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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Van Renterghem, P. (1995). Etude de l'expression des facteurs de transcription TTF-1 et Pax 8 dans les thyrocytes de chien en culture primaire (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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Faculté des Sciences

Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Nucléaire

Faculté de Médecine

Directeur de thèse; Pr. G. Vassart Promoteur de thèse: Dr. D. Christophe

Etude de Texpression des facteurs de transcription TTF-1 et Fax 8 dans les thyrocytes de chien en culture primaire

Mémoire présenté en vue de l'obtention du grade de Docteur en Sciences

Pierre Van Renterghem

Mars 1995

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Faculté des Sciences

Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Nucléaire

Faculté de Médecine

Directeur de thèse: Pr. G. Vassart Promoteur de thèse: Dr. D. Christophe

Etude de l'expression des facteurs de transcription TTF-1 et Fax 8 dans les thyrocytes de chien en culture primaire

Mémoire présenté en vue de l'obtention du grade de Docteur en Sciences

Pierre Van Renterghem

Mars 1995

Je voudrais vous remercier, Pr. J.E. Dumont, pour la confiance que vous m'avez accordée.

Vous m'avez permis de me joindre à votre équipe au sein de laquelle je n'ai pas tardé à me sentir comme un poisson dans l'eau. Au cours de ces quelques années, j'ai pu bénéficier de l'excellent environnement scientifique que vous avez développé autour de vous. Je me suis même plus qu'habitué aux multiples séminaires auxquels vous nous "invitez" régulièrement.

Vos petits mots illisibles m'ont, lorsqu'ils sont devenus positifs, beaucoup encouragé.

Pr. Vassart -vous permettez que je t'appelle Gilbert ?- tu m'as surpris par ta rapidité de déplacement lorsque l'on te conviait à contempler un nouveau résultat. Cette contemplation, qui était tout sauf passive, a toujours été source de critiques, d'interprétations, d'enthousiasme et d'encouragements. Le sens de l'humour de mon patron a aussi beaucoup contribué à ce que je me sente parfaitement à l'aise, trouvant ainsi la sérénité (si, si!) indispensable à un travail

exigeant. Merci pour tout, Gilbert.

Je remercie Daniel Christophe qui m'a guidé tout au long de mon apprentissage. Son esprit critique hors du commun a régulièrement tempéré ma candeur naïve. Me voilà forgé dans un moule de rigueur scientifique qui devrait me permettre de mieux affronter l'avenir.

Mes camarades du C5-133 ont largement fait preuve de tolérance à mon égard. L'avouerais-je, je suis assez envahissant? Est-ce parce que j'ai d'abord été séquestré sous la hotte? Les horaires décalés de Véro ont failli la priver définitivement de sa table de travail. Marc occupait la table d'en face. Elle était encore plus encombrée que la mienne (à l'époque) et cela me rassurait.

Alena m'a trouvé bruyant (?) mais nous nous sommes quand même bien entendus. Bruno s'est révélé, dans un premier temps, comme l'incarnation de mon antithèse. Hakim fait plaisir à voir.

Philippe est resté poli en prenant possession de mon ex-table. Christiane s'est occupée du fond musical mais a bien voulu cesser de jouer avec l'ammoniaque concentré. Daniel a résisté à mon passage.

Ces quelques années n'auraient pas eu la même saveur sans la complicité de Taga, Michel Milinko., Marc Abra, Clive et Pitou. Patience mes amis, l'heure approche où nous dégusterons ce fameux Corbière...

Marian, Sab, Bernard et Christophe m'ont appris à manipuler les protEINES et les lapins.

Sarah D. m'a plus qu'aidé pour l'immunofluorescence.

Rédiger en même temps qu'Isabelle et David était d'un grand secours moral.

Les réunions PAI avec les équipes des Professeurs Rousseau, Martial et Szpirer ont été fort instructives.

D y a des besognes qu'on est content de ne pas devoir accomplir. Merci à Naïma, Joseph et

Johan. Merci aussi à Christian, Christiane, Marie-Jeanne, Daniel S et tous ceux qui s'affairent

pour que le labo ne manque de rien. Merci à Danièle et à Catherine. Merci à Christine et à son

équipe de l'ARBD pour les dosages hGH.

Colette, Florence, Stéphane Swi qui est toujours disponible, Didier et son synthé, Nathalie Su qui est bon public, Sabine, Stein et Anne, Claude, Val.P., Anouk(nouk?), Jacqueline et ses biscuits, Marc P. ses conseils et son rire étonnant, Jason, Anne M. qui n'était pas mal pour une vétérinaire. Pascale H., Dominique et son sourire, Olivier, Frédérique, Michel qui aime le boding, les multiples Catherine, Stéphane Schu, Massimo et Filo, Eric, Pierre R., Mireille, Fabienne, Sylvia R. et V., Nathalie et Pascale qui sont décoiffantes, Marcella, Thierry et sa bande. Manuel, Fred et Anne, Marc L, Benoît, Françoise W. (würst!), Valérie S., Carine, Martine, Françoise L., Raymond, Pierre M., Laurence, Serge, Viviane qui est une passionnée, Jacques, Dominique, Patricia, Kathy qui m'a fait découvrir les planches et le mégatrac... et je suis certain qu'il en manque beaucoup mais je ne les oublierai pas. Et puis, il y a Christian, Fabienne, Marcelle, Gisèle, Véro, Minique et tous les autres que je revois chaque fois avec plaisir.

Que Gene sache que je pense à elle en ce moment.

Jai pu bénéficier du soutien de l'A.P.M.O., de l'I.R.S.I.A. et de l'U.L.B.

Les encouragements familliaux ont toujours été réconfortants. Merci à Mother pour la chasse aux fêtes d'orthographe. Merci à mon frangin qui s'est occupé de mes bolides successifs et de ma bicoque, m'épargnant ainsi des soucis supplémentaires.

Aime, tu m'es devenue indispensable et, à tout moment, tu es à mes côtés. Merci.

ûf Marraine

AMPc Adénosine 3',5'-monophosphate cyclique

bHLH basic Hehx-Loop-Helix

bZIP basic leucine Zipper

CaMKII ou IV Protéine kinase dépendante du complexe Calcium/Calmoduline de type II ou IV

