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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Szynal, M. (2003). Etude du potentiel oncogène de la protéine Tax du virus de la leucémie bovine : implication dans le dérégulation de l'homéostasie des lymphocytes B primaires (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
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D 03198
I ______
Co-promoteurs : Dr. A. Van den Broeke Dr. C. Van Lint
Etude du potentiel oncogène de la protéine Tax du virus de la leucémie bovine : implication dans la dérégulation de l’homéostasie des lymphocytes B
primaires
Université Libre de Bruxelles
003130E33
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade légal de Docteur en Sciences
Maud SZYNAL 2003
Université Libre de Bruxelles
Laboratoire d’hématologie expérimentale Promoteur : Dr. P. Martiat
Co-promoteurs : Dr. A. Van den Broeke Dr. C. Van Lint
Etude du potentiel oncogène de la protéine Tax du virus de la leucémie bovine : implication dans la dérégulation de Fhoméostasie des lymphocytes B
primaires
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade légal de Docteur en Sciences
Maud SZYNAL 2003
accuedCie au sein de son CaSoratoire. J'admire Ce professionnaCisme de ce grand homme qui a de surcroît toujours Ce sens de Chumour.
Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance auprès du <Drdinne J^an den (Broehe, sans qui cette heCCe thèse n'aurait jamais vu Ce jour. CEn sa compagnie, j'ai passé Ces quatre pCus enrichissantes années de ma vie, tant sur Ce pCan professionneC que personneC Jfon seuCement, j'ai profité pCeinement de son accueiC au sein du groupe (BL'V mais aussi de son soutient et de ses conseiCs éclairés.
Son sens critique, son inteCCigence, sa rigueur scientifique, sa personnaCité attachante et son humour sont tout à son honneur. ‘ECCe a su m'enseigner Ce métier de chercheur et m'incuCquer Ce sens de C'autonomie, Ca rigueur scientifique et surtout Ca confiance en soi
J'exprime ma sincère gratitude au <Pr C^rine Van Lint pour son aide et Ces conseils qu'eCCe m'a prodigués en tant que copromoteur de Ca TacuCté des Sciences.
lM.es remerciements s’adressent aussi au <Pr Jlrsène (Bumy pour ses remarques pertinentes et son soutient inconditionnée dans Ca réaCisation de ma thèse de doctorat.
Les nombreuses discussions avec Dr %aren iViÛard-ÇaCCo m'ont souvent éclairé et aidé dans l'apprentissage du métier de chercheur. Dn effet, j'admire son sens aigu de Ca précision, son enthousiasme, sa chaleur et son humanisme.
Le Cahoratoire dlKématoCogie Expérimentale aura été comme une seconde famille, cependant iC me faut maintenant dire mes adieux Je n'ouhCierais jamais Ces nombreux débats philosophiques, politiques,
voire typiquement féminins qui ont pu se dérouler à midi ou tard Ce soir entre deuxétapes de manipulation.
Je remercie tout particulièrement ‘Yvette, maître dans C'ait de manipuler, de m'avoir enseigné de nombreuses techniques en (Biologie Moléculaire. Toujours souriante, de bonne humeur et pafois espiègle, elle a toujours su répondre à toutes mes questions.
Enfin, je tiens à exprimer ma gratitude au Eonds pour Ca recherche dans Cindustrie et dans CagricuCture ainsi que Ca Eondation (Rpse et Jean JLoguet.
J'ai été toucHée à de maintes reprises par ['amitié, ûa compréhension et ùi compassion de mes potes (Bassam, Ma[ram, ^douane, JCaïdar, Marie et JA^nne Soree qui ont toujours été Cà pour me conseiCCer, m'encourager et m'ouvrir CesyewQ
Merci (Bassam, ta vision et ton assurance dans (a vie ont été un grand enseignement pour moi J'admire Ca gentiCCesse et Ca Cucidité d'un grandpersommge, j'ai nommé ^douane.
Je tiens aussi à saCuer Ce graruCdipComate Mahram, qui a toujours eu Ces derniers mots pour m'apaiser, entre autre par des séances de cassages de Boîte enfrigoCite. (Puisse Ca médecine ou Ces cieio^te remettre un jour sur pied!
Merci à toi, Haïdar d'être teC que tues et... courage, c'est Bientôt fini!
Que serais je devenu sans mes amies Marie et Jinne Soree qui ont toujours été présentes pour moi, que ce soit dans (es moments difficiCes comme Ces meilleurs. Pt coquines, ne faites pas trop de Bêtises, je vous tiens à CœiÛ
Ceci vaut pour toi aussi Maria! Pt n'ouBCie pas, ne laisse personne t’atteindre par des remarques désoBCigeantes, sois heureuse et profite de Cavie avec ta petite choute.
l)n Beau jour, venu d'un pays proche de mes origines, un jeune docteur gentiC taCentuew^ et généreiv^ est venu me rejoindre dans Ca même Barque et notes avons Bravé Ces mêmes tempêtes ceCCuCaires et démons irradiants. PaveC, je te remercie d'avoir été assez fou pour manipuler ce weeh^end du 8 et 9 février ; sans toi, j'aurai peut-être Balancé une imprimante par Ca fenêtre ou ... !!!
J’ai pu profiter de Ceypérience de notre grand séducteur JCugues, en tant qu’eoçpert du cytomètre defCu^et du tri ceCCuCaire.
Pnfin iCy a aussi Jlnne Zerghe et Philippe LewaCCe qui ont égayé mes midis.
J’ai une pensée émue pour mafamiCCe et mes amis qui m’ont toujours épauCé et encouragé dans mes chovç. Maman, Papa et Sophie, merci pour votre amour et votre soutient moral Jiprès de longues journées de CaBoratoire, fai pu profiter de Ca compagnie de (Benoît, Carole, Saroya, Marie-Julie, Serge et pleins dautres pour comBler mes soirées. Je tiens aussi à remercier mes amis Çosseliens, Claire et Vincent pour leurs conseils et avis éclairés.
Voici deiv^ ans que deiv(_ petits félidés égayent mes soirées et c’est avec etey, que je retrouve Ce calme du guerrier qui, je Cavoue, m ’échappe parfois...
