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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Chaput, M. D. (1986). Altérations physiologiques induites par des métabolites réactifs de l'oxygène chez la levure (Unpublished doctoral dissertation).

Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences

Service de Chimie biologique

ALTERATIONS PHYSIOLOGIQUES INDUITES PAR DES METABOLITES REACTIFS DE

L'OXYGENE CHEZ LA LEVURE

Mémoire présenté en vue de l’obtention du grade légal de docteur en

sciences chimiques

Mariella CHAPUT

Février 1986

FACULTE DES SCIENCES

L'épreuve publique pour l’obtention du grade légal de Docteur en Sciences de Me CHAPUT, Mariella, Licencié en

Sciences, pour le groupe des sciences chimiques, aura lieu le :

JEUDI 20 FEVRIER 1306 A 16.00 HEURES.

dans le Grand Auditoire des Bâtiments de l’Université Libre de Bruxelles, 67, rue des Chevaux à 1640 Rhode-St-Genèse.

Me CHAPUT présentera et défendra publiquement une dissertation originale intitulée :

"Altérations physiologiques induites par des métabolites réactifs de l’oxygène chez la levure’’?

et une thèse annexe intitulée :

"L’induction contrôlée de mutants rho chez une souche de levure pet thermosensible doit permettre d’analyser l’évolution du génome mito­

chondrial et de démontrer l’importance de la perte de séquences

intergéniques spécifiques pour la stabilisation de l’information

conservée".

thermosensible doit permettre d'analyser l'évolution du génome mitochondrial et de démontrer l'importance de la perte de séquences

intergéniques spécifiques pour la stabilisation de l'information conservée.

constructives, a grandement contribué à la réalisation de ce travail.

Ma reconnaissance va également a Madame J. Brygier po\ir sa collaboration et sa gentillesse.

Enfin, j'ai apprécié la sympathie et la bonne humeur des membres du service de chimie biologique.

Je remercie le Fonds National de la Recherche Scientifique de m'avoir accordé le soutien financier pour accomplir mes

recherches.

RESUME.

Des composés rédox, comme la meradione et le PMS, sont capables d'effectuer un cycle d'oxydoréduction chez la levure Saccharomyces cerevisiae augmentant ainsi la production endo­

gène des métabolites toxiques de l'oxygène.

Quelle que soit la localisation intra- ou extracellulaire de la source génératrice de métabolites toxiques de Oj , les dégâts létaux encourus par la levure restent relativement peu importants. La protection enzymatique endogène minimale, sub­

sistant, par exemple, après croissance aux dépens du glucose (répression catabolique carbonée) ou développée par la cellule en l'absence d'oxygène, suffit déjà à limiter considérablement les effets toxiques d'une production accélérée d'ions supero­

xydes (Oj* ) et de HjO 2 . Cependant, la levure est relativement plus sensible aux effets délétères d'un hydroperoxyde exogène tel le t-butylhydroperoxyde.

Nos expériences ont montré que les catalases intracellu­

laires participent activement à la protection de la levure contre HaOjgénéré in situ. Par contre, la très lente diffu­

sion de HjOj externe dans le compartiment cytoplasmique suf­

fit à minimiser les dégâts internes potentiels d'un flux de HJ O 2 exogène.

Les superoxydes dismutases protègent les levures contre les effets délétères de O 2 * générés tant dans le compartiment intracellulaire que dans l'espace extracellulaire. Ce résul­

tat suggère soit que O 2 ' peut diffuser librement au travers de la membrane plasmique, soit l'existence d'xone superoxyde dismutase cyanure-sensible dans l'espace périplasmique.

Les dérivés actifs de l'oxygène sont responsables de

dégâts létaux mais peuvent également induire des altérations

non létales. Ainsi, nous avons mis en évidence que o"* et H O

générés tant à l'intérieur qu'à l'extérieur de la cellule entraînent une augmentation très significative du taux de mutants rho~ et sont donc susceptibles d'altérer l'infor­

mation génétique.

La perméabilité sélective de la membrane plasmique

peut être également affectée. Cependant, chez la levure, seul le traitement au t-butylhydroperoxyde (tBH) s'est avéré capa­

ble de lever, de façon significative, la barrière de perméa­

bilité (membrane plasmique) à l'influx de nombreuses substan­

ces extracellulaires (acide succinique, p-nitrophénylphosphate).

Au niveau moléculaire, les lipides insaturés des struc­

tures membranaires de la levure sont sensibles à la peroxy­

dation. Nous avons mis en évidence que le système xanthine /xanthine oxydase, la-ménadione et le tBH induisent de telles peroxydations*).L'importance des peroxydations observées est fortement déterminée par la nature de la source de carbone présente dans le tampon d'incubation des cellules. L'analyse de cette relation nous permet de penser que les lipides insa­

turés néosynthétisés sont les cibles majeures des peroxydes.

Un effet protecteur éventuel contre les peroxydations exer­

cé par des réducteurs physiologiques, produits plus pafticu- lièrement lors du catabolisme de certaines sources de carbone

(glucose, éthanol/cyanure), est également à retenir.

Une altération non létale d'une fonction membranaire plus spécifique a également été étudiée. Le transport actif des purines est surtout affecté par une source génératrice de O 2 * . La vitesse initiale d'entrée de l'hypoxanthine est alors réduite mais sans modification importante de l'accumu­

lation de la purine in situ, c'est-à-dire sans affecter la capacité bioénergétique de la cellule.

Notons encore que, dans certains cas : xanthine/xanthine xydase et tBH, nous avons pu établir, par l'action d'agents chélateurs, que les ions ferriques Feparticipent aux

celles dues au tBH étant, toutefois, en grande partie, non lipidiques).

processus cytotoxiques soit en catalysant la dicaux hydroxyles (OH*) soit par stimulation des peroxydations.

formation de ra­

de la propagation

o;

HO a*

OH.

•Oa PMS DCIP GSH tBH EDTA

Desféral CCCP pNPP pNP MDA LH LOOH X se DMPO SOD TB A

K3

radical superoxyde radical perhydroxyle radical hydroxyle oxygène singulet

phénazine métosulfate 2 ,6 dichlorophénol indophénol

glutathion réduit thuty 1 hydroperoxyde

éthylène diamine tétraacétate Desférrioxamine méthane sulfone

m-chlorophénylhydrazone carbonyl cyanure p-nitrophénylphosphate

p-nitrophénol malonaldéhyde lipide

hydroperoxyde de lipide xanthine oxydase

5,5 diméthyl -1- pyrroline -N- oxyde superoxyde dismutase

acide thiobarbiturique

ménadione

Table des matières.

Pages

r. ' ' 1

Résumé

Table des matières 5

Introduction - Table des matières 6

Matériels et méthodes 61

Résultats expérimentaux - Table des matières 69

Conclusions et discussion 156

★

Bibliographie 166

INTRODUCTION

Introduction p. 8

. Réactivité des métabolites toxiques de O 2 • p. 10 A. Ion superoxyde, radical perhydroxyle

B. Peroxyde d'hydrogène C. Radical hydroxyle D. Oxygène singulet

B. Complexes oxygénés d'ions métalliques.

. I - Production des métabolites toxiques de l'oxygène 1. Voies physiologiques de la production des espèces

toxiques dérivées de O 2 .

A. Production intracellulaire p. 13 1. Oxygène singulet p. 13

2. Radical superoxyde p. 15 3. Peroxyde d'hydrogène p. 18 4. Radical hydroxyle p. 19

- Présence de fer catalytiquement actif in vivo - Présence de cuivre catalytiquement actif in vivo - Agents complexants les ions ferreux et ferriques - Autres réactions productrices de OH.