CKII Caséine Kinase II

CMB Cyclic AMP Modulated Einding activity

CRE Cyclic AMP Responsive Elément

CREE CRE Einding Protein

CREM CRE Modulator

GH Growth Hormone

GR Récepteur aux glucocorticoïdes

GSK3 Glycogen Synthase Kinase 3

HRE Hormone Responsive Elément

HSH Helix-Span-Helix

HTH Helix-T um-Hehx

ICER Inducible cAMP Early Repressor

KID Kinase Inducible Domain

PKA Protéine kinase dépendante de l'AMPc

PKC Protéine kinase C

PPl Protéine phosphatase de type 1

PP2A Protéine phophatase de type 2A

PR Récepteur à la progestérone

PRL Prolactine

RAR Récepteur à l'acide rétinoïque a//-trans

RTSH Récepteur de la TSH

SPE Protéine E du surfactant

T3 Triiodothyronine

T4 Thyroxine

TAF TEP Associated Factor

TEP TATA box Einding Protein

Tg Thyroglobuline

TPA 12-0-tetradécanoyl-phorbol-13 -acétate

TPO Thyroperoxydase

TR Récepteur aux hormones thyroïdiennes

TSH Thyroid Stimulating Hormone

TTF-1 Thyroid Transcription Factor -1

Table des matières

I. Introduction...3

A. Initiation de la transcription...3

1. Notions de promoteurs et d!enhancers... 3

2. Transcription de base...5

3. Régulation transcriptionnelle... 6

B. Facteurs de transcription... 8

1. Structure - notion de modularité... 8

2. Domaines de liaison à l'ADN... 9

a) Hélice-coude-hélice et homéodomaine... 11

b) "Doigts à Zinc"... 12

c) Domaine basique hélicoïdal...13

d) Feuillet P... 13

C. Régulation d'un régulateur... 14

1. Régulation transcriptionnelle...15

2. Epissage alternatif - stabilité du messager...15

3. Contrôle de la traduction...16

4. Modifications posttraductionnelles - Phosphorylation...17

5. Multimérisation... 17

6 . Le concept du dominant négatif... 17

7. Localisation subcellulaire... 18

D. Régulation transcriptionnelle par les hormones...19

1. Hormones stéroïdes et thyroïdiennes... 19

2. Régulation transcriptionnelle via la cascade de l'AMP cyclique... 21

a) CREB, un grand "classique" de plus en plus complexe...21

(1) La famille CREB/ATF...21

(2) Causes et effets de la phosphorylation de CREB...23

(3) Collaborations... 24

b) Le facteur AP-2... 24

c) Régulateurs non classiques... 25

(1) Spécificité tissulaire et régulation hormonale...25

(2) SFl : un récepteur nucléaire impliqué dans la cascade AMPc... 26

E. Système thyroïdien... 27

1. Contrôle transcriptionnel des gènes Tg et TPO... 27

a) TTF-1 responsable de la spécificité tissulaire?... 28

b) Recherche d'un élément cis impliqué dans le contrôle par l'AMP cyclique... 29

c) TTF-2 alias CMB?... 29

d) Pax 8 entre en scène...30

e) Conclusions... 30

2. Un facteur à homéodomaine et un facteur à domaine "paired" se lient aux promoteurs des gènes Tg et TPO... 30

a) TTF-1... 30

b) Pax 8 ...32

n. Matériel et méthodes... 34

A. Manipulations fondamentales...34

B. Culture de cellules...34

1. Thyrocytes de chien en culture primaire... 34

2. Cellules Hela... 35

C. Transfection et dosage d'activité des gènes rapporteurs... 35

1. Transfection de thyrocytes de chien en culture primaire...35

2. Transfection de cellules Hela...35

3. Dosage d'activité CAT...35

4. Dosage d'hormone de croissance humaine... 35

D. Production d'homéodomaine dTTF-1 recombinant en système procaryotique...35

E. Footprinting à la DNase 1... 36

ni. Objectifs du travail...37

rv. Résultats...39

A. Analyse fonctionnelle... 39

B. Etude de l'expression de TTF-1... 45

1. Production de TTF-1 recombinant...46

2. Liaison à l'ADN de TTF-1 recombinant...46

3. Immunisations... 49

4. "Study of TTF-1 gene expression in dog thyrocytes in primary culture"... 50

C. L'expression de Pax 8 est augmentée dans les thyrocytes de chien stimulés par l'AMP cyclique...71

1. Production de MBPdPaxSa... 71

2. Immunisations... 73

3. "Pax 8 expression in primary cultured dog thyrocytes is increased by cyclic AMP"...74

V. Résumé... 92

VI. Discussion... 94

Vn. Bibliographie...103

I. Introduction

Ce travail de doctorat a été consacré à l'étude du contrôle transcriptionnel de gènes spécifiques de la thyroïde. Décrivons brièvement ce système thyroïdien d'entrée de jeu. La fonction essentielle du thyrocyte, la cellule fonctionnelle typique de la glande thyroïde, est de synthétiser les hormones thyroïdiennes triiodothyronine (T3) et thjn'oxine (T4). Cette synthèse est contrôlée positivement par une hormone peptidique d'origine hypophysaire appelée thyrotropine ou TSH (pour "Thyroid Stimulating Hormone") (Dumont et al., 1989). Pour résumer, le thyrocyte a besoin de 4 éléments pour synthétiser les hormones T3 et T4: la thyroglobuline (Tg) (protéine précurseur dont certains résidus tyrosine seront iodés et couplés deux à deux), la thyroperoxydase (TPO), de l'iodure et du peroxyde d'hydrogène. La TSH agit en partie par stimulation de la transcription des gènes codant pour la thyroglobuline (Van Heuverswyn et al., 1984, 1985) et la thyroperoxydase (Gérard et al., 1988). En fait, la TSH se lie à son récepteur extracellulaire (Parmentier et al., 1989), cette association permet au complexe récepteur - hormone d'interagir avec une protéine Gs, ce qui conduit à l'activation de l'adénylyl cyclase. L'augmentation du taux d'AMP cyclique ainsi générée active une protéine kinase dépendante de l'AMPc. Ensuite nous nous heurtons à l'inconnu: le mécanisme liant la stimulation de la cascade de l'AMP cyclique à l'activation transcriptionnelle des gènes Tg et TPO. Son étude est le sujet de ce travail.

En tant que toute première étape vers la synthèse d'une protéine, l'initiation de la transcription est probablement l'événement à réguler par excellence. Au cours de cette introduction, nous décrirons l'assemblage de l'ARN polymérase II avec les facteurs de transcription généraux, ce qui nous permettra de voir à quels niveaux peuvent agir des régulateurs transcriptionnels. Nous examinerons ensuite la structure particulière des facteurs de transcription ainsi que les niveaux auxquels ils peuvent eux-mêmes être régulés. Nous nous intéresserons aux mécanismes de régulation hormonale de la transcription en montrant la différence entre les hormones stéroïdes dont les récepteurs nucléaires sont eux-mêmes des régulateurs transcriptionnels, et les hormones peptidiques qui se lient à des récepteurs extracellulaires, activant ainsi des cascades d'événements intracellulaires. Nous terminerons cette introduction en décrivant plus en détail les connaissances concernant la régulation transcriptionnelle des gènes Tg et TPO.

A. Initiation de la transcription

1. Notions de promoteurs et d'enhancers

Les régions régulatrices d'un gène transcrit par l'ARN polymérase II sont composées de deux types d'éléments; les éléments de base et les éléments spécifiques. Le rôle des éléments de base est de déterminer la position du site d'initiation de la transcription. Cet élément est en général une séquence consensus TATA (la "TATA box") située une trentaine de bases en amont du site d'initiation de la transcription. Cette séquence est le site de fixation à l'ADN du facteur de transcription général TFIID (voir § I. A.2). Une fois ce facteur fixé, les autres facteurs de transcription généraux ainsi que l'ARN polymérase II s'y associent et s'assemblent en un complexe de préinitiation capable d'initier la transcription en un site précis. Un complexe de préinitiation déterminé est par contre incapable de réguler à lui seul la vitesse de la réaction d'initiation. Cette tâche incombe au deuxième type d'éléments.

Ceux-ci, appelés éléments cis, sont des sites de fixation pour des facteurs de transcription

spécifiques qui interagissent avec le complexe de préinitiation. Ces éléments s'assemblent en deux types de régions régulatrices. Les éléments promoteurs proximaux associés avec l'élément de base forment le promoteur proprement dit qui s'étend sur quelques centaines de paires de bases en amont du site d'initiation de la transcription. Les éléments promoteurs distaux forment une région "enhancer” (Müller et al., 1988) qui peut être éloignée du promoteur de plusieurs milliers de paires de bases. Par définition, un enhancer peut être situé indifféremment en amont, en aval ou dans un intron du gène dont il régule la transcription, et ce dans n'importe quelle orientation. Notons que Yenhancer ne possède pas d'élément initiateur défini.

On parle souvent de la modularité des régions régulatrices. Chaque module est formé d'un ou plusieurs sites de fixation pour un facteur de transcription. On pourrait définir le module comme étant la plus petite unité fonctionnelle d'un promoteur capable de relayer un contrôle transcriptionnel. Certains modules sont capable de conférer une spécificité tissulaire à la transcription d'un gène, d'autre modules confèrent la réponse à une hormone, etc...

élément promoteur de base

Figure I.l. Représentation schématique des zones régulatrices d'un gène

imaginaire. Les facteurs trans spécifiques lient leurs éléments cis au niveau des

éléments promoteurs proximaux et distaux. Les facteurs de transcription généraux

et TARN polymérase II se fixent au niveau de la TM 7M box, élément promoteur de

base. Le promoteur, composé des éléments promoteurs de base et proximaux,

s'étend jusqu'à quelques centaines de paires de bases du site d'initiation de la

transcription. Venhancer peut être éloigné de plusieurs milliers de paires de bases,

n est ici représenté en amont du gène mais peut par définition se trouver en aval ou

même dans un intron.

