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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Janowski, M. (1969). Le métabolisme des RNA et des ribosomes chez Acetabularia mediterranea (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
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UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES
FACULTÉ DES SCIENCES SERVICE DE MORPHOLOGIE ANIMALE
Le métabolisme des RNA et des ribosomes chez
Acetabularia mediterranea
Mémoire présenté pour l’obtention du grade de
Docteur en Sciences Chimiques
JANOWSKI, Michel
REMERCIEMENTS .
Qu'il nous soit permis d'exprimer ici toute notre gratitu de envers M. le Professeur J, Brachet qui, tout au long de notre travail, n’a pas cessé de nous manifester son intérêt et son at tention et qui, sans compter, nous a prodigué ses précieux con seils.
Une très grande partie de nos recherches a été effectuée on collaboration avec notre ami Silvano Bonotto. De nombreux pro blèmes théoriques et pratiques n’ont été résolus que grâce à son habileté et à scn courage. J'aimei'ais qu'il trouve ici l'expres sion de ma reconnaissance.
Nous tenons également à romercior tous les chercheurs et amis des laboratoires de morphologie animale, de chimie biologi que et do génétique pour les discussions qu'ils nous ont accor dées dans une ambiance de parfaite camaraderie.
2
-INTRODUCTION ,
^ » Lo cycle biologiguOn
Acotabularia mediterranea est une algue marine de la famil le dos Dasycladacôeso Les détails de son développement ont été décrits par Hamraerling (1931), par Schulzo (1939) ©t, plus tard, par Puiseux-Dao (19ô3)» Sa culture en laboratoire est relative ment aisée (Hammerling, 1932, 1944; Beth, 1953; Lateur, I96», Cette algue est unicellulaire et uninucléée Jusqu'au moment de la roproductiouo A l'état presque adulte, elle se présente sous la forme d'une tige (ou siphon) portant à la base une touffe de rhi- zoïdes, dont l’un contient le noyau primaire (ou végétatif): très volumineux (10”^ mm^ au maximum de son développement), il con tient plusieurs nucléoles différenciés en forme de boudin» La partie apicale de la tige constitue la zone de croissance; il s'y développe successivement plusieurs couronnes de verticillos caducs»
quo la partio non ntiliséo du noyau priaairo reste à son e;apla” cernent priaitifo Un tel mode de division caractérise on général les uoyauj: polyploïdes (Puisoux-Dao, 1966).
Chaque noyau secondaire s'entoure de cytoplasme, puis d'uno épaisse membrane munie d'un clapet circulaire; il subit encore un certain nombre do mitosos et le cysto, contenant do 10 à 20 noyaux entre dans une période de repos. Chaque logo du chapeau contient à peu près 80 eyetes.
Lorsque les conditions extérieures sont favorables, la la tence est intei’rompuc par une nouvelle vague do divisions mito tiques asynclironos, accompagnées par la méiose et par une cyte- diôrôse. Ce processus aboutit à la formation d'isogamètes flagel lés dont la copulation donne naissance à des zygotes. Puiseux-Dao
(1963) affirme que la méiose peut ne pas avoir lieu; dans ce cas il se forme des soldes qui, libérés dans le railieu, se différen cient en Eoospores biflagollôs. Les zygotes (ou les zoospores) se fixent à un support et leur noyau, dont le volume est très faible (5.10“^ mm^), acquiert le type primaire on élaborant un nucléole sphérique. La jeune plantule se différencio aussitôt en une tige pourvue d'un rhizoïde; elle accroît son volume exponentiellement jusqu’à CO qu’elle atteigne une longueur de t{. à 5 cm.
2. Les substances morphogénétiouee.
Les résultats des expériences effectuées sur des fragments nucléôs et anuclôés d*Acotabularia. ainsi que la description dos phénomènes observés lors de la réalisation de greffes inter- ou intraspôcifiquos, ont fait l’objet de nombreuses revues (Hammer- ling, 1955} ^957} 1963; Brachet, 1957; Puiseux-Dao, 1963» Brachet ot Lang, 1965; Werz, 1965; Gibor, 1966).
L’ablation du rhizoïde d’Acetabularia fournit un fragment anucléé qui, non seulement est capable de sui-vivre pendant de nombreuses semaines, mais encore possède les capacités morphogô-
cal; pour une même rôgicn de la tige^ il dépend de la longueur du fragiaoüt (Iii.EiEie;.'ling, 193^£î-j 1934ï>)<> Tout fragment riMcléé pos sède toujours une capacité morphogénétique complète. Ces obser vations ont conduit Hammorling (1934c) à formuler les proposi tions suivantes;
(1) Les potentialités niorphogénétiques des fragments anucléés sont déterminées par la quantité de certaines substances, dites "lûorphogénétiques”, présentes dans le cytoplasme au moment do l’énucléation,
(2) Ces substances se répartissent suivant un gradient apico- basal décroissant,
(3) Dans les fragments nucléôs. ces substances sont produites continuellemont,
L’utilisation d’espèces voisines d’Acetabnlarla raediterranea (Acetabularia crenulata et Acicularia Schonckii) ont permis à Hammorling et à son écolo de réalisez* une série de travaux d’une élégance extrême, qui ont conduit à d’importantes conclusions à propos de la spécificité d'espèce des substances morphogéuéti ques, Le chapeau régénéré par un fragment anucléé est toujours spécifique de l’espèce. Sur une greffe interspécifique entre un rhizoido et un fragment anucléé, il apparaîtra un chapeau de type hybride, dont la tendance à présenter les caractères de l’espèce cytoplasmique s'accroît avec la longueur du cytopleismo greffé. Lorsque se produit une deuxième régénération, après la dégénéres cence ou l’ablation du premier chapeau, elle est do type pure ment nucléaire. Dos greffes plurinucléaires mixtes aboutissent à la formation d’un chapeau hybride dont la forme est directement influencée par le rapport du nombre des noyaux de chaque espèce. Les conclusions de ces expériences remarquables (Hamraerling, 1934a, 1946; Mashlanlca, 1946) peuvent se résumer comme suit: (4) Les substances morphogénôtiques varient d’une espèce à l’autre,
-■=y1
-(6) Dans les greffons plurinucléaires interspécifiquesu les ca- ract.éristiquQS du chapeau sont déterminées par le rapport quanti
tatif des doux types de substances,
(7) Tout se passe comme si les substances morphogénétiquos re présentaient une forme intermédiaire du contrôle, qualitatif et quantitatif, exercé par les gênes.
Une autre propriété des substances morphogénétiques devait ôtre mise en évidence par Beth (1943^, b et c): alors que les frag ments nuclôés d^Acicularia Schonclcii ne régénèrent que dans % des cas, les fragments anuclôés ne forment jamais de chapeen.
Maie il suffit que soit groffé, à l'un des deux types de fragment, un rhizoïde d*Acotabularia mediterranoa, pour que s'accomplisse une raorphogénèse de type hybride. Il apparaît par conséquent que:
(8) Certaines substances morphogénétiques sont spécifiques et déterminent la forme du chapeau.
(9) D'autres substances morphogénétiques sont dépourvues do spé- cifj.cité d'espèce et leur rôle consiste à rendre les premières fonctionnelles. Chez Acicularia. la lenteur de leur production se rait à l'origine du faible taux de régénérescence dans les frag ments nucléôs. Le simple apport de ces substances par une greffe interspécifique suffirait à dôclenchor l'utilisation de la poten tialité stockée,
Los expériences de greffes de rhizoïdes étaient susceptibles de donner prise à certaines critiques, vu l'apport de cytoplasme périnucléaire. Des transplantations do noyaux isolés ont ôté réa lisées, confirmant essentiellement les résultats précédents (Hara- merling, 1955; Hichter, 1959b; Zatsche, 19b2, I963).
morpho--
6
-gôïiétiquQfî continuent à se distribuer suivant un gradient antô- rO“postôrlour dais les fragmenta nucléés, ce gradient disp£.raîû dans les fragaionts anuclôés. Il se reforme cependant, sous l'ef fet d'une nouvelle illumination, avec une éventuelle inversion de la polarité.
Une illumination modérée est indispensable à la réalisation de la morphogénèse, c'est-à-dire à la mise en oeuvre de certains processus métaboliques et du fonctionnement de certains compo sants structurels du cytoplasme (Stich, 1953» 1956; Beth, 1955; Terborgh et Thimann, 196i^).
(10) L'ensemble des processus morphogônétiques semble donc s'éta blir suivant au moins trois étapes distinctes:
a) la production dos substances morphogénétiques ou, plutôt, de leurs précurseurs, indépendamment de toute illumination;
b) l'activation de ces substances, c’est-à-dire leur forma tion à partir des précurseurs, sous l'influence do la lumière;
c) la réalisation de la morphogénèse, sous l'effet d’une illumination môme modérée.
