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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Boeckstaens, M. (2007). Les transporteurs d'ammonium Mep/Amt/Rh de la levure Saccharomyces cerevisiae: fonctions et régulations (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des Sciences – Sciences biologiques, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/210669/14/735f7ae2-3328-437a-ab3e-7cadecded193.txt
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ndréLes transporteurs d'ammonium Mep/Amt/Rh de la levure Saccharomyces cerevisiae :
fonctions et régulations
Mélanie
BOECKSTAENS
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ctobre2007
VLB - IBMM
BIBLIOTHEQUE
T hèse présentée en vue de l ’ obtention du grade de
D octeur en S ciences
Université Librede Bruxelles Facultédes Sciences
Institutde Biologieetde Médecine Moléculaires Laboratoirede Physiologie Moléculairedela Cellule
Promoteur : Dr Anna Maria Marini Co-Promoteur : Pr Bruno André
Les transporteurs d'ammonium AAep/Amt/Rh de la levure Saccharomyces cerevisiae :
fonctions et régulations
MÉlanie
BOECKSTAENS
Octobre
2007
T hèse présentée en vue de l ’ obtention du grade de
D octeur en S ciences
A papy
A/Verci à toutes tes personnes qui' ont rendu ces quatre années inoubliables I
Je tiens tout d'abord à remercier Bruno pour m'avoir accueillie au laboratoire. Merci de m'avoir encouragée à dépasser mes limites et d'avoir été présent durant mes moments de doute.
Merci aux deux inséparables « sages » du laboratoire, Stéphan et Antonio, pour leurs encouragements et conseils. Je te remercie tout particulièrement Stéphan pour le temps que tu as passé à la lecture de la thèse et des articles, mais aussi pour toutes tes merveilleuses histoires...
J'aimerais également remercier les membres (anciens ou actuels) du laboratoire qui m'ont accompagnée durant ces quatre années. Merci à Catherine, Justine et Eisa pour leur serviabilité et leurs bons desserts. Merci à Momo pour sa bonne humeur et son thé à la menthe. Merci à Fadi pour sa générosité et sa gentillesse inégalables. Je remercie également Kevin et Elisa pour leurs nombreux encouragements. Merci à Gilles qui a contribué de manière efficace à l'étude des Mep. Merci à Sophie et à Elina pour leur sympathie. Merci également à Florence, Sébastien et Christophe.
Je voudrais également remercier sincèrement Sandra pour m'avoir initiée aux manips. Je ne pourrais évidemment pas oublier de remercier ces deux personnes merveilleuses que sont Cathy et Lydia. Merci les Filles pour les
« moments cafés » du matin, nos nombreuses discussions, vos rires, vos encouragements incessants, votre sensibilité et votre humanité... Merci d'avoir toujours été présentes !
Merci aux copines d'unif, Isa, Monique, Carole et Sarah, pour ces nombreux anniversaires passés ensembles ! Je tiens tout particulièrement à remercier Monique pour avoir déplacé un verre à pieds à un moment crucial...
Merci aussi à Marianne et Basile ! Je remercie également Caro, Laurent, Mathéo
et son futur petit frère pour leur joie de vivre. Merci aussi aux volleyeurs (et -
euses) et au coach qui m'ont permis de me défouler joyeusement ! Merci Luc,
Jess, Anne-Pa, Jen, Sylvie, Cactus, Didi, Pom, Isa, Bruno et Aline. Merci aussi
aux « anciens copains » de secondaire pour les soirées sympas pleines de bons
souvenirs ...
Je tiens également à remercier Evelyne, Fabienne et André pour la charmante collaboration. Merci aussi à Dominique Loqué pour avoir notamment fait des milliers de kilomètres pour assister à la défense de thèse et pour son enthousiasme fascinant pour la recherche.
Je ne pourrai probablement jamais assez remercier ma famille. Merci à vous TOUS de m'avoir toujours soutenue malgré les tristes moments que nous avons traversés... Merci à mes chers Maman et Papa pour leur amour inestimable, merci pour TOUT ! Merci à mes Mamys et Papys adorés pour leur gentillesse, leur bienveillance et leurs encouragements incessants. Merci à ma petite Zoeurette chérie, confidente de toujours ! Merci aux Disparus qui sont toujours dans mon cœur et qui, je sais, seraient fiers... Merci aussi à mes deux rayons de Soleil : ma petite Princesse Noémie et son grand frère Aurélien. Merci à TOUTE la famille et aux amis des parents pour leurs encouragements ! Je remercie également la famille de Pat pour leurs paroles encourageantes.
Je ne saurais oublier de remercier l'Amour de ma vie. Pat. Merci infiniment pour tout ce que tu m'as apporté ces quatre années. Ton soutien m'a permis de réaliser des choses que je croyais irréalisables, et tes conseils (ainsi que ton esprit de contradiction !) m'ont fait avancer et progresser. Tu m'as permis de croire en moi, et ça, je ne t'en remercierai jamais assez. Merci enfin pour ton Amour qui est incontestablement l'un des plus beaux cadeaux que la vie m'ait offerte ces dernières années.
Merci enfin à ma super promotrice, Anne-Marie ! Tout d'abord, j'aimerais
te remercier sur le plan scientifique pour tout ce que tu m'as appris, pour ton
ouverture d'esprit et ta disponibilité... En effet, Proximus aura probablement
fait pas mal de bénéfices sur notre compte et aura contribué à faire avancer la
science ;) ! Merci d'avoir cru en moi et de m'avoir fait partager ta passion. Ces
quatre années resteront inoubliables et cela en grande partie grâce à toi. Enfin,
je voudrais te remercier pour ce que tu m'as apporté en tant qu'amie. Merci pour
ton soutien, tes conseils, ton humour et ta présence à chaque instant... Sans
oublier de remercier Mon Cher Richard, surnommé Nikolaï en russe, ... pour les
moments de bonheur et de rire mémorables !
