1 ml de NaOH 0,5 M. Le RNA est ainsi totalement hydrolysé et le

par 1 ml de TCA 20 ^ en présence de RNA froid (500 As) servant

d'entraîneur. Le précipité est filtré après 1 heure et lavé com­

me décrit plus haut,

- détermination de la radioactivité des composés acido-solubles,

Les prises de 0,5 ml effectuées au cours du temps sont re­

cueillies dans des tubes à centrifuger contenant 1 ml de NaCL

0,9 ^ et maintenus à 0° C, Les prises sont homogénéisées immé­

diatement et les opérations suivantes sont effectuées à la cham­

bre froide (0-4° C),

Après 5 minutes de centrifugation à 2000 tours/minutes, les cu­

lots sont lavés deux fois par 1 ml de NaCl 0,9

Les trois surnageants résultant des centrifugatioiïs sont rassem­

blés et consitituent la fraction permettant de déterminer la ra­

dioactivité des composés acido-solubles du "milieu".

Les culots obtenus sont ensuite extraits au TCA 10 ^ pendant 1 h, ;

après 5 minutes de centrifugation à 2000 tours/minute

,

loté sont lavés deux fols au TCA 5 ^ et les trois surnageants

rassemblés fourniront la radioactivité des composés acido-solubles

présents dans la levure.Après 3 extractions des surnageants (étherlvol)

une partie aliquote de la solution aqueuse est évaporée sur pla­

quette de cuivre ; la radioactivité est ensuite déterminée au

compteur de Geiger à fenêtre mince. Une fraction aliquote de la

fraction "milieu" est évaporée telle quelle sur plaquette de cui­

vre afin d'en déterminer la radioactivité,

/ l4

Incorporation de Phénylalanine C dans les protéines syn­

thétisées par la levure.

Les prises (0,5 ml) effectuées au cours du temps dans le milieu l4

dans 1 ml de TCA 10 ^ et 0.5 nil de Phénylalanine non marquée

(lyiM) 5 la phénylalanine déjà estérifiée au tRNA est hydrolysée par 45 minutes d* ébuUition. Les précipités sont filtrés et lavés comme précédemment et la radioactivité en est déterminée au comp­

teur de Geiger.

Préparation de sphéroplastss de levures

Les sphéroplastes sont obtenus par traitement des levures S, ce-

revisiae par un extrait enzymatique provenant de l'escargot Hélix

pomatla. La méthode utilisée est dérivée de celle décrite par

DUELL et al (1964). Les levures récoltées en phase exponentielle

de croissance, sont resuspendues dans 3 ml (l g de levure poids

humide/ml) d'une solution de tampon citrate-phosphate 0.1 M

(pH 5«8) et 0.63 M en Sorbitol - O.O3 M 2-mercaptoéthylamine,

4.10 M EDT. contenant 33 mg de Glusulase (l'enzyme provenant

d'un extrait préparé par l'Industrie biologique française est

clarifié par 10* de centrifugation à 3*500 g et le surnageant comportant la glusulase -100 mg par ampoule - est additionné

d'un dixième de son volume, d'hydrochlorure de cystéine 1 9^,

pour inactiver le merthiolate destiné à stabiliser la préparation

enzymatique).

Après une incubation de 40 minutes à 30® G, les sphéroplastes

sont centrifugés à 0® C avec précaution (lO' à la SERVALL à

1.000 g). Les sphéroplastes sont ensuite lavés par 3 ml de SOR-

BITOL 0.63 M 5.10"^M en MgCl^.

Les sphéroplastes sont resuspendus dans 10 ml de tampon

isotoni-—2

que d'incubation (2.10 M KNa - PO^^ pH 6.3 rendu O.63 M en sor- bitol et contenant par ml^lO mg de glucose, 10 mg de casamino

acids DIEGO et 5/<-moles de MgGl^).

Après 20' d'incubation à 30® G dans ces conditions isotoniques

Isolement de polyribosomes de sphéroplastes de levure

/

,

f

1^

Les sphéroplastes incubés en présence ou non d*Adénine-8 C sont centrifugés 5 minutes à 1.000g. Le culot obtenu est resuspendu

_2

-3

5.10 M MgCl^. Le lysat ainsi obtenu est débarassé des débris

cellulaires par 15 minutes de centrifugation à 10.000g.