D’autres mécanismes paraissent aussi avoir une grande impor tance, dont la nature n’est pas encore connue (Richter, 1962; Clauss, 1963; Terborgh, 1965)î la morphogénèse ne se réalise i>as lors de l'exposition continue des algues à de la lumière rouge, à moins qu'un éclairement par do la lumière bleue vienne à intor- rompro cette condition expérimental© pendant une minute par Jour. Il existe sans doute des accepteurs spécifiques de lumière, dont l'action pourrait se situer au niveau de la porraéabilité de la membrane de la collule et des organites (Clauss, 1961).
nor-
"7-Ealeaont, Un prétraitement de ces fragmente par de la trypafla- vin© quij cotrcrairemont à l’obscui'itô, ne provoque pan la réduc tion do la taille du noyau tout en inhibant la croissancej abou tit à la réalisation de la raorphogénèse stir une tige encore plus courto (Wera, 195?aj 1959a)«
(il) La croissaïice et la morphogénèse, pour autant que celle-ci soit définie comme la seule formation du chapeau, apparaissent
comme des phénomènes indépendantsc
3* Action du cytoplasme sur le noyau.
Le fait que le cytoplasme exerce un important pouvoir régu lateur sur le noyau a été clairement mis en évidence par deux types d’expériences (Haamerling, 1939i 1953» 1957)î i- pos sible de retarder indéfiniment les divisions nucléaires en pro cédant à l’ablation du chapeau chaque fois qu’il atteint sa taille adulte. Inversément, la greffe d’une tige âgée sur un rhisoïde jeune induit prématurément la division du noyau.
L'état énergétique du cytoplasme joua aussi un grand rélo on. CG qui concerne la morphologie et l’activité du noyau (Si/ich, 1951» 195Ô; Brachet, 1952; Stlch et Hammerling, 1953; Brachet et al., 1955; Hammerling et Stich, 1956a, 1956b). Obtenue soit
par le maintien des algues à l’obscurité, soit par l'ablation de la tige, soit encore par l’action d’inhibiteurs des phosphoryla tions oxydatives, la dj.rainution de la production d’énergie dans le cytoplasme provoque rapidement la réduction des volumes nu cléaire et nucléolaire. Le nucléole perd sa différenciation et devient sphérique, tandis que sa teneur en RNA décroît. Une ré versibilité complète de ces phénomènes s’observe lorsque les plantes sont ramonées dans des conditions normales ou lorsque le rhizoide amputé a régénéré une nouvelle tige, capable d’assu- i’cr de nouveau une production suffisante d'énergie.
La nature des substances mcrphOf^énétlgueG„
Il ne fait aucun doute que les substances morphogéré tiques jouent un rôle d’intermédiaire entre le codage spécifique du DNA et l’expression de cotte spécificité dans le cytoplasmeo II est donc tout naturel de penser qu’elles pourraient être constituées, au moins partiellement, par des RNA messagers (m-RNA)o Synthéti sés dans le noyau, ces RKA. seraient ensuite déversés dans le cy toplasme suivant un gradient de distribution apico-basalo On pourrait également s’attendre à ce qu’ils jouissent d’une stabi lité remarquable (Brachet, I960),
De nombreuses expériences autoradiographiques ont mis en évidence que de l’orthophosphate-P^^ (Stich et Hainmorling, 1955> Hammorling et Stich, 1956a, 1956b), de l’acide orotique-C^^ et de 1’adônine-G^^ (Vanderhaeghe, 1957)» de l*uracile-C^^ (Werz et Zetsche, 1963), de la ^-ffiéthylcytosine-H^ (de Vitry, 1963)» de l’uridine-H^, do la cytidino-H^ et do la guanosine-H^ (de Vitry, 1965a) s’incorporent tous dans les RNA de la même manière: la première phase du marquage se déroule dans le noyau et, sur tout, dans le nucléole; la seconde, cytoplasmique, consiste en la formation d’un gradient apico-basal de radioactivité. Ce gra dient n’apparaxt pas dans les algues qui séjournent à l’obscu rité ,
l’enzy-mo, sans que ce phénomène ait une répercussion sur la teneur en RNA slobal.
l^-.'Cluorodéoxyurxdine est un inhibiteur de la synthèse du DI'iA; convertie in vivo en fluorouracile et puis en acide fluoro- uridyliquo (Cohen et al». 1958), elle interfère très probable ment avec la synthèse du RKA s£.ms avoir d'action sur le RNA pré existant (Danneborg et al», 1958; Chaudhuri et al., 1958; Karaov- sky et Easch, I960; Paul et Hagirav/a, 1962) et provoque l'in hibition de la raorphogénèse (et non celle de la croissance) seulement dans les fragments nuclôés (de Vitry, I96I, 1964a, 1964b).
On admet généralement que 1'actinomycine bloque la synthèse du m-RNA (Ilarbsrs et Muller, 1962; Reich et al., 19o2b; Shatlîin,
1962) en se combinant avec le DNA (Kirk, I960; Hurwitz et al., I960; Reich et al.. 1961, 1962a). Certains auteurs affirment ce pendant qu'elle inhibe la synthèse de tous les RNA (Reich ot al.,
mômes propriétés (Green et al.. 19ô7; Schveiger et_al», 'f96?a), ainsi que le cytoplasme même (Schv/eiger et al.. 1967a)»
On peut dès lors imaginer que l’initiation de la morphogé- nèse puisse être due à la présence de ra-RNA stables synthétisés dans le noyau et déversés dans le cytoplasme» La croissance ul térieure du chapeau serait contrôlée par l’intermédiaire de n-RNA synthétisés dans les chloroplastes (Brachet et al., 1964)» En faveur de cette hypothèse, des expériences autoradiographiques ont montré que de 1*actinomycine-C^^ se fixe dans les chloroplas tes (de Vitry, 1965b); en outre, cot antibiotique provoque des altérations, visibles au microscope électronique, de leur morpho logie (Boloukhôre-Prosburg, 1965). L’importance du rôle Joué par le DNA extra-nucléaire a aussi pu être mis en évidence par l’étu de des effets de l’hydroxyurée sur la morphogénèse. Cette subs tance empêche la synthèse du DNA en bloquant la réduction des ri- bonucléotides en désoxyribonucléotides (Young et Rodas, 196-4; Yarbro et al.. 1965; Adams et al.. I960; Turner et al., 1966). Or, elle inhibe la morphogénèse des fragments nucléés et anucléés l’effet étant réversible après le report des fragments traités dans un milieu normal (Brachet, 1967; Heilporn-Pohl et Limbosch- Rolin, 1968).
Des greffes interspécifiques, réalisées à l’aide d’un frag ment nucléé et d’un fragment anucléé dont l’un a été préalable ment irradié par dos rayons ultra-violets, forment un chapeau hybride dont les caractéristiques se rapprochent le plus de colle du fragment non irradié. Le phénomène est d’autant plus accentué que la longueur d’onde se rapproche de 254 Des expériences semblables, réalisées à l’aide de greffes intraspécifiques, mon trent également que la longueur d’onde de 254 nyi est celle qui provoque le plus efficacement l’inhibition de la morphogénèse Olanmerling, 1956; Six, 1956; Werz et Hamraerling, 1961).