TABLE DES MATIERES
ABRÉ VIA TIONS ET CONVENTIONS D ^ÉCRITURE... 6
RÉSUMÉ... 7
INTRODUCTION... 8
1. Propriétés chimiques, bio- et géo- physiques de l’ammonium...8
2. Assimilation de l’ammonium en tant que source azotée...9
3. Cytotoxicité de l’ammonium en excès... 10
4. Identification des transporteurs d’ammonium de la famille Mep/Amt/Rh... 11
4.1. Utilisation du méthylammonium pour la caractérisation cinétique des transporteurs d’ammonium.... 11
4.2. Caractérisation moléculaire des premiers transporteurs d’ammonium par complémentation de fonction chez la levure... 13
4.3. Ubiquité et multiplicité des protéines Mep/Amt/Rh... 13
4.3.1. La sous-famille Mep/Amt... 13
4.3.2. La sous-famille Rh... 15
5. Substrat et mécanisme de transport des protéines Mep/Amt/Rh... 16
5.1. Substrat et mécanisme de transport des protéines Mep/Amt... 16
5.2. Substrat et mécanisme de transport des protéines Rh... 17
6. Topologie des protéines Mep/Amt/Rh... 18
7. Oligomérisation des protéines Mep/Amt/Rh...19
8. Structure tridimensionnelle des protéines Mep/Amt/Rh... 19
8.1. La cristallisation des protéines EcAmtB et AfAmtl... 19
8.2. La cristallisation du complexe formé du transporteur EcAmtB et de son régulateur GlnK... 21
8.3. Les simulations moléculaires dynamiques...23
9. Les transporteurs Mep/Amt de la levure Saccharomyces cerevisiae... 24
9.1. Rôles physiologiques des protéines Mep/Amt de la levure... 24
9.1.1. Rôle physiologique des protéines Mep/Amt dans l’acquisition d’ammonium comme source d’azote... 24
9.1.2. Rôle physiologique des protéines Mep/Amt dans la recapture de l’ammonium métabolique excrété... 25
9.1.3. Rôle physiologique des protéines Mep/Amt en tant que senseur...25
9.2. Régulation des protéines Mep/Amt de la levure...26
9.2.1. Régulation transcriptionnelle des gènes MEP/AMT de la levure...26
9.2.2. Régulation post-traductionnelle des protéines Mep/Amt de la levure... 28
2
BUT. 31
RÉSUL T ATS ET DISCUSSION...32
1. La kinase Nprl est requise pour l’obtention d’une conformation active des transporteurs d’ammonium Mepl, Mep2 et Mep3...32
1.1. La kinase Nprl est nécessaire à l’activité optimale des transporteurs Mepl, Mep2 et Mep3...32
1.2. Les transporteurs Mepl, Mep2 et Mep3 sont stables en absence de la kinase Nprl...33
1.3. La kinase Nprl n’est pas nécessaire à la localisation des transporteurs Mepl, Mep2 et Mep3 à la membrane plasmique... 34
1.3.1. Les protéines Mep sont localisées à la surface cellulaire indépendamment de l’intégrité de la kinase Nprl... 34
1.3.2. Le transporteur Mep 2 est localisé à la membrane plasmique indépendamment de l'intégrité de la kinase Nprl... 35
1.4. La surproduction des protéines Mepl et Mep3 ou l’absence de la protéine Amul permettent de contourner la nécessité de la kinase Nprl à l’activité de ces deux transporteurs... 36
1.4.1. La surproduction des protéines Mepl et Mep3, mais non celle de Mep2, permet de contourner la nécessité de la kinase Nprl à l'activité de ces deux transporteurs...36
1.4.2. L'absence de la protéine Amul permet de contourner la nécessité de la kinase Nprl à l'activité des transporteurs Mepl et Mep3 mais non à celle de Mep2... 37
1.5. L’inactivation d’une version thermosensible de Nprl s’accompagne d’une conversion rapide entre deux formes de la protéine Mep2, concomitante à une inactivation du transporteur... 38
1.6. Le statut azoté influence le profil de migration des protéines Mepl, Mep2 et Mep3...40
1.6.1. La proportion des deux formes du transporteur Mep2 est influencée par la présence d’ammonium et est corrélée à l'état de phosphorylation de la kinase Nprl... 40
1.6.2. Les profils de migration des protéines Mep et de la kinase Nprl sont influencés par la source azotée...41
1.7. Le passage d’un état à un autre de la protéine Mep2, induit par l’inactivation de la kinase Nprl ou la qualité de la source azotée, a lieu à la membrane plasmique... 42
1.8. La kinase Nprl n’a pas d’effet majeur sur la distribution des protéines Mepl et Mep2 au sein des radeaux lipidiques... 43
1.9. Discussion... 45
2. Etude des modifications post-traductionnelles des protéines Mepl, Mep2 et Mep3...47
2.1. Etude des différents états des protéines Mepl et Mep3... 47
2.1.1. Les protéines Mepl et Mep3 sont phosphorylées indépendamment de l’intégrité de la kinase Nprl 47 2.1.2. Les transporteurs Mepl et Mep3 sont phosphorylés à la membrane plasmique...48
2.1.3. Une des phosphorylations de Mepl et Mep3 requiert l’intégrité de la caséine kinase 1...48
2.2. Etude des différents états de la protéine Mep2...50
2.2.1. La protéine Mep2 est modifiée de manière précoce dans la voie de sécrétion...50
2.2.2. La kinase Nprl est nécessaire à la stabilité de la première modification de Mep2...51
2.2.3. La protéine Mep2 est modifiée dans son extrémité C-terminale cytosolique...52
2.2.4. Etude de la nature des modifications de Mep2... 53
2.3. Discussion... 62
3
3. Relation structure - fonction des protéines Mep/Amt/Rh...64
3.1. Modélisation de la structure des transporteurs d’ammonium Mep de la levure...64
3.2. Régulation du transporteur Mep2 par la kinase Nprl : relation structure - fonction...65
3.2.1. Isolement de protéines Mep2 Nprl-indépendantes...65
3.2.2. Des mutations dans les boucles cytoplasmiques de la protéine Mep2 restaurent l’activité du transporteur en absence d’une kinase Nprl fonctionnelle... 67
3.2.3. L ’extension C-terminale hydrophile module positivement et négativement l’activité du corps hydrophobe de Mep2... 68