Abréviations - Résumé INTRODUCTION
I. Le virus de la leucémie bovine 1
I. 1) Généralités sur les deltarétrovirus 1
I. 2) Pathogenèse induite par BLV 2
I. 3) Structure de la particule virale 3
I. 4) Le génome et les protéines de BLV 4
I. 5) Le cycle réplicatif rétroviral 5
I. 6) Régulation transcriptionnelle basale du LTR 7
I. 7) La protéine Tax®^'^ et ses fonctions
I. 7. 1) Le potentiel transactivateur de Tax 8
I. 7. 2) Les domaines fonctiormels de la protéine Tax 9 I. 7. 3) Le potentiel oncogène de la protéine Tax dans un modèle in vitro 11 de fibroblastes embryonnaires de rat
I. 8. La protéine Tax^^^'^"' et ses fonctions
I. 8. 1) Les domaines protéiques fonctionnels 11
I. 8. 2) Les activités transcriptionnelles
1~) La transactivation du LTR^^^^~‘ 12
2) Le signalement de NF-kB par Tax^^^^~' 13
31 L'activité trans-répressive de Tax^^^^'* 14
I. 8. 3) Le potentiel immortalisant 15
I. 8.4) Le contrôle du cycle cellulaire 15
I. 8. 5) Les voies régulées par Tax^^^^'' et potentiellement impliquées 16 dans la transformation du lymphocyte T
1. 9) La leucémogenèse induite par BLV 17
I. 10) Les mécanismes de leucémogenèse
I. 10. 1) Régulation de la prolifération et de l'apoptose par BLV 19 1. 10. 2) Les mécanismes moléculaires impliqués dans la leucémogenèse 21
I. 10. 3) Le mécanisme d’apoptose 22
IL Etablissement d’un modèle de culture de lymphocytes B pour 25 l’étude du potentiel oncogène de
II. 1) Les plaques de Peyer ovines, une source de lymphocytes B 25 II. 2) La culture de lymphoc)4es B primaires requiert la costimulation 26
par CD 154 et des cytokines à chaînes y communes
BUT DU TRAVAIL 29
RESULTATS 30
I Etude du potentiel oncogène de Tax®^'^
I. 1 Identification des perturbations de l'homéostasie cellulaire associées à l'expression de Tax
1) Transfert rétroviral et expression de Tax dans un clone de lymphocytes B ovins 30 2) Les lymphocytes B ovins exprimant Tax acquièrent un phénotype
indépendant de cytokines 32
3) Tax augmente la croissance des lymphocytes B primaires
3. a) Tax augmente la croissance du Clone 2, slglVL^ 33 3. b) Tax augmente la croissance des clones de lymphocytes B slgG^ 34
ii
3. c) Mise en évidence d’effets précoces associés à l’expression de Tax : utilisation de vecteurs rétro viraux coexprimant Tax et EGFP
1) Mise au point des vecteurs rétro viraux 34
2) Transduction des lymphocytes B ovins par le vecteur rétroviral 37 pSFTaxCE : la croissance accrue des lymphocytes B associée à l'expression de Tax est un événement précoce
4) L'augmentation de croissance cellulaire induite par Tax résulte d’une prolifération cellulaire accrue
4. a) Tax augmente la prolifération cellulaire et modifie la distribution des 39 lymphocytes B dans les différentes phases du cycle cellulaire
4. b) En absence de CD154, Tax est capable d’augmenter la prolifération
cellulaire 40
5) Tax prolonge la survie des lymphocytes B et les protège de l'apoptose
induite par privation de facteurs de croissance, par dommage physique ou après traitement par des inhibiteurs de NF-kB.
5. a) Tax protège les lymphocytes B de l'apoptose en conditions stimulées
et privées de facteurs CD 154 et IL-4 41
5. b) Tax protège les lymphocytes B de l'apoptose induite par les radiations y 42 5. c) Tax protège les lymphocytes B de l'apoptose induite par inhibition de NF-kB 42 II. 2 Identification des mécanismes cellulaires impliqués dans la dérégulation de
l'homéostasie cellulaire associée à l'expression de Tax
1) La croissance accrue des lymphocytes B exprimant Tax résulte ni de facteurs 44 sécrétés ni de mécanismes impliquant le contact cellulaire
2) Tax augmente l'activité nucléaire de NF-kB dans les lymphocytes B
2. a) Tax augmente l'activité nucléaire de NF-kB dans les lymphocytes B 45 issus des PP jéjunales
2. b) Des cellules tumorales dérivées d'animaux leucémiques possèdent une activité nucléaire NF-kB similaire aux lymphocytes B primaires et
l'expression de Tax augmente cette activité 47
3) Etude du rôle d'iKBa dans l'activité nucléaire NF-kB accrue, médiée par Tax 48 4) L'expression de Tax dans les lymphocytes B est corrélée à la surexpression de 49 Bcl-2
II Etude des mutants de
I. 1 Construction des plasmides d'expression pSGTax M228, M303 et M228+303 51 I. 2 La substitution de la Lys 303 par Glu 303, responsable de la latence virale 52 dans les cellules YR2, abolit le potentiel transactivant de Tax
I. 3 La substitution de la Lys 303 par Glu 303 n'affecte pas le potentiel transformant 53 de Tax dans un modèle in vitro de cellules non lymphoïdes
DISCUSSION ET PERSPECTIVES 55
Bibliographie 64
Matériel et Méthodes 83
PUBLICATIONS 94
ARNm ARN messager ATL Adult T-cell leukemia
ATF Activating transcription factor BLV Bovine leukemia virus
BCR B-cell receptor
CAD Caspase-activated deoxyribonucléase CAPE Acide cafféique phénétyl ester CBP CREB binding protein
CRE Cyclic-AMP responsive élément CREB CRE binding élément
CDK Cycline-dépendante kinase EBL Leucose bovine enzootique ECMV Encéphalomyocarditis virus
EGFP Enhanced green fluorescent protein EMSA Electrophoretic mobility shift assay
G3PDH Glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase GaLV Gibbon Ape leukemia virus
GFP Green fluorescent protein HIV Human immunodeficiency virus
HTLV-1 Human T-cell leukemia/lymphotropic virus type 1 ICAD Inhibiteur de la caspase-activated deoxyribonucléase IL-2, 4,... Interleukine 2,4, ...
IL2-Ra Sous-unité a du récepteur de 1TL2 IgG Immunoglobuline d’isotype G IgM ou IgG Immunoglobuline d’isotype M ou G
sIgM(ou G)^ Exprimant des immunoglobulines d’isotype M (ou G) de surface IkB Inhibiteur de NF-kB
IKK Kinase d’IxB
LTR Long terminal repeat
MAPK Mitogen-activated protein kinase MESV Murine embryonic stem cell virus MoMuLV Moloney murine leukemia virus NF-kB Nuclear factor-KB
PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells PCAF p300-CBP associated factor
PCNA Proliferating cell nuclear antigen PCR Proliferating chain reaction PL Lymphocytose persistante PKC Protein kinase C
PP Plaques de Peyer
REF Fibroblastes embryonnaires de rat
Rb Rétinoblastome
RxRE Rex responsive élément ROS Reactive oxygen species RT-PCR PCR après rétrotranscription SV40 Simian virus 40
SFFV Spleen focus-forming virus
TPCK N-tosyl-L-phénylalanine chlorométhyl cétone
TRAF Tumor necrosis factor receptor (TNFR) associated factor TxRE Tax responsive élément
IV
Résumé
Le virus de la leucémie bovine (BLV) est un oncorétrovirus complexe apparenté au virus T lymphotrope humain (HTLV-1) responsable de leucémies à cellules T chez l’homme. Chez le bovin, l’infection par BLV induit un syndrome lymphoprolifératif chronique suivi dans de rares cas d’une leucémie aiguë de type B. La transmission expérimentale du virus au mouton par contre, induit le développement de tumeurs lymphoïdes B chez tous les animaux infectés, après une période de latence nettement plus courte. Contrairement aux rétrovirus simples dont les mécanismes de transformation sont bien documentés, BLV et HTLV-1 ne possèdent ni oncogène classique ni site d'intégration préférentiel.
Les protéines transactivatrices Tax®^'^ et Tax^^'^’’ jouent un rôle essentiel dans la régulation de l’expression virale et sont impliquées dans la transformation cellulaire, bien que leur expression ne soit pas requise pour le maintien de l’état transformé. Tax®^'" serait donc un acteur indispensable dans les étapes précoces de la cascade menant au phénotype malin du lymphocyte B, mais jusqu’à présent, aucune évidence expérimentale n’a démontré son potentiel oncogène dans cette cellule cible. L’objectif de notre travail était d’étudier les perturbations de l’homéostasie cellulaire associées à l’expression de Tax dans les lymphocytes B ovins et de mieux comprendre le rôle joué par cette protéine dans le processus multi-étapes menant à la transformation.
Nous avons examiné l'impact de l'expression de Tax dans sa cellule cible, le lymphocyte B ovin, en utilisant des clones de lymphocytes B isolés de plaques de Peyer jéjunales ovines dont la survie et la prolifération en culture dépendent de la costimulation par CD154 (CD40L) et rinterleukine-4 (IL-4).