2. Transcription de base

Toute seule, TARN polymérase II est incapable de discerner les gènes à transcrire. Un complexe de préinitiation formé de facteurs de transcription généraux doit d'abord s'assembler au niveau de la TATA box (pour une revue, voir Roeder, 1991) avant de recruter la polymérase. D'autres facteurs de base se joignent alors à l'ensemble, leur rôle ultime étant sans doute après séparation locale des deux brins d'ADN au niveau du site d'initation, de catalyser l'étape de "promoter clearance" qui consiste à libérer TARN polymérase du complexe de préinitiation, lui permettant ainsi de procéder à l'élongation de la transcription.

La plupart de ces facteurs de transcription généraux sont composés de plusieurs sous- unités. Nombre d'entre elles ont déjà été clonées.

TFIID est le premier complexe à se lier à la TATA box via sa composante TBP (la

"TATA box Binding Protein"). Cette protéine a été récemment cristallisée (Nikolov et al., 1992). Elle a une structure très particulière constituée de deux domaines structurellement semblables (feuillets 3 antiparallèles). TBP se lie à l'ADN en plaçant ses feuillets 3 dans l'axe de la double hélice, provoquant une courbure ("bending") d'une ampleur impressionnante au niveau du sillon mineur, à tel point que la structure de la double hélice est bouleversée (Kim Y. et al., 1993; Kim J. et al., 1993). Cette courbure intervient vraisemblablement dans l'ouverture du site d'initiation. TFIID est aussi composé des TAF ("TBP Associated Factors") qui servent de relais entre le complexe de préinitiation et les facteurs de transcription spécifiques (pour revue, voir Sharp, 1992). Ils semblent ne pas être indispensables in vitro à la transcription basale. La liaison spécifique de TAFjjlSO à l'ADN au niveau du site d'initiation du promoteur du gène "major late" de l'adénovirus a été récemment mise en évidence (Verrijzer et al., 1994). Cette caractéristique n'est pas généralisable à tous les promoteurs et pourrait expliquer les différences d'activité transcriptionnelle entre éléments promoteurs de base.

La liaison de TFIID à la TATA box est stabilisée par TFIIA. Ce facteur ne paraît pas indispensable in vitro. Son rôle essentiel serait d'empêcher l'association entre des cofacteurs négatifs et TBP, favorisant ainsi la formation d'un complexe de préinitiation complet.

TFIIB rejoint le complexe TATA-TFIID-TFIIA. Cette étape est essentielle car elle conditionne l'entrée de l'ARN polymérase II dans le complexe de préinitiation.

L'ARN polymérase de type II se joint au complexe de préinitiation, associée à TFIIF dont le double rôle semble être de réduire l'affinité de la polymérase pour des sites ADN non spécifiques et de favoriser l'association de la polymérase avec le complexe de préinitiation (Greenblatt, 1991).

L'ensemble est finalement rejoint par TFIIE et TFIIH. La transcription peut alors démarrer après séparation des brins d'ADN au niveau du site d'initiation. Cette séparation est catalysée par une activité hélicase dépendante de l'ATP, portée probablement par une des sous-unités de TFIIH comme cela a été proposé pour la sous-unité RAD25 par Guzder et al. (1994). Le rôle de TFIIH est aussi de catalyser l'étape de "promoter clearance" dont dépend l'élongation de la transcription mais qui conditionne aussi la formation du complexe de préinitiation suivant. Outre la phosphorylation du domaine carboxyterminal de l'ARN polymérase H, cette étape nécessite aussi une activité hélicase dépendante d'ATP. Drapkin et Reinberg (1994), se fondant sur les exigences différentes de ces étapes en nucléotides triphosphates, proposent d'ailleurs que RAD25 serait plutôt impliqué dans l'étape de

"promoter clearance" que dans la fusion de l'ADN.

L'initiation de la transcription est donc un processus complexe impliquant de nombreuses protéines (plus d'une vingtaine!). Cette complexité a probablement l'avantage énorme d'offir beaucoup de possibilités de régulation. Voyons comment l'initiation peut être régulée.

3. Régulation transcriptionnelle.

Si l'on plonge dans une solution adéquate, in vitro, un promoteur possédant une TATA box et des éléments cis libres de toute protéine, et si l'on y ajoute tous les facteurs de transcription généraux décrits plus haut ainsi que l'ARN polymérase ü, une activité transcriptionnelle basale sera détectable. L'addition de facteurs activateurs à ce milieu réactionnel permettra d'augmenter cette activité mais la stimulation ne sera pas très élevée.

Or, in vivo, une cellule aurait avantage à pouvoir réguler la transcription de ses gènes avec le plus d'efficacité possible, ainsi qu'à pouvoir réduire complètement l'expression de certains de ses gènes. Une cellule peut eSectivement réprimer ou activer la transcription basale, le taux d'expression résultant de la combinaison de ces interactions positives et négatives.

Deux mécanismes de répression du taux basal de transcription sont possibles. Le promoteur peut être séquestré dans un contexte chromatinien fermé de telle sorte que la machinerie transcriptionnelle n'y ait plus accès (répression indirecte). Dans le noyau, l'ADN est étroitement associé à des protéines formant un complexe nucléoprotéique que l'on appelle "chromatine". En particulier, l'ADN s'enroule autour de structures cylindriques formées d'histones, ce qui donne à la chromatine observée au microscope électronique un aspect caractéristique en "collier de perles", chaque "perle" correspondant à un nucléosome.

A l'interphase, cet ensemble nucléoprotéique forme une structure encore plus compacte, plus difficilement accessible aux facteurs de transcription. Nous n'insisterons pas beaucoup sur le rôle de la chromatine dans l'activité transcriptionnelle. Ce rôle n'est d'ailleurs pas encore bien compris. Une revue très récente fait le point sur cette question encore controversée (Paranjape et al., 1994). En résumé, pour un gène donné, on peut distinguer trois états d'activité transcriptionnelle. A l'état inactif, l'ADN englobé dans une structure chromatinienne compacte est réprimé par les nucléosomes et des répresseurs différents des histones. Il est inaccessible à la machinerie transcriptionnelle. A l'état déréprimé, l'ADN est au moins en partie libéré d'une structure chromatinienne trop compacte, il devient accessible à la machinerie transcriptionnelle. Les facteurs de transcription généraux peuvent jouer leur rôle, mais sont livrés à eux-mêmes. Il ne bénéficient que de peu d'aide de la part des activateurs transcriptionnels. A l'état activé enfin, tous les facteurs de transcription spécifiques se lient aussi à l'ADN et stimulent fortement la transcription basale.

La méthylation des gènes est aussi un important niveau de régulation. La méthylation de dinucléotides CG est généralement associée aux structures chromatiniennes compactes caractéristiques des régions transcriptionnellement inactives (pour plus d'information, voir Christophe et Pichon, 1994).

D'autre part, la formation du complexe de préinitiation peut être bloquée

prématurément par fixation d'un répresseur à TBP (répression directe), ainsi la composante

négative NCI de USA Ç'Upstream factor Stimulatory Activity”) s'associe à ITIID, stabilise

la liaison de celui-ci à l'ADN mais empêche TFIIA et les autres composantes du complexe

de préinitiation de se lier (Meisteremst et al., 1991).

La figure 1.2 (adaptée de Roeder, 1991) illustre bien la multitude de niveaux auxquels un activateur transcriptionnel peut agir. La première option est de déréprimer la transcription basale (antirépression) soit en jouant sur la structure chromatinienne, soit en empêchant le facteur répresseur de remplir sa fonction (par exemple en aidant TFILA. à écarter NCI pour s'associer à TFIID).

AcUvator / Positiva Colactor

Figure 1 . 2 . Illustration des différents niveaux d'action des régulateurs transcriptionnels (adapté de Roeder, 1991). L'assemblage des facteurs de transcription généraux (TFIID, A, B, F, E, H) et de TARN polymérase II (PoUI) est décrit. La transcription peut être réprimée par la stmcture chromatinienne ou par l'intervention d'un cofacteur négatif (NC) se liant à TFIID. Les niveaux d'action des activateius sont indiqués par des flèches discontinues.