3.2.4. L ’extension C-terminale hydrophile de Mep 2 n ’est pas essentielle à la fonction de transport de la protéine... 72
3.2.5. Discussion...73
3.3. Mécanismes de transport des protéines Mep/Amt : relation structure - fonction...76
3.3.1. Un résidu aspartate conservé joue un rôle structural dans la reconnaissance de l’ammonium .. 76
3.3.2. Identification d’une sous-famille fonctionnelle au sein des protéines Mep/Amt fongiques... 79
4. Rôles physiologiques des transporteurs Mep et de leur régulateur positif Nprl...87
4.1. La kinase Nprl n’est pas directement requise pour l’activation de la répression catabolique azotée... 87
4.1.1. La dérépression des gènes de la NCR dans les cellules nprI-1 résulte d’un défaut d’entrée d’ammonium... 87
4.1.2. La restauration de la répression azotée dans les cellules nprl suite à l’augmentation de la concentration externe en ammonium dépend du pH et de la concentration en zinc du milieu...88
4.1.3. La kinase Nprl et la protéine Amtil ne sont pas requises pour l ’activation des gènes de la NCR en réponse au traitement à la rapamycine et à la limitation ou à la carence en azote...89
4.1.4. Discussion... 89
4.2. La protéine Mep2 et la kinase Nprl jouent un rôle important dans la croissance cellulaire en présence de différentes sources azotées à travers la recapture de l’ammonium catabolique excrété... 90
4.2.1. Les cellules triple-mepA et nprI-1 présentent des défauts de croissance comparables en présence de nombreuses sources azotées... 90
4.2.2. Une partie des défauts de croissance des cellules nprl-1 est la conséquence de l’excrétion de l'ammonium catabolique... 91
4.2.3. Discussion...93
4.3. Rôle du transporteur Mep2 dans le développement de la croissance pseudohyphale... 94
4.3.1. La mutagenèse du site putatif de phosphorylation par la protéine kinase A abolit la fonction de transport de la protéine Mep2... 94
4.3.2. Un résidu chargé négativement en position 186 est requis pour la fonction de senseur de Mep2 96 4.3.3. Le transporteur Mep2 et la kinase Nprl jouent un rôle important dans le développement pseudohyphal en présence de différentes sources azotées à travers la recapture de l'ammonium catabolique excrété...97
4.3.4. L ’extension C-terminale hydrophile de Mep2 module positivement et négativement la fonction de senseur de son corps hydrophobe... 98
4.3.5. L ’extension C-terminale de Mep2 n ’est pas essentielle à la formation de pseudohyphes...99
4.3.6. La substitution de l’histidine 194 en glutamate découple les fonctions de transport et de senseur de Mep2...100
4.4. Discussion 101
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 104
MATÉRIEL ET MÉTHODES... 115
1. Souches et milieux...115
1.1. Saccharomyces cerevisiae... 115
1.2. Escherichia coli... 115
2. Plasmides navettes S. cerevisiae - E. coli... 116
3. Manipulation de l’ADN... 116
3.1. Traitements enzymatiques... 116
3.2. Extraction et purification d’ADN... 116
3.3. Amplification de fragments d’ADN par la réaction de polymérisation en chaîne...116
3.4. Mutagenèses dirigées... 117
3.5. Construction de plasmides... 117
3.6. Séquençage de T ADN... 119
4. Transformation des cellules... 119
5. Délétions de gènes chromosomiques... 120
6. Dosage de l’activité des perméases... 120
7. Extraits protéiques, Western blot et immunodétection... 121
7.1. Extraits cellulaires totaux... 121
7.2. Traitement à la phosphatase des extraits cellulaires totaux... 121
7.3. Extraits cellulaires enrichis en membranes... 122
7.4. Traitement à la phosphatase des extraits cellulaires enrichis en membranes... 122
7.5. Traitement à la N-glycosidase F des extraits cellulaires enrichis en membranes... 122
7.6. Traitements chimiques des extraits cellulaires enrichis en membranes... 122
7.7. Traitements protéolytiques... 123
7.8. Western blot et immunodétection... 123
8. Isolement de microdomaines lipidiques insolubles au Triton X-100 (1%)... 124
9. Fractionnement subcellulaire...124
10. Immunoprécipitations... 125
11. Localisation des protéines fusionnées à la GFP... 126
12. Programmes informatiques... 126
BIBLIOGRAPHIE... 127
PUBLICATIONS... 144
5
ABRÉVIATIONS ET CONVENTIONS D’ÉCRITURE
Abréviations
GABA Acide y-amino butyrique
GS Glutamine synthétase
GDH Glutamate déshydrogénase
GOGAT Glutamine a-cétoglutarate amino-transférase
RE Réticulum endoplasmique
Triple-mep-d meplA mep2A mep3A
NCR Nitrogen Çatabolite Repression, Répression catabolique azotée NCI Nitrogen Çatabolite Inactivation, Inactivation catabolique azotée SDS-PAGE Electrophorèse sur gel de dodécylsulfate polyacrylamide de sodium GFP Green Fluorescent Protein, Protéine fluorescente verte
TOR Target Of Rapamycin, cible de la rapamycine
Conventions d’écriture
Mepl protéine
MEPI gène
mepl gène muté
mepl A gène excisé
6
RÉSUMÉ
Les protéines de la famille Mep/Amt/Rfi sont largement conservées dans l’évolution. Cette famille comprend les facteurs Rhésus dont les antigènes Rh humains sont les membres les plus notoires. Le rôle des protéines de type Mep/Amt/Rh en tant que transporteurs d’ammonium a largement été décrit chez les bactéries, les champignons et les plantes. Néanmoins, leur mécanisme de fonctionnement demeure élusif et la régulation de leur activité a été peu abordée chez les organismes eucaryotes. En utilisant comme modèles de la famille Mep/Amt/Rh les trois transporteurs d’ammonium de la levure Saccharomyces cerevisiae, nous avons tenté de comprendre les mécanismes de fonctionnement et de régulation de cette famille de protéines membranaires.