L'expression de Tax au moyen d'un vecteur rétroviral, confère aux lymphocytes B la capacité de croître en absence de cytokines de la famille à chaîne y-commune (yc) (IL-2, IL-4, IL-7, IL-15), suggérant que Tax est capable de court-circuiter les voies contrôlées par l'activation des récepteurs à ces cytokines. En présence de CD 154 et IL-4, Tax perturbe le cycle cellulaire, accroît la prolifération et réduit la mort apoptotique des lymphocytes B ovins, qu’ils soient slgM^ ou slgG^. L’expression de Tax protège les lymphocytes B de l’apoptose induite par la privation en facteurs CD154/IL-4, par l’irradiation y et par le traitement par des inhibiteurs de NF-kB. Enfin, l’étude de lymphocytes B transduits par des vecteurs rétroviraux co-exprimant Tax et EGFP suggère que ces perturbations induites par Tax sont des événements précoces et que Tax est toxique lorsque son niveau d’expression est élevé.
Nous avons montré qu’en présence de Tax, la protéine anti-apoptotique Bcl-2 est surexprimée, suggérant son implication dans les mécanismes de survie induits par Tax. Tax augmente aussi l'activité nucléaire de NF-kB, un facteur essentiel dans la régulation transcriptionnelle de gènes cellulaires impliqués dans des mécanismes tels que la prolifération, l'apoptose et la différentiation des lymphocytes B. Les complexes majoritaires dont la concentration nucléaire est modulée par Tax sont les homodimères p50/p50 et les hétérodimères RelB/p50. Enfin, en absence de signaux CD154/IL-4 ou après traitement des cellules par des inhibiteurs spécifiques de NF-kB, Tax est capable de rétablir l’activité nucléaire NF-kB perdue et de réduire le taux d'apoptose, suggérant un lien entre le niveau de NF-kB et la survie prolongée.
L’effet de Tax sur l’activité nucléaire NF-kB n’est pas l’exclusivité du l)miphocyte B primaire; il est également observé lorsque l’expression de Tax est induite dans le lymphocyte B tumoral.
Nos observations suggèrent que Tax est impliqué dans l'initiation de la leucémogenèse associée à BLV. Cependant, les provirus intégrés dans les clones B tumoraux sont silencieux, et l’expression de Tax n'est pas requise pour le maintien de l'état transformé. Des mutations ponctuelles dans tax peuvent être à l’origine du blocage transcriptionnel du provirus tumoral. Nous avons montré qu’une de ces mutations dans l'extrémité carboxy-terminale abolit le potentiel transactivant de la protéine Tax, mais que ce mutant est toujours capable de transformer des fibroblastes embryonnaires de rat en coopération avec Ha-ra5. Ces données suggèrent que les fonctions de transactivation et de transformation liées à Tax sont dissociées. L'expression de mutants de Tax, par transfert rétroviral dans notre modèle de lymphocytes B ovins en culture, devrait contribuer à distinguer les mécanismes cellulaires associés au potentiel transactivant de ceux liés au potentiel leucémogène de la protéine.
Nous avons donc mis en évidence le potentiel oncogène de Tax et identifié des mécanismes cellulaires impliqués dans la dérégulation de la croissance des lymphocytes B. L’analyse des profils d’expression de ces différentes populations de lymphocytes B devrait permettre la mise en évidence des gènes cellulaires orchestrant ces processus, et l’identification de nouvelles cibles potentielles pour le traitement de maladies lymphoprolifératives à cellules B.
Partie I
Introduction
Figure I. 1 Illustration par microscopie électronique d’un virus HTLV-1 infectant un lymphocyte T
Illustration d’un virus HTLV-1 (en bleu) infectant un lymphocyte T (en rouge) réalisée par Dennis Kunkel, grossissement de 3.475x (autorisation de D. Kunkel).
Introduction
I. Le virus de la leucémie bovine
La première description de pathologie induite par le virus de la leucémie bovine remonte au dix-neuvième siècle dans l'étude menée par Sidamgrotzky sur la leucose bovine, qu'il caractérisa d'entité clinique. En 1957, Bendixen, initié en épidémiologie, documenta la leucose bovine enzootique (EBL) comme une maladie chronique contagieuse se développant après une période de 1 à 8 ans et qui dégénère, dans un petit nombre d'animaux infectés, en tumeurs. Il documenta également l'existence de manifestations sporadiques non contagieuses qui ne sont pas liées à la présence de virus. Les particules virales furent observées pour la première fois en 1969 par Miller dans la culture de leucocytes extraits d'un animal EBL atteint de lymphocytose persistante. Ces particules ont été nommées Virus de la Leucémie Bovine (BLV), après démonstration de leur caractère infectieux chez le bovin et le mouton. BLV fut par la suite identifié comme un rétrovirus exogène complexe .
1.1) Généralités sur les deltarétrovirus
Le groupe BLV/HTLV, les spumavirus et les lentivirus sont classés comme rétrovirus complexes. En plus des quatre gènes viraux principaux gag, pro, pol et env, les rétrovirus complexes, contrairement aux rétrovirus simples, codent pour des gènes supplémentaires qualifiés d'accessoires mais indispensables pour l’expression virale. BLV, HTLV(human T-lymphotropic virus type)-l et HTLV-2 forment un genre à part entière, le genre des deltarétrovirus. Ils sont caractérisés par la même organisation génomique, des stratégies d'expression génique et des pathologies similaires . Alors que les oncorétrovirus simples sont soit transduisants par expression d’un oncogène cellulaire soit cis-activants par intégration dans le génome cellulaire à proximité ou au sein d’un proto-oncogène, la leucémogenèse induite par HTLV et BLV est en partie médiée par la protéine transactivante Tax, d'où leur dénomination d'oncorétrovirus transactivants. Contrairement aux autres rétrovirus oncogènes, une faible proportion seulement d’individus infectés par ces virus développe des tumeurs.
M o rb id it é
A
tumeurs tumeurs < 5%
lymphocytose persistante 30-35 %
>• porteurs asymptomatiques ~ 60 %
^ animaux exposés mais non infectés (fréquence non connue)
---►
Temps
Figure I. 2 La pathogenèse induite par BLV chez les bovins
animauxinfectés
I. 2) Pathogenèse induite par BLV
Le virus BLV a été décrit comme l’agent infectieux de la leucose bovine enzootique (EBL), une maladie chronique qui se développe chez le bovin après une longue période de latence. Bien que BLV puisse causer un désordre malin fatal de type B, la majorité du bétail infecté est asymptomatique (60% des cas). Un tiers des animaux infectés développe un désordre prolifératif chronique, appelé lymphocytose persistante (PL). Il s'agit d'une prolifération polyclonale de lymphocytes B du sang circulant. Moins de 5% des bovins infectés développent des tumeurs et/ou lymphosarcomes après une période allant de 10 à 12 ans (Figure I. 2). Les cellules tumorales sont monoclonales pour l’intégration du provirus alors que l'intégration est polyclonale au cours de la PL .
BLV est apparenté au virus HTLV-1 (human T-lymphotropic virus type-1) qui est l'agent étiologique de leucémies à cellules T de l'adulte ATL (adult T-cell leukemia). HTLV-1 est également associé à un désordre neurologique chronique connu sous le nom de tropical spastic paraparesis et à une myélopathie HTLV-1-associée . L'infection par HTLV-1 d'enfants à la naissance conduit au développement d'ATL 20 à 30 ans après infection et dans 1% des cas seulement'^*. L'ATL aiguë se caractérise par un nombre élevé de lymphocytes T malins circulants et exprimant souvent CD4. Ces tumeurs sont très agressives puisqu'elles mènent à la mort de l'individu infecté dans un délai très court (environ 6 mois) . Il a été montré que ces tumeurs proviennent d'un ou plusieurs clones contenant un petit nombre de provirus intégrés. Alors que le virus humain HTLV-1 infecte les lymphocytes T (voir Figure I. 1), le virus de la leucémie bovine infecte et transforme les lymphocytes B.