-11"
Allon et Zamscnikf 1962: Nathans, I964)» Un traitement des frag ments nuclôôs et anuclôôs d’Acetabularla par la puromycine bloque totalement leur régénération (Brachot et al., 19ô4; de Vitry, 1965b; Zetsche, 1965)» Le phénomène est peu réversible dans le cas des fragments anuclôés; il l’est dans le cas des fragments nucléés, mais il y a souvent apparition de nombreuses hétéromor- phoses (Brachetj 1963; Brachot et al,, 1964)0 II semble donc
qu’une synthèse ordonnée de protéines soit indispensable à la réalisation d’une morphogénèse normale. Des observations au mi croscope électronique ont montré que, même dans les conditions où la puromycine inhibe de 60 à 70 % les synthèses protéiques, le noyau poursuit l’émission de matériel riche en RNA dans le cyto plasme environnant (Boloukhère-Presburg, 1966); les mitochon dries et les chloroplastes subissent, par contre, des altérations morphologiques profondes, Zetsche (1966d) a relaté, en accord avec ces constatations, des observations faites sur le plan bio chimique: une inhibition totale des synthèses protéiques par la puromycine est réversible seulement dans le cas des fragments nucléés; la présence du noyau n’est cependant plus nécessaire pour le déclenchement des synthèses à la fin du traitement,
Dos expériences autoradiographiques ont montré que la mé thionine, qui stimule la morphogénèse (Brachet et Olszewska, I96I; de Vitry, 1962a), s'incorpore dans le cytoplasme suivant un gradient apico-basal; une partie de ce précurseur des protéi nes se fixe d'abord dans le noyau et migre ensuite dans le cyto plasme (Olszowska et Brachet, I960, 1961; de Vitry, 1965a), com me le fout les précurseurs des RNA, Une irradiation ultra-violet- to localisée dvx rhisoïdo inhibe l'incorporation de méthionine, d'uridine et d'adénine radioactives, sans empêcher la formation du gradient typique (Brachet et Olszov/ska, 196O; Olszowska et al.,
disul-fure exercent5 par un mécanisas encore obscur, des effets impor tants sur la morphûgénôse (Brachot, 1958, 1959a, 1959b; de Yitry. 19b2a; Brachet et al., I965). Le comportement de la lysine-H^ rappelle également celui des substances morphogénétiques (de Yi-
try, igôifa, 1965a) et son incorporation dans les protéines basi ques apicales est extrêmement sensible à l’action de l’actinomy- cine (de Vitry, 1965c). Werz (1959b) a montré que seulement les zones do croissance et de morphogénèse contiennent dos protéines spéciales, colorables par de l’azocarmin-B à pH 2, et du RNA hautement polymérisé que l’on peut mettre en évidence à l’aide d'azur-I, de pyronine ou do trypaflavine (Werz, 1960a). Ces doux types de substances ne sont plus décelables lorsque la croissan ce et la morphogénèse sont bloquées par l’obscurité; elles réap paraissent sous l’effet de la lumière et semblent précéder les événements morphogénétiques. Notons d’ailleurs que le cytoplas me de l’apex et du rhizoïde sont les régions les plus basophiles
(donc les plus riches en RNA) de l’algue (Brachet et al., 1955; Werz, 1961a; Puisoux, 1963).
.Des études microscopiques (Werz, 1960b, 196lc) ont révélé l’existence de polysaccharides anioniques, répartie dans des struc tures réticulées ou en bâtonnets, toujours présents là où s'ac complit la morphogénèse, même dans le cas d'hôtéromorphoees à lo calisation anormale. Ces structures sont hautement spécifiques,
aonime le montre l’étude de huit espèces différentes de Dasycla- dacées; dans une greffe interspécifique, elles acquièrent les caractères de l’espèce dont provient le noyau. Lors de l’inter ruption d'un événement morphogénôtique par la suppression de 1’éclairomont, los structures étudiées restent stables pendant environ 30 jours.
Des photographies réalisées à l’aide d’un microscope élec tronique font apparaître que la plus forte densité de ribosomes se trouve bien dans le cytoplasme périnucléaire et dans la poin te de la tige, où ils se présentent principalement sous la forme de polyribosomes (Werz, I965; Van Gansen et Boloukhêre-Presburg,
l’c-pcx. Leur apparitioa précède 3.a foriaation d’un chapoau oxi d’ua verticillo; cos deu:c processus rflorph-ogénétiques débutent par une lyse iocctlo do la paroi cellulaire (Wors, 19S6b).
En conclusionj rien no permet d’établir avec certitude que les substances laorphogônôtiques sont formellemont identifiables à des rs-RîTA d’origine nucléaire, qui pourraient n’etre que leur précurseur. Elles pourraient être constituées par des protéines spéciales dont la synthèse, très sensible à l’action de la puro~ mycine, serait contrôlée par du n-RîTA d’origine nucléaire (3ra- chet, 1968), réparti dans le cytoplasme suivant un gradient api- co-basal. La formation de ces protéines exigerait de la .lumière. Cetto hypothèse oxpliquerait pourquoi, traités pendant quelques jours par de la puromycine ou par de la RNase, les fragments anu cléés perdent définitivement leur potentialité aorphogônétique. Elle expliquerait aussi pourquoi l’actinomycine et la 5-fluoro- déoxyuridine provoquent une inhibition plus marquée de la mor- phogônèse chez les fragments nucléés que chez les fragments anu- ciéés.
Ces protéines spéciales seraient capables de déclencher une série d’événements cytoplasmiques parmi lesquels, évontuollement une synthèse extra-nucléaire de m-RKA. A son tour, celui-ci ser virait de modèle à des enzymes et à des pi’Otéines de structure. Très ingénieuse, quoique fort spéculative, cette hypothèse, déve loppéo par de Vltry (1965c) à partir des prédictions de base de Brachet (1957)j repose sur l'ensemble des observations faites sur le comportement des fragments nucléés et anucléés en préson- co de divers métabolites et anti-métabolites d'une pax’t, et sur l’étude autoradiographique de la synthèse de RNA et de protéines dans diverses conditions expérimontalos d’autre part.
5- Acti^^ités synthétiques en l'absenco du noyau.
sur les problènos des synthèses de protéines, do RHA et de DM dans des paragraphes ultérieurs «
L’énucléation ne supprime pas la pénétration, au sein de la cellule, des ions carbonate (Brachet et al,. 1955)j phosphate
(Hanmerling et Stich, 195^), sulfate (Clause, 196l) et ammonium (Bremor et Schv/eigor, I960),
La respiration et la photosynthèse ne sont pas affectées pendant plusieurs semaines après l’ablation du noyau (Chantrenne- Van Halteren et Brachet, 1952; Brachet et al». 1955)i ainsi que la synthèse des pigments plastidiaux: la chlorophylle (Clauss, 1958) et divers caroténoïdes (Richter, I958). Aussi n’est-il pas étonnant de constater que des réserves d’énergie continuent à s’accumuler sous la forme do polyphosphates (Stich, 1953, 1955s 1956; Thilo et alo. 1958) et d’ATP (Brachet et al,. 1955)» ce qui permet leur utilisation dans des réactions anaboliques, La teneur on sucres réducteurs et non réducteurs s'accroît (Clauss et Keck, 1959)» ainsi que celle en un polysaccharide (Brachet et al., 1955)» peut-être identifiable à de l’inuline (Vanden Dries- sche et Bonotto, 1987)o La formation de phospholipides se pour suit (Schv;eiger et Bremer, 1960b) et la réserve d’acides aminés et de peptides libres so maintient à un niveau constant (Richter, 1963; Vanden Driessche, 1966),
Notons finalement que le rythme photosynthétique endogène, dont la phase est cependant déterminée par le noyau (Schweiger et al,., 1964)» peut se manifester pendant plus d’un mois après l’énu cléation (Svveeney et Haxo, I98I; Richter, I963; Vanden Driessche,
1966)
s’in-
-15-corporsr dans les protéines pondant une longue période après l’é- nucléation (Bracliet et Chantrenne, '»9î>'!s 1952; Brachet et alo, 1955).
Il ne fait aucun doute maintenant que les chloroplastes con tribuent activement à ce phénomène: ils sont capables d’auto réplication en l’absence du noyau, mais se divisent toutefois moins rapidement que dans les fragments nucléés (Shephard, Î965a)<, Au soin des fragments anuclôés, ils sont capables de synthétiser du RWA et des protéines (Schweigor et Berger, 1964; Goffeau et Erachet, 1965; «âe Vitry, 1965c; Chapman et al.. 1966; Schweiger
et ûl,, 1967a); cette propriété s’observe môme in vitro pendant un temps limité (Brachet et Goffeau, 1964; Goffeau et Brachet,
1965; Berger, 1967).
-t6-L'activité de plusieurs enzymes s'accroît au sein des Trag- méats anucléés: l'jnvertase (Keck et Clauss, 1958)j, la pliospho- rylase (Clauss, 1959)» l'aldolase (Baltus, 1959)s la déshydro- génase maliquo (Sclmeiger ot al,.. 19678), l'UDP-glucose^-épimérase
(Zotsche, 1966b), l'UDFG-pyrophosphoz'ylase (Zetsclie, 1968) et, malgré de premiers résultats en appsirencG négatifs (Keck et Clauss,
1958; Vanderhaoghe ot Baltus, 1962), la phosphatase acide (Spen cer et Karris, 1964; Triplett et al., 1965)» H ne fait donc au cun doute que le cytoplasme anucléé contient une information sta ble, non seulement capable de provoquer la croissance ot de diri ger des événoraonte raorphogénétiques, mais encore de permettre la synthèse continue d'enzymes fonctionnels.