Nous montrons qu’un résidu aspartate, conservé dans la famille Mep/Amt/Rh et situé à proximité d’un vestibule cation-attractif, joue un rôle stmctural dans la reconnaissance de l’ammonium chez le transporteur Mep2. De plus, un résidu histidine très conservé dans le pore hydrophobe des protéines Mep/Amt/Rh est substitué par un aspartate chez un sous-groupe de transporteurs d’ammonium fongiques. Cette substitution permet de définir deux sous-familles fonctionnelles possédant des propriétés bien distinctes. Nous proposons que les deux sous-groupes de protéines, représentés d’un côté par les transporteurs Mepl et Mep3 et de l’autre côté par la protéine Mep2, transportent l’ammonium selon un mécanisme différent.
Alors que la forme NH4^ serait reconnue dans les deux cas, dans le premier, elle traverserait telle quelle le pore et dans le second, elle serait déprotonée en NH3 durant son parcours.
Nos données indiquent par ailleurs que l’activité du transporteur Mep2 est régulée par des changements conformationnels engageant son extrémité C-terminale. Des domaines de régulation positive et négative ont été identifiés dans cette extension. La région de régulation positive est conservée chez les membres Mep/Amt, suggérant un mécanisme de régulation commun. De plus, ce domaine activateur est nécessaire à l’obtention d’une conformation active de Mep2 qui coïncide avec la présence d’un état modifié de la protéine immunodétectée. La zone de régulation négative n’est par contre conservée que chez un sous-groupe d’orthologues fongiques de Mep2. Nous montrons également que la kinase Nprl intervient dans la modulation de l’activité intrinsèque des trois protéines Mep qui demeurent inactives mais stables à la membrane plasmique en absence de la kinase. En particulier, l’intégrité de la kinase est requise pour la stabilité de l’état modifié de la protéine Mep2. La kinase Nprl protégerait le transporteur Mep2 de l’inactivation en contrecarrant l’effet négatif de l’extension C-terminale sur l’action de son domaine positif.
La présence d’une concentration importante en ammonium est une des conditions physiologiques entraînant une disparition de l’état modifié de Mep2, suggérant qu’un contrôle rapide de l’activité du transporteur pourrait s’avérer important pour, par exemple, empêcher la cellule d’accumuler l’ammonium à des concentrations toxiques.
Hormis leur rôle dans le transport d’ammonium en tant que source d’azote, nous montrons que l’activité des protéines Mep est requise pour différentes réponses physiologiques. Une diminution d’entrée d’ammonium en absence des protéines Mep ou de leur régulateur positif Nprl entraîne une dérépression des gènes soumis à la répression catabolique azotée ainsi qu’un défaut dans le repompage de l’ammonium catabolique excrété durant la croissance en présence d’autres sources azotées. Un rôle supplémentaire de senseur d’ammonium avait été attribué au transporteur Mep2 dans l’induction de la croissance filamenteuse en réponse à une limitation en ammonium. Nous montrons que l’état d’activité de la protéine Mep2 est étroitement lié à sa capacité à induire le développement filamenteux et que l’extrémité C-terminale du transporteur n’est pas requise à la fonction de senseur. Finalement, nous proposons que le mécanisme de transport soit à l’origine de l’induction de la croissance pseudohyphale enclenchée par la protéine Mep2.
7
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Figure 1. Structure de l’ammonium.
(a) Structure des molécules de NH3 et NH4^.
(b) Structure tridimensionnelle des molécules de NH3 et NH/.
Ion Rayon de l’ion déshydraté
(nm)
Rayon de l’ion hydraté (nm)
+
0 X
0.115 0.280
U* 0.094 0.382
Na'" 0.117 0.358
NH/ 0.148 0.331
K" 0.149 0.331
Rb^ 0.163 0.329
Cs'" 0.186 0.329
Tableau 1. Comparaison des rayons de quelques ions déshydratés et hydratés.
D’après Howitt et Udvardi, 2000.
INTRODUCTION
1. Propriétés chimiques, bio- et géo- physiques de l’ammonium
Le terme « ammonium » apparaîtra tout au long de ce manuscrit, aussi les premières lignes seront consacrées à un rappel de quelques propriétés générales de ce composé ainsi qu’à la définition de la terminologie qui sera adoptée.
La forme chargée NH4^ est en équilibre constant avec la forme neutre NH3 : NHj + H^ ^ NH4"
Le ratio [NH3]/[NH/] est déterminé par le pH, selon l’équation de Henderson-Hasselbalch :
logio ([NH3]/ [NH/]) = pH - pKa
Par définition, une diminution d’une unité de pH s’accompagne d’une augmentation d’un facteur 10 du ratio [NH4^]/[NH3]. La molécule d’ammoniac, le NH3, est une base faible dont le pKa est de 9.25 à 25°C en phase aqueuse. Ainsi, à pH 7, plus de 98% de ce composé se présente sous la forme NH/.
Pour une majorité de conditions physiologiques, le Nïlt^ prédominera donc de loin sur le NH3.
Le terme « ammonium » sera utilisé dans ce manuscrit pour désigner la somme des deux formes + NH3). Lorsqu’une distinction devra être explicitée, les formules chimiques « NH3 » et
« NH/» ou
les qualificatifs « neutre », « chargé », « protoné », « ionique » ou « cationique » seront employés.