B. Production extracellulaire des métabolites de l'oxygène la phagocytose. p. 24

2. Production de métabolites toxiques de O 2 induite par les composés rédox. p. 26

II. Dommages biochimiques et physiologiques causés par les dérivés toxiques de l'oxygène. p. 30

1. Mutagénèse. p. 31

2. Radicaux de l'oxygène et inflammation. p. 31

3. Dégradation de 1'ADN . p. 32 4. Inactivation d'enzymes, p. 34 5. Peroxydation des lipides, p, 35

III - Défenses contre les dérivés toxiques de l'oxygène. p. 40 1. Les superoxydes dismutases. p. 41

2. Les catalases. p. 44

3. Les glutathion peroxydases p. 45 4. Les hémoperoxydases p. 46

5. Autres systèmes de défenses contre les métabolites

toxiques de Oj. p. 47

6 . Ubiquité des systèmes de défense.p. 48

IV - La levure

1. Régulation par l'oxygène et adaptation respiratoire . p, 50 2. Répression catabolique carbonée.

3. Défenses enzymatiques des levures contre la toxicité de 0^

p. 56 1. Les catalases.

2. La cytochrome c peroxydase 3. Les superoxydes dismutases.

V But du travail. p. 61

INTRODUCTION.

Beaucoup de cellules principalement chez les organismes eucaryotes requièrent l'oxygène moléculaire pour leur métabo­

lisme énergétique ainsi que pour certaines synthèses vitales.

Mais si l'utilisation de l'oxygène moléculaire comme accepteur terminal d'électrons dans les processus oxydatifs est avantageu­

se pour la cellule, elle est également une source potentielle de dangers.

Toutes les formes de vie sont sensibles à la toxicité de l'oxygène. Si l'oxygène hyperbarique endommage très cer­

tainement toutes les cellules, une pression normale de O, semble déjà provoquer des altérations qui ne se manifestent que très lentement et dont l'importance varie considérablement avec le type d'organisme utilisé ( 1 ).

Dans son état fondamental, (état triplet * Z O 2 ) , l'oxygène y

est une substance radicalaire avec 2 électrons non appariés,

,

,

de meme spin, loges dans des orbitales x differentes. Cette structure électronique implique que O, ne peut pas accepter une paire d'électrons d'un autre atome au cours d'une oxyda­

tion car ces électrons devraient être de spins parallèles.

Cette restriction de spin explique que la réduction de l'oxy­

gène s'effectue préférentiellement selon des chemins réaction­

nels à 1 électron plutôt qu'à 2 électrons et ralentit ses ré­

actions avec les substances non radicalaires. Donc, quoique Oj soit thermodynamiquement un oxydant puissant, des contraintes

cinétiques et surtout la restriction de spin rendent sa réac­

tivité assez faible; des catalyseurs efficaces sont générale­

ment requis dans les réactions impliquant 0 j(l, 2 ).

Beaucoup d'effets toxiques de l'oxygène sont attribua­

bles à des molécules activées de l'oxygène ou à des radicaux

provenant de sa réduction incomplète plutôt qu'à O 2 lui-même dans son état fondamental. Plusieurs mécanismes d'activation de l'oxygène conduisent à la formation de ces espèces réacti­

ves capables d'induire des dommages aux systèmes vivants.

La réactivité de O 2 peut être accrue si un électron singulet est excité. L'oxygène activé obtenu se trouve alors dans l'état singulet 'O 2 (D.

Une autre voie d'activation de O 2 fait intervenir sa réduction incomplète. La réduction totale de O 2 en eau re­

quiert 4 électrons, mais le processus séquentiel univalent fournit 3 intermédiaires réactifs : 02 ~ , H 2 O 2 , OH., selon le schéma suivant (3) :

e"+ 2H‘

H 2 O 2 ^{e + H}

V OH. e + H

H 2 O H 2 O

Ces métabolites réactifs de l'oxygène ou des entités

dérivées de ceux-ci : peroxydes organiques (ROOH), radicaux

alkoxy (RO.), radicaux peroxy (ROO.), complexes oxygénés

actifs d'ions métalliques etc... sont également capables de

détruire l'architecture chimique de la cellule.

Réactivité des métabolites toxiques de O 2 .

A. Ion superoxyde, radical perhydroxyle.

L'ion superoxyde Oj se comporte comme un radical et comme un nucléophile; il peut être oxydant ou réducteur. Ses réactions sont lentes et sa réactivité est fortement modifiée par son envi­

ronnement : solvant, contre-ion et surtout les ions métalliques oxydoréducteurs ( 2 ).

L'ion superoxyde est instable en solution aqueuse où il ne peut donc s'accumuler.

Il ne réagit en tant qu'oxydant que vis-à-vis des donneurs de H : catéchol, ascorbate, atocophérol (1). Il se comporte dès lors, le plus souvent, comme un réducteur. Or les systèmes bio­

logiques sont généralement endommagés par des attaques oxydati­

ves. Il est donc peu probable que 0/ soit l'espèce majeure res­

ponsable de la toxicité de l'oxygène (4).

Le pouvoir oxydant de O/ diminue lorsque le pH croît. L'a­

cide conjugué HO 2 ’ (radical perhydroxyle) est donc meilleur

oxydant que O 2 ' tandis que 02 * est meilleur réducteur que HO/ (5).

Etant plus oxydant, H 02 ' est plus actif que O

. Mais le pK de cet acide étant de 4.8, au pH physiologique ( _ pH 7) la proportion de HO 2 ’ est très faible (inférieure à 1 %) . Mais certains micro-environnements possèdent un pH nettement plus acide. Ainsi, à la surface des membranes où la charge négative de surface cause une chute du pH de la région immédiatement ad- . jacente à la membrane, la concentration en HO 2 * serait nettement plus élevée que dans le cytosol. En outre, dans un environnement non polaire (membranes) H 02 * non chargé peut diffuser et exercer ses effets délétères (4, 6 ).

Etant peu réactif, O 2 ' peut migrer sur des distances plus longues et atteindre des cibles vitales plus efficacement que HO 2 ' ou des substances plus réactives (4). A proximité des mem­

branes O

serait converti en une espèce plus réactive ( H 02 ‘ )

responsable des dommages ( 6 ).

B. Peroxyde d'hydrogène.

H 2 O 2 est peu réactif et peut, en général, diffuser librement à travers les membranes.

Beaucoup de réactions associées à Oj' et Hj Oj dépendent de la présence d'ions métalliques oxydoréducteurs qui augmen­

tent fortement la réactivité de ces métabolites. Comme l'oxy­

gène moléculaire, O 2 ' et Oj apparaissent comme des précur­

seurs d'espèces plus toxiques ( 2 ).

C. Radical hydroxyle.

Le radical hydroxyle (OH") est un oxydant extrêmement puissant. Il réagit, non spécifiquement, avec presque toutes les molécules, à des vitesses proches de la vitesse de diffu­

sion. Il provoque une inactivation générale d'enzymes et de systèmes membranaires. Son temps de vie est inférieur à 1 ^sec.

et son trajet libre moyen est très court (7). Dans un système biologique, étant donné l'abondance des cibles moléculaires, il est peu probable que OH* échappe à un piège non discrimi­

nant. Il ne pourra donc survivre un temps suffisamment long pour attaquer spécifiquement des macromolécules critiques ( 8 ).

Les dégâts causés par OH* seront limités à l'environnement immédiat de son site de production.