Il a été montré que cinq isozymos de la dôshydrogénase mali- que, séparables par électrophorèse, se distribuent d’une manière caractéristique entre quatre familles de Dasycladacées (Schv/ei- ger et al,, 1967b). Chez Acetabularia. il en existe deux qui, tout on conservant leurs propriétés électrophorétiques et leurs proportions relatives, continuent à se synthétiser en l’absence du noyau. Une greffe interspécifique ou la transplantation d'un noyau isolé dans le cytoplasme d'une autre espèce bouleverse la distribution des isozymes: elle devient celle de l'espèce dont provient le noyau. La modification comprend la disparition des isozymes qui n'existent pas chez l'espèce qui a fourni le noyau. Les isozymes étudiés sont localisés dans les chloroplastes: cette constatation est d'une grande importance, car elle indique que le noyau peut exercer un contrôle sur une information stable lo calisée au sein des plastes, qui jouissent pourtant d'une grande autonomie.
^7-intormodiairo, La transplantation d*un noyau isolé fournit lo mê me résultat; l'injection d’un homogénat concentré do cytoplasme aod donne lieu au remplacement complet de la phosphatase acic par l’enzyme de type intermédiaire. Il n’est pas encore possible de dire si ces résultats reflètent une induction ou, comme le suggère l’existence de l’enzyme intermédiaire, une transition al lés téri que.
Il a ôté démontré que la phosphatase acide d'Acetabularia sc trouve sous la forme de cinq isozymes, dont trois sont aisément dosablos (Spencer et Harris, 1964; Triplett et al.1965)- L’ac tivité de l’un d'entre eux, qui n’est localisée ni clans les chlo- roplastes ni dans les mitochondries, ne cesse do diminuer au cours do la période qui suit l'ablation du noyau. Les deux autres, as sociés aux chloroplastes et aux mitochondries, augmentent d’ac tivité au moment de la formation du chapeau, même en l'absence du noyau. Bien que ce phénomène puisse être également interprété par une transformation allostôrique aussi bien que par une induc tion, il implique la présence d'un mécanisme régulateur encore fonctionnel longtemps après l'énucléation. L’une des phosphatases se comporte effectivement comme un enzyme inductible, mais seule ment lorsque le noyau est présent: une déficience en phosphate inorganique dans le milieu de culture provoque, tant chez les frag ments nucléés que chez les fragments anucléés, la décroissance de l’activité globale des phosphatases, parallèlement à la dégra dation des polyphosphates de haute masse moléculaire; la dispa rition de cos derniers coïncide, uniquement chez les fragments nucléés, avec l'acci’oissement de l’activité d’une phosphatase plastidialo (Brachet et Lievons, I968),
7» La synthèse do RHA en l’absence du noyau.
Dès 1955» il a été montré que les fragments anucléés d* Ace- tabularia sont le siège d’une synthèse nette de RKA (Brachet ^ al., 1955). Il u’a d'abord pas été possible de confirmer ce résul tat (Richter, 1959a; Naora et al.. 1959); niais il s’est avéré par la suite que ce désaccord provenait, très probablement, de diffé rences dans les conditions de culture et d’éclairement adoptées dans les divers laboratoires: les fragments anucléés sont capa bles d’augmenter leur teneur en RNA chloroplastiquo, pendant que l’on observe une diminution parallèle de la quantité do RNA non chloroplastique (Kaoi-a et al. « I960). La prouve définitive devait être fournie peu après: dans les fragments nucléés comme dans les fragments anucléés, la teneur en RM diminue à l’obscuricéj ce pendant, lorsque des algues entières ont été maintenues à l’obs curité pendant 10 jovirs et puis privées de leur noyau, les frag ments anucléés qui en proviennent peuvent devenir, à condition
qu'on les ramène à la lumière, le siège d’une importante synthèse nette de RNA (Schwoigor et Bremer, 1960a, 1961).
La synthèse nette de RM en l’absence du noyau est inhibée par un traitement prolongé par de l’actinorayeine, sauf dans le cas des fragments anucléés basaux, dont la limitation des capa cités morphogénétiques est bien connue. On a également observé, dans des fragments nucléés et anucléés traités par de la ENase, un accroissement paradoxal, par rapport aux témoins non traités, de la teneur globale en RNA (Brachet et Six, 1966),
Dos expériences autoradiographiques et biochimiques ont mon tré qxie de la guanosine-H^ (de Vitry, 1965a), de l’acide orotique-
çt de l'adénine-C^^ (Brachet et Sz&farz, 1953; Vanderhaeghe et Szafarz, 1955; Vanderhaeghe, 1957; Naora et al.. I960) s'in- corpox’ont dans les fragments anucléés d’Ace tabularia. Du
gradient d© Eaccharose, d© HWA radioactifs dont le profil do sé- diüientation ressoiafclo à celui des r-lîNA d* fisc lier ichia coli.
(E.coli); ces RNA marqués ont ôté isolés à partir des chloroplas- tes, des mitochondries et, assez curieusement, du cytoplasme dé barrassé de ces organites par centrifugation (Schvreiger et al.,
1967a)O Les chloroplaotes isolés à partir de fragments anucléés d‘Acetabulai'‘ia sont capables d'incorporer in vitro de l'uracile-
dans des ENA 23, î6, 9 et /f s; leur synthèse est inhibée par l'obscurité, par la DKase et par l'actinomycine (Berger, 1967).
80 Le DHA d*Acotabularla,
Le DNA do 1*Acotabularia en croissance est tellement dilué dans l'énorme volume du noyau, qu'il n'est pas possible do le mettre en évidence à 1*aj.de de la réaction de Feulgen» Celle-ci no devient positive qu'au moment de la fragmentation nucléaire; elle s'estompe dès que la jeune plantule commence sa croissance.
Dos dosages fluorométriques (Baltus et Brachet, 1962; Gibor et Izawa, I963) et l'étude de l'incorporation d'actinomycine-C^^ (de Vitry, 1964b, 1965c) ont démontré que les chloroplastes con tiennent du DNA, dont la teneur, même dans le cytoplasme anucléé, augmente au cours du temps (Heilporn-Pohl et Brachet, 1966). Le DNA plastidial d * A c e t abularia peut être observé sous la forme de fibrilles, à l'aide du microscope électronique (Werz, 1966a; Pulseux-Dao ot al.. 1967; ïïerz et Kelner, 1968b). Dans un lysat do chloroplastes, il a une structure en double fibre (Wers et Kelner, 1968a, 1968b). Sa synthèse reflète certainement la mul tiplication des chloroplastes, qui est possible même en l'absen ce du noyau (Shephard, 1965a)» L'incorporation de thymidine ra dioactive, décelée par autoradiographie, avait déjà suggéré que le cytoplasme anucléé est capable de synthétiser du DNA (Brachet, 1958). Il est à présent certain que la synthèse du DNA extra nucléaire s'effectue principalement au sein des chloroplastes (de Vitry, 1965c; Shephard, 1965b; Chapman et al.. 1966).
20
ci-itiques par Green et a3..(î9Q7)» qni ont réussi à extraire et à fractionuers dans un gradient de CsCl, deux espèces extra-nuclé aires de DNA. L’une (lj70/f g/cc) provient, do toute évidence, dos chloroplastes et l’autre (1,714 g/cc) pourrait être de nature mi tochondriale. La densité du DNA plastidial semble proche de celle du DNA nucléaire (1,702 g/cc), extrait à partir des cystes.
9* Conclusion.
Los propriétés étonnantes de 1*Acetabularia en font un ma tériel do choix pour l’étude des nombreux problèmes inhérents au fonctionnement d’une cellule infiniment plus complexe qu'une bac térie. Trop pevi de données expérimentales sont disponibles, qui permettraient l’idontification de la réserve d’information d’ori gine nuciéairo grâce à laquelle est possible, même en l'absence du noyau, la synthèse des protéines, indispensable au maintien des fonctions vitales, à la croissance et à la réalisation de la morphogénôse.
Les enayîaes synthétisés dans les fragments anucléôs semblent soumis à des mécanismes régulateurs purement cytoplasîniques, dont la nature nous échappe encore largement,
La signification et le rôle du rythme pliotopériodique res tent une énigme; il est indéniable que ce i-ythmc existe et, pourtant, il ne semble pas, à première vue, que ce rythme soit indispensable au déroulement normal d’un cycle biologique complot.
-22
PLAN DU TRAVAIL.
Lo présent travail est divisé en deux parties: la première est consacrée à l'étude dos RNA d*Acotabularla méditerranea et la seconde, à celle des diverses particules, ribosomialos ou d'apparence ribosomiale, de cette algue.
En premier lieu, nous décrirons les caractéristiques des RNA globaux dos algues nuclééos et anucléées, étudiées par des cen
trifugations en gradient de saccharose (examen de leur profil do sédimentation, évaluation do leurs constantes de sédimentation, test do leur intégrité après extraction). Nous verrons que l'énu cléation provoque des modifications profondes du i^rofil de sédi mentation des RNA globaux. L'examen des RNA présents dans les différentes fractions sub-cellulaires nous permettra de les clas ser en plusieurs familles, caractérisées par leur profil de sédi mentation et par leurs constantes de sédimentation.