La "vraie" activation ne résulte pas d'une dérépression. Elle consiste à accélérer la

vitesse d'initiation de la transcription par interaction avec le complexe de préinitiation. D

paraît clair aujourd'hui que tous les activateurs ne contactent pas la même cible. On peut

supposer que tous les facteurs généraux sont des cibles potentielles d'activateurs, même si,

jusqu'à présent, des interactions avec TFIID (TBP ou TAF) et TFIIB sont presque les

seules à avoir été débusquées. Un même activateur peut contacter plusieurs facteurs de

transcription généraux. Par exemple, VP 16 interagit avec TBP, TAF40 et TFIIB (Stringer

et al., 1990; (joodrich et al., 1993; Lin et Green,1991). Les activateurs catalysent plusieurs

étapes clefs de l'assemblage du complexe de préinitiation. Après liaison des activateurs et de

TBP à l'ADN, la première étape consiste à "capturer" TFIIB. La deuxième étape,

dépendante des TAF, vise à terminer l'assemblage du complexe de préinitiation (Choy et

Green, 1993).

L'action réelle de l'activateur sur le facteur de transcription général qui mène à l'accélération du processus d'initiation semble encore assez obscure. Il semblerait que l'interaction puisse provoquer un changement conformatioimel rendant certains domaines plus accessibles, comme cela a été montré pour TFIIB activé par VP 16 (Roberts et Green, 1993).

On peut diviser les activateurs en deux catégories selon qu'ils se lient à l'ADN ou non.

Les facteurs de transcription se lient effectivement à leur élément cis spécifique alors que les coactivateurs forment un pont entre les facteurs de transcription spécifiques et les facteurs de transcription généraux. Illustrons ceci par le contrôle de la transcription du gène IgH, spécifique des cellules B. La spécificité cellulaire du promoteur de ce gène est conférée par un élément "octamère" (Wirth et al., 1987). Pourtant le même élément est aussi impliqué dans l'expression de plusieurs gènes ubiquistes et en particulier dans la transcription du gène codant pour l'histone H2B (LaBella et al., 1988). Deux facteurs de transcription, Oct-1 et Oct-2 (Schôler, 1991), se lient à cet élément octamère. Le premier est ubiquiste alors que le second est spécifique des cellules B. Oct-2 ne semblait cependant pas sufBre pour expliquer la spécificité tissulaire de l'activité des promoteurs de gènes d'immunoglobulines.

L'isolement de OCA-B a permis de lever le mystère. OCA-B est un coactivateur spécifique de Oct-1 et Oct-2, spécifique du promoteur du gène IgH et spécifique des cellules lymphoïdes (Luo et al., 1992).

B. Facteurs de transcription

1. Structure - notion de modularité

Une quantité impressionnante de facteurs de transcription ont déjà été identifiés (voir par exemple la compilation de Faisst et Meyer, 1992). En les comparant entre eux, il a été possible d'établir une classification basée sur une série de motifs séquentiels ou structuraux.

Il s'est avéré que ces motifs constituaient généralement soit le domaine de liaison à l'ADN, soit le domaine activateur ou encore l'interface de dimérisation. Enormément de facteurs de transcription forment effectivement des homo- ou hétérodimères. Parler de domaines nous amène tout naturellement à introduire la notion de modularité des facteurs de transcription.

Alors que les pionniers effectuaient la dissection fonctionnelle des premiers activateurs de transcription eucaryotes identifiés (GAL4 et GCN4, tous deux de la levure Saccharomyces cerevisiae), il leur est vite apparu qu'il était possible de distinguer un domaine de liaison à l'ADN d'un domaine activateur. En remplaçant les 74 acides aminés du côté aminoterminal de GAL4 par le domaine de liaison à l'ADN du répresseur bactérien LexA, Brent et Ptashne (1985) ont montré que la protéine de fusion générée était capable d'activer la transcription d'un gène de levure placé en aval de l'opérateur LexA, alors qu'elle n'était plus capable d'activer la transcription à partir d'un site UAS q spécifique de GAL4.

Ceci démontrait que la spécificité de liaison à l'ADN pouvait être modifiée tout en ne changeant rien aux propriétés activatrices. Peu après, Keegan et al. (1986) montraient que le domaine de liaison à l'ADN de GAL4 (les 74 premiers a.a.) était capable de lier l'ADN tout seul mais était incapable d'activer la transcription. Au contrmre, il agissait même comme un répresseur.

La structure modulaire aurait un avantage évolutif car elle permettræt de créer un grand

nombre de possibilités d'interactions au sein de complexes de transcription élaborés, ce qui

au fil du temps affine le potentiel régulateur de la cellule (Frankel et Kim, 1991).

tex A- QAL4

Figure 1.3. Modularité des facteurs de transcription, a: extrait de Keegan et al.

(1986). Effets de dérivés de GAL4 sur l'expression d'un gène de fusion GALl-lacZ dont le promoteur comporte un site de liaison à GAL4 (17 mers) ainsi que l'élément UAS

(élément de contrôle naturel du gène HIS4, stimulé par une carence en histidine) permettant une activation constitutive. On constate que GAL4 complet stimule la transcription alors que sa partie N-terminale, comportant le domaine de liaison à l'ADN, réprime la transcription basale (cf. activité p-galactosidase indiquée à droite des constructions), b; extrait de Brent et PtasW (1985). Le répresseur bactérien LexA est incapable d'activer la transcription à partir de son opérateur placé en amont d'im gène de levure, contrairement à la protéine de fusion LexA-GAL4.

2. Domaines de liaison à l'ADN

Afin de voyager à travers la diversité des facteurs de transcription, il nous paraît

raisonnable de nous rattacher à leurs domaines de liaison à l'ADN. Après tout, un facteur de

transcription se lie, par définition, à l'ADN, sinon c'est un cofacteur, mais ne forme pas

obligatoirement de dimères. Signalons qu'une revue de ce sujet est parue récemment

(Angrand, 1993). La figure 1.4 regroupe les représentations de la plupart des domaines

évoqués ci-dessous.

Figure 1.4. Domaines de liaison à l'ADN. a. HTH et homéodomaine (tiré de

Angrand, 1993); b. doigts de Zinc C 2 H 2 ; c. C 4 (tiré de Angrand, 1993); d. bZIP

(tiré de McKnight, 1991); e. bHLH (tiré de Ma et al., 1994).

a) Hélice-coude-hélice et homéodomaine

Historiquement, le motif hélice-coude-hélice (HTH, pour "Helix-Tum-Helix”) est le premier domaine de liaison à l'ADN qui ait été décrit à la suite d'études cristallographiques des répresseurs procaryotiques X (Anderson et al., 1981). Ce motif est constitué de deux hélices a de 8 à 10 acides aminés (a.a.) séparées par un coude de 3 a.a. L'hélice située du côté carboxyterminal ("hélice de reconnaissance") se positionne au niveau du sillon majeur de l'ADN.

L'homéodomaine est un domaine de 60 acides aminés initialement identifié par comparaison des premiers gènes homéotiques clonés chez la drosophile (McGuinnis et al., 1984b). A l'heure actuelle, des centaines d'homéoprotéines ont été identifiées chez de nombreuses espèces animales, végétales et même chez la levure (pour revue, voir Gehring et al., 1994). Elles ont été répertoriées en plusieurs classes en fonction de leur homéodomaine ainsi que de leur éventuel domaine associé (POU, Paired, LIM). Certaines de ces protéines ne présentent que l'un des domaines associés sans homéodomaine proprement dit.

Les prédictions de structures secondaires avaient laissé entrevoir une homologie de structure entre l'homéodomaine et le motif HTH (voir fig. 1.4.a). La détermination de la structure tridimentionnelle de quelques homéoprotéines par résonance magnétique nucléaire (Qian et al, 1989) ou par cristallographie (Kissinger et al., 1990) a confirmé ces prédictions. L'homéodomaine est formé de trois hélices a. Les hélices 2 et 3 se superposent au motif HTH. L'hélice de reconnaissance (hélice 3) se positionne dans le sillon majeur de l'ADN. Le résidu 9 de cette hélice joue un rôle important dans la spécificité de la liaison (pour revue, voir Treisman et al., 1992).