D. Oxygène singulet.

Ne subissant plus de contraintes de spin, 'possède une réactivité comparable à celle de OH* grâce à une orbi­

tale vide qui lui confère un caractère électrophile très prononcé. Mais il est plus discriminant que OH* dans ses réactions et est donc davantage susceptible de causer des dommages à des cibles critiques ( 6 , 8 ).

E. Complexes oxygénés d'ions métalliques.

Les formes oxygénées de sels métalliques semblent être impliquées dans la toxicité de l'oxygène. Les ions ferryl

(Fe O ou Fe OH*"^) et Cupryl (Cu o'*’ ou Cu OH*'*’) sont des

oxydants puissants (2, 6 ). Ils peuvent être considérés comme des complexes OH* - ions métalliques leur conférant ainsi la réactivité de OH* mais avec un plus grand degré de sélectivi­

té ( 6 ). Les ions perferryl ( Fe* "**-02 * ) et percupryl (Cu *''’-02 *)

sont nettement moins réactifs.

I. Production des métabolites toxiques de l'oxygène.

I. 1. Voies physiologiques de la production des espèces toxiques

dérivées de O 2 .

A. Production intracellulaire.

La majeure partie de l'oxygène consommé par les cellules aérobies est réduit complètement en eau sous l'action de la cytochrome oxydase sans libérer d'intermédiaires. Parallèle­

ment, une fraction faible, mais non négligeable, de l'oxygène moléculaire est utilisée dans des réactions métaboliques oxy­

datives conduisant à la libération de sous-produits toxiques de O 2 . La réduction uni- ou bivalente de O 2 est la conséquence de processus oxydatifs ayant leur siège dans certains compar­

timents subcellulaires particuliers.

1 ) Oxygène singulet.

Le mécanisme le plus probable et le moins controversé en ce qui concerne la production de ^ O 2 sont les réactions de photosensibilisation. L'illumination de certains pigments : chlorophylles, rétinal, flavines, porphyrines, en présence d'oxygène provoque l'excitation de cet oxygène. Des chercheurs ont montré que in vivo, les chloroplastes illuminés, le cris­

tallin et la rétine de l'oeil de mammifères produisent ^Oj( 1 , 6 ).

D'autres réactions ont été proposées comme génératrices d'oxygène singulet

a) La dégradation d'hydroperoxydes de lipides (LOOH) au cours de la propagation de la peroxydation pour­

rait générer *-02 par un mécanisme qui n'est pas cla­

rifié (9 - 12) mais où la réaction : 2 LOO* - LOOL +

pourrait intervenir ( 6 ).

b) La réaction catalysée par la myéloperoxydase ( 6 , 13) : H, + Cl“ ^ HjO + 0 Cl“

+ 0C1“-, HjjO + Cl" +

c) La dismutation spontanée de ' (14 - 17) 20 a' + 2 H"^ ^ O, + ^ Oj

d) La réaction de Haber-Weiss catalysée par les ions ferriques ( 8 , 18)

Fe* +

Oj • + H, O, ——k "O, + OH • + OH

Bien que les 2 dernières réactions soient thermodynami­

quement possibles (19) leur contribution à la production de

^Oj in vivo est très controversée (1, 6 ). Les quantités for­

mées par ces voies semblent très faibles et donc difficiles à détecter.

Les preuves de la production de ^Oj in vivo ne sont pas très convaincantes. Ceci résulte du manque de spécificité des méthodes de détection : chémiluminescence (14, 17), effets pro­

tecteurs de pièges à ^0^ ( 8 , 11, 12, 15, 18). La détermination chromatographique du produit de réaction du piège avec le pré­

sumé ^Oj est plus fiable (9, 10, 16) mais n'est pas entièrement spécifique (13).

En outre, ^en solution aqueuse retourne rapidement à son état fondamental et 0 , ' est un destructeur de ^ 0 ^ par transfert électronique ( 1 , 20 ).

Comme les réactions productrices de ^ les plus proba­

bles surviennent à un stade plus tardif du processus d'acti­

vation séquentielle de l'oxygène, ^ 0 ^ n'est vraisemblablement

pas l'espèce majeure responsable de la toxicité de dans les

systèmes biologiques ( 6 ).

2) Radical superoxyde.

De nombreuses réactions spontanées d'autoxydation sont susceptibles de produire O 2 ’. L'autoxydation des hydroquinonss, leucoflavines, catécholamines, thiols, tétrahydroptérines pro­

duit O 2 *. La réoxydation par l'oxygène de ferroprotéines non héminiques (ferrédoxines), de flavines, de certaines flavopro- téines réduites génère également Oj". L'action catalytique de certaines métallo-flavoenzymes, xanthine oxydase, aldéhyde oxydase, dihydro-orotate déshydrogénase entraîne aussi la réduction univalente de O 2 (3, 21).

L'oxyhémoglobine (Hb Oj) libère lentement O 2 * lors de sa conversion en méthémoglobine. En réalité, Hb Oj serait davan­

tage un composé superoxoferrique [Hb (Fe ^- 02 ')] qu'un compo- sé oxo-ferreux [Hb (Fe - 0^ )]. La simple perte de * par dissociation est peu probable en raison de forces électrosta­

tiques. Mais Oj’ pourrait être déplacé par des nucléophiles anioniques tels que Cl~ très abondant dans les érythrocytes

( 22 ) .

En solution aqueuse Fe s'autoxyde lentement en rédui­

sant Oj par un chemin univalent (23) :

2 J. 2 J. 3 J. —

Fe + Ojj Fe ^ - q Fe ^ + 0^ ’

Les chloroplastes illuminés produisent Oj* (24-26) probablement sur la face réduite du système de transport élec­

tronique (24). Le site de la réduction univalente de O 2 serait un accepteur d'électrons primaire du photosystème I. La vitesse de formation de O 2 * dans des chloroplastes illuminés est éva­

luée à 15 umoles O 2 '/mg chlorophylle x heure (27).

Des mitochondries d'origine animale ou végétale ou des

particules submitochordriales sont des sites de production de

O 2 * .

La vitesse de production de O 2 ' par des mitochondries isolées dépend de leur état métabolique. Dans les conditions physiologiques, la production de O 2 ‘ est maximale dans l'état 4 caractérisé par un haut degré de réduction des transporteurs d'électrons (28 - 30). Dans cet état 4, la vitesse de la res­

piration est contrainte par la faible disponibilité en ADP.

La production de O 2 ’ par les mitochondries est tribu­

taire d'un substrat pouvant être respiré : succinate ou un substrat dont l'oxydation est couplée à la réduction du NAD

(31, 32). La formation de O 2 ' dans des mitochondries isolées est accrue en présence d'antimycine A, inhibiteur du complexe bci. Dans ces conditions particulières, la majeure partie de

l'oxygène consommé est réduite en O 2 * (28, 29). La production de O 2 " est inhibée par la roténone si l'oxydation du substrat est couplée à la réduction du NAD (28, 33) (schéma 1 ci-après).

Ces observations ainsi que celles qui suivent ont permis de mettre en évidence 2 sites distincts de production de O 2 * au niveau de la chaîne respiratoire de particules submito­

chondriales .

a) La région ubiquinone-cytochrome b de la chaîne respiratoire est apparue comme un site important de réduction univalente de Oj (28, 30). En modulant le contenu en ubiquinone réductible de la membrane des particules submitochondriales (par extraction et ré­

incorporation) , Boveris et al. ont montré que la pro­

duction de HjOj était directement proportionnelle à la quantité d'ubiquinone réductible de la membrane

(34). Des résultats similaires ont été obtenus en augmentant la concentration en ubiquinone comme accepteur d'électrons du complexe I isolé (35).