Nous présenterons ensuite des expériences préliminaires d’incorporation de dans les RNA des fragments nucléés et anu- cléés; malgré les inconvénients que présente la technique utili sée, la chromatographie des RNA-P^^ sur des colonnes d'albumine méthylée fournira des renseignements utiles en montrant une simi litude frappante entre le métabolisme du RNA dans les deux types de fragmente.
Une étude plus poussée du métabolisme des RNA sera alors décrite; nous avons eu recours à des incorporations d'viridine-H'^, pondant des temps courts (30 min à 4 h) et pendant des temps
frag-
.25-montG anucléés: les RHA radioactifs ont été alors fractionnés dans des gradients de saccharose. Nous verrons aussi ce qu*il ad vient de cos RM au cours d’une '’chasso" de la radioactivité instable.
Dans la partie consacrée aux ribosomes, nous signalerons qu'il a été possible de purifier et de fractionner des ribosomes chloroplastiques d'Acetabuleria, et que les tentatives d’iso
lement des ribosomes cytoplasmiques ont toujours abouti à un échec» Nous verrons ensuite comment, dans le cas des algues entières, de l'uridine-lP s’incorpore, pendant des temps courts (15 ciin à
k h) et pendant des temps longs (plusieurs Jours), dans les di
verses particules, ribosoniales ou d’apparence ribosomiale, d’un homogènat total; comme dans le cas des RKA, nous étudierons le sort de ces particules marquées, au cours d’une ”chasse" de la radioactivité instable.
La comparaison entre l’incorporation d’uridine-H-^, pendant un temps bref (2 h), dans les particules de la fraction non chlo- plastique des algues entières et des fragments anucléés. nous permettra de suggérer que le cytoplasme, même anucléé, pour rait être capable do synthétiser des ribosomes, partiellemnt as sociés en polyribosomes. Nous verrons qu’il s’agit bien de ribo somes, du fait qu’ils incorporent des acides aminés tritiés.
Nous montrerons, en outre, que les synthèses cytoplasmiques, chez les fragments anucléés, peuvent être stimulées par de la lumière.
Outre les ribosomes, deux espèces de particules (30 et 50 s) se marquent rapidement dans le cytoplasme nucléé ou anucléé; nous nous efforcerons d'obtenir des indications sur leur nature, on observant les effets du chloramphénicol sur leur marquage res pectif par de 1’uridine-H^, dans le cytoplasme d’algues entières.
Nous pourrons ensuite montrer que, tout comme la fraction non chloroplastique, la fraction chloroplastlque incorpore rapi dement (2-3 h), en la présence ou en l’absence du noyau, de
l’u-X
riboijo-
-24*-mos nôosynthétiséc au soin dos chloi-oplastes sont partiel].Giae:it associés en polyribosomes.
CV
-2>
MATERIEL ET METHODES.
10 Culture et manipulation des algues.
Des souches d*Acetabularla medlterranea sont maintenues de puis de nombreuses années au laboratoire. Elles sont cultivées suivant une méthode voisine de celle décrite par Hâmmerling 0951)* qui a ôté améliorée par Dateur (1963). Le milieu do culture est constitué par do l'eau de mer naturelle, stérilisée à l’autoclave; 11 est cîirichi par l’addition de nitrate do Na (0,1 s/1), de
phosphate de Na (0,02
s/D
et d’un extrait obtenu à partir de terre organique riche en soufre et en acides aminés.Bien qu’elle permette l'obtention de cystes quasi-stériles, l’utilisation d'antibiotiques est actuellement évitée en raison des nombreuses anomalies,provoquées par de tels traitements.au cours du développement et de la morphogénèse des algues. Le rem placement fréquent du milieu empêche la prolifération des micro organismes .
Les chambres de culture sont maintenues à 20°C et leur éclai rement journalier est de 12 h. La répartition des tubes à fluo rescence assure une illumination dont l'intensité est compri se, suivant l’emplacement, entre 1.5OO et 2.500 lux.
-26
-2O Incorporations de précurseura radioactifs.
Lss algues ou les fragments sont incubés dans leur milieu do culture contenant la quantité désirée de précurseur radioac tif. La durée de l'incubation et la radioactivité spécifique du milieu seront mentionnées au cours de l'exposé de chaque expé rience .
Nous avons constaté que l'incorporation du précurseur se poursuit pendant de nombreuses heures après la fin de l'incuba tion. Il est donc indispensable, dès que le temps désiré est écou lé, d'effectuer un rinçage des algues et de procéder immédiate ment aux opérations ultérieures,
5» Homogénéisation.
La méthode la plus satisfaisante consiste à émincer les al gues aux ciseaux dans le volume désiré de la solution tampon. Silos sont ensuite homogénéisées soit, lorsque leur nombre ne dépasse pas 500, dans un homogénéiseur Potter-Elvehjem soit, au- delà de ce nombre, dans un homogénéiseur à piston conique en ver re rodé.
4, Extraction du RNA.
1) Première méthode. Les RNA extraits par cette méthode ont été étudiés par chromatographie sur colonne d'albumine méthylée.
a) Fractions sub-çellulaires: 50 à 100 fragments nucléôs ou anucléés, préalablement incubés on présence d'orthophosphate-I^^, sont homogénéisés dans 1 à 2 ml de Tris-HCl 0,0î M (pH 7,4) con tenant du saccharose 0,25 M, L'homogénat est centrifugé pendant î min à 50 g afin d'éliminer les débris des membranes. Les chlo- roplastes sont ensuite sédiraentés par une centrifugation do 15 min à 1,200 g et resuspendus dans 1 à 2 ml de la solution utili sée pour l'homogénéisation.
27“
il a ôté décrit ci-dessus, on ajoute du dodécylsulfate de Na (SDS!v Jusqu'à une concentration finale de 0,3 % et un volume é^jal de phénol-eau (9:1> vol/vol) contenant 0,î % de 8~hydroxyquinolineo L’émulsion est agitée pendant 45 min à 45®C et les phases sont séparées par centrifugation. L'interphase est reprise dans 1 ml do Trie-HCl 0,01 M (pH 7*4) et réextraite pendant 15 min à 65®C en présence de SDS 0,3 %> de phénol-eau (9*‘î) et de 8-hydroxyqui- noline 0,1 %« Les phases aqueuses provenant des doux opérations sont rassemblées et réextraitos par du phénol pendant 15 ™in à 25®C. Los HÎTA sont précipités à trois reprises par du KaCl 0,1 M et 2 volumes d'éthanol et, finalement, purifiés par une dialyse contre 5OO volumes d'eau pondant une nuit à 4°C.
2) Deuxième méthode. Cotte méthode a été utilisée afin d'obte nir, à partir des chloroplastes, des mitochondries et du cytoplas me (surnageant post-mitochondrial), des quantités appréciables de RNA dont les caractéristiques ont été étudiées par des centri fugations en gradient de saccharoso, 1,000 à 5.000 algues entiè res ou fragmente ont ôté utilisés lors de chaque expérience. Les volumes des solutions que nous reportons ici sont ceux utilisés pour 1.000 plantes. Toutes les opérations se déroulent à 4®C,
a) Fractions sub-£ollulaires: les algues entières ou les fragments sont homogénéisés dans 10 ml d'acétate de Na 0,01 M (pH 5j0) contenant du glucose 0,54 M, de l'éthylène-diamine- tôtraacétate de Na (EDTA) 0,001 M , 1 rag/ml de naphtalène disul- fonate (NDS) et 100 )ig/ml de sulfate do polyvinyle (PVS)^ L'ho- mogônat est filtré par aspiration à travers une épaisseur de soie à bluter, puis centrifugé pendant 2 min à 70 g, afin d'éliminer les débris dos membranes. Les chloroplastes sont sédimentés par une centrifugation de 5 min à 1.200 g et les mitochondries, par une centrifugation de 10 min à 3O.ÜOO g. Le surnageant de cette dernière centrifugation est appelé "fraction cytoplasmique" . Les deux culots sont suspendus dans 10 ml du tampon à l'acétate déjà décrit.
uti-
-28-liaée est celle de Baltus et Quortier (1966): deux extractionîi consécutivea en présence d*uii même volume de phénol-eau (9:1, vol/vol) pendant 5 min, suivies par une troisième extraction on présence d*un même volume de chloroforme- alcool isoamylique (35:1, vol/vol) pondant 5 mlUo Les ENA sont précipités par l’addition de 0,1 vol.de NaCl 10 % et de 2 volumes d’alcool absolu. Ils sont en suite dissous dans un petit volume (0,2-0,5 ni) de tampon à l’acé tate 0,01 H (pH 5j0) contenant de l’EDTA 0,001 M et 20 ;jg/ml de F7S, et finalement reprécipités par l'addition d'un volume égal de NaCl 4 M, Cette dernière précipitation est complète après une nuit à
EoCOli: les constantes de sédimentation des di verses espèces do ENA présentes chez Acetabuleria ont fréquem ment ôté évaluées en calibrant les gradients de saccharose à l'aide de ENA radioactif de Ë.coli. Les bactéries (E.coli B) ont été cultivées en présence de 10 )ic/ml d’uridine~H^ Jusqu’à une densité optique de 0,6; les ENA ont été extraits de la même ma nière que ceux d*Acetabuleria.