Les moutons infectés expérimentalement par inoculation de lymphocytes de bovins BLV-séropositifs développant une PL ou par injection directe d’ADN proviral offrent un modèle d’étude unique largement utilisé. La séroconversion est détectable à partir de 1 à 2 semaines après injection et tous les moutons infectés développent des leucémies ou des lymphosarcomes après une période de latence beaucoup plus courte que celle observée chez le bovin (de 9 mois à 2 ans)^^’^"*^. Bien que les moutons soient rarement infectés dans les circonstances naturelles, le virus transmis expérimentalement induit une pathologie similaire, offrant un modèle extrêmement utile pour étudier la leucémogenèse induite par BLV.
Après la période asymptomatique, un tiers des bovins infectés par BLV développent une lymphocytose persistante qui est caractérisée par une prolifération importante de lymphocytes B exprimant les marqueurs CD5 et l'immunoglobuline M (IgM) en surface’^^.
Un nombre limité de tumeurs bovines se composent de lymphocytes B exprimant des IgG en
légende :
t
gp51/SUgp30/TM• pl5/MA O pl4/PR
• pl2/NC
• p24/CA tRNA
IN ARN
génomique membrane lipidique
Figure I. 3 Représentation schématique du virion BLV
surface (slgG"^)^’^, alors que les lymphocytes issus de lymphomes ou leucémies ovines sont systématiquement slgM"^ 180,276 mouton, les cellules infectées provenant d'animaux aleucémiques ont été décrites comme étant CDS"^ ou CD5', CDl Ib"^ et slgM"^ 29,226,275 jj ^ également suggéré que d'autres types cellulaires peuvent être infectés par BLV, comme les granulocytes, monocytes et lymphocytes T CDS"^ 59,95,239
I. 3) Structure de la particule virale
Le virion BLV a une structure sphérique d'environ 100 nm de diamètre. Il est constitué d'une enveloppe, une matrice et une capside renfermant l'acide nucléique (Figure I.
3). L’enveloppe virale est composée d’une bicouche lipidique d’origine cellulaire, où sont insérées des glycoprotéines virales formées de deux sous-unités liées par des ponts disulfures:
la sous-unité externe gp51 (SU) qui comprend F antirécepteur et la sous-unité transmembranaire gp30 (TM) qui contient le peptide de fusion"^. Les protéines de la matrice (MA) sont en contact avec la surface interne de la bicouche et entourent la capside appelée également core. La capside, de forme sphérique, est constituée de la protéine p24. Elle protège l'acide nucléique qui est associé aux nucléoprotéines pl2 et contient également trois enzymes virales indispensables au cycle viral : la protéase (pi4), l'intégrase (IN) et la réverse transcriptase (RT). La protéase est indispensable pour la maturation des virus et l’intégrase permet l'intégration du génome viral sous forme d'ADN double-brin dans le génome cellulaire. Leur génome ne sert pas directement de messager, il est rétrotranscrit en ADN linéaire double brin par la réverse transcriptase avant d'être intégré dans le génome de la cellule hôte où il détournera la machinerie cellulaire pour son expression .
I. 4) Le génome et les protéines de BLV
Le génome de BLV (générant un provims d'une longueur de 8,7 kb, voir Figure I. 4) contient huit phases de lecture répertoriées. Les protéines codées par gag, pro et pol sont exprimées grâce au messager génomique. Le précurseur polypeptidique majoritaire traduit du messager génomique est celui de Gag. Ce précurseur de 44 kDa est protéolysé en quatre protéines structurales : p24, pl5, pl2 et plO. La protéine majeure du core p24 est la cible principale de la réponse immunitaire humorale chez l'hôte infecté. pl5 est la protéine associée à la matrice. Sa protéolyse génère la protéine de la matrice plO ainsi que le petit peptide p4.
La protéine pl5 est myristilée tout comme son dérivé plO. Il semble que l'extrémité amino
terminale du précurseur Gag soit impliquée dans l'interaction protéine-ARN nécessaire au
Sag I
CAP|---f
[Ër^
pol
bl5 pl2 PrGag
Pr Gag-Pro
p24
capH^
À CAPh
CAP I-
CAP
p24 PR
pis 912
L P24 PR RT IN
- AAAAAA
_j---AAAAAA
AAAAAA
R3
■ - AAAAAA
■ -AAAAAA
G4
Figure I. 4 Structure du provirus BLV, les transcrits et protéines
Pr : précurseur polypeptidique, À : site donneur d’épissage,T: site accepteur d’épissage
^ : changement de phase de lecture ribosomiale
processus d'encapsidation virale'^^. Il a été en effet montré in vitro que pl5 forme un complexe spécifique avec le dimère d’ARN au niveau du premier signal d'encapsidation situé en aval du PBS et à proximité du codon d'initiation du gène La protéine nucléocapsidique pl2, riche en prolines et fortement basique, possède deux doigts de zinc contenant des tryptophanes qui sont importants pour son affinité de fixation à l'ADN .
Le précurseur Gag-Pro généré par un changement de phase de lecture ribosomique permet l'expression de la protéase pl4 ainsi que les quatre protéines codées par gag. Le gène pol est exprimé par deux changements de phases de lecture, le précurseur de 145 kDa Gag- Pro-Pol généré code pour la réverse transcriptase (RT) et l'intégrase (IN). Le processus de clivage des précurseurs Gag, Gag-Pro et Gag-Pro-Pol par la protéase virale semble être lié à l'assemblage et au bourgeonnement des virions. L'activation et l'action prématurées de pl4 empêcheraient un assemblage efficace et seraient fatales pour le virus.
Le transcrit simplement épissé code pour les protéines d'enveloppe. Grâce à son peptide signal, le précurseur glycosylé de 72 kDa est traité comme une protéine cellulaire destinée à la sécrétion. Il est clivé par une protéase cellulaire dans l'appareil de Golgi en protéines gp51 et gp30. Les tests ELISA développés pour détecter une infection par BLV tirent profit du fait que la protéine gp51 induit une production massive d'anticorps spécifiques chez les animaux infectés^®^. Deux études récentes soutiennent la présence d'une structure formant un domaine RBD (receptor-binding domain) pour la protéine gp51, à l'instar du RBD du virus écotrope F-MLV^^’^'^. Il a été également montré que la capacité fiisogénique de la protéine d'enveloppe est abolie par mutation d'un site de fixation d'ions zinc, site qui serait situé à l'opposé du domaine RBD dans la protéine gp51^^. La glycoprotéine transmembranaire gp30, hautement glycosylée, comporte le peptide hydrophobe de fusion à son extrémité amino-terminale^* ^ L'insertion en oblique de l'hélice a du peptide de fusion dans la bicouche lipidique ainsi que la mobilité d'une petite chaîne polypeptidique de gp30 sont responsables de la déstabilisation de la membrane cellulaire^*’. Le segment couvrant les résidus 19 à 27 de gp51 adopte une structure amphipatique de feuillet P capable d'interagir avec le peptide de fusion ou une autre région de gp30. La portion cytoplasmique de gp30 contient plusieurs motifs comme le motif ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) et un motif riche en proline à séquence PX2PX4.5P Ces deux motifs se retrouvent dans les protéines membranaires d'autres virus B-lymphotropes comme dans LMP2A d'EBV, ce qui a mené plusieurs groupes à supposer qu'ils jouent un rôle dans l'activation et la prolifération des lymphocytes B infectés et contribuent à la persistance du virus211
Le génome contient aussi une région appelée X située entre le gène d'enveloppe et le LTR en 3’(2i8,229) région contient des séquences qui codent pour au moins quatre
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Figure I. 5 Structure secondaire théorique du RxRE d’HTLV-1 (Cullen BR1992)
protéines : Tax, Rex, G4 et R3. Un messager de 2.1kb est obtenu par un mécanisme de double épissage. Sa traduction conduit à l'expression de Tax ou Rex selon le codon initiateur utilisé^'^. La protéine Tax ou p34 est encodée par la phase de lecture la plus longue LOR.