Les fonctions NADH - ubiquinone réductase et ubi- quinol-cytochrome c réductase produisent Oj * et H

02 . Le site de production des métabolites toxiques de Oj serait donc localisé au niveau de 1 'ubiquinone.

L'autoxydation de l'ubiquinol et de 1'ubisemiquinone

(radical relativement stable dans les membranes) semblent être les sources de O 2 ‘ (34 - 37).

L'autoxydation du cytochrome b,** a été également proposée comme source de Oj' car ce cytodir orne est très fortement réduit dans des mitochondries couplées en pré­

sence d'ATP (30, 38). Mais cette source semble moins im­

portante que les formes réduites de l’ubiquinone ( 20 ).

b) Des chercheurs ont montré que le complexe I est également une source de Oj‘ si le substrat utilise

le NAD comme cofacteur accepteur de H. La réduction univalente de O 2 se situerait, dans ce cas, au ni­

veau de la flavoprotéine NADH déshydrogénase(39 - 41).

La réoxydation par O 2 du NADH lié à la déshydrogénase est beaucoup plus rapide que celle du NADH libre (41).

En résumé, la production de Oj' au niveau de la mito­

chondrie se présente comme suit :

Schéma 1.

P*

b] 2 s c cyt aa

!

^ C£>\

: ;

20

I I ,

antimycine A cyanure

Les productions de Oj' aux 2 sites étant additives, les particules submitochondriales génèrent 2 à 3 nmoles

— _ 1 , _ 1

Oj’ X min X mg protéines (32, 38, 41).

Dans des conditions physiologiques, en présence d'ATP, Nohl et Hegner (38) ont évalué que, dans les mitochondries intactes, 80 % des ions superoxydes produits sont dismutés par les s peroxydes dismutases. Les 20 % restants sont détectés à l'extérieur de la mitochondrie. Il y a donc diffusion de ~ vers le cytosol.

Qz a

Qz Q 2

succinate FP -

Les microsomes sont également reconnus comme une source physiologique de O 2 . Des microsomes isolés génèrent des quan-

tités considérables de Qj' ( - 20 n moles x min x mg proteines ) (42, 43 ). Les fla.voprotéines NADPH cytochrome P«o réductase,

NADPH cytochrome c réductase et le cytochrome b, sont les sources majeures de O 2 et 82 dans ces membranes (15, 42 - 44).

Toute la panoplie de sources cellulaires de Q’ et Hj 0^

est modulée par une série de contrôles physiologiques et bio­

chimiques (apport en oxygène et en substrat, transition état 4 vers état 3 dans les mitochondries etc...). Mais l'ubiquité des superoxydes dismutases rend très difficile l'évaluation quantitative de la production naturelle de in vivo (45).

3) Peroxyde d'hydrogène.

Certains enzymes : glucose oxydase, amino-acide oxydase, glycollate et urate oxydases catalysent des réactions au cours desquelles 2 électrons sont transférés à l'oxygène avec forma­

tion de H 2 Q 2 (20, 46, 47).

Mais une des sources les plus communes de H,Ojest la dismutation de O 2 *, un processus spontané ou catalysé par des enzymes spécifiques.

2 Oj" + 2 H"*" - H 2 O 2 + O 2

Dans des particules submitochondriales ainsi que dans les chloroplastes, le rapport 02 “/H 2 O 2 produits est de 1.5 à 2.1 indiquant que O 2 ’ est pratiquement le précurseur stoechiomé­

trique de H 2 Ci mitochondriale ou chloroplastique (27, 31, 32, 34, 35, 49).

En présence de leurs substrats, mitochondries, micro­

somes, peroxysomes et enzymes cytosoliques sont des sources

de H 2 O 2 contribuant, dans le foie de rat, pour 15 %, 45 %, 35 %

et 5 % respectivement à la production totale de H 2 Q

(33).

Des mitochondries isolées dans l'état 4 produisent 0,3 à 1 n moles de Ha O 2 x min~’’x mg protéine”*’ , ce qui équivaut à environ 2 % de la consommation d'oxygène dans les conditions physiologiques (28-30, 38). Dans l'état 3 caractérisé par une respiration importante, la production de HjOaest négligea­

ble (20, 41).

L'addition de NADH et surtout de NADPH à des microsomes isolés entraîne une production de de 6 à 15 n moles x min”*

X

mg protéines ”*(33, 50). Mais il n'y a pas d'indice de la formation de HaO 2 dans le réticulum endoplasmique de cellules intactes (20 ) .

Les peroxysomes contiennent des enzymes générateurs de

^

9

. " ® amino acide oxydase, L a hydroxyacide oxydase, acyl coenzyme A oxydase, urate oxydase (20). La membrane des pero­

xysomes étant très perméable à HaOa, l'équilibre des concentra­

tions en HaOa entre les peroxysomes et le cytosol s'établit très rapidement.

4) Radical hydroxyle.

Plusieurs modes de production de radicaux hydroxyles ont été proposés. En présence d'un système générateur de radicaux superoxydes, la réaction de formation de OH* la plus générale­

ment admise in vitro est la réaction de Haber-Weiss catalysée par les ions métalliques oxydoréducteurs.

O, +

”'*' [ 1 ]

m

'^'*" + H^q - + OH” + OH* [2]

q* + HjO^ - Oj + OH + OH* [3]

La réaction [3] non catalysée est cinétiquement extrê­

mement lente (51-53). l.a catalyse de la réaction s'avère indis­

pensable. Elle est effectuée par des ions métalliques oxydoré­

ducteurs dont les plus efficaces sont Fe et Cu ^ (54 - 57).

Notons que la réaction [2] sera d'autant plus efficace que la

concentration en H, 0 ^ est élevée car O^' et sont en compé­

tition pour

(oj +

'^‘^+2 - HjOj+ (54, 58).

Si la possibilité d'une réaction de Haber-Weiss est acceptée in vitro, la formation de OH* par cette voie in vivo est fort controversée. Les divergences de résultats observées dans la littérature auraient leur origine princi­

palement dans les méthodes de mise en évidence de OH* et dans les conditions expérimentales (présence quelquefois fortuite de pièges à OH*, d'agents chélateurs ...).

Ainsi, certains auteurs (59, 60) n'ont pas détecté de production de OH* dans les fluides extracellulaires en l'absence de catalyseur exogène. Ils ont dès lors mis en doute la présence de fer catalytiquement actif in vivo et, par conséquent, l'éventualité d'une telle réaction in vivo.

Mais l'existence de catalyseurs physiologiques a été démontrée.

Présence de fer catalytiquement actif in vivo.

La catalyse de la réaction de Haber-Weiss étant indis­

pensable, cette réaction n'aura de sens dans les systèmes bio­

logiques que si des ions métalliques sont disponibles sous une forme catalytiquement active. Ceci mettrait en relief l'impor­

tance de ces ions dans la toxicité des dérivés actifs de l'oxy­

gène .

Les ions ferreux et ferriques sont en majeure partie liés à des protéines : hémoprotéines, transferrine (transporteur du fer), ferritine (protéine de stockage), lactoferrine). La

concentration en Fe et Fe libres in vivo est pratiquement nulle. Mais ces complexes fer-protéines ne catalysent pas la réaction de Haber-Weiss. Seuls, les ions Fe*"^ et Fe*"*” libres et leurs complexes où le fer n'est pas lié à des protéines sont aptes à l'effectuer (59, 61).

Il semble que de tels complexes existent dans les systè­

mes biologiques. Tout d'abord, les ions Fe*et Fe*sont con­

tinuellement en mouvement entre leurs sites de transport et de

stockage et leurs sites d'utilisation ( 1 , 61).