Le NH3 possède trois atomes d'hydrogène et une paire d'électrons non-liants entourant l'atome central d'azote (Fig.la). Considérant l’effet de répulsion des électrons libres, l'ammoniac adopte une structure qui n’est pas planaire (Fig.lb). Le NH4^ forme une structure tétraédrique, comportant un atome d’hydrogène à chaque sommet. Les formes neutres NH3 et H2O ont une taille et un moment dipolaire similaires, et sont toutes deux capables de former des liaisons hydrogènes avec d’autres molécules. Le NH3, contrairement à sa forme protonée, est accepteur d’hydrogène dans ce type de liaison. Le NH4^ possède par contre un rayon ionique semblable au mais supérieur aux cations H3Û^, LF et Na’’, et inférieur aux cations Rb"^ et Cs’^ (Tableau 1). Les enveloppes d’hydratation entourant le NH4’’ et le K’’ ont aussi une taille similaire. Finalement, la forme neutre NH3 se dissout beaucoup plus rapidement dans les solvants organiques que sa contrepartie cationique. Il n’est de ce fait pas surprenant que la perméabilité au NH3 de la majorité des bicouches lipidiques soit de trois ordres de grandeur plus importante que celle au NH4’’.
Les propriétés physiques et chimiques de l’ammonium déterminent la nature de ses interactions avec les transporteurs spécifiques ou avec d’autres systèmes de transport de molécules ou d’ions aux propriétés similaires à l’ammonium. C’est ainsi que certains canaux à H2O, les aquaporines, sont perméables au NH3 (Jahn et ai, 2004 ; Saparov et ai, 2007) tandis que des canaux à potassium présentent une conductance au NH4"^ (Spalding et al, 1999).
8
Mis à part l’azote atmosphérique, l’ammonium est le eomposé azoté le plus abondant sur terre. Il apparaît ubiquitaire bien que sa eoncentration varie d’un écosystème à l’autre. Par exemple, dans le sol des forêts boréales, la quantité d’ammonium par litre de sol analysé varie de 0.4 à 4 mmol/1 (Vitousek et ai, 1982 ; Bijlsma et ai, 2000) alors que celle-ci peut être plus élevée (de 2 à 20 mmol/1) dans les sols agricoles où l’apport d’ammonium dans les engrais est non négligeable (Wolt, 1994).
L’abondance d’ammonium dans les sols est notamment modulée par la présence de microorganismes nitrifiants. Ces microorganismes sont peu présents dans des conditions de bas pH, basse température et pauvre approvisionnement en oxygène, l’ammonification l’emportant alors sur la nitrification (Eviner et Chapin, 1997).
2. Assimilation de l’ammonium en tant que source azotée
L’ammonium constitue une excellente source azotée pour de nombreux microorganismes et de nombreuses plantes. L’assimilation de l’ammonium fait intervenir deux voies [(1+2) et 3] et comprend trois réactions majeures menant à la formation de glutamate et de glutamine, les deux principaux donneurs d’azote dans les réactions de biosynthèse de composés azotés:
GS
NH4*^ + glutamate + ATP glutamine + ADP + P; (1)
GOGAT
glutamine + a-cétoglutarate + NAD(P)H <-> 2 glutamate + NAD(P)^ (2)
NH4^ + ATP + a-cétoglutarate + NAD(P)H glutamate + ADP + Pi + NAD(P)^ (1+2)
GDH
NH4^ + a-cétoglutarate + NAD(P)H o glutamate + NAD(P)^ (3)
Quasi toutes les sources azotées sont dégradées en ammonium et/ou en glutamate (pour revue : Kleiner, 1993), plaçant donc l’ammonium à une position centrale étant donné son ubiquité et sa qualité de source azotée préférentielle à la jonction du catabolisme et de l’anabolisme azotés. Cependant, la hiérarchie des réactions d’assimilation de l’ammonium semble varier d’un organisme à l’autre.
La communauté microbienne est réputée pour sa capacité à utiliser une large variété de substrats azotés, allant des macromolécules (protéines) aux simples composés inorganiques (N2). Généralement, les microorganismes disposent d’une multitude de composés azotés dans leur environnement, l’ammonium constituant une source azotée privilégiée. Chez beaucoup de bactéries, la voie de la glutamine synthétase/glutamate synthase (GS/GOGAT, réactions 1 et 2) constitue l’unique voie d’assimilation de l’ammonium et permet d’utiliser efficacement celui-ci, même s’il est présent dans le milieu à une concentration inférieure à 0.1 mM. Chez d’autres bactéries, comme les enterobacteriaceae, la voie catalysée par la glutamate déshydrogénase (GDH, réaction 3) constitue une alternative pour l’assimilation de l’ammonium. Cependant, étant donné sa faible affinité pour
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l’ammonium (Km ~ 1 mM), cette voie est peu efficace dans des conditions où la concentration en ammonium est limitante (pour revues: Reitzer et Magasanik, 1987 ; Merrick et Edwards, 1995).
Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l’ammonium constitue également une souree d’azote privilégiée dont l’assimilation peut être réalisée par les deux voies préeitées (Wiame et ai, 1985 ; Grenson, 1992). Il apparaît eependant que la voie faisant intervenir la glutamate déshydrogénase à NADP (réaction 3) codée par le gène GDHA/GDHl (Moye et ai, 1985) soit prédominante. La croissance d’un mutant gdhl est en effet fortement ralentie en présence d’ammonium comme unique source d’azote. La levure possède d’autre part une glutamate déshydrogénase à NAD, Gdh2 (Miller et Magasanik, 1990), mais contrairement à celle à NADP, cet enzyme a une fonction catabolique et son expression est réprimée lorsque l’ammonium est abondant. Une troisième glutamate déshydrogénase, Gdh3, à NADP, aurait un rôle physiologique non redondant à celui de Gdhl mais sa fonction demeure énigmatique (Avendano et al, 1997 ; Deluna et ai, 2001). La deuxième voie d’assimilation de l’ammonium chez la levure (réactions 1 et 2) fait intervenir la glutamine synthétase Glnl, indispensable à la production de glutamine (Benjamin et ai, 1989), et la glutamate synthase GUI (Filetici et al, 1996).