5< Isolement et fractionnement des ribosomes.
Première méthode. Cette méthode permet l’obtention de quan tités appréciables de ribosomes chloroplastiques. Les tentatives d’isolement des ribosomes non chloroplastiques ont toujours abouti à des échecs.
riboso-
-29-raoB sont obtenus en centrifugeant le surnageant pondant 2 h à t20o000 g (Spinco L50, rotor 40), Les ribosomes sont remis on sus pension dans 2 ml de la solution de lyse et eédimentés de nouveau pendant 2 h à 120,000 g.
2) Deuxième méthode. Nous venons de signaler qu’il n’a pas été possible de purifier des quantités mesurables de ribosomes cyto plasmiques. On peut cependant les déceler à l’état de traces dans un gradient de saccharose, grâce à un marquage par de l’uridine-H^ ou par des acides aminés-H^j à condition de ne pas les soumettre au préalable à des opérations de purification, La technique mise en oeuvre a l’inconvénient d’être très limitative. En effet, des dosages de lig (méthode de Ballantine et Burford, 1957) nous ont montré que sa concentration intra-cellulaire est de 0,05 M. Il est donc nécessaire do diluer fortement les homogénats d*Aceta- bularia dans une solution 0,01 M en î-îg , afin de contrôler d’une manière satisfaisante la concentration de ces ions. Il on résul te que seul un petit nombre d’algues (une dizaine par gradient de saccharose) peut être utilisé lors de chaque expérience et qu’il devient illusoire, dans ces conditions, de vouloir déceler des ribosomes par leur absorption à 260 n^. Cette difficulté est vraisemblablement à l'origine des échecs encourus lors des essais d’isolement des ribosomes cytoplasmiques.
3) Rj-'bosonios de E„coli. Dos ribosomes de E.coli, isolés par la méthode de Tissières et al.(t939)» ont été utilisés pour ca librer les gradients de saccliarose dans lesquels sont centrifu gés les ribosomes radioactifs d*Acetabularia. Ils ont été par tiellement dissociés en étant suspendus dans du tampon Tris-HCl OjCd n (pH 0,03 M an
6„ Traitements par la RKase,
Afin de les débarrasser des traces de DKase ôventuellomont présentes, toutes les solutions stock de HNase pancréatique com merciale ont été placées pendant ÎO min dans un bain à ÎOO°C, Dans les conditions expérimentales utilisées, un tel traitement ne provoque pas de diminution mesurable de l'activité enzymati que do la RNaso. L'activité résiduelle de la DNase n'a pas ôté testée,
1) RNA, Dissous dans do l'acétate 0,01 M (pH 5,0) contenant de l'EDTA 0,001 M, les RNA dont nous désirions contrôler la pureté ont ôté traités pendant 30 min à 37®0 par 30 ^g/ml de RNaso. Ils ont été soumis immédiatement à une centrifugation en gradient de saccharose,
2) Ribosomes. Les fractions d'homogénat destinées à un trai tement par de la HKase ont ôté maintenues pendant 30 min à i|.®C en présence de l'enzyme très dilué (0,05 pig/ml), puis centrifu gées dans un gradient de saccharose en même temps que les frac tions non traitées,
7, Chromâtographios sur des colonnes d'albumine méthylée.
L'albumine (Bovine plasma albumia, fraction Vj Armour) a été estérifiéc suivant la méthode de Mandell et Ilershey (I960) et la colonne a été préparée suivant la technique de Monior et al» 0962)0 Le diamètre de la colonne a cependant été réduit à \ cm La hauteur totale de la couche active (kieselguhr enrobé de pro téines) était de cmo
Le RNA est mis en solution dans du NaCl 0,2 M maintenu à pH 6,7 par du tampon avi phosphate 0,05 M, introduit dans la co lonne et ensuite élue avec du NaCl (pH 6,7) dont la concentra tion augmente suivant un gradient linéaire continu de 0,2 à
UsO Mo Le volume total do l'ôluant, récolté par fractions do 0,75 ml, est do 30 21I0
8. Centrifugations en gradient de saccharose »
l ) RNA. Des gradients linéaires de Zf,8 ml ont été réalisés à l'aide de saccharose 5-20 % dissous dans du tampon à l'acétate do Na 0,0^ M (pH 5*0) contenant do l’EDTA 0,001 M et 20 ;ag/ml do PVSo Dissous dans 0,2 à 0,3 ml du même tampon, le RNA est dé posé à la surface du gradient et centrifugé pondant 5 h à 37o500 tours/min (Spinco L50, rotor SW39) ou pendant 3 h à Zf5»000
tours/min (Spinco L2, rotor SW50).
Des fractions de 2 gouttes sont collectées par le fond du tube, que l'on a percé à l'aide d'une aiguille do seringue (Vl?), ot sont diluées dans 0,3 ml d'oau. L’absorption à 260 rap est
déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre Beckman ot la radioac tivité est mesurée dans 5 wl de solution de Bray (i960), à l'ai*- de d'un compteur de scintillations en milieu liquide (Nuclear, Chicago).
32-2) Rj-bosomecs„ 0,2 à 0,3 d'homogénat (fraction chloropls.s- tique, fraction non chloroplastique ou honogénat total) ou de sus pension do ribosomes sont centrifugés pendant 3 h à 37«500 tours/ min (Spinco L50, rotor SW39) ou pendant 2 h à i|-5-000 tours/min
(Spiaco LH, rotor SW50), dans un gradient linéaire de saccharo se Î5-30 % (4,8 ml) dissous dans une solution de Tris-HCl 0,01 M
(pH 7,4), KCl 0,01 M et acétate de Mg 0,01 M, La récolte des frac tions (2 gouttes) se fait par le fond du tube. Leur absorption à 260 m;.\ est éventuellement déterminée comme dans le cas des RUA; chaque fraction est ensuite additionnée de 0,1 ml do sérumalbumine 1 %t puis d*un même volume d'acide trichloroacétique (TCA) 10 %. Après 30 min à 4°0, les précipités sont recueillis sur doc fil tres Miilipore, rincés avec 15 12I de TCA 5,5 % et séchés soit pen dant une nuit à température ordinaire, soit pendant H h â 80®C, La radioactivité dos filtres est déterminée à l'aide du compteur de scintillations dans 10 ml de la solution suivante: 5,0 g do 2,5-’diphényl03ca20lo (PPO) et 0,5 S de 2,2'-P‘-phénylène-bis-(4“ môthyl-5”Phényloxazole) (diméthylPOPOP) dans 1 1 de toluène»
9 O Ultracontrifugations analytiques.
Nous avons maintes fois évalué les constantes de sédinerita- tion dos RNA d'Acotabularia en calibrant les gradients de saccha rose à l'aide de RWA radioactif do R»coli» Le but de cos mesures n'était pas do déterminer la valeur exacte de ces constantes, mais d’établir une classification des RNA en plusieurs familles carac térisées par leur comportement pendant une ultracentrifugation en gradient de saccharose»
FIGURE 1
Les RNA des algues entières, des fragnents nucléôs et des frag» raents anucléés»
a. Algues entières en croissance.
b. Algues entières munies d*un chapeau adulte depuis environ
tO jOUi-3.
c. Fragments anucléés depuis 5 jours. d. Fragments anucléés depuis 20 joxirs.
RESULTATS EXPERIMENTAUX o
Comnie la validité des méthodes utilisées dans ce travail sera discutée plus loin d^une manière détaillée (cf.Discussion dos résultats et conclusions), nous nous bornerons à signaler ici que les résultats obtenus sont très reproductibles, du moins dans une mÔme culture d'Acetabularia. Toutes les expériences ont été répétées au moins deux fois sauf, pour des raisons qui seront exposées au cours de la discussion, colles qui concernent l’iso- lement dos RNA cytoplasmiques,
^ » Los RNA d'Acetabularia mediterranoa.
a) Les RNA des algues entières, des fragments nucléés et des fragments anucléés,
Le RNA extrait à partir d'algues entièi'es en croissance et précipité par du KaCl 2 M se fractionne on deux pics majeurs dans un gradient de saccharose (Fig.îa). Lo rapport do leurs surfaces
(et, par conséquent, de leurs masses) vaut approximativement 1 :î; étant donné que leurs masses moléculaires sont différentes,ce.'là signifie qu'ils n'existent pas en quantités équimoléculaires.