Le domaine POU

Il s'agit d'un motif de 150-160 a.a. identifié chez les facteurs Pit-1, Oct-1, Oct-2 et Unc- 86 , dont les initiales composent le nom "POU" (pour revue, voir Verrijzer et Van der Vliet, 1993). Ce motif est constitué de deux sous-domaines séparés par une région variable;

le domaine POU spécifique (POUg) de 75-82 a.a. de long et le domaine POU homéodomaine (POU hd ) ^ ^ Le domaine POU^D se lie à l'ADN comme les homéodomaines classiques. Le domaine spécifique POU§ se fixe aussi spécifiquement à l'ADN en insérant une hélice a dans le sillon majeur adjacent, contribuant ainsi à la moitié de la spécificité du site de liaison du domaine POU entier. Le domaine POUg semble aussi impliqué dans la formation de dimères et dans l'activation transcriptionnelle proprement dite.

Le domaine "LIM"

Le domaine "LIM" a été identifié à l'origine dans les protéines lin-11 Isl-1 et mec-3

(Freyd et al., 1990; Karlsson et al, 1990 ). Il s'agit d'un domaine riche en résidus cystéine et

histidine dont le rôle est encore obscur. Etant donné sa structure, il est possible que ce

domaine interagisse avec des ions métalliques. Certaines protéines présentent ce domaine

associé à un homéodomaine alors que d'autres n'ont pas d'homéodomaine. Dans le cas de

Isl-1, il a été montré que le domaine LIM inhibe la liaison à l'ADN de l'homéodomaine

associé (Sanchez-Garcia et al., 1993).

Le domaine "Paired"

Ce motif de 128 a.a. a été initialement identifié à partir des gènes de drosophile paired, goosebery-proximal et goosebery-distal (Bopp et al., 1986). Chez la souris, 9 gènes Pax contenant ce motif (du côté aminoterminal) ont été identifiés (pour revue, voir Babinet, 1993; Stapleton et al., 1993). Certaines protéines Pax possèdent en plus un homéodomaine complet ou tronqué (voir fig. 1.5). Le domaine paired est capable de lier l'ADN seul ou avec l'homéodomaine. D est constitué de deux sous-domaines responsables chacun de la moitié de la spécificité de liaison à l'ADN au niveau de deux sites situés dans 2 sillons majeurs adjacents (Czemy et al., 1993). Le domaine semble non structuré en solution et adopte une structure en hélice a lors de la liaison à l'ADN (Epstein et al., 1994).

Paxl Pax 2 Pax 3 Pax 4 Pax 5 Pax 6 Pax 7 Pax 8 Pax 9

domaine paired octapeptide homéodomaine

Figure 1.5. Famille des protéines Pax. Le motif des domaines paired représente la classification établie en fonction de la séquence de ces domaines. Les octapeptides et les homéodomaines complets ou tronqués sont représentés.

b) "Doigts à Zinc"

Plusieurs classes de protéines à "doigts à Zinc" ont été décrites mais toutes se lient à l'ADN en plaçant une hélice a dans le sillon majeur de l'ADN.

Famille C 2 H 2

La structure est constituée d'un feuillet P à deux brins antiparallèles suivi d'une hélice a (Pavlevitch et Pabo, 1991). L'ensemble (d'une trentaine d'a.a.) est maintenu dans une conformation globulaire par coordonnation d'un ion Zn^+ avec 2 résidus cystéine (l'un sur le premier brin P, l'autre dans la boucle entre les 2 brins) et 2 résidus histidine (sur l'hélice a).

Une protéine de cette famille peut présenter de 2 à plusieurs dizaines de "doigts", chacun

reconnaissant 3 paires de bases. La protéine s'enroule autour de l'ADN, chaque doigt liant

un triplet adjacent au triplet reconnu par le doigt précédent (voir fig.I.4.b). Le facteur Spl

présente un tel motif

Famille C 4

Le motif îe cette famille est caractéristique de la superfamille des récepteurs nucléaires qui se lient aux séquences palindromiques HRE (^'Hormone Resportsive Elément"). D est constitué de 70 a.a. assemblés en deux "doigts" adjacents. Chaque doigt est formé d'une boucle suivie d'une hélice a, l'ion Zn 2 + étant lié par deux résidus cystéine de la boucle et deux résidus cystéine du côté aminoterminal de l'hélice (Luisi et al., 1991). Le motif prend une conformation globulaire avec ses deux hélices formant un X. L'hélice a du module 1 est responsable de la reconnaissance du demi-site ADN (voir fig. I.4.c). La spécificité de l'espacement est conférée par une région D située dans la deuxième boucle, qui est partiellement responsable de la dimérisation.

Famille C 5

Ce motif est retrouvé chez des activateurs transcriptionnels de la levure dont le célèbre GAL4. D est organisé en deux petites hélices a maintenues par 2 Zn^"*" coordonnés à 6 cystéines (Marmorstein et al., 1992). Deux résidus lysine situés dans la partie carboxyterminale de la première hélice sont responsables de la liaison à un triplet situé dans le sillon majeur de l'ADN. Par effet de positionnement, la dimérisation est aussi responsable d'une partie de la spécificité de la liaison.

c) Domaine basique hélicoïdal

Ce domaine constitué de résidus basiques n'est pas structuré en tant que tel mais adopte une conformation hélicoïdale par contact avec l'ADN. La liaison à l'ADN se fait après dimérisation. C'est d'ailleurs l'interface de dimérisation qui a été identifiée avant la région basique elle-même.

Domaine bZIP à "leucine zipper"

Le domaine "leucine zipper" est formé d'une hélice a comprenant 4 ou 5 résidus leucine espacés de 7 a.a. Ce domaine permet la dimérisation par formation d'un "coiled coil"

entre deux hélices à leucines. La dimérisation permet de placer les domaines basiques dans deux sillons majeurs adjacents (Vison et al., 1989; voir fig. I.4.d). Le domaine bZIP est retrouvé par exemple dans la famille CREE/ATF.

Domaine bHLH à hélice-boucle-hélice

Ici aussi la liaison à l'ADN n'est possible qu'après dimérisation via le motif hélice- boucle-hélice, permettant de placer les régions basiques dans les sillons majeurs (voir fig.

I.4.e). Tous les membres de cette famille identifiés à ce jour (MyoD,...) reconnaissent une séquence consensus CANNTG (Blackwell et Weintraub, 1990).

d) Feuillet P

Ce type de motif a été identifié par cristallographie du complexe formé par le répresseur bactérien met et un opérateur (Somers et Phillips, 1992). Le répresseur met forme un dimère. Le feuillet P antiparallèle est formé de deux brins provenant chacun d'un monomère.

Le répresseur est aussi capable de reconnaître les distorsions spécifiques de la séquence de l'opérateur sans contacter les bases responsables.

Un feuillet P antiparallèle à 10 brins est responsable de la liaison à l'ADN de la TATA

box Binding Protein. Au niveau du sillon mineur, l'ADN épouse la face concave du feuillet,

ce qui l'oblige à former une courbure {"bending") considérable compensée par déroulement

de la double hélice (Kim Y. et al., 1993; Kim J. et al., 1993).

C. Ré 2 ulation d*un ré 2 ulateur

Comme toutes les autres protéines, les facteurs de transcription peuvent être régulés à de nombreux niveaux, allant de l'initiation de la transcription aux régulations posttraductionnelles sans oublier la localisation subcellulaire. La figure 1.6 résume schématiquement les niveaux de régulation les plus courants des facteurs de transcription.

Figure 1.6. Niveaux de régulation d'un activateur transcriptionnel. Transcription

(initiation et élongation), épissage alternatif et polyadénylation, stabilité du

messager, traduction de la protéine et choix du site d'initiation de la traduction,

stabilité de la protéine, modifications posttraductionnelles (phosphorylation, liaison

d'un ligand,...), séquestration dans le cytoplasme (éventuellement par dimérisation

avec une protéine inhibitrice), translocation nucléaire, multimérisation. Les

modifications posttraductioimelles peuvent avoir lieu dans le noyau.