Dans les fluides synovial et cérébrospinal, Gutteridge et collaborateurs ont pu détecter des concentrations en fer non lié à des protéines par la capacité de la bléomycine d'induire des dégâts à 1'ADN en présence de fer catalytique- ment actif (62, 63).

Des bactéries, également, contiennent du fer libre (64, 65) et les parois de certaines d'entre elles sont capables de piéger des quantités variables d'ions métalliques divers ( 66 ).

Dans les réticulocytes, du fer catalytiquement actif a égale­

ment été détecté (67).

Dans les mitochondries, un tiers du fer (1,7 nmoles/

mg protéines) n'est lié ni à l'hème ni à des métalloprotéines.

Ce pool dont au moins la moitié est sous la forme Fe est localisée principalement dans la membrane interne et dans la matrice mitochondriale. Ce pool pourrait constituer le donneur proximal pour la synthèse de l'hème ( 68 ).

En conclusion, il semble donc bien qu'il y ait suffisam­

ment de fer disponible in vivo pour permettre la production de OH' par la réaction de Haber-Weiss.

Présence de cuivre catalytiquement actif in vivo.

95 % des ions Cu’*"*’ sont liés à la caeruloplasmine, les 5 % restants sont soit associés à la sérum albumine, soit forment des petits pools de complexes d'ions cuivriques.

Cu"*"*^ possède une grande affinité pour les molécules contenant

des groupements amino. Les concentrations intracellulaires en pro­

téines étant élevées, tout ion Cu"'”*’ libre est rapidement fixé par les protéines. Dans les systèmes biologiques, Cu"*"*^ ne jouerait donc pas un rôle important dans la formation de radicaux OH* libres (1).

Cependant, il s'est avéré que, même associé à des protéi­

nes Cu''"*’, restait encore apte à catalyser une réaction de Haber- Weiss. Dans ce cas, OH’ est formé en un site précis et n'est plus décelable en tant que radical OH’ libre dans le milieu

( 1 ) .

Agents complexants les ions ferreux et ferriques.

Dans les conditions physiologiques, le fer est extrê­

mement peu soluble; sa concentration à l'état libre ne dé­

passerait pas 10 M. L'ion ferrique tend, en effet, à former des précipités avec OH* et les phosphates inorganiques. Les agents chélateurs, en le complexant, ont pour fonction d'aug­

menter sa solubilité. In vitro, ces agents chélateurs, 1'EDTA par exemple, favorisent souvent la production de OH’ par la réaction de Haber-Weiss (12, 54, 60, 69).

Mais tous les agents chélateurs ne sont pas également efficaces. Dans l'ion ferrique libre et ses chélates, la disponibilité d'un site de coordination du fer est requise pour catalyser la réaction de Haber-Weiss. Un site de coor­

dination libre ou occupé par un ligand facilement remplaçable

(HaO) facilite la réduction de Fe par Oi (réaction [1]) mais ce n'est pas une nécessité absolue. Par contre, l'occupation de tous les sites de coordination du fer par l'agent chélateur et le déplacement de l'eau dans la première sphère de coordi­

nation empêche la liaison de Hj Oj au Fe*'*’ chélaté et donc la réaction de Haber-Weiss. Le Desféral, l'acide diéthylène triaminepentacétique, le phytate excluent l'association d'eau à Fe’"*" et empêchent de ce fait la réaction de Haber-Weiss (60, 69) .

Dans la cellule, les traces d'ions ferreux et ferriques non liés à des protéines sont probablement chélatés par des constituants cellulaires : acides organiques (citrique), phosphate, esters de phosphate, ATP, ADP, GTP, acide picoli- nique (70) ainsi que les groupements phosphates des lipides de membranes (61, 71).

Fe*'*’ chélaté par le phosphate permet la production de OH*

Dans les conditions physiologiques (pH _ 7, en présence de phos phate et d'esters de phosphate), sans addition d'agents chéla­

teurs artificiels, Flitter et al. ont mis en évidence une pro­

duction de OH* catalysée par le Fe^ endogène (moins de 5 /

M)

et non stimulable par l'EDTA. Ils suggèrent que la stimulation

de la production de OH' par addition d'EDTA observée par certains auteurs résulterait uniquement de la solubilisa­

tion de Fe*"*" exogène, ajouté à des concentrations largement supérieures aux concentrations naturelles (70).

Autres réactions productrices de OH*

Dans la réaction de Haber-Weiss, les ions superoxydes servent uniquement à réduire Fe*'*’. La production de OH' sans la participation de Oj ‘ pourrait être envisagée si Fe^'*’ peut être réduit par une autre entité physiologique.

Des réducteurs tels que NAD(P)H et GSH, quoique abondants dans la cellule, ne peuvent réduire Fe*(61, 72, 73 ). Ils con tribuent un peu à la production de OH' in vitro par un mécanis me impliquant O 2 ' issu de leur autoxydation catalysée par Fe*

(72-74).

L'ascorbate, par contre, peut remplacer O 2 ‘ dans les réactions conduisant à la formation de OH' par un mécanisme Fe’^ dépendant. L'ascorbate réduit Fe^(71; 73) :

Ascorbate + 2 Fe*"^ - 2 Fe®"*^ + dehydroascorbate et son autoxydation génère H 2 O 2 :

Ascorbate + O 2 -* dehydroascorbate + H 2 O 2

Comme l'ascorbate est abondant dans les compartiments intra- et extracellulaires, même en présence d'une source de O 2 ', Winterbourn affirme que le mécanisme ascorbate-dépendant est prédominant aux concentrations physiologiques en ascorbate

(59, 73).

Mais l'ascorbate est un antioxydant. Il réagit en effet avec H 2 O 2 , O 2 ' et OH'. Il est donc rapidement oxydé dans un système générateur de ces métabolites (61). Néanmoins, il est possible que in vivo, le mécanisme ascorbate dépendant parti­

cipe à la production physiologique de OH'.

Remarquons que, dans tous les mécanismes de formation

de OH', c'est H 2 O 2 plutôt que O 2 ’ qui est le plus certainement

impliqué.

B. Production extracellulaire de métabolites de l'oxygène : la phagocytose.

La tâche des leucocytes est de trouver, tuer et éli­

miner le matériel étranger. Le microorganisme envahisseur, rendu plus perceptible au phagocyte par la fixation préa­

lable de facteurs du plasma (opsonines), peut alors se lier à la membrane du phagocyte et être ingéré par phagocytose

(13, 75).

Au contact de particules étrangères ou de complexes antigène-anticorps, la respiration des phagocytes s'accroît par un facteur 10 à 20, Ce phénomène a été observé tant chez des neutrophiles que chez les monocytes et macrophages. Cette consommation d'oxygène supplémentaire est insensible au cyanure et s'accompagne de la production de HjOa. Elle résulte de l'ac­

tivation d'une NADPH oxydase membranaire au moment de la liai­

son d'une bactérie au phagocyte. Cet enzyme catalyse la forma­

tion de Oa' par la réaction :

NADPH + 2 Oa - NADP"'" + 2 0,” + H"''

La production de Qa ’ atteindrait, chez les neutrophiles, 120 n moles Oa‘/min x 10^ cellules. Les radicaux Oj’ sont à l'origine de HaOa par dismutation et sont libérés dans le phagosome.

Chez certains leucocytes (neutrophiles et macrophages) des chercheurs ont mis en évidence une activité NADH oxydase productrice de Ha0a(13) :

NADH + Oa + H"*" - HaO^ + NAD"*"

Mais le de cet enzyme est très grand.