200/<'l de ce lysat (contenant environ 2 DO de matériel absorbant

à 260 m/^ ) sont déposés au sommet d'un gradient linéaire de saccha- rosel7.3^ ^ (w/v) en Tris 2.5 . 1L0"^M MgCl^ 5.10”^M pH 7.4, éta­ bli dans un tube de rotor S¥ 39»

Après deux heures de centrifugation à 32.000 tours/minute (SPIN-

CO L50 - rotor S¥ 39) le diagramme de sédimentation est détermi­ né. Après traitement du surnageant de lyse à la RNAse (O.l^g/ml-

1 minute à 30° C) , les polysomes sont détruits.

Estimation de la proportion de mRNA chez la levure

Deux voles différentes ont permis d'estimer la proportion de mRNA

chez la levure

1° Estimation basée sur la quantité de polyribosomes isolables

Plusieurs hypothèses sont nécessaires pour pouvoir effectuer cette

estimation.

Nous avons considéré que

%

a) seulement 70 ^ des ribosomes sont sous forme de polyribosomes et l'entièreté du mRNA est associé aux polyribosomes.

b) Dans les polyribosomes, le mRNA est saturé s les ribosomes

se touchent,

c) il y a 10 de tRNA par rapport au R.RNA

d) le poids moléculaire du R-RNA de levure est Identique à celui

de E. coli (cf. KURLAND I96O - CLICK et TINT 19^7)

Les hypothèses c et d semblent pouvoir être considérées comme

Les hypothèses a et b conduisent à une sous-estimation de la quan­

tité de mRNA j en effet, il semble se confirmer que la totalité

des ribosomes soient dans la cellule associés entre eux et que

le mRNA n'est pas saturé par les ribosomes. Le tassement maximum

des ribosomes sur la fibre de mRNA n'a été observé par microsco­

pie électronique que dans le cas de polyribosomes extraits de

certaines tumeurs (SHELTON et KUFF I966) ; d'une manière

géné-0

raie, on observe plus souvent une séparation de 50 à 150 A en­

tre les ribosomes (SLAYTER et al I963 - RICH et al I963 - STAE- HELIN et al 1964) ou encore 75 à 105 nucléotides distribués par

ribosomes (PADAYATTI et ROLFE I968), Bien que certaines variations quant au nombre de ribosomes fixés sur un mRNA donné soit possi­

bles, nos résultats indiquant que la densité de mRNA par riboso­

me est constante en moyenne, nous permettent à bon droit de con­

sidérer comme valable une distribution régulière des ribosomes

que l'hypothèse b implique. Nous obtiendrons donc ainsi une es­

timation minimale de la proportion de mRNA. Si on considère donc

qu'il y a 65 nucléotides par ribosomes (distance entre 2 nuclé-

o O

otides = 3.4 A - Diamètre des ribosomes 220 A),

On a en calculant en poids moléculaire 65 x 300 unités de masse moléculaire de mRNA par ribosome,

6 6

Pour le R-RNA d'un ribosome, on a 2 x 0,55 x 10 + 1.1 x 10 =

2.2 X 10 unités de masse moléculaire de R-RNA par ribosome.

m_RNA ^

6p ^

;00 ^

^ _gRNA--- „

^

R-RNA

Z.2

10°

Si on n'a que 70

^

aura donc

mRNA

0.62 ^

L'estimation minimale de la proportion de mRNA nous donne une

valeur voisine de 0,6

De toutes récentes données (KAZAZIAN et FREEDMAN 1968) ont montré que les ribosomes pouvaient être bien plus tassés sur le mRNA

que ne le supposaient les données antérieures.

2° Estimation basée sur la radioactivité qui s'incorpore rapide­

ment dans le RNA

D'après la Fig, 26 on peut déterminer la radioactivité incorporée l4

en 5 minutes lors d'un marquage à l'Adénine-8 G. Certaines hypothèses sont également nécessaires :

a) l*adénine-8 C assimilé par la levure, n'entre dans le RNA que sous forme d'Adénine, On considère également que la distri­

bution de chaque nucléotide dans le RNA qui se marque rapidemment l4

est statistique et que l'Adénine-8 C entre dans le RNA avec la radioactivité spécifique du marqueur ajouté,

b) le RNA rapidement marqué est exclusivement du mRNA,

c) pendant les 5 minutes d'incorporation, on peut négliger la dégradation de RNA et l'augmentation de radioactivité est effec­

tivement une mesure de la synthèse de RNA. On considère en outre

que dans les sphéroplastes l'augmentation de la quantité de mRNA

suit la même cinétique que dans les cellules Intactes.