1. Régulation transcriptionnelle

La transcription du gène est un niveau de régulation très important (même pour un facteur de transcription). Cela paraît logique. Enormément de ces protéines sont spécifiques d'un nombre très limité de types cellulaires. Illustrons cette situation par un exemple parmi tant d'autres; Pit-1 (Bodner et al., 1988; Ingraham et al., 1988), facteur spécifique de la glande hypophyse. Au sein de cette glande, le facteur Pit-1 n'est cependant pas confiné dans un seul type cellulaire. D est responsable de l'expression du gène de l'hormone de croissance dans les cellules somatotropes (Mangalam et aï., 1989), du gène de la prolactine dans les cellules lactotropes (Fox et al., 1990) et du gène de la sous-unité P de la thyrotropine dans les cellules thyrotropes (Steinfelder et al., 1991). Il est intéressant de noter que Pit-1 est capable de se lier au promoteur de son propre gène (Chen et al., 1990). Cette propriété autorégulatrice permettrait à Pit-1 de stabiliser le phénotype hypophysaire. On retrouve cette propriété chez d'autres facteurs de transcription spécifiques d'un tissu: le facteur myogénique MyoD (Thayer et al., 1989) par exemple.

Le gène CREM ÇCyclic AMP Elément Modulator”) présente la particularité de pouvoir être transcrit à partir de deux promoteurs. Un ARNm codant pour une forme très courte de 120 a.a., ICER {"Inducible Cyclic AMP Early Repressor"), est en effet synthétisé à partir d'un promoteur intronique. ICER, qui est presque réduit au domaine de liaison à l'ADN de CREM, agit comme répresseur de la transcription de gènes dépendant d'un élément cis CRE (Stehle et al., 1993, et voir § I.D.2.a). La nuit, une production de norépinéphrine contrôlée par les rythmes circadiens stimule les récepteurs P-adrénergiques des cellules de la glande pinéale, augmentant ainsi le taux d'AMPc dans les pinéalocytes. Ce mécanisme conduit à la production rythmique de la mélatonine après activation préalable d'une enzyme clef L'activation concomitante du répresseur ICER permettrait un contrôle négatif de l'expression de cet enzyme par un mécanisme rétro-actif Comme ICER est capable de réprimer sa propre expression, le système peut revenir à son état initial (Molina et al., 1993).

Au contrôle de l'initiation, il faut ajouter le contrôle de l'élongation de la transcription.

Ce type de contrôle est moins décrit. Il a été récemment montré que l'élongation de la transcription du gène c-myc était régulée par des transactivateurs classiques (Yankulov et al., 1994).

2. Epissage alternatif - stabilité du messager

Le grande diversité du monde des facteurs de transcription est encore multipliée par l'usage fi-équent de l'épissage alternatif B n'est pas rare qu'un seul gène soit à la base de plusieurs variants. L'épissage permet d'éliminer l'un ou l'autre des domaines créant ainsi des isoformes diflférentiellement régulables ou dont les propriétés transactivatrices peuvent varier ou même être opposées. La régulation de ce mécanisme n'est pas encore bien décrite.

Pour un facteur donné, la population de variants peut être spécifique d'un tissu comme cela a été montré pour le facteur Oct-2: les cellules B contieiment essentiellement la forme activatrice Oct-2.1 alors que les cellules neuronales synthétisent préférentiellement les formes inhibitrices Oct-2.4 et Oct-2.5 (Lillycrop et Latchman, 1992).

Un variant Pit-1 sans domaine POU spécifique lie l'ADN généralement avec une affinité

réduite par rapport à la forme complète. B existe cependant un site pour lequel les deux

formes ont une affinité équivalente. Cela a permis de montrer que la forme sans POUg n'est

plus capable d'activer la transcription (Voss et al., 1993). Cette forme serait impliquée dans

la répression de l'expression du gène de la prolactine (Day and Day, 1994).

Le gène CREM code pour une famille de variants générés par épissage alternatif. La plupart des formes de CREM ont une activité répresseur. Une forme activatrice (CREMx) est cependant fortement induite lors de la spermatogenèse sous l'action de la FSH {"Follicle Stimulating Hormone"). C'est une polyadénylation différentielle du transcrit CREMx qui est à la base de cette induction par stabilisation du messager (Foulkes et al., 1993).

Certains gènes dont l'expression doit être régulée très rapidement {c-fos, c-jun, c-myc) sont soumis à un contrôle de la dégradation de leur messager mettant en oeuvre des séquences déstabilisatrices AU-riches dans leur extrémité 3' non codante (Shaw et Kamen, 1986).

3. Contrôle de la traduction

Certains messagers codant pour des facteurs de transcription sont produits constitutivement mais ne sont traduits que dans certaines conditions. C'est, par exemple, le cas du facteur GCN4 de la levure. Ce facteur qui régule la transcription de gènes impliqués dans la biosynthèse des acides aminés n'est traduit que lorsqu'il y a carence en acides aminés (Abastado et al., 1991). La protéine kinase GCN2 activée par les ARN de transfert "non chargés" phosphoryle le facteur d'élongation eIF-2 régulant ainsi un processus de réinitiation. La partie 5' de l'ARNm codant pour GCN4 contient plusieurs petites phases ouvertes de lecture (minicistrons). En présence d'acides aminés, la traduction est initiée au niveau du premier minicistron et réinitiée au niveau du minicistron 4. En cas de carence en acide aminé, le facteur eIF-2 phosphorylé augmente le temps requis pour reformer le complexe d'initiation. La traduction est de ce fait réinitiée plus en 3', au niveau du codon AUG de GCN4 (pour une revue concernant les minicistrons, voir Geballe et Morris, 1994).

Chez les eucaryotes supérieurs, le contrôle traductionnel est aussi utilisé. Le messager codant pour le facteur BTEB est par exemple détectable dans plus de tissus que la protéine correspondante (détectable uniquement dans des cellules nerveuses et les spermatocytes). Il a été montré que la région 5' de ce messager contient 10 minicistrons et est capable de diminuer la traduction d'une séquence codant pour l'enzyme CAT qui lui serait accolé (Imataka et al., 1994).

La traduction de l'ARN messager codant pour Pit-1 est doublement régulée. Au cours du développement embryonnaire de la souris, l'ARNm codant pour Pit-1 apparaît 3 jours avant la protéine (Dollé et al., 1990). D'autre part, deux formes majeures de 33 et 31 kDa sont détectables dans l'hypophyse. Ces deux variants semblent être générés par l'utilisation de deux résidus méthionine différents séparés de 27 a. a. pour l'initiation de la traduction (Voss et al., 1991).

Le messager C/EBPa est aussi à l'origine de deux protéines (42 et 30 kDa) traduites à partir de sites d'initiation différents (Lin et al., 1993). La forme la plus courte, traduite à partir du troisième codon AUG de la phase de lecture ouverte, garde les propriétés transactivatrices (à partir des promoteurs 422(ap2) et C/EBPa) mais perd les propriétés antimitotiques de p42. Le rapport p30/p42 varie au cours de la différenciation du préadypocyte 3T3-L1 et au cours du développement de l'hépatocyte.

Citons encore CREM dont nous avons déjà parlé plus haut. Il existe une forme courte

appelée S-CREM générée à partir du messager CREMx par utilisation d'un AUG d'initiation

interne (Delmas et al., 1992). S-CREM est un répresseur alors que CREMx est un

activateur. Deux fonctions opposées peuvent donc être générées à partir d'un même

transcrit.

4. Modifications posttraductionnelles - Phosphorylation

La phosphorylation est probablement le mode de régulation des facteurs de transcription le plus répandu. Par exemple, CREB active la transcription de ses gènes cibles suite à la phosphorylation de sa sérine 133 par la PKA (protéine kinase dépendante de l'AMPc) en réponse à une augmentation du taux d'AMPc intracellulaire (Gonzalez et Montminy, 1989). D'autres protéine kinases sont connues pour phosphoryler des facteurs de transcription: la PKC, la GSK3 (Glycogène Synthase Kinase 3) et la CKII (Caséine Kinase II) étant les plus répandues (pour une revue, voir Meek et Street, 1992).

Un facteur peut être soumis à une suite de phosphorylations et déphosphorylations. Par exemple, c-Jun est activé par stimulation au TP A (12-0-tetradecanoyl-phorbol 13-acetate).