L'interaction de Oa’ et de Hj O j catalysée par des sels de fer entraîne la formation de OH* très réactif.

La phagocytose s'accompagne également de la migration

des lysosomes des neutrophiles vers l'endroit de liaison du

microorganisme, leur fusion avec la membrane plasmique et

le déversement de leur contenu dans le phagosome. En plus d'enzymes protéolytiques etc^ les lysosomes contiennent de la myéloperoxydase, un enzyme capable d'activer HjO 2

en présence d'ions Cl~ avec production d'hypochlorite O Cl” : Ha O 2 + Cl" - O Cl" + HaO

O Cl très actif provoque des chlorinations de macromolécules suivies de protéolyse, décarboxylation, etc...

Une autre espèce toxique, est probablement formée sous l'action de la myéloperoxydase :

O Cl" + HaOa - + Cl” + HaO

Tous ces métabolites toxiques de l'oxygène collaborent à l'action bactéricide des phagocytes. Leur importance appa­

raît clairement lors de l'étude des conséquences d'une défi­

cience dans leur production. Dans le cas de maladie granulo­

mateuse chronique (chronic granulomatous diseasej, l'ingestion des microorganismes par phagocytose est normale mais la NADPH oxydase des phagocytes n'est pas activée ou est déficiente.

Les microorganismes sont donc ingérés mais ne sont pas tués.

L'existence d'une multiplicité de réactions bactéricides serait avantageuse pour permettre l'élimination d'une grande variété de microorganismes différents dont la sensibilité à un dérivé toxique de l'oxygène particulier peut être très variable.

L'ingestion de matière particulaire par les phagocytes initie une production très rapide de métabolites bactéricides.

La conversion du neutrophile d'un état de repos à un état com­

plètement stimulé prend 20 à 70 secondes. En combinaison avec les enzymes lysosomiaux, les dérivés toxiques de Oa constituent une défense puissante contre les microorganismes envahisseurs

(13, 75).

I. 2. Production de métabolites toxiques de induite par des composés rédox.

La production intracellulaire de O^' et HjO^ peut être accrue artificiellement par l'utilisation de composés rédox.

Leurs cycles répétés de réduction et d'oxydation constituent des sources continues de métabolites toxiques de l'oxygène.

Après diffusion dans la cellule, ces composés rédox su­

bissent une réduction catalysée par des enzymes membranaires ou cytosoliques (schéma 2). La (NAD(P)H - quinone) oxydoréduc- tase (76), la NADPH cytochrome P 450 réductase, la NADH ubiquino- ne oxydoréductase catalysent des processus à 1 ou à 2 électrons.

Le composé rédox est alors spontanément réoxydé par l'oxy­

gène moléculaire dans la cellule. Le produit de la réaction- est Oj ' ou selon que le processus implique 1 ou 2 élec­

trons .

A AH AH + Oj - A + Oj ” +

'*’

A AH J AH + Oj - A + HjOj

Le nombre d'électrons transférés à l'oxygène par le composé rédox réduit dépend de la nature de ce dernier et de l'enzyme qui catalyse sa réduction (77, 78).

Les électrons destinés à la réduction des composés rédox sont détournés de leur chemin normal conduisant à la cytochrome oxydase. Néanmoins, ils réduisent l'oxygène mais par une voie qui n'est plus sensible aux inhibiteurs de la cytochrome oxydase (cyanure). Les composés rédox aug­

mentent donc la respiration cyanure insensible de la cellule.

La mesure de la stimulation de la respiration cyanure insen­

sible par les composés rédox est une indication de leur ca­

pacité à capter les électrons (78, 79).

Cette aptitude des composés rédox à accroître la production de métabolites toxiques de l'oxygène apparaît tant chez les bactéries et les cellules animales (80) que chez les chloroplastes (26).

Le fonctionnement optimal de ce cycle d'oxydo-réduction requiert O , et un apport abondant d'électrons dérivés de sub­

strats métabolisables.

En effet, puisque la production de O et de indui­

te par les composés rédox dépend de cycles de réduction par des donneurs d'électrons intracellulaires suivis de réoxyda­

tions par O J , une source de pouvoir réducteur est requise pour la réduction de ces composés. Diverses sources de carbo­

ne peuvent jouer ce rôle mais le glucose est toujours la meilleure, les enzymes de son catabolisme étant constitu­

tifs. Beaucoup d'autres sources d'électrons ne sont effi­

caces que si les enzymes nécessaires à leur catabolisme ont été induits par une croissance préalable de la cellule aux dépens de cette source de carbone (80, 81).

L'état physiologique des cellules est également un fac­

teur qui contrôle l'importance du shunt électronique. Les cellules en phase exponentielle de croissance sont métabo- liquement plus actives que les cellules en phase stationnai­

re et réduisent donc les composés rédox plus efficacement (80).

La production des dérivés toxiques de l'oxygène par le cycle d'oxydoréduction de certains composés est généralement intracellulaire si la réoxydation est suffisamment rapide pour survenir avant que la forme réduite du composé ne s'é­

chappe vers l'extérieur. Une fraction du composé rédox réduit peut néanmoins avoir le temps de diffuser hors de la cellule.

Son autoxydation avec production de Oj ' et de O, se déroule,

dès lors, dans le fluide externe (81) et schéma 2 .

SHEMA 2

--->

> «t

«3

a

«■«t

Les composés rédox peuvent également induire la production de OH'. Plusieurs mécanismes ont été proposés sur la base de la

présence d'effets inhibiteurs des enzymes protecteurs et des pièges à OH *. La réaction de Haber-Weiss catalysée par des ions métalliques est, ici encore, une source possible de OH*; la réac­

tion directe de la forme réduite du composé avec HjO* en est une autre (réaction [4]). Winterbourn (82) a mis en évidence un tel mode de production de OH* en utilisant le paraquat (PQ) comme composé rédox.

[4]

Cette réaction ne nécessite pas de catalyseur métallique et est en compétition avec 1 ' autoxydation du PQ'*’.

La réoxydation du PQ**" se fera par l'une ou l'autre voie en fonction des concentrations relatives en HjOj et O,. La réaction [4] a lieu plus probablement dans des conditions d'anoxie partielle.

Dans des conditions où l'oxygène est limitant, le PQ^

peut réduire Fe . Fe catalyse ensuite la décomposition de

HjOj menant à la production de OH* (réaction [2]). Dans ces

conditions, Oj* ne participe plus directement au processus (83) .

A cause de son extrême réactivité, la production de OH' libre in vivo est mise en doute par certains chercheurs qui lui préfèrent le concept de crypto OH' ( 6 ). C'est une espèce qui ressemble à OH' mais qui est plus discriminante dans ses réactions, le crypto OH' serait formé par le mécanisme suivant :

,--OH

R. + HjOa - CR''” : ] ^ R + OH' + OH"

' ' - -OH

^ cible y

R +

" + produits

où R. = composé rédox ayant subi une réduction à 1 électron : PQ'*’, semiquinone (84)

Si la réaction de R' avec Oj est beaucoup plus rapide que sa réaction avec H 2 O 2 , la formation de crypto OH' n'au­

ra lieu que dans des conditions où l'oxygène est limitant ( H 2 O 2 / O 2 élevé ) .

Les caractéristiques du crypto OH' dépendent fortement de son environnement qui détermine le mécanisme de sa forma­

tion et de son évolution subséquente ( 6 ).