Cette hypothèse c conduit probablement à sous-estimer la propor­

tion de mRNA ; en effet, les synthèses de macromolécules sont

plus lentes dans les sphéroplastes et on peut considérer ceux-ci

comme physiologiquement équivalents à des cellules en absence

de croissance (DE KLOET I961), Les hypothèses a et b par contre entraînent une surestimation de la valeur calculée j en effet

La fig. 26 montre que l'on incorpore dans une fraction de 0,125 l4

ml, 10 IPM d'adénine-8 G 4^C/|cmole pour une DO correspondan­

te de 0,1 dans une cellule de 3 mni de trajet optique. En consi­

dérant un rendement de 50 ^ du compteur à scintillation, la

quantité d'adénine incorporée dans le niRNA = ---——mole/ml, X 1Q ^

te d'adénine

incor-poréex

k

1^0

Sachant que E, pour les ribosomes de levure est 113 (YIN i960)

1cm

et en considérant qu'il ya 60 9“ de RNA par ribosome, la quantité de nucléotides dans le R-RNA

_ 0,1 X 3.3 X 10 X 60 X 10"^

113 X 100 X 300

-3

-3

R RNA 58,5 X 10 R RNA + sRNA 64,24 x lo"^

= 0.00113

kt Il y a donc 0,113 9“ de mRNA nouvellement synthétisé.

Mais cette quantité ne représente qu'une fraction du mRNA, On

peut considérer que la quantité de mFNA -varie suivait 3a fonction Me

ou M est la quantité de mRNA au temps tsso et “ = temps de géné-iC ration (II6') M e t O kt M* . ~ 1.04 la quantitité de mRNA

marqué ne représente que

4 de la quantité de mRNA

RETICULOCYTES DE LAPIN

Préparation des réticulocytes de lapin

Les lapins sont anémiés par quatre injections sous-cutanées jour­

nalières de phénylhydrazine (la solution à 2,5 ^ est injectée à

raison de 0.3 ml/Kg. Les lapins dont la réticulocytose est ainsi

provoquée selon la méthode de BORSOOK et al (l952) sont sacrifiés

deux jours après, sous anesthésie (injection dans la veine mar­

ginale de l»oreille de NEMBUTAL additionné d'HEPARINE).

Le sang est récolté et centrifugé pendant 15' à, 2.800 g j après

deux lavages par une solution isotonique (NaCl l4.10 M, KCl

"“3 / ”3

5.10 Acétate de Mg 5*10 "^M) , la majorité des leucocytes

constituant la couche supérieure du culot est éliminée.

Système d'incorporation acellulalre d'acides aminés

Les réticulocytes centrifugés et lavés sont lysés par 2 volumes

de solution hypotonique (Tris-HCl 10 M pH 7»^ - contenant HCl

1,5 .10 M et acétate de Mg 5.10 "^M). Après 30 secondes dans

cette solution, 1'Isotonlclté est rétablie par addition de sac­

charose (85 mg par ml de lysat). Cette manière de procéder évi­

te dans une large mesure la lyse des leucocytes contaminants.

Le surnageant résultant d'une centrifugation de 15* à. 17.500 g

constitue le lysat de réticulocytes qui permet d'étudier la for­

mation acellulaire des protéines. Les conditions d'incubation

de ce lysat sont dérivées de celles décrites par LAMFROM et

KNOPF (1964), La cinétique de synthèse des protéines est étudiée dans un volume total de 1 ml comprenant 0,8 ml de lysat et 0,2

ml de milieu d'incubation comprenant 4ftmoles MgCl^, 8^moles KCl,

lOftmoles Tris HCl (pH 7.8), 8^moles GSH, Ift-mole ATP, 0.25 /U.

mole GTP, 5moles de phosphoenolpyruvate, environ 50^g de pyru-

l4

20^ 1 de leucine ou valine C et 30^1 d'une solution de Profla-

vlneO L'incubation se fait à 37° G, Pour les cinétiques d'incor­

poration, des prises de 0.1 ml sont effectuées au cours du temps

et précipitées par 2 ml de TCA 5

Conditions d'incorporation des acides aminés dans les

réticulocytes entiers

Les réticulocytes centrifugés sont resuspendus dans

4

de milieu d'incubation (Ce milieu d'incubation contient les com­

posants suivants pour 50 ml NaCl 9 30 ml de tampon phosphate

10 pli

7*4,

5

1,5 mg de Trytophane).