Le TPA active la PKC, mais plutôt que par phosphorylation directe de c-Jun, la PKC agit par activation d'une protéine phosphatase qui déphosphoryle c-Jun au niveau d'un site proche du domaine de liaison à l'ADN, pouvant être phosphorylé par la GSK3 in vitro. La GSK3 étant cytoplasmique, il est possible que c-Jun soit phosphorylé par cet enzyme juste après sa synthèse, avant d'être transporté vers le noyau dans un état inactif pour y être ensuite activé à un moment précis (Boyle et al., 1991).

Nous incluons dans cette section l'activation d'un facteur par liaison d'un ligand. Les récepteurs aux hormones stéroïdes sont soumis à un tel mode de régulation. Nous en reparlerons plus bas.

5. Multimérisation

L'homodimérisation et l'hétérodimérisation sont des phénomènes très répandus chez les facteurs de transcription. Deux des principales interfaces de dimérisation sont les domaines leucine zipper (CREB, C/EBP,...pour revue, voir Hurst, 1994) et HLH (MyoD, myc,...pour revue, voir Littlewood et Evan, 1994) décrits plus haut. La dimérisation peut jouer un rôle dans la liaison à l'ADN. Les sites de liaison sont d'ailleurs souvent symétriques (palindromes ou répétitions directes). Le site de liaison préférentiel des hétérodimères correspond souvent à la juxtaposition des demi-sites reconnus par chacun des partenaires dans le contexte d'un homodimère. Les nombreuses combinaisons possibles permettent d'augmenter considérablement la spécificité des interactions au sein d'un complexe transcriptionnel.

6. Le concept du dominant né£atif

L'hétérodimérisation n'offre pas seulement l'avantage de multiplier les possibilités de combinaisons de facteurs de transcription, elle permet dans certains cas de réguler négativement l'activité d'un activateur transcriptioimel par formation de dimères inactifs.

Plusieurs mécanismes ont été mis en évidence. Dans certains cas, l'hétérodimérisation aboutit à la formation d'un complexe capable de lier l'ADN mais incapable d'activer la transcription, dans d'autres cas, l'association avec un partenaire dépourvu d'un domaine de liaison à l'ADN empêche le dimère de se lier à sa cible. Dans un troisième cas, la dimérisation permet de séquestrer un facteur dans le cytoplasme, nous en discuterons plus bas.

La famille CREB/ATF (voir § I.D.2.a) est cormue pour sa complexité. Elle est

composée d'activateurs et de répresseurs capables de former aussi bien des homodimères

que des hétérodimères. L'association entre un activateur (CREB) et un partenaire dépourvu

de domaine activateur (CREM a, P ou y) permet d'accroître les possibilités de régulations

transcriptionnelles dépendant d'un élément CRE. Il a été montré récemment qu'un dimère

CREB-CREMa dont les deux partenaires sont phosphorylés est capable d'activer la

transcription de façon équivalente à un dimère CREB-CREB dont une seule protéine est phosphorylée (Loriaux et al., 1994). Le taux d'activité transcriptionnelle dépendant d'un CRE serait déterminé par le rapport activateur sur répresseur et par le degré de phosphorylation du dimère (pour une revue, voir de Groot and Sassone-Corsi, 1993).

MyoD, E12 et E47, des membres de la famille des facteurs à domaine bHLH (voir § I.B.2.C), sont aussi soumis à une régulation négative par formation de dimères avec un partenaire, Id ("Inhibitor of DNA binding"), possédant l'interface de dimérisation HLH sans domaine basique de liaison à l'ADN (Benezra et al., 1990). Plusieurs isoformes provenant de 3 gènes différents ont été identifiées (Benezra et al., 1990; Sun et al., 1991; Christy et al., 1991). Id est exprimé dans de nombreux types cellulaires en prolifération mais son activité est réduite dans les cellules différenciées (Biggs et al., 1992).

Le principe du dominant négatif est aussi appliqué dans la famille des protéines à domaine POU. Une protéine de cette famille appelée I-POU (Treacy et al., 1991) est amputée de 2 résidus de la partie aminoterminale de son homéodomaine, ce qui l'empêche de se lier à l'ADN. I-POU est capable de former des hétérodimères avec Cfl-a, une protéine à domaine POU qui active la transcription du gène de la dopadécarboxylase dans les neurones dopaminergiques de la mouche (Johnson et Hirsch, 1990). Ces hétérodimères sont incapables de se lier à l'ADN. Notons qu'une forme activatrice, twin of I-POU (Treacy et al., 1992), est produite à partir d'un transcrit I-POU épissé différemment. Ce facteur possède les 2 résidus absents de I-POU et est incapable de dimériser avec Cfl-a. Par contre, twin of I-POU peut activer la transcription de gènes différents de ceux qui sont régulés par Cfl-a. Le gène I-POU génère donc au moins deux types de protéines qui interviennent dans des programmes de régulations distincts lors du développement neuronal.

7. Localisation subcellulaire

Confiner un facteur de transcription dans le cytoplasme permet d'empêcher ce facteur

d'accéder à sa cible. Un certain nombre d'exemples sont décrits. La classe A (voir § I.D.l)

des récepteurs nucléaires aux stéroïdes (glucocorticoïdes, oestrogènes,...) est maintenue

sous forme monomérique dans le cytoplasme, associée à des protéines de choc thermique

(HSP). La liaison du ligand permet à ces récepteurs de se libérer des HSP, de dimériser et

de pénétrer dans le noyau (Tsai et O'Malley, 1994). Dans les myocytes en prolifération,

MyoD est séquestré dans le cytoplasme et ne migre vers le noyau que suite au retrait du

sérum du milieu de culture et à l'action indirecte de la PKA (Vandromme et al., 1994). Le

transport de la protéine c-fos vers le noyau dépend aussi de signaux extracellulaires. Dans

des fibroblastes cultivés en l'absence de sérum, c-fos est retenu dans le cytoplasme par une

protéine instable dont l'effet est contrecarré par une stimulation de la cascade de l'AMPc

(Roux et al., 1990). L'activité des facteurs de la famille rel (NF- k B,...) est principalement

régulée par modification de leur localisation subcellulaire. Dans le cytoplasme, NF- k B est

associé à I k B. La phosphorylation de I k B, par exemple, suite à une stimulation de la cellule

aux esters de phorbol, rompt cette association et permet à NF- k B de migrer vers le noyau

où il active la transcription de gènes cibles dont le gène de la chaîne légère k des

immunoglobulines (pour revue, voir Rushlow et Warrior, 1992).

D. Régulation transcriptionnelle par les hormones.

Il faut distinguer deux types de régulations hormonales. Les hormones peptidiques agissent via un récepteur membranaire extracellulaire et activent une cascade de régulations intracellulaire conduisant à l'activation de protéine kinases et/ou phosphatases. Le signal arrive finalement au noyau et active (ou réprime) la transcription du gène cible par modification quantitative ou qualitative d'un ou plusieurs régulateurs. Les hormones stéroïdes et thyroïdiermes par contre traversent la membrane cytoplasmique et vont directement activer leurs récepteurs cytoplasmiques ou nucléaires qui peuvent alors activer eux-mêmes la transcription des gènes cibles.

1. Hormones stéroïdes et thyroïdiennes

Les récepteurs aux hormones stéroïdes et thyroïdiennes constituent une superfamille avec les récepteurs à la vitamine D, à l'acide rétinoïque a//-trans, acide 9-cis rétinoïque, etc... (Pour une récente revue, voir Tsai et O'Malley, 1994). Tous ces récepteurs sont de grandes protéines divisibles en domaines fonctionnels et présentant une grande homologie structurelle les unes par rapport aux autres. Soulignons, par exemple, que leurs domaines de liaison à l'ADN et de dimérisation constitués de deux doigts à zinc (voir § I.B.2.b), leurs domaines de liaison au ligand ainsi que leurs domaines transactivateurs sont situés à des positions correspondantes. On divise cette superfamille en deux groupes: le groupe A, des

"grands récepteurs", est constitué des récepteurs aux glucocorticoïdes (GR), progestérone (PR), androgènes, minéralocorticoïdes et oestrogènes; le groupe B, des "petits récepteurs", est composé des récepteurs aux hormones thyroïdiennes (TR), aux acides rétinoïques all- trans (RAR) et 9-cis (RXR), à la vitamine D,...