Cette phosphoprotéine nucléaire de 34 kDa transactive l’expression virale^^'^ et les expériences de coopération avec l'oncogène Ha-ra^ dans les fibroblastes embryormaires de rat ont montré qu'il possède un potentiel oncogène. Rex ou pl8 est encodée par la phase de lecture la plus courte, SOR. Cette phosphoprotéine nucléaire de ISkDa module l'expression cytoplasmique des transcrits viraux complets et simplement épissés Les protéines Rex d'HTLV-I et de BLV sont interchangeables dans les tests fonctionnels, suggérant qu'elles agissent par des mécanismes très semblables^"^. Rex^^'"'^'' contient un signal de localisation nucléaire riche en arginine qui est critique pour son interaction avec l'ARN viral, au niveau d'un motif de reconnaissance, le RxRE (Rex response element) (Figure I. 5). La région X de BLV contient deux autres phases de lecture codant pour les protéines G4 et R3. Les transcrits sont générés par un épissage alternatif et les protéines sont traduites par des codons initiateurs de la traduction différents de ceux pour Tax et Rex. Bien que leur délétion n'affecte pas l’infection en elle-même, elle semble atténuer la charge virale, suggérant que ces protéines influencent la propagation virale^^"*’^^^. Des messagers codant pour G4 ont été détectés spécifiquement dans des bovins infectés atteints de lymphocytose persistante^. Les expériences de coopération avec l'oncogène Ha-ra5 ont montré que G4 possède, contrairement à R3, un potentiel oncogène in vitro^^^.
I. 5) Le cycle réplicatif rétroviral
Le cycle de réplication rétroviral peut être divisé en deux phases, la phase d’établissement et la phase d’expression, qui est accomplie par la machinerie cellulaire"^^.
Suite à la recoimaissance et la liaison de certains récepteurs cellulaires par les glycoprotéines gp51, les rétrovirus entrent dans la cellule hôte par fusion des bicouches (Figure I. 6). Les tentatives pour identifier le récepteur cellulaire sont restées vaines. Le peptide hydrophobe de fusion de gp30 provoque la fusion des bicouches lipidiques virales et cellulaires par déstabilisation locale de la membrane de la cellule ciblée. La fusion libère alors le core dans le cytoplasme de la cellule hôte. Pendant la migration du core vers le noyau, l’ARN est rétrotranscrit par la RT associée à la capside et grâce aux désoxyribonucléotides cellulaires capables de rentrer à l'intérieur de la capside.
Tout comme les messagers cellulaires, le génome rétroviral est modifié posttranscriptionnellement : il est capé (GDP méthylé attaché par un lien 5'-5' au premier
RNA cnvolopc
ONA SYNTICSIS Of A
ONA/RNAAND THENA ONA/ONA DOUBLE HELIX BY REVERSE TRANSCRIPTASE
ONA
INTEGRATION OF DNA COPY INTO HOST CHROMOSOME
inisgiaiod DNA of viru»
Figure I. 6 Cycle de réplication des rétrovirus
nucléotide), méthylé en position 6 de certaines adénines et polyadénylé (de 50 à 200 A).
Chaque molécule d’acides nucléiques est associée au niveau de la région PBS (primer binding site) à un tRNA libre qui, par son bras 3'OH libre, servira d’amorce lors de la transcription inverse. Le génome rétroviral a la particularité de posséder à ses deux extrémités deux séquences R identiques, de répétitions directes, et les régions uniques U3 et La séquence U3, riche en purine, est située en 3' entre la région R et la polypurine tract, région insensible à l'activité RNaseH de la RT, alors que la région U5 se retrouve en 5' entre le PBS et la région R. La réverse transcription du génome en ADN bicaténaire est réalisée par les activités ADN polymérase et RNAse H de la RT, ainsi que deux sauts de l'extrémité 5’ à l'extrémité 3’ sur la molécule modèle. Ces sauts sont rendus possibles par la structure de l'ADN, imposée par la capside et apparemment circulaire. Le résultat de ces sauts est la duplication des séquences uniques en 5' et 3', U5 et U3, faisant apparaître deux répétitions terminales identiques : U3-R-U5 appelées LTR (long terminal repeat). Les LTR contiennent les éléments promoteurs et enhancers nécessaires à la transcription virale ainsi que les séquences nécessaires à la polyadénylation du mRNA. Bien qu'ils soient identiques, le LTR en 5’ remplit le rôle de promoteur tandis que le LTR en 3' a un rôle de terminateur. L’ADN bicaténaire linéaire est transloqué dans le noyau puis intégré de manière colinéaire dans le génome cellulaire grâce à l’intégrase. La forme intégrée porte le nom de provirus.
L'intégration au sein du génome cellulaire se fait au hasard avec une légère préférence pour l'euchromatine moins dense donc plus accessible^*®.
Après intégration, commence la phase d'expression du provirus qui acquiert le statut de gène cellulaire. Contrairement aux rétrovirus simples, les facteurs de transcription cellulaires ne suffisent pas pour permettre l'expression efficace du rétrovirus complexe. Après intégration du provirus, la machinerie cellulaire à elle seule ne permet qu'une synthèse basale très faible des messagers viraux. Pour les deltavirus, seuls les messagers viraux tax/rex sont capables de quitter le noyau à cette étape (voir Figure I. 7). Les protéines traduites retournent dans le noyau par leur signal de localisation nucléaire. La protéine Tax, même en faible quantité, active avec puissance la transcription de tous les gènes viraux. La transactivation du promoteur viral résulte de l’interaction indirecte de Tax au niveau d’éléments ci s-régulateurs situés dans la région U3 du LTR, nommés TxRE (Tax responsive element) . Elle mène aussi à l'accumulation de la protéine de régulation posttranscriptionnelle Rex jusqu'à un niveau critique. Cette dernière se fixe sur l'élément de réponse RxRE et permet ainsi la translocation des messagers non épissés et simplement épissés qui resteraient, sans son intervention, séquestrés dans le noyau^”*. La région RxRE, de plus de 250 nucléotides, s'étend sur une partie de la région U3 et la totalité de la région R^^. Sa structure secondaire hautement ordonnée et
Figure I. 7 Modèles d’action des protéines Tax et Rex dans le cycle réplicatif
composée de multiples tige-boucles est importante pour l'activité de Rex. Son mode d'action ainsi que la discrimination entre transcrits doublement épissés et les autres transcrits n'ont pas encore été élucidés. La structure secondaire formée par RxRE en 3' semble importante pour la maturation des transcrits et plus précisément pour leur polyadénylation. La distance séparant le signal de polyadénylation et le site d'addition des poly(A) est exceptionnellement longue (250 nucléotides contre 10-30 nucléotides pour les autres rétrovirus et les gènes cellulaires).
Le reploiement de l'élément RxRE permet la juxtaposition du signal de polyadénylation près du site de clivage en 3' (cf. Figure I. 5). Il n'y a cependant pas d'évidence d'une participation de Rex dans le mécanisme de polyadénylation. L'action des protéines Rex permet l'expression des protéines de structure et réduit indirectement la synthèse de messagers doublement
' • '207 episses .
Les produits de la traduction des messagers viraux ainsi que les ARN génomiques s'assemblent enfin à la périphérie de la cellule pour former des particules virales qui seront libérées par bourgeonnement. Seuls les messagers non épissés contiennent un signal d'encapsidation qui se trouve en aval du premier site donneur d'épissage leur permettant d'être emballés dans une capside. L'assemblage est régi par un ensemble d'interactions, entre ARN
■^oc ,
génomique, précurseurs polypeptidiques et bicouche lipidique . Après libération dans le milieu extracellulaire, les virions subissent un processus de maturation protéolytique nécessaire à la formation de particules virales infectieuses.