FIGURE 2.
ConstantcG de Gédimeatation des RNA d’Acetabulfiria. évaluées en calibrant les gradients de saccharose avec du lîNA-H^ de F..cpli. Test do la dégradation du RNA pendant le processus d‘extraction.
a. Cosédimentation du RNA d»Acetabularia avec du RNA~H^ do
EoCOli.
b. Rôextraction du RNA-H^ 1? Q (marqué pendant 5 ûîi présence de 20 p.c/m.1 d*uridine-K^) avec le ENA non radioactif d'algues
porteuses d'un chapeau adulte.
c. Réoxtraction du RNA"E^ 23 s (marqué pendant 3 h en présence de 20 jic/ml d’uridine-H^) avec le RNA non radioactif d'algues porteuses d'un chapeau adulte.
”35'°
«no vitsssQ plus rapide que celle en RNA léger (Fig.îc,d). Nous ignorons, toutefois, si co phénomène s'accentue lorsque les frag ments anucléés ont formé un chapeau.
Les RNA des fragments nucléés présentent, dans un gradient de saccharoso, les mêmes propriétés que ceux des algues entières. Aucun changement ne se manifeste dans l'aspect général du pro fil de sédimentation, même 25 jours après l'opération (Pig.lo).
SNA d'Acetabularia. ■X
La calibration dos gradients à l'aide de RNA-Ir de S.coli a montré que les constantes do sédimentation des RNA lourd et léger d'algues entières, évaluées par extrapolation linéairo, sont de l’ordre do 25 et l6 s (Fig.2a), La vitesse de migration des fronts de sédimentation, pendant une ultracentrifugation analytique (Photo 1), permet de calculer des valeurs 25 et 17 a, La concordance entre ces résultats, obtenus par doux méthodes différentes, est satisfaisant©,
ENA étudiés.
Afin do déceler une dégradation éventuelle du RNA pendant le processus d’extraction, nous avons effectué l'expérience sui vante: les RNA radioactifs, provenant d'algues entières incubées pondant 3 Qîi présence d'uridine-H^, ont été extraits, puis frac tionnés dans un gradient do saccharose. Les fractions correspon dant à chaque espèce de RNA ont été rassemblées et ajoutées à un homogénat do 500 algues entières non l'adioactives, porteuses d’un chapeau adulte. Une nouvelle extraction, suivant le processus habituel, a donné les résultats représentés dans les figures 2b et c. Trois conclusions peuvent être tirées de cette expérience: a) les RNA marqués pondant un temps bref (3 h) no sédimontent pas exactement à la mémo position que los RNA non radioactifs;
FIGÜRS 5
Les HNA des fz’actioiio sub-cellulaires.
a« Chloi-oplastos des algues entières en croissance, b.Chloroplastss de fragments anuclôés depuis 5 jours. Ce Chloroplastes d’algues entières porteuses d'un chapeau
adulte depuis emriron 10 jours,
d. Mitochondries des algues entières en croissauce,
e. Cytoplasmo (s'drnageant post-mitochondrial) des algues on- tièros eîi croissance,
f. Cosédimentatioa des SHA mitochondï'iaux et cytoplasmiques
X
d’algues entières avec du RNA-H'^ de S,coli.
c) si l'on admet que les RNA non marqués se comportent do la môme manière quo les RNA néosynthétisés, le profil caractéristi
que des algues porteuses d*un chapeau adulte ne résulte pas de la dégradation du RNA lourd en RNA léger. On ne peut cependant pas QxclTU-e la possibilité d'une dégradation préférentielle du ENA lourd en produits non précipitables. lia validité de l'expérience do contrôle décrite ici sera discutée ultérieurement (cf.Dis cussion des résultats").
Intérêt de_la £réc^itation par du__NaCl 2 M,
La fig.5 mo'c en évidence l'intérêt d’une précipitation dos RNA par du RaCl 2 H, et pas seulement par do l'éthanol: une très forte proportion do RNA de faible masse moléculaire et de maté riel non identifié est présente dans la partie supérieure du gra dient. Comme nous n'avons étudié, dans le présent travail, que les RNA lourds, nous avons éliminé ces substances, qui auraient pu se montrer gênantes lors des expériences d'incorporation de précurseurs radioactifs.
b) Los RHA des diverses fractions sub-cellulaires.
Les RNA plastidiaux ont un profil de sédimentation semblable à celui du RNA total, que les algues soient en période de crois sance (Fig,4a), ou qu'elles soient anucléées (Fig.4b) ou porteu ses d’un chapeau adulte (Fig,4c).
Les RNA des mitochondries (Fig,4d) et ceux du cytoplasme (Fig, 4o) no se comportent pas de la même manière quo ceux de la frac tion plastidialo: ils sédimentent dans un rapport de surface 2:1, et non 1:1. Nous ignorons si, comme dans le cas do la fraction chloroplastiquo, l'absence du noyau provoque une modification de leur profil do sé(i}.mentation.
FIGURE 5.
Chromatographie, sur colonne d'albumine méthylée, des RKA néo- synthétisée dans les fragments nuclôés et anucléés d*Acetabu-» laria. 50 à 100 fragments de chaque type ont été incubés pen dant 30 min en présence de 100 ^c/ml do Dans le cas des oxpôrioncos e et f, les fragments ont été homogénéisés 2 h après la fin de l'incubation,
a. Homogénat total de fragments nuclôés, b. Homogénat total de fragments anucléés.
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la X’éalieation est assos malaisée, n*a pas encore été vérifiée. Le rendoment moyen dos extractions est approximativement de O» 03 p-S do chloroplastiqus et de 0,01 ;ig de RNA non chloro- plastique (cytoplasmo+mitochondries) par algue adulte,
2, Incorporation de dans les RNA des fragments nucléés et anucléés.
La chromatographie sur colonne d'albumine méthylée montre que les RM marqués pendant un temps court (30 min) par du
(100 _^ic/ml) sont au nombre de trois au moins, tant dans les frag ments nucléés (Fig,5a) que dans les fragments anucléés (Fig.5b) provenant d'algues opérées 5 jours auparavant. La première espè ce moléculaire, éluée à une concentration saline do 0,if M, repré sente vraisemblablement le RNA soluble (s-RNA) de l'algue. On observe sa présence dans la fraction non chloroplastique des fragments nucléés (Fig.5c) et anuclôjs (Fig.5d); elle est absen te dans la fraction chloroplastique dos deux types do fragments (Fig.5o et f).
Un deuxième pic de radioactivité qui, à l'inverse du premier, existe clans les chloroplastes (Fig.5e et f) et seulement dans ceux-ci (Fig.5c et d), s'élue à 0,65 M. Il est peu affecté à la cuite d'un traitement par de la RNase (10 min à 25®C) ou après une incubation on présence do KOH (16 h à 37°C). Cependant, 5 à
10 % de sa radioactivité so retrouvent dans les quatre principaux nucléotides, entre lesquels le marquage du se répartit comme l'indique le tableau I,
pre-luiôres expériences ont été réalisées, n’était pas exempte de HNase (Polatnick et Baclirach, Î96l)«
Comme il ross»îx't du tableau I, les compositions en bases des RKA rapidement marqués dans les chloroplastes no sont pas les mêmes que celles des r-RNA chloroplastiques et cytoplasmiques totaux, déterminées par Baltus et al,(1968).
Tableau I» Répartition de la radioactivité du P^^(%) entre les quatre nucléotides principaux des RNA chloroplastiques néo- synthétisés, A titre indicatif, on a mentionné les composi~ tiono on bases des r-RNA chloroplastiques et cytoplasmiques (%) déterminées par Baltus et al,(1^8),
RNA C <r A Ç" 6 <T ü (T
0,65 H 21 ,2 0,7 28,9 0,2 27,7 0,5 22,2 0,8
0,9 M 25,0 0,3 25,8 0,2 28,1 0,3 21,1 0,2
“RNA chloroplast. 28,5 1.7 ^k»0 0,9 26,0 0,8 21,5 0,1 -RNA cytoplasm. 18,8 0,1 21,0 1.7 22,5 0,2 58,0 1,0
C,A,6,Ü: acides cytidyliquo, adônyllque, guanyliquo et uridyliquo.