Dans beaucoup de sols, l’ammonium et le nitrate sont les sources d’azote prédominantes disponibles pour la nutrition des plantes. Le rôle de l’ammonium dans cette nutrition a probablement été longtemps sous-estimé. En effet, de nombreuses plantes prélèvent préférentiellement l’ammonium quand il est fourni simultanément au nitrate, même si la concentration en ammonium dans les sols, excédant rarement 50 pM, est souvent 10 à 1000 fois inférieure à celle du nitrate (Marschner, 1995).
L’ammonium requiert en effet moins d’énergie pour son transport et son assimilation dans les cellules que le nitrate, qui doit être réduit en nitrite puis en anunonium avant d’être assimilé (Bloom et al, 1992). Néanmoins, une croissance optimale de la plante est en général observée quand l’azote lui est fourni simultanément sous forme de nitrate et d’ammonium (Bloom et ai, 1993). Hormis son absorption par les racines, les plantes peuvent également se fournir en ammonium à partir d’interactions symbiotiques avec des microorganismes fixateurs de N2 atmosphérique. L’ammonium peut aussi être produit à l’intérieur des cellules de la plante soit par le catabolisme des composés aminés endogènes, soit par la réduction des nitrate et nitrite prélevés du sol. Les deux voies d'assimilation de l'ammonium précitées existent chez les plantes. Cependant, l’analyse de mutants indique que la voie de la glutamate déshydrogénase (réaction 3) ne constitue pas une alternative significative pour la synthèse de glutamate, qui est assurée de façon majeure par des enzymes effectuant la réaction 2 et utilisant le NADH, le NADPH mais aussi la ferredoxine réduite comme cofacteurs (pour revue : Suzuki et Knaff, 2005).
3. Cytotoxicité de l’ammonium en excès
Si l’ammonium constitue une excellente source azotée pour de nombreux microorganismes et végétaux, il est essentiellement eonnu en tant que produit métabolique cytotoxique ehez les animaux.
Chez ces derniers, l’ammonium est issu du catabolisme des protéines et des acides nucléiques, et est aussi produit par le métabolisme de la flore intestinale. L’ammonium produit au niveau du cerveau est détoxiqué par les astrocytes tandis que la production intestinale est détoxiquée par les hépatocytes via
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le cycle de l’urée. L’ammonium échappant à la synthèse d’urée dans le foie est transformé par la glutamine synthétase des hépatocytes périveineux en glutamine, qui est déversée dans le sang. L’urée est ensuite éliminée dans l’urine par les reins et la glutamine est retransformée dans le tube proximal des néphrons en ammonium qui sera finalement excrété dans l’urine. La production rénale d’ammonium joue par ailleurs un rôle majeur dans l’excrétion acide. L’excrétion d’ammonium est en effet critique pour la maintenance de l’homéostasie acide/base chez les animaux (Wall, 1996). De plus, la concentration d’ammonium et le pH du plasma sont strictement régulés. L’augmentation du taux d’ammonium sanguin, survenant par exemple lors d’un dysfonctionnement hépatique, affecte le métabolisme de nombreux tissus et plus spécifiquement le système nerveux central, pouvant causer notamment une paralysie cérébrale (pour revue : Butterworth, 2002).
Bien qu’il constitue une source azotée pour les plantes, l’ammonium en excès peut aussi être toxique pour ces dernières. Lorsque de l’ammonium est fourni comme seule source azotée, les plantes présentent un défaut de croissance. Cette toxicité est notamment liée à l’acidification de la rhizosphère provoquée par l’excrétion de protons ainsi qu’à la substitution par le NH4^ de cations essentiels comme le (pour revue : Britto et Kronzucker, 2002).
La toxicité de l’ammonium chez les microorganismes est beaucoup moins documentée.
Néanmoins, une étude récente met en évidence une toxicité de ce composé à haute concentration chez la levure Saccharomyces cerevisiae, lors d’une limitation en potassium (Hess et ai, 2006). Une excrétion d’acides aminés est observée dans ces conditions et est proposée comme constituant un mécanisme de détoxication de l’ammonium chez la levure. En revanche, un excès d’ammonium, atteignant une concentration de l’ordre du molaire, ne semble pas néfaste pour les bactéries (Muller et ai, 2006).
4. Identification des transporteurs d’ammonium de la famille Mep/Amt/Rh
4.1. Utilisation du méthylammonium pour la caractérisation cinétique des transporteurs d’ammonium
Si l’ammonium apparaît comme une source d’azote privilégiée chez les microorganismes et les plantes, et comme un élément clé dans l’excrétion acide pour le contrôle du pH chez les animaux, les voies spécifiques de transport de ce composé à travers les membranes plasmiques sont restées longtemps méconnues. Il était généralement admis que la diffusion translipidique du NH3 était la voie majeure d’entrée de ce composé.
Le point de départ de l’étude des systèmes spécifiques de transport d’ammonium est marqué par l’utilisation du méthylammonium/méthylamine (CH3NH3VCH3NH2) radiomarqué au carbone 14 en tant qu’analogue méthylé de l’ammonium et permettant une analyse cinétique (Hackette et ai, 1970).
En effet, les isotopes de l’azote qui pourraient être tracés sont moins faciles d’accès. L’isotope '^N possède un temps de demi-vie de 10 min et le suivi de l’isotope '^N nécessite un spectromètre de masse. Les premiers systèmes de transport d’ammonium sont mis en évidence chez le champignon filamenteux Pénicillium chrysogenum, en montrant que l’incorporation de [‘"*C]-méthylammonium est compétitivement inhibée par l’ammonium (Hackette et ai, 1970). Le transport de ce composé est par
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la suite étudié chez d’autres champignons tels que Aspergillus nidulans, Stemphylium botryosum et enfin S. cerevisiae (Arst et Paillard, 1973 ; Pateman et ai, 1974 ; Roon et ai, 1975 ; Breiman et Barash, 1980). La levure S. cerevisiae constitue un outil particulièrement approprié à l’étude de la physiologie cellulaire. Cet Ascomycète présente en effet la complexité d’organisation d’une cellule eucaryote tout en offrant une simplicité de manipulation. Il possède un temps de génération assez court, existe sous deux formes (haploïde et diploïde) et se prête particulièrement bien aux analyses basées sur les méthodes de génétique classique et moléculaire.