Le début de l'incorporation est déterminé par l'addition de

lOfil

(pour 1 ml de solution d'incubation) d'un mélange d'acides aminés

(Hydrolysat de protéines reconstitué - SCH¥ARTZ),

L'incubation se fait à

37°

prises de 0.1 ml sont effectuées au cours du temps et précipitées

par

2

5

Détermination de la radioactivité des protéines synthéti­

sées dans les systèmes de réticulocytes.

Le précipité

TCA

30

à 90°

sur mlllipores (0.65^) après refroidissement, et lavé par du

ESCHERICHIA COLI

Souches de Escherichia coli

La souche 112 - 12 gai cys his su (WOLLMAN 1953) provient

du laboratoire du Professeur R, THOMAS j cette souche dérive

de

La souche ML 308 que nous avons utilisée à Strasbourg provenait

du laboratoire de F, GROS.

Culture de Escherichia coli

Les bactéries sont cultivées aérobiquement à 37® 0 dans un milieu

à base de tryptone semblable à celui décrit par KAISER (l955)

_2

excepté qu'il contient du MgCl^ 10 M.

Pour la préparation de grandes quantités d'enzymes d'activation,

des cultures intensives de E, coli ont été fournies par le pro­

fesseur WELSCH de l'Université de Liège,

Préparation du DNA de E. coli

Le DNA est obtenu par une modification de la méthode de MARMUR

(1961), Après le traitement à la RNAse, la solution est agitée à deux reprises en présence de phénol 90 ^ (^/^) à 40° C,

Après la dernière déprotéinisation, le DNA de la phase aqueuse

est précipité par addition d'I volume d'éthanol.

Les fibres de DNA sont récoltées sur une baguette de verre et

exprimées pour en extraire le maximum de solution liquide } le

DNA est ensuite lavé deux fois à l'éthanol 80 ^ et il est conser­

vé dans l'éthanol au congélateur.

Le DNA est dissout avant utilisation dans un tampon Tris-HCl

Préparation des ribosomes de E, coll 112,12

-2

Une suspension de E, coli dans un tampon Tris-HCl 10 M MgCl_

-2

, ^

10 M pH 7.4 est broyé à la presse de FRENCH comme lors de la

préparation des enzymes d'activation.

Le surnageant d'une centrifugation à 20.000 g, constitue la

source d'obtention des ribosomes.

Ces ribosomes sont contenus dans le culot d'une centrifugation

à 105.000 g (2 h à 30.000 tours/minutes à la Splnco L 50 en

rotor

4o).

10”^M MgCl^ 10“^M pH

7.4.

Le culot résultant est constitué essentiellement de ribosomes

70 S } il est conservé dans l'azote liquide. Lorsque les

bac-—2

téries sont broyées en présence de tampon Tris-HCl 10 M MgCl„

-4

10 M pH 7.4, on peut obtenir^en faisant toutes les opérations

dans ce même tampon, les sous-unités ribosomiales } ces sous-

unités ribosomlales sont séparées par centrifugation en gradient

de saccharose 5-20 comme décrit à la Fig, 4l,

Chacun des pics est récolté séparément.

Les ribosomes 30 S et 50 S provenant de plusieurs centrifugations

de ce type sont rassemblés et dialysés contre du tampon Tris-HCl

-2

10 M MgCl^ 10 M pH 7.4.

Après cette dialyse, les ribosomes subissent deux cycles de la­

vage et centrifugation à 105.000 g dans le même tampon.

Ils sont conservés dans l'azote liquide sous forme de culot jus­

qu'au moment de leur utilisation.

Les coefficients d'extinction par mole de phosphore à 260 m^ sont

respectivement de 7.710, 7,^50 et 7.810 pour les 30,50 et

JO

(MIALL et WALKER I967).