Dans tous les cas, la liaison du ligand active le récepteur. Le récepteur actif semble agir, quel que soit son groupe, par interaction avec TFIIB. Les différences sont situées plus en amont (voir fig. 1.7). Les aporécepteurs (récepteurs sans ligand) du groupe A sont localisés dans le cytoplasme, sous forme monomérique, complexés à des protéines de choc thermique (hsp90, hsp70 et hsp56). La liaison du ligand induit un changement conformatiormel du récepteur, qui lui permet de se dimériser après s'être libéré des protéines de choc thermique.

Le récepteur activé migre vers le noyau, où il se lie à sa cible ADN avec haute affinité et active la transcription. Les aporécepteurs du groupe B sont déjà localisés dans le noyau et sont capables de se lier à l'ADN même en l'absence de ligand. Us agissent alors en tant que répresseur de la transcription basale par interaction avec TFIIB (Baniahmad et al., 1993).

La liaison du ligand induit un changement conformationnel qui modifie l'interaction avec TFIIB de telle manière que la transcription est maintenant activée.

Notons que ces récepteurs sont déjà phosphorylés avant toute liaison de ligand, après liaison à l'ADN, le récepteur est hyperphosphorylé par une protéine kinase dépendante de l'ADN . Cependant, le rôle exact de ces modifications n'a pas encore pu être déterminé.

Alors que l'importance de la phosphorylation dans la capacité des récepteurs à activer la transcription a été montrée, aucune mutation des sites de phosphorylation du récepteur à la progestérone n'affecte profondément ses propriétés transactivatrices (revu par Tsai et O'Malley, 1994). La phosphoiylation pourrait aussi intervenir dans la régulation de la localisation subcellulaire du récepteur aux glucocorticoïdes (De Franco et al., 1991).

La dimérisation est essentielle à l'activation. Les membres du groupe A forment des homodimères et se lient à des séquences palindromiques. Les membres du groupe B par contre forment des hétérodimères et se lient à des séquences du type répétition directe.

L'espacement entre les répétitions est spécifique du dimère. Dans plusieurs cas la meilleure

affinité d'un récepteur de la classe B pour l'ADN est obtenue par dimérisation avec RXR

(voir Tsai et O'Malley, 1994 et réf citées). Il existe une classe récemment identifiée de

récepteurs "orphelins" qui lient l'ADN sous forme monomérique. Nous en reparlerons plus loin.

Signalons l'existence d'oncogènes dérivés de ces récepteurs. Par exemple, v-erbA, dérivé du récepteur aux hormones thyroïdiennes, est incapable d'activer la transcription alors qu'il se lie très bien au site TR. D agit donc comme dominant négatif et cause la transformation cellulaire.

Figure 1.7. Activation des récepteurs aux hormones stéroïdes/thyroïdiennes (extrait de Tsai et OlVlalley, 1994). Le groupe A est représenté par PR/GR, le groupe B par TR/RAR. La dimérisation et la liaison à l'ADN des membres du groiq>e A dépend de la liaison préalable du ligand. Les membres du groupe B, constitutivement nucléaires, peuvent être activés par liaison du ligand à plusieurs niveaux;

dimérisation, liaison à l'ADN ou fonction activatrice.

2. Régulation transcriptionnelle via la cascade de l*AMP cyclique

La cascade de l'AMP cyclique est l'une des voies de transduction de signaux les plus importantes dans les cellules eucaryotes. Nous avons, par exemple, déjà évoqué que dans le système thyroïdien qui nous intéresse directement, la TSH active la transcription des gènes de la thyroglobuline et de la thyroperoxydase par un mécanisme dépendant de l'AMPc. Les nombreuses études publiées jusqu'à présent concernant ce type de régulation transcriptionnelle montrent l'implication d'un facteur appelé CREE (pour "Cyclic AMP Responsive Elément Binding protein”). Depuis les premiers travaux qui avaient laissé espérer un mécanisme relativement simple et direct, la situation s'est fort compliquée. CREE fait partie d'une grande famille (CREE/ATF) dont les nombreux membres qui existent sous plusieurs variantes peuvent former des homodimères et hétérodimères, sans compter les interactions directes avec les membres d'autres familles de protéines. D'autre part, des cas

"non classiques" (n'impliquant pas un membre de la famille CREE/ATF) sont de plus en plus décrits.

a) CREE, un grand "classique" de plus en plus complexe.

La découverte d'un élément de réponse à l'AMP cyclique ("CRE" de séquence palindromique 5'-TGACGTCA-3') dans le promoteurs de plusieurs gènes répondant à l'AMP cyclique a permis l'isolement d'un facteur de 43 kDa (CREE) capable de s'y lier (Montminy et Eilezikjian, 1987). Ce facteur s'avérant un substrat direct de la protéine kinase dépendante de l'AMP cyclique (PKA), un mécanisme simple semblait pouvoir être imaginé:

le taux d'AMPc augmente, la PKA est activée, phosphoryle CREE qui peut alors activer la transcription de gènes placés sous sa dépendance (figure 1.8). Il a bien vite fallu se rendre compte que cette vision ne tenait pas compte de certaines subtilités; action d'autres protéine kinases et phosphatases, affinités différentes pour différents sites ADN, hétérodimérisation au sein d'une famille bien plus grande que prévue...

(1) La famille CREE/ATF

Depuis le clonage du CREE original (Hoeffier et al., 1988), de nombreux ADN

complémentaires correspondant à des protéines suffisamment homologues entre elles pour

qu'on puisse les grouper dans une même famille, ont été clonés (pour revue, voir Lee et

Masson, 1993). Tous possèdent une région basique - "leucine zipper" (bZIP) responsable de

leur dimérisation et de leur liaison à l'ADN. Homo- et hétérodimérisation sont possibles,

quoique toutes les combinaisons ne soient pas permises. De plus, certains membres de la

famille CREE/ATF peuvent hétérodimériser avec c-fos ou c-jun, protéines possédant aussi

un domaine bZIP. La complexité de cette famille est encore multipliée par l'utilisation

intensive de l'épissage alternatif Celui-ci peut non seulement supprimer l'un ou l'autre

domaine de la protéine, ce qui peut affecter sa régulation, mais il peut même créer

activateurs et répresseurs à partir d'un même gène. A titre d'exemple, présentons les trois

membres les plus connus de cette grande famille.

Figure 1.8. Activation transcriptionnelle dépendant de l'AMP cyclique. Modèle CREE. H=hormone; Re=récepteur; G=protéine G; AC=adénylyl cyclase; R=sous- imité régulatrice de la PKA; C=sous-unité catalytique de la PKA; P symbolise la phosphorylation de CREE ("CRE Einding protein") sur sérine 133. Les autres composantes du complexe transcriptionnel ne sont pas représentées.

CREB fut la première de ces protéines à avoir été identifiée (Montminy et Bilezikjian, 1987). Détaillons ses différents modules. Le domaine KED ("Kinase Inducible Domain") contient plusieurs sites consensus de phosphorylation par différentes protéine kinases, dont la PKA qui phosphoryle la sérine 133. Ce domaine est entouré de deux régions riches en résidus glutamine comme on en trouve dans les domaines activateurs d'autres facteurs de transcription tels que Spl. Liaison à l'ADN et dimérisation se font grâce au domaine bZIP carboxyterminal.

CREM Ç'Cyclic AMP Responsive Elément Modulator") est présent sous forme d'un grand nombre de variants. La plupart sont des répresseurs mais il existe au moins une forme activatrice (CREMx). Le gène CREM a la particularité de coder pour deux domaines bZIP dont un seul est présent par protéine (Foulkes et al., 1991).

ATF-1 ("Activating Transcription Factor - 7") est une protéine très homologue à CREB (sauf du côté aminoterminal), exprimée dans de nombreux types cellulaires et capable de dimériser avec CREB. En réponse à une augmentation du taux d'AMPc, ATF-1 est capable d'activer la transcription à partir d'un CRE aussi bien que CREB (Rehfuss et al.,

1991).