I. 6) Régulation transcriptionnelle basale du LTR
Après intégration du provirus, la transcription basale, assurée par la machinerie cellulaire, permet l'expression de la protéine nucléaire Tax qui transactive ensuite l'expression provirale. La transcription basale du LTR de BLV se déroule donc indépendamment de la présence de Tax. Plusieurs éléments présents dans le LTR de BLV sont susceptibles d’induire cette expression basale (Figure I. 8). Il a été clairement établi que les facteurs CREB/ATF sont capables d'initier la transcription virale en absence de Tax’’^^^.
Des sites de fixation de NF-kB peu conservés ont été identifiés dans la région U3 mais ils ne semblent pas affecter l'expression virale ’ . L'élément de réponse aux glucocorticoïdes (GRE), également identifié dans la région U3, confère une inductibilité spécifique à la dexamethasone et la mutation du motif GRE réduit l'activité basale du LTR en expériences de transfection transitoire^*^^. Dans la région LF5, un site de fixation aux facteurs de régulation à l'interféron (IRF) stimulerait également l'expression virale en absence de Tax’^^. Une séquence activatrice de 64 pb a été documentée dans l'extrémité de la région R et une
-211 ♦1 +235 +320 nt
Figure I. 8 Représentation schématique du LTR de BLV (Calomnie C. et al., 2001)
quatrième E-box y a été récemment découverte^^. Chacun des éléments de réponse à Tax (TxRE) contient un motif homologue E-box chevauchant le motif CRE (cAMP responsive element)^®’^^*. Les sites E-box fixent des facteurs transcriptiormels cellulaires de la famille bHLH (basic helix-loop-helix). La mutation du site E-box 4 réduit l'expression basale du gène rapporteur sous le contrôle du LTR dans plusieurs lignées lymphoïdes B . Enfin, la structure chromatinienne et son état d'acétylation régulent l’expression transcriptionnelle de nombreux promoteurs cellulaires et viraux. Le recrutement de désacétylases au niveau des séquences du LTR est proposé comme responsable du maintien du promoteur dans une forme inactive'
I. 7) La protéine Tax®^'^ et ses fonctions I. 7.1) Le potentiel transactivateur de Tax
Tax est une phosphoprotéine nucléaire de 309 acides aminés (34 kDa). Les signaux requis pour l'initiation de la transcription rétrovirale ont d'abord été étudiés par des expériences de transfection transitoire dans des lignées cellulaires infectées par BLV avec des plasmides recombinants exprimant le gène bactérien de la chloramphénicol acétyl-transférase (cat) sous le contrôle du LTR de BLV^^’^^^. La transactivation du LTR fut apparente uniquement dans les cellules productrices de virus, suggérant l'intervention exclusive d'une protéine virale transactivatrice^^’^^^. C'est en 1987 que la protéine Tax fut identifiée comme transactivateur spécifique du LTR, par transfection du gène rapporteur cat sous le contrôle du LtrBlv jgg fibroblastes infectés par des rétrovirus murins recombinants exprimant exclusivement
Les expériences de transfection transitoire réalisées avec des LTR délétés ont permis d'identifier une région de 75 pb, située dans la région U3, requise pour la transactivation du LTR par Tax^^’^^’'^^. La séquence nucléotidique de cet élément a révélé la présence de deux séquences répétées de 21 pb, appelées TxRE, centrées à ~148 et 123 pb en amont du site d'initiation de la transcription. Un troisième élément fut identifié en aval des deux autres, en position -48 par rapport au site cap de l'ARN (Figure I. 9). Ces trois éléments contiennent un motif palindromique central de 8 pb (TGACGTCA) imparfaitement conservé correspondant au site de fixation des facteurs de transcription de la famille CREB/ATF, appelé CRE'™. Ces protéines appartiennent à une classe de facteurs connus sous le nom de facteurs 'bZIP'. Elles possèdent un domaine de liaison à l'ADN riche en résidus basiques et une structure en hélice a amphipatique riche en leucines. Après dimérisation, les hélices a des facteurs bZip forment une structure d'hélice super-enroulée dite de tirette à leucines'^'^. Les leucines internes à la super hélice stabilisent la structure par interactions hydrophobes et de van der Waals. La
Figure I. 9 Représentation des éléments TxRE et ses motifs CRE non conservés dans le LTR de BLV
Les motifs CRE présents dans les éléments TxRE comportent un nucléotide différent du consensus CRE (indiqué avec un exposant). Les positions des motifs TxRE par rapport au site d’initiation de la transcription (+1) sont indiquées en rouge.
formation de cette tirette à leucines permet de juxtaposer une paire de modules de fixation à l'ADN, ainsi capables de fixer, sous forme d'Y, deux séquences adjacentes d'ADN. Le motif CRE est primordial pour la transactivation du LTR par Tax puisque la mutation du motif abolit totalement cette propriété^^’^^^. Néanmoins, les séquences flanquantes, qui diffèrent entre BLV et HTLV-1, sont requises pour obtenir une transactivation optimale par Tax. Les expériences de transactivations mutuelles des éléments TxRE de BLV ou d’HTLV-1 par leur protéine Tax ont démontré que les protéines Tax®^'^ et Tax^^'^'^'' ne sont pas interchangeables.
Etant donné que l’élément TxRE de BLV et d’HTLV-1 ne diffèrent que par les séquences flanquantes des motifs CRE, le motif CRE serait le centre fonctionnel d’un élément plus large dont la spécificité serait déterminée par ces séquences flanquantes. Deux copies TxRE sont suffisantes pour conférer à un promoteur hétérologue la capacité d’être activé par Tax®^'^*'^^\
D'ailleurs, l'excision d'un seul élément TxRE n'altère pas la capacité d’un rétrovirus recombinant à infecter l'animal'^"*. La fixation de la protéine Tax purifiée à l'élément TxRE n'a pu être mise en évidence par expérience de retard de migration sur gel (EMSA) . Néanmoins, les EMSA réalisés avec les extraits nucléaires de lymphocytes B bovins infectés par BLV ont clairement montré que les facteurs CREB, ATF-1 et ATF-2 fixent spécifiquement les éléments TxRE de BLV'”^. La fixation de ces complexes est d’ailleurs corrélée au niveau d’expression du virus dans la culture ex vivo de lymphocytes provenant d'animaux atteints de lymphocytose persistante. La présence de la protéine Tax purifiée augmente in vitro la fixation des membres de la famille CREB/ATF aux motifs CRE en interagissant avec leur domaine bZip^°. De plus, l’homodimérisation des protéines bZip telle que CREB, nécessaire pour son activité transcriptionnelle, est facilitée par la présence de Tax.
Il semble donc que Tax se lie aux éléments TxRE de manière indirecte, par interaction avec les facteurs CREB/ATF qui servent de médiateurs. Pour HTLV-1, il a été clairement montré que CRE, dans son contexte spécifique de régions flanquantes, forme une structure ternaire avec Tax^^’^'^'^ et CREB, et que la présence de Tax dans ce complexe est essentielle pour la transactivation. Plusieurs évidences suggèrent qu'un tel complexe ternaire Tax®^'’^:CREB; TxRE est impliqué dans la transactivation du LTR de BLV. L'aecroissement de la fixation des complexes transcriptionnels CREB/ATF aux éléments TxRE, induite par la présence de Tax, pourrait également contribuer à la transactivation du LTR par Tax.