En 1975, à une époque où le transport des acides aminés est déjà bien documenté, Roon et ses collaborateurs publient une étude concernant le transport d’ammonium chez S. cerevisiae (Roon et al., 1975). Ils proposent l’existence d’un unique système de transport de méthylammonium. L’entrée de ce composé est légèrement réduite en présence d’un excès de cations monovalents (Na"^, K^) mais totalement inhibée de manière compétitive par l’ammonium. Les amines dont les chaînes carbonées sont de plus grande taille que la méthylamine (diméthylamine, triméthylamine, éthylamine, propylamine) sont de faibles inhibiteurs tandis que les composés de la taille de la méthylamine (hydrazine, hydroxylamine) présentent un niveau d’inhibition intermédiaire. De façon surprenante, la plupart des L-acides aminés se comporte comme des inhibiteurs non compétitifs de l’entrée de méthylammonium.
L’autre avantage de l’utilisation du méthylammonium comme analogue de l’ammonium est que ce composé, non métabolisé par S. cerevisiae, est cytotoxique et permet ainsi l’isolement de mutants résistants, potentiellement affectés dans une voie d’entrée de l’ammonium/méthylammonium. A posteriori, il apparaît que l’isolement de mutants incapables de croître en présence d’ammonium comme unique source d’azote aurait représenté un fameux défi, étant donné la multiplicité des systèmes d’entrée de ce composé qui allait être révélée. Ce défi a pu être contourné par la sélection positive de mutants résistants au méthylammonium, présentant en second lieu un défaut d’entrée d’ammonium.
Le double mutant mepl-1 mep2-l (« Méthylammonium Permease ») est ainsi isolé, par Dubois et Grenson, pour sa résistance à des concentrations toxiques en méthylammonium (Dubois et Grenson, 1979). Ce mutant croît très lentement en présence de faibles concentrations en ammonium comme seule source d’azote, alors que la croissance des simples mutants mepl-1 et mep2-l est peu affectée.
Dans la représentation de Lineweaver-Burk, l’entrée de [‘'‘Cj-méthylammonium dans les cellules sauvages présente un profil biphasique, alors que chacune des deux pentes observées est spécifiquement perdue dans un mutant affectant un des deux gènes MEPl ou MEP2. Contrairement aux résultats obtenus par Roon et al. (1975) indiquant l’existence d’une voie unique de transport de méthylammonium/ammonium chez la levure, l’étude menée par Dubois et Grenson (1979) révèle donc la présence d’au moins deux systèmes d’entrée pour ces composés. Ces deux voies d’entrée du méthylammonium sont compétitivement inhibées par l’ammonium. La mutation mepl-1 abolit une voie d’entrée de haute Vmax et de faible affinité (Km mea ; 2 mM, K am : 20 pM, Vmax : 50 nmoles mea/min/mg de protéines) tandis que la mutation mep2-l altère un système de Vmax moindre mais de plus haute affinité (Km mea : 0.25 mM, K am : 1 pM, Vmax : 20 nmoles mea/min/mg de protéines). La résistance au méthylammonium des cellules mepl-1 mep2-l apparaît liée à la mutation mepl-1 affectant la fonction de transport de haute capacité. Etant donné que le double mutant mepl-1 mep2-l
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Sous-famille Rh
Animaux
CeRhl HsRhCE
HsRhD
CeAmt2-
CeAmt4
CeAmtl
Plantes
DdAmtC DdAmtl
LjAmt1;2 AlAmtir LjAmt1;3,
AtAmt1;4.
LeA.mt1;2 LjAm<1;l ,,, ,
LeAmt1;1 AtAmtl;, SpAmt3
LjAmt2;1
DdAmtA
Bactéries
CgAmtl CgAmt2 ScMepl ScMep3 CaMep2
ScMep2 SpAmt2 ■ CaMepI
Champignons
Sous-famille Mep/Amt
Figure 2. Arbre phylogénétique de quelques membres de la famille Mep/Amt/Rh.
AfAmtl, 2, 3: A. fulgidus Amtl (Andrade et al., 2005), 2 (ac. n. : AAB89503) et 3 (ac. n. ; AAB89501); EcAmtB; E. coli AmtB (van Heeswijk et ai, 1996); AbAmtB; A. brasilense AmtB (Van Dommelen et al., 1998); BsAmtB: B. subtilis AmtB (ac. n. : CAB15668); CgAmtl, 2: C. glutamicum Amtl et 2 (Siewe et al., 1996 ; Meier-Wagner et al., 2001) ; ScMepl, 2, 3: 5. cerevisiae Mepl, 2 et 3 (Marini et al., 1994; Marini et al., 1997a); CaMepI, 2 : C. albicans Mepl et 2 (Biswas and Morschhâuser, 2005), AnMepA, MeaA ; A. nidulans MepA et MeaA (Monahan et ai, 2002a) ; SpAmtl, 2, 3 ; 5. pombe Amtl, 2 et 3 (Mitsuzawa et ai, 2006) ; HcAmtl, 2,3 : H. cylindrosponim Amtl, 2 et 3 (Javelle et ai, 2001; Javelle et ai, 2003) ; AtAmtl;!, 1;2, 1;3, 1;4, 2: A.