L'utilisation du p52 comme précurseur et la mise en oeuvre dos chromatographies sur des colonnes d’albumine méthylée pour la séparation des RNA no nous ont pas donné pleine satisfaction» Cette méthode nous a toutefois permis do recueillir des renseigne ments qui ont été fort utiles pour la suite du travail. En effet, le s'incorpore très activement dans des polyphosphatos haute ment polymérisôs (Thilo et al,1936), qu'il est malaisé de séparer dos RNA, Nos conclusions initiales (Janowski, 1965) ont été cri tiquées par Richter (1966), qui a montré que les substances qui s’éluent à la concentration saline do 0,65 M sont constituées en grande partie par des polyphosphates. Do plus, les RNA qui quittent la colonne d’albumine méthylée sont tellement dilués que leur détoction spoctrophotométrique exigerait la mise en
FIGURE 6
Incorporation d’uridinc-H^ pendant un temps court dans les RNA des algues entières et dos fragments anuclôés.
a. Algues entières, incubées pendant min en présence de 2C ;ic/ml d’uridine~K^,
b. Fragments anucléés, incubés pendant 30 présence de 20 ;ac/ml d’uridine-H^ O
Co Cosédinientation du RM-H^ d’algues entières, incubées pen dant 2 h en présence do 20 ;ic/ml d'uridine-H^, avec du RNA non radioactif de foie de lapin.
plus spécifique que le mais qui ne permet pas de déterminer la composition on bases des RNA nouvellement synthétisés., Nous avons aussi adopté la méthode de centrifugation en gradient de saccharose qui, tout en étant plus sensible pour de faibles quan=> tités de matériel, possède un pouvoir de résolution plus élevé.
3 O Incorporation d’uridlne-H^ dans les RNA dos algues nuclééos
et anucléées.
a) Reraarnue préliminaire; contrôle de la nature des RKA étudiés. Au cours d'expériences dont les résultats seront décrits ci- dessous, la nature de tous les RNA étudiés (non marqués, marqués à la suite d’une incubation longue ou brève en présence du pré curseur radioactif, ou encore marqués après la chasse de la radio activité instable) a été vérifiée à l'aide de traitements par do la RNase, préalablement maintenue pendant ÎO min dans un bain d’eau bouillante (cf."Matériel et méthodes"). Aucune absorption dans l’ultra-violet, ni aucune radioactivité résiduelle, n’a ja mais été observée, à la suite de ces traitements enzymatiques, ailleurs que dans la fraction non sédinentable des gradients de saccharose.
b) Incorpor.ationB de courte durée.
I
FIGURE 7.
Incorporation d*uridine~H^ pendant un temps long dans les RM d'alguGS entières et de fragments anucléés»
a. Algues entièrosj incubées pendant k jours en présence de 2 ;ic/ml d‘uridine*“H^ „
bo Chloroplastos de fragments anucléés la veille de 1‘expôrien^ ce et incubés pendant 4 Jours en présence de 2 }xc/ml d*uri=> dine-H^ o
Co Mitochondries de fragments anucléés la veille de 1'expérien ce et incubés pendant 4 jours en présence de 2 ^c/ml d’uri«> dins-H^, La quantité de RKA déposée sur le gradient était trop faible pour que l’absorption à 260 soit mesurable.
do foie de lapin (Fig,6c). Des expériences complémentaires (F, Lotstra, mémoire de licence) ont montré que les RNA de chaque fraction sub-collulaire se comportent de la même manière. Los RHA rapidement marqués (30 min à 4 h) d*Acetabularia sont vrai semblablement localisés dans des particules de type ribosomial 30 et 50 comme nous le verrons bientôt,
c) Incorporations de longue durée.
Lorsque le temps d’incubation est porté à plusieurs jours, la radioactivité des RNA d*Acetabularia n’a plus les mêmes carac téristiques que colle des ENA qui se marquent pendant un temps bref. Le matériel radioactif sédimente à la position des RNA glo baux (16 et 25 s), dans le cas des algues entières (Fig.?a) et dans celui des fragments anucléés, dont nous avons isolé les fractions chlcroplastique (Fig,?b) et mitochondriale (Fig,7c), Ce phénomène s'observe aussi dans les trois fractions sub-cel- lulciires (chloroplastiquo, mitochondriale et cytoplasmique) considérées indépendamment l’une de l’autre (F,Lotstra, mémoire de licence).
La radioactivité hétérogène, observée après une incubation de 30 min en présence du précurseur radioactif (cf. Fig.6a et b), n'est plus présente dans la région supérieure du gradient. Les RNA 16 et 25 s n’ont pas la même radioactivité spécifique, ce qui permet déjà de soupçonner que le ENA 16 s ait, en fait, une double nature: il pourrait être constitué, en partie, par un RNA dont le métabolisme serait particulièrement lent. Cette hy pothèse, qui était déjà suggérée par l’évolution dos profils de radioactivité en l'absence du noyau, va trouver un argument sup plémentaire dans les expériences de chasse de la radioactivité instable.
d) Chasse do la radioactivité instable.
FIGURE 8O
Chasse de la radioactivité instable.
Remarqueî les profils d’absorption à 260 uyi sont ceux des RM non radioactifs d*algues entièresj porteuses ou non d*un cha*- peau adulte, utilisés comme entraîneur dans ces expériences; nous n’avons pas utilisé d®entraîneur dans le cas d«
a. Algues entières, incubées pendant 5^50 on présence de 10 ^c/ml d’uridine-H-', puis reportées pendant U Jours dans un milieu non radioactif O
bo Fragments anucléés, incubés pendant 5 Jours en présence de 2 ^c/ral d’uridino-ïP, puis reportés penfant 17 Jours dans un milieu non radioactif.
c. Aigues ontièrec, incubées pondant 6 Jours en présence de 2 p.c/ïïil d’uridine-H^, puis reportées pondant 34 Jours dans un milieu non radioactif.
d. Algues entières, incubées pendant 24 b en pi'ésence de
20 yic/ml d'uridine~H^, puis reportées pendant 88 Jours dans un milieu non radioactif.
e« Même expérience que a, mais les algues ont été reportées dans un milieu contenant 20 jig/ml d’actinomycine D.
FIGÜRE 9
Centrifugation, dans un gradient de saccharosej. des ribosomes chloroplastiques d*Acetabularia.
a» Les ribosomes des chloroplastes»
b O Les ribosomes partiellement dissociés de E^coli, centrifu*» gés dans les mêmes conditions que les ribosomes chloroplas tiques d*Acetabulariao
noyau: la radioactivité de la région 25 s diminue plus rapidement que celle de la région 16 s, dans le cas des algues nucléées (Fig, 8a) ou anucléôes (Fig.8b), Pendant ce temps, le marquage de la ré gion 16 s paraît se déplacer vers une position plus légère, 15 s, A partir du moment où le pic de radioactivité 25 s n'est prati quement plus décelable (Fig.8c), la radioactivité 15 s diminue,
mais si lentement qu'elle est encore présente plus do 88 jours après le début du report (Fig.Sd), Une constatation importante est que cetto évolution est inchangée lorsque le report s'effectue dans un milieu contenant 20 ;Ag/ml d'acünomycine D (Fig.8e), No tons que l'on peut également observer un marquage stable au ni- veaix d'un pic mineur, évalué à 9 s et, dans le cas des algues en tières, dans une région hétérogène plus lourde que le pic 16 s»
ko Les ribosomes d*Acetabuloria meditorranea.
Des quantités appréciables de ribosomes ont été obtenus à partir dos chloroplastes d * Ac etabulerla. qu'il est facile de ré colter par centrifugation, même lorsque des quantités importan tes d'homogénat sont mises en oeuvre, La fig.9a montre le pro fil caractéristique de l’absorption ultra-violette dos riboso mes chloroplastiquQs. Doux pics majeurs sôdimentent approxi mativement à 50 et à 50 s, comme le montre une comparaison avec le profil de sédimentation des ribosomes, partiellement disso ciés, de E.coli (Fig,9b), Le rapport de leurs surfaces est 2:1, alors que celui des RNA extraits par le phénol est 1:1. Les ri bosomes 70 G sont représentés par un pic mineur. Les spectres d’absorption dos trois types de particules sont caractéristi ques des acides nucléiques (Fig.9c).
Le rendement do la purification des ribosomes chloroplasti- ques (0,013 de RNA/collulo) est inférieur à celui do l’extrac tion directe des RNA (0,03 ;ug/cellule), Nous verrons ultérieure ment que ces derniers ne sont probablement pas exclusivement ri» bosomiaux: ils pourraient contenir, en outre, une espèce