I. 7. 2) Les domaines fonctionnels de la protéine Tax
Parmi les domaines fonctionnels importants de Tax, un domaine transactivateur intrinsèque a été identifié au centre de la protéine^^^ (Figure I. 10). Afin de déterminer les
Domaine de
Doigt Région régulation
de zinc activatrice négative
(P)
240 265Zn LLL
30 53 106 157 197
M228
293
^303
100
_L_
200
_L_
300
_U
309 a.a.Figure 1.10 Représentation schématique de la protéine Tax®^''
Représentation des domaines fonctionnels de Tax®^'^ et leur positions dans la séquence en acides aminés.
@ : groupe phosphate porté par le résidu désigné, L: leucine, mutation présente dans le provirus de la lignée tumorale YR2 (M22g et M3Q3)
domaines requis pour son activité transactivatrice, différentes régions polypeptidiques de Tax ont été fusionnées avec le segment de la protéine Gai 4 qui est spécifique pour sa fixation à l'ADN. L'étude a montré que la région comprise entre les résidus 157 et 197 constitue le domaine fonctionnel primordial pour le potentiel transactivant de Tax. Cette région a une charge globale neutre, ne semble pas être structurée en hélice mais sa haute teneur en leucine (24%) lui permettrait d’interagir avec de nombreuses protéines comme les facteurs de transcription CREB/ATF.
Diverses mutations, comprenant des insertions et délétions d'un ou plusieurs nucléotides, ont été réalisées dans le cDNA tax. Le potentiel transactivant des mutants a été testé par la technique du gène rapporteur ’ . La majorité des mutants générés perdent leur potentiel transactivant, suggérant que la protéine Tax possède une structure tertiaire à hautes contraintes conformationnelles. L’analyse théorique de la séquence d’acides aminés de Tax révèle la présence d’un doigt de zinc à l’extrémité amino-terminale . Les transitions effectuées au niveau des résidus Cys 30, Cys 33, Cys 50 et His 53, impliqués dans cette structure, ont montré que ce domaine fixe un ion de Zinc et est essentiel pour la transactivation du LTR. Il s’avère que le domaine de localisation nucléaire de la protéine Tax”^^'""' comprend la région en doigt de zinc^"^^. Pour Tax®^'^, l'analyse par immunofluorescence indirecte a révélé que les protéines mutantes dans le doigt de zinc sont toujours nucléaires^^'. La structure en doigt de zinc de Tax®^'^ n'est donc pas requise pour sa localisation nucléaire mais néanmoins indispensable pour son potentiel transactivant. Il a été suggéré que ce domaine interagit avec des protéines impliquées dans la transcription rétrovirale. Cette hypothèse est renforcée par l’évidence que les facteurs de transcription GATA-4, -5, et -6, par leur tandem de doigts de zinc, interagissent physiquement avec des facteurs comme NFATc4, SF-1, CBP ou p300^'^^\
Il a été récemment proposé que l'activité transactivatrice de Tax est limitée ou régulée négativement par un domaine fonctiormel compris entre les résidus 240 et La substitution d'un seul acide aminé dans cette région induit l’augmentation du potentiel transactivant. De plus, le core CRE sans son contexte de régions flanquantes suffit pour assurer la transactivation du LTR par ces mutants. Certains de ces mutants sont aussi capables de transactiver les séquences TxRE d'HTLV-1 contrairement à la protéine sauvage.
L'utilisation d'un de ces mutants a permis de montrer que la protéine Tax active l'expression du gène humain c-fos dans des lignées B humaines et bovines. L’abolition du domaine répresseur de Tax augmente cette transactivation^^*^. La transactivation de c-fos par Tax est
1 7 S médiée par les motifs CRE et cArG box, présents dans le promoteur ’ .
I-Introduction I. 7. 3) Le potentiel oncogène de la protéine Tax dans un modèle in vitro de fîbroblastes embryonnaires de rat
Le potentiel oncogène de Tax a été testé par des essais d'immortalisation et de transformation de fibroblastes embryonnaires de rat, modèle communément utilisé pour examiner le potentiel de transformation des protéines oncogènes'^*’. L’expression des protéines Tax et Tax ' immortalise les fibroblastes embryonnaires de rat (REF) . Les REFs cotransfectés avec tca et l'oncogène ras d'Harvey (Ha-ra5) acquièrent un état transformé: ils forment des foci, sont capables de croître en agar mou et de proliférer dans du milieu de culture contenant un faible pourcentage en sérum. Les souris nues inoculées avec ces REFs cotransfectés développent des tumeurs. L’expression de la protéine Tax d’HTLV-1 a été montrée comme étant nécessaire et suffisante pour induire l’immortalisation de lymphocytes T primaires humains ’ . Jusqu'à présent, des expériences similaires en lymphocytes B primaires ovins ou bovins n’ont pas été réalisées pour la protéine Tax de BLV.
Une hypothèse suggère que la transactivation de gènes cellulaires par Tax®^'^ est impliquée dans la transformation du lymphocyte B infecté. Les expériences de mutation dans la région en doigt de zinc de Tax suggèrent que ses fonctions de transactivation et de transformation sont indépendantes^^'. Les mutations affectant cette structure abolissent le potentiel transactivant mais n'affectent pas la capacité à transformer les REFs et à induire des tumeurs dans les souris nues. L'expression de la protéine Tax dans des cellules de mammifères ou d’insectes révèle qu'elle est phosphorylée au niveau des résidus sérines Ser 106 et Ser 293. La charge négative des deux résidus et non leur état phosphorylé est indispensable pour le potentiel transformant . La protéine mutante pour ces deux sérines, déficiente pour la transformation dans le système des REFs, possède néanmoins un potentiel transactivant inchangé, confirmant la séparation des fonctions de la protéine. Cependant, le provirus recombinant portant cette double mutation induit des tumeurs chez le mouton. Les discordances obtenues entre le système REF et le modèle animal in vivo a relancé le débat sur la nécessité de développer un modèle in vitro de lymphocytes B plus proche du système in
■ 268 VIVO .
I. 8. La protéine et ses fonctions
BLV et HTLV-1 possèdent une organisation génomique similaire, induisent des pathologies comparables et expriment des protéines structurellement et fonctionnellement semblables. Cependant, alors que BLV induit des tumeurs de type lymphoïde B, le virus
11
NLS avec l’ADN
Domaine de Dimérisation
LLLL
fixation à CREB 50
fîxation à p300/CBP 100
domaine d’activation de NF-kB
150 200 250
d’activation du
Ltrhtlv-1
fixation à PCAF
300 353
Acides aminés
Figure 1.11 Représentation schématique de la protéine
Représentation des domaines fonctionnels de et leur positions dans la séquence en acides aminés.
L: leucine, : mutations M22 et M42
I-Introduction
• HTLV 1 ' '
humain HTLV-1 infecte et transforme des lymphocytes T. La protéine Tax ' a ete largement étudiée, c'est pourquoi nous consacrons ce paragraphe à la description de son potentiel oncogène et transactivant.
est une phosphoprotéine de 353 a.a. essentiellement localisée dans le noyau des lymphocytes Elle transactive l'expression virale par les éléments cis-régulateurs TxRE de 21pb situés dans la région U3 du LTR et régule des gènes cellulaires tels que des oncogènes, des facteurs de croissance et leurs récepteurs. Ces activités sont régies par sa capacité à agir sur cinq voies de signalement cellulaires distinctes : CREE/ATF, NF-kB/RcI, NF-AT, SRF et Enfin, la protéine Tax se lie à et inhibe ou active des protéines impliquées dans le cycle cellulaire, la réparation des dommages génomiques et l'apoptose'®^.