thaliana Amtl;l, 1;2, 1;3 (Ninnemann et ai, 1994; Gazzarrini et ai, 1999) 1;4 (ac. n. : Q9SVT8) et 2 (Sohlenkamp et ai, 2000);
LjAmtl;!, 1;2, 1;3, 2;1: L. japonicus Amtl;l (Salvemini et ai, 2001), 1;2, 1;3 (D’Apuzzo et ai, 2004) et 2;1 (Simon-Rosin et a/.,2003); LeAmtl;!, 1;2, 1;3:Z,. esculentum Kmt\;\ (Lautere/a/., 1996), l;2et 1;3 (von Wiren e/a/., 2000b) ; CeAmtl, 2, 3,4:
C. elegans Amtl (ac. n.: P54145),
2
(ac. n.: Q20605), 3 (ac. n.: Q21565) et 4 (ac. n.: AAA96190); CeRhl,2
: C. elegans Rhl (Ji et ai, 2006) et2
(ac. n.; AAF97865) ; DdAmtA, B, C : D. discoideum AmtA, B et C (Follstaedt et ai, 2003) ; DdRhgA, B: D.discoideum RhgA (ac. n.: AAF63243) et B (ac. n.: AAN76728); GcRh: G. cydonium Rh (Seack et ai, 1997) ; DmRh: D.
melanogaster Rh (ac. n.; AAF19374) ; Rh HsRhCG, AG, BG, CE, D: H. sapiens RhCG, AG (Marini et ai, 2000a), BG (Liu et ai, 2001), CE et D (Avent et ai, 1990).
est capable de croître en présence d’une forte concentration en ammonium (20 mM), l’existence d’une troisième voie d’entrée, de plus faible affinité pour l’ammonium, est envisagée. Une entrée résiduelle de méthylammonium est d’ailleurs mesurée dans le mutant mepI-1 mep2-l (Km mea : 20 mM, Vmax : 33 nmoles mea/min/mg de protéines). Il s’avérera plus tard que la levure possède trois systèmes de transport d’ammonium de type Mep et que les trois doivent être simultanément mutés pour donner lieu à un phénotype d’absence de croissance en présence d’une faible concentration en ammonium (Chap.
9.1.1). La mutation mepl-1, affectant la fonction du transporteur Mepl, se révélera de nature particulière, étant donné qu’elle permet la trans-inhibition du troisième transporteur Mep3, normalement intact dans la souche mepl-1 mep2-l, procurant ainsi à cette dernière le caractère exceptionnel d’un triple mutant (Chap. 7).
Il faudra attendre 1994 pour que la première caractérisation moléculaire d’un transporteur d’ammonium soit décrite chez la levure S. cerevisiae (Marini et al., 1994).
4.2. Caractérisation moléculaire des premiers transporteurs d’ammonium par complémentation de fonction chez la levure
Les deux premiers gènes codant pour des transporteurs d’ammonium, MEPI de la levure S.
cerevisiae et AMTI;1 de la plante Arabidopsis thaliana, sont parallèlement isolés par complémentation de fonction : leur expression restaure la croissance des levures mepI-1 mep2-l en présence d’ammonium 1 mM ainsi qu’une entrée de méthylammonium menant à l’intoxication cellulaire (Marini et al., 1994 ; Ninnemann et al., 1994). Les protéines ScMepl et AtAmtl;!
permettent alors de définir une nouvelle famille de transporteurs largement conservée, nommée Mep/Amt. De nombreux transporteurs d’ammonium seront identifiés par homologie de séquences mais aussi par complémentation de fonction chez la levure. Le mutant affecté dans les trois transporteurs Mep de la levure (ci-après nommé triple-mepzl) constituera un outil important dans la caractérisation fonctionnelle de transporteurs d’ammonium hétérologues issus de champignons, de plantes mais aussi de bactéries et d’animaux dont l’homme.
4.3. Ubiquité et multiplicité des protéines Mep/Amt/Rh
4.3.1. La sous-famille Mep/Amt
Les protéines de la famille Mep/Amt sont composées d’environ 400 à 600 acides aminés et sont hautement hydrophobes. Elles sont largement conservées chez les bactéries, les champignons, les plantes et les animaux invertébrés mais font défaut chez les vertébrés (Fig.2 et 3).
A l’exception de certaines bactéries, la plupart pathogènes telles que Hélicobacter pylori qui ne possèdent pas ce type de protéines, les transporteurs Mep/Amt sont vastement représentés aussi bien chez les archaebactéries et les eubactéries qui peuvent en compter jusqu’à trois membres (pour revue : Javelle et Merrick, 2005). La protéine bactérienne Mep/Amt la mieux caractérisée est l’unique transporteur d’ammonium AmtB d'Escherichia coli (Chap. 8). Les gènes MEP/AMT procaryotiques font partie presque invariablement d’un opéron dicistronique comprenant le gène GLNK (pour revue : Thomas et ai, 2000a) (Tableau 2). La protéine GlnK est un homologue des protéines de type Pu et est
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DFPHGEMNYYAQSDVNFLSKYKHAQEQERLREREQMQEIY--- ENCFEDAVgWEMPEGNSTVYIPEDPTFKPSGPSVPSVPMVSPLPMASSVPLVP-
448 429 407 417 405 404 414 425 416 371 408 418
501 534 428 475 492 489 534 499 480 391 457 479
Figure 3. Alignement de quelques protéines de la famille Mep/Amt/Rh.
Les séquences ont été alignées à l’aide du programme ClustalW. Les membres bactériens sont EcAmtB
d'Escherichia coli
(van Heeswijket al.,
1996) et AfAmtld'Archaeoglobus fulgidus
(Andradeet al.,
2005). Les membres fongiques sont ScMepl, 2 et 3 deSaccharomyces cerevisiae
(Mariniet al.,
1994 ; Mariniet al.,
1997a), CaMepl et 2 deCandida albicans
(Biswas et Morschhâuser, 2005). Les membres végétaux sont AtAmtl;! et AtAmt2d'Arabidopsis thaliana
(Ninnemannet al.,
1994; Gazzarriniet al.,
1999). Les membres animaux sont CeAmtl (ac. n.: P54145) et CeRhl (Jiet al.,
2006) deCaenorhabditis elegans
et HsRhCGd'Homo sapiens
(Marini