II. Dommages biochimiques et physiologiques causés par les dérivés toxiques de l'oxygène.

Les dérivés actifs de l'oxygène générés dans les compar­

timents intra- ou extracellulaires sont capables de tuer des bactéries, des fibroblastes, des hépatocytes, de lyser des cellules tumorales, des érythrocytes, d'inactiver des virus.

Ils sont également responsables de l'inactivation d'en­

zymes, de la dégradation de 1'ADN et des polysaccharides, de la peroxydation des lipides et de dommages aux membranes.

De plus, les radicaux libres de l'oxygène ont été im­

pliqués comme agents étiologiques de plusieurs dommages : vieillissement, mutagénèse, carcinogénèse, arthrite ...

Si les chercheurs sont en général d'accord quant aux ci­

bles moléculaires des dérivés actifs de l'oxigène, il est, par contre, extrêmement difficile d'identifier précisément le métabolite toxique qui a touché la cible. En effet, quel­

le que soit la source, plusieurs de ces métabolites sont, en général, présents simultanément et sont en interaction.

De plus, les pièges de ces substances toxiques utilisés pour indiquer leur production, ne sont, le plus souvent, pas très spécifiques. Il n'est donc pas surprenant que, pour un même dégât, les opinions divergent au sujet du métabolite respon­

sable du dommage. Des différences dans les conditions expé­

rimentales, les méthodes de dosage et de protection utilisées sont certainement la cause des divergences observées dans la littérature.

Etant donné la très grande variété de dégâts faisant intervenir des dérivés actifs de l'oxygène, nous nous limi­

terons à quelques exemples en mentionnant, si possible, les

espèces réactives supposées responsables du processus délétère.

1 . Mutagénèse.

Des mutations induites par les dérivés actifs de l'oxy­

gène peuvent être mises en évidence le plus aisément avec des microorganismes unicellulaires. Ainsi, l'oxygène hyperbarique ou les cycles d'oxydoréduction de composés rédox endommagent E. coli. Une fraction significative de ces bactéries ainsi traitées ne forment plus que des microcolonies lors d'une croissance sur milieu gélosé (80, 85, 86 ). La mortalité est également plus élevée lors d'une croissance sur milieu mini­

mum indiquant l'apparition induite d'auxotrophies nutrition­

nelles (80, 87).

2. Radicaux de l'oxygène et inflammation.

Les granulocytes (leucocytes polynucléaires) ont la propriété de s'agglomérer aux sites d'infection ou de bles­

sure. Leur activation entraîne la production de Oa* dont une proportion importante s'échappe des granulocytes et peut en­

dommager des tissus avoisinants ( 88 ). La destruction des tissus normaux aux sites d'inflammation est donc une consé­

quence malheureuse des réactions inflammatoires (89).

In vitro, Mc Cord a montré que des dérivés actifs de

l'oxygène, produits par la réaction catalysée par la xanthine oxydase, dépoly mérisent l'acide hyaluronique, un constituant majeur du fluide synovial (23, 88 ). Cette dégradation de la synovie se caractérise par une diminution de sa viscosité et de ses propriétés lubrifiantes.

Le fluide synovial contient très peu de catalase et une quantité insuffisante de SOD pour le protéger totalement sur­

tout si la production de dérivés actifs de l'oxygène est éle-

vee.

Une agression oxydative importante est observable in vivo dans les cas d'arthrite rhumatoïde. L'agression résulte d'un large influx de leucocytes polynucléaires dans le flui­

de synovial au niveau de l'articulation enflammée. La produc­

tion importante de O 2 * * et de 0 ^ qui en résulte, la présence d'ions ferriques catalytiquement actifs dans le fluide syno­

vial et l'absence de protection efficace, entraînent la for­

mation de OH' responsable de la dépolymérisation de l'acide hyaluronique et donc de la détérioration du fluide synovial

( 88 ) .

3. Dégradation de l'ADN.

Les dérivés actifs de l'oxygène tels que OH' ou un autre oxydant aussi puissant sont capables de provoquer des coupu­

res de brins d'ADN (90). La production de OH* peut se faire au niveau meme de l'ADN car l'ADN peut lier Fe stimulant * + ainsi la formation de OH * à partir de HjOj . Les dégâts qui en résultent sont localisés au site de production de OH*.

Les entités réactives auraient pour cibles les groupes déso- xyriboses dont la dégradation libère des fonctions aldéhydes

(par exemple : le malonaldéhyde) (91, 92).

Les effets délétères des intermédiaires toxiques de l'o­

xygène au niveau de l'ADN in vivo sont bien illustrés par le mode d'action de la bléomycine et des drogues quinoïdes anti­

tumorales .

Les bléomycines sont des glycopeptides ayant des proprié­

tés antibactériennes, antivirales et antitumorales. ces sub­

stances ont une grande affinité pour l'ADN. Elles s'insèrent entre les paires de bases de l'ADN gênant ainsi la réplica­

tion et la transcription. Mais cette propriété seule n'est

pas responsable de toute son action ( 93, 94).

La bléomycine induit des dégâts à 1'ADN par un pro- cessus Fe - et O * + 2 - dépendant. La bléomycine préalable- ment associée à 1'ADN lie Fe . L'autoxydation de cet Fe chélaté produit des espèces ayant la réactivité de OH* pro­

voquant des dommages à leurs sites de production, largement supérieurs aux effets de Fe seul. L'espèce oxydant le ché-

* +

late Fe - bléomycine pourrait être O 2 lui-même ou un de ses dérivés.

ADN + BLM ADN . BLM jr

ADN.BLM.Fe (II) ,1

.OH + OH H 2 O 2

O 2

'--- H 2 O 2 N

'--- 02 ’+ 2H''' '--- O 2

ADN*.BLM.Fe (III)

Les dégâts comportent la libération des pyrimidines, la coupure des brins d'ADN et l'oxydation des entités désoxyri- boses (93, 95-97).

Les effets antitumoraux et cytotoxiques des drogues qui- noïdes (adriamycine, daunorubicine) seraient également causés par des dérivés actifs de l'oxygène générés par un cycle d'o- xydoréduction.

Comme les bléomycines, ces substances s'intercalent entre les bases de l'ADN. Mais les dégâts qu'elles y induisent ne peuvent s'expliquer uniquement par une inhibition de la réplication de l'ADN et/ou de la synthèse des ARN.

Leur action requiert une activation microsomale condui­

sant à la formation d'un radical seràiquinone sensible à l'o­

xygène. Bach ur et al. proposent le mécanisme suivant ^98) :

NADPH Fl P (OX)

ADN

^ ARN

NADP' ; c Fl p.(réd)3 (

O- O

où Fl P = flavoprotéine. O _O

Le radical semiquinone serait suffisamment stable pour migrer vers le noyau^s'intercaler entre les bases de 1'ADN et y être réoxydé par O 2 . La production de métabolites de O 2 serait lo­

calisée précisément au niveau de l'ADN (98, 99).

4. Inactivation d'enzymes.

Les mécanismes d'inactivation d'enzymes par les métabo­

lites toxiques de l'oxygène peuvent être très différents.

L'enzyme peut être détruit par une oxydation non spécifique de la molécule ou être simplement inactivé par l'oxydation de fonctions réactives particulières.

Le premier mécanisme peut être illustré par l'inactiva­

tion de l'acétylcholinestérase pure ou liée à un système mem­

branaire sous l'action du système ascorbate / Cu’*”'’ / O 2 (100) L'absence de protection par les pièges à OH’ mais l'efficaci­

té des complexants du Cu"*”^ à protéger l'enzyme suggèrent la participation de OH* non pas libre mais site-spécifique.