1. 8.1) Les domaines protéiques fonctionnels
L'extrémité amino-terminale de la protéine Tax (40 kDa) contient un signal de localisation nucléaire (NLS)^'*® et une structure hydrophobe en doigt de zinc^"'^ qui est importante pour la transactivation du LTR et plus particulièrement pour la liaison aux facteurs CREB^'*^ (Figure I. 11)^^. Le domaine compris entre les résidus 81 et 95 constitue le domaine d'interaction avec les coactivateurs transcriptionnels CEP et p300^^^’®''^. La partie centrale de la protéine contient plusieurs résidus leucines. Elle est impliquée dans l'homodimérisation"®
et possède un domaine important pour l'activation de NF-kB (résidus 109 à 175)''*^. La région carboxy-terminale contient un domaine d'activation impliqué dans la transactivation rétrovirale. Ce domaine contiendrait un domaine de fixation au facteur PCAF (p300-CBP associated factor)^^’"^ et une hélice a à caractère amphipatique interagissant avec le domaine carboxy-terminal des facteurs CBP/p300^‘^'.
I. 8. 2) Les activités transcriptionnelles 1) La transactivation du LTR'*^^^ '
Le LTR d'HTLV-1 contient 3 motifs TxRE de 21pb qui se composent d'un core CRE imparfait flanqué de régions 5' G-riches et 3' C-riches^’’'®*. In vitro, ces motifs CRE lient les facteurs CREE, CREM (CRE modulator), ATF, TREB (Tax-responsive élément binding proteins) et HEB (21-pb binding protein) ’ ’ ’ . L'extrémité amino-terminale de Tax interagit avec CREE"', augmente la stabilité des dimères et leur fixation aux éléments TxRE^'’^®^’^'®. La transactivation optimale du LTR requiert l'homodimérisation de la protéine
12
La stabilité du complexe ternaire est aussi accrue par interaction directe spécifique de Tax avec l'ADN, au niveau des régions flanquantes de Le contact direct de la protéine par ses résidus 89 à 110 lui permettrait de se positiormer correctement, laissant ainsi ses régions carboxy-terminales stériquement accessibles'^^. Une protéine correctement positionnée est capable de recruter les coactivateurs transcriptiormels CBP/p300 par ses résidus 81 à En absence de Tax, CBP et p300 sont recrutés par CREB suite à sa phosphorylation par la protéine kinase PJ^. Ces coactivateurs possèdent une activité histone- acétylase pour les quatre histones (H2A, H2B, H3 et H4), leur permettant d'ouvrir la structure chromatinienne et d'initier la transcription^''’La protéine Tax interagit directement avec CBP notamment au niveau d'un domaine appelé KIX qui est important pour la fixation de CREB phosphorylé''*^. Le recrutement de CBP par Tax permet d'assembler CBP et CREB sans que ce dernier soit phosphorylé'^. Tax, CREB et CBP forment un complexe quaternaire stable avec les sites TxRE, qui est fonctionnellement insuffisant en absence du facteur PCAF (p300-CBP associated factor)'*''. Le coactivateur transcriptioimel PCAF est recruté par interaction directe avec Tax au niveau de l'hélice a carboxy-terminale, et ce indépendamment du recrutement de CBP^^’"^ Il est intéressant de noter que ce même domaine interagit également avec CBP. D’ailleurs, une mutation dans ce domaine (M47) abolit la fixation de PCAF et CBP^'". Bien que PCAF soit capable d'acétyler les histones H3 et H4^"^, il stimule la transactivation de TxRE d'une manière histone-acétyltransférase-indépendante. CBP et PCAF sont capables d'interagir avec divers composants de la machinerie cellulaire. En effet, CBP entre en contact avec TBP et TFIIB au sein du complexe transcriptionel avec l'ARN pol jj5,48,146 PCAF interagit avec la forme hyperphosphorylée de la polymérase Comme Tax interagit avec TFIIA et TBP in vitro et in vivo, la formation du complexe CREB:Tax:CBP/PCAF pourrait augmenter la stabilité du complexe d'initiation de la transcription ou en modifier la structure^^’'*^’^".
2) Le signalement de NF-kB par Tax**^*"^'*
Une des caractéristiques des cellules ATL est la surproduction de certaines lymphokines (IL-6, GM-CSF,...) et la surexpression de la sous-unité a du récepteur à l'IL- 213,45,263,312 L'gxpression de ces gènes est en partie régulée par les facteurs de transcription de la famille de NF-kB. Les facteurs NF-kB intervierment dans les réponses inflammatoires et immunitaires, dans la croissance cellulaire et la différentiation. Tax active des gènes cellulaires par la voie de NF-kB en augmentant l'activité nucléaire de ces facteurs'^. Les lymphocytes d'ATL induites par HTLV-1 et les cellules exprimant Tax ont une activité NF-
I-Introduction
kB anormalement élevée’^^. Parmi les membres de la famille NF-KB/Rel (p50, p65, p52, c- Rel, Rel B, plOO et pl05), l'hétérodimère p50/p65 est la forme active la plus communément présente dans les noyaux des lymphocytes T. Contrairement aux lymphocytes B, NF-kB est majoritairement séquestré dans le cytoplasme des lymphocytes T non activés. Il est retenu par les molécules inhibitrices IkB, essentiellement IxBa et IkBP, sous forme de complexe inactif.
L'activation du lymphocyte T (LPS, cytokines, infection virale, mitogènes) induit la phosphorylation des molécules IxBa et IkBP, qui sont ensuite ubiquitinées et dégradées par le protéasome 26S. L'expression de Fax induit la translocation de facteurs NF-kB dans le noyau par deux processus indépendants^'*^. D'une part, Tax peut physiquement interagir avec les molécules IkBœ et pl05, provoquant ainsi la dissociation des complexes inactifs^^’*^^. D'autre part, la protéine virale induit la phosphorylation site-spécifique d'IxBa en augmentant l’activité de sa kinase spécifique IKK. Cette étape est critique pour l'ubiquitination et la dégradation d'iKBa et donc pour l'activation de NF-kB. Le core complexé d'IKK se compose des deux sous-unités catalytiques IKKa et IKKp ainsi qu'une sous-unité de régulation IKKy (ou NEMO)^**^. L'association physique entre Tax et IKKy permet de recruter Tax au niveau des sous-unités catalytiques, mécanisme essentiel pour que Tax puisse accroître l'activité d'IKK^^°’^°^. Pour être actives, les sous-unités IKKa et IKKp doivent être phosphorylées sur des sérines particulières. Il semble que Tax intervienne également en amont, en faisant la connexion avec une MAP3K dont le rôle présumé est de phosphoryler IKK . La dégradation d'iKBa par le protéasome libère les dimères de NF-kB, qui migrent ensuite vers le noyau par leurs signaux de localisation nucléaire. En plus de l'action cytoplasmique, il a été proposé que Tax intervient aussi au niveau nucléaire. Tax colocalise avec p50 et p65 en des structures nucléaires ponctuées qui contiennent entre autre l'ARN polymérase II^^’^'*^. Etant donné que les protéines NF-kB interagissent avec pSOO*'*^*^ comme le fait CREB avec CBP, Tax pourrait activer l'expression cellulaire dépendante de NE-kB par un mécanisme analogue à celui exercé par CREB/CBP, c'est-à-dire via NF-KB/p300^^*l Les expériences d'immunocytochimie par microscopie confocale montrent que des mutants déficients pour NE-kB (tel que M22) ne colocalisent plus avec p300. Une série de gènes tels que IL-2, IL-2Ra, c-myc, c-rel sont surexprimés suite à l'action de Tax sur l'activité de NF-kB^'*^.
3) L'activité trans-répressive de
Tax possède également la capacité de réprimer des gènes cellulaires tels que box, la /?- polymérase (chargée de la réparation), p53, Ick (PTK) ou pis”'**^'*'^ (inhibiteur de la cycline-
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Figure 1.12 Mécanisme potentiel de l’activité transactivante et trans-réprimante de (Yoshida M. 2001)