Ces données nous permettent de comparer les interactions de la

Proflavlne avec des quantités de sous-unités contenant la même

Système acellulaire de synthèse des protéines

Pour l'étude de l'incorporation d'acides aminés dans un système

acellulaire sous la dépendance de l'addition de polynucléotides

de synthèse , nous avons utilisé la souche de E. coli ML 308

originaire du laboratoire de F, GROS,

L'extrait utilisé provient de 10 g de bactéries récoltées en

phase exponentielle de croissance et resuspendues dans 12 ml

de tampon Tris-HCl 10 M ^pH 7«^)f contenant j Acétate de Mg^^

—2 —1 ~3

2,10 M, saccharose 2,10 M, Hercaptoethanolamine 6,10 et

KOI 10“^M,

Cette suspension est broyée par l'30" d'agitation sous refroi­

dissement dans le BRAUN (en présence de 30 g de billes de verre

de 0 11-12), Le broyât obtenu est centrifugé 20' à 17.000 g

et le surnageant constitue l'extrait brut.

Cet extrait est préincubé 45 minutes à 37° 0 afin d'épuiser le

mRNA endogène dans un milieu contenant pour 15 ml d'extrait,

WgSO^ 30^moles, KCl 60 ^ moles, ATP 20/^ moles, PEP 5/^ moles,

pyruvate kinase 100 1 ^mole de chacun des 20 acides aminés

et DNA se 50^ g.

L'extrait ainsi préincubé est dialysé pendant l6 heures à 4° C

contre du tampon Tris-HCl 10”^M (pH 7.4), Acétate de Mg 2.10”^M

-2

et KCl 10 M, Le milieu réactionnel d'incorporation des acides

aminés contient pour 1 volume total de 0,425 ml (en ^ moles) j

Tris HCl pH 7.4,20 - MgSO^, 4 - KCl, 50 - GTP, 0.1 - ATP, 2

- PEP,4 - Pyruvate kinase 15 /tg $ 0,1 de chacun des acides

aminés (sauf celui dont on étudie l'incorporation), et 0.1 ml

d'extrait dialysé et préincubé.

L'incubation se fait en présence de Proflavine ou de Bromure

d'Ethidium, avec du poly U (25 ^g) et de Phénylalanine J’^C-tRNA

(l50y<.g - 4,300 IPM ^^C) ou de poly UG (25 ^ g) et de Valyl -

^^C-tRNA (150^g - 28,348 IPM ^^C).

arrêtée par addition de 1 ml de TCA 10 Après 30' à 90° 0, le

précipité est recueilli par centrifugation et lavé deux fois au

TCA 5 ^ et deux fois par 5 ml d'Ethanol 95 Le précipité est

finalement dissous dans 0.3 ml d'H^O et repris par 10 ml d'un

mélange scintillant (BBOT 4g, naphtalène 80g, toluène 600 ml,

méthylcellosolve 400 ml) et sa radioactivité est mesurée au comp­

teur à scintillation BECKMAN.

Dans ces conditions, le poly U stimule plus de 50 fois l'incor­

poration de Phé. Pour chaque concentration de Proflavine ou de

bromure d'éthldium utilisée, un blanc comprenant exactement les

mêmes composants excepté le polynucléotide, a été déduit de la

valeur obtenue en présence du polynucléotide.

RNA DE TRANSFERT UTILISES

Le tRNA de levure

Le tRNA de levure utilisé est une préparation commerciale BOEH-

RINGER, Les tRNA de levure purifiés utilisés ont été obtenus dans

le laboratoire de Chimie Biologique de l'Université de Strasbourg

par distribution à contre courant de ce tRNA commercial (DIRHEI-

MER et EBEL 1967),

Les tRNA des réticulocytes de lapin

sont obtenus par extraction au phénol (KIRBY 1965) d'une suspen­ sion de réticulocytes (l volume de cellules sédimentées pour 8

volumes du milieu suivant s 0.1 M NaCl - 6.10"^M KCl - 1.5 . 10"^M

- MgCl^ contenant 0,1 ^ de glucose). Le tRNA déprotélnisé est en­

suite précipité à l'éthanol et purifié par passage sur une colon­