Cu'*^'*’ associé à l'enzyme en raison de son affinité pour les groupements amino serait réduit par 1'ascorbate. D'autre part, 1'ascorbate est une source de HaO 2 par autoxydation. La réaction de Ha Oj avec Cu'*’, resté lié à l'enzyme, génère OH’

au niveau de la protéine. Ces OH’ réagissent avec la premiè­

re cible disponible c'est-à-dire avec la protéine support, à leur site de formation.

De plus, ces dommages biologiques site-spécifiques sont

également du type répétitif car le Cu’*”'’ recyclé est prêt

pour catalyser une nouvelle production de OH’. Le même site

subit donc des coups multiples et récurrents conduisant à des dommages irréversibles.

Mais une inactivation enzymatique peut également ré­

sulter d'une réaction plus discriminante comme l'oxyda­

tion de groupes fonctionnels - SH.

Ce mode d'action des dérivés toxiques de l'oxygène est observé par exemple lors du traitement des hépatocytes avec la ménadione ( 101 ).

Le cycle d'oxydo-réduction de la ménadione chez les hé­

patocytes entraîne une altération de l'homéostasie intracel­

lulaire du Ca’’”*’. Cette altération résulte, entre autres, de l'inhibition de l'efflux de Ca"*”^ hors de la cellule, un pro­

cessus catalysé par une Ca'*’'*’-ATP ase membranaire. L'inactiva­

tion de l'enzyme suite au traitement à la ménadione est la conséquence de l'oxydation d'une fonction - SH critique du site catalytique. L'activité peut être restaurée par l'action du dithiothréitol ou du GSH. L'inactivation de l'enzyme ne résulte donc pas d'une oxydation non spécifique mais unique­

ment de l'oxydation d'une fonction -SH.

5. Peroxydation des lipides.

La peroxydation des lipides est Une forme de dommages oxydatifs largement étudiée dans les membranes biologiques.

Les lipides insaturés et particulièrement les acides lino- lénique et arachidonique sont des composés facilement oxy­

dables .

Dans un système membranaire, l'étendue possible des peroxydations et leur mécanisme dépendent, comme l'ont montré Girotti et Thomas (102), de la nature des acides gras insaturés, de l'état physique des lipides de la mem­

brane ainsi que de la présence d'autres composants membra­

naires .

La peroxydation des lipides est un processus complexe, radicalaire, au cours duquel les acides gras insaturés sont dé­

gradés en une variété de produits. Quoique les détails chimiques de la réaction en chaîne ne soient pas encore bien compris, le mécanisme de la réaction comprend 3 étapes :

1 ) une étape d'initiation au cours de laquelle un radical organique est produit par capture d'un H. (étape 1 du schéma 3)

2) une phase de propagation rapide, autocatalytique. Le

radical formé durant l'initiation tend à se stabiliser par réarrangements moléculaires pour former un diène conjugué

(étape 2 ). Ce nouveau radical réagit ensuite rapidement avec en produisant un radical hydroperoxy (étape 3 ).

Ce dernier, en captant un H d'une molécule de lipide intacte conduit à la formation d'un hydropéroxyde de lipide et 'un nouveau radical réamorçant la chaîne (étape 4 ). Les ra­

dicaux peroxy ( LO 2 *) et les peroxydes de lipides (L 02 H) sont susceptibles d'être dégradés surtout en présence d'ions métalliques pour donner un mélange complexe de produits réactionnels. Des intermédiaires radicalaires sont également formés lors de la réaction des lipopero- xydes avec lésions métalliques. Ces radicaux participent également à la propagation de la peroxydation par capture de H (12).

Exemples : Fe*'*’ + LOOH - RO’ (radical alkoxy très réactif) Fe *'*’ + LOOH - RO 2 '(radical peroxy)

3) étape de terminaison lente.

Initiation

Propagation

OOM

LC. L 4 H produits de dégradation

Terminaison L' ^ LO^’ ---produits non radicalaires

-h LCC’—^ LOCH + L./^nt:Cx »J]

Initiation de la peroxydation des lipides.

Les mécanismes proposés pour cette étape sont très nom­

breux. O 2 , ^ Oj , O 2 ' , OH' et Ha O 2 ont tous été proposés comme agents déterminants dans la peroxydation de lipides.

Un mécanisme d'initiation souvent proposé est l'attaque des acides gras par OH' (10, 12, 54, 102-106). Ce radical étant très électrophile tous les H sont susceptibles d'être captés :

LH + OH' - L' + HaO

Mais, étant donné son temps de vie très court, OH* libre atteint rarement les membranes. Girotti et Thomas proposent plutôt une peroxydation de lipides induite par des espèces très réactives (OH*) générées par une réaction de Haber-Weiss au niveau de Fe directement lié à la membrane même (102, 107) .

De nombreux auteurs affirment que O’ ne réagit pas avec les lipides. Par contre, Bielski et collaborateurs (4) ont montré que l'acide conjugué H O ^* pouvait initier la peroxy­

dation des lipides polyinsaturés LH + H O *

- L* + H,0,

Mais à la différence de OH *, seuls les H doublement ally- ligues (\ /\ / ) (les H les plus réactifs) peuvent être arrachés par HO^*. Etant plus abondant à la surface membranaire, HO^ * pourrait diffuser dans le domaine lipidique et induire des réactions d'oxydation en chaîne.

Pour d'autres auteurs, la peroxydation de lipides O^ * - et Fe ^ - dépendante serait amorcée par l'action de l'ion perferryl (Fe ~ ) plutôt que OH*. Cet ion perferryl ré­

sulterait de l'interaction de 0 ^ avec Fe*( 11 ; 12 , 108).

Pourtant, cet ion est connu comme étant peu réactif (109).

En l'absence de sels de fer, il est apparu que la pero­

xydation de lipides pouvait être réalisée par un autre méca­

nisme où l'agent actif est O^ * réagissant avec des hydrope­

roxydes de lipides préformés :

O 2 * + LOOH -. X* où X * est un radical de nature X * + LH - XH + L* inconnue

Ces réactions sont plus lentes que l'oxydation catalysée par Fe*^ mais elles peuvent être observées dans des systèmes où la catalyse des réactions par Fe*est impossible. Cette peroxydation est autocatalytique et requiert des hydropero­

xydes de lipides préformés. La vitesse d'oxydation initiale

des lipides est alors proportionnelle au contenu en LOOH

initial, présents en tant qu'impuretés (110 - 112 ).

Il est possible que tous les agents actifs proposés soient impliqués dans la peroxydation des lipides. Mais les détails cinétiques et chimiques de la réaction varient avec le système biologique. La formation d'hydroperoxydes de lipides ne dépendra pas uniquement de la présence d'une seule espèce oxydante mais plutôt de toutes les espèces en proportions variables dans les différents systèmes ( 20 ).

Conséquences de la peroxydation des lipides.

Des altérations des propriétés physiques des phospho­

lipides de membranes suite à une peroxydation entraînent une augmentation de la rigidité de la membrane et de la charge négative de surface (apparition de groupements car- boxyles à la surface). Un accroissement de la charge néga­

tive de surface influence la conductivité intrinsèque de la bicouche, l'adsorption des protéines chargées, altère la perméabilité ionique et la stabilité électrique de la membrane. Un changement de la viscosité peut altérer égale­

ment l'activité d'enzymes intégrées.

Les produits de dégradation des peroxydes peuvent être hautement toxiques. Ainsi, des aldéhydes libérés peuvent ponter des protéines.

Ces altérations physico-chimiques ont des conséquences physiologiques graves telles que le gonflement des mitochon­

dries, l'hémolyse, l'inhibition de la respiration. L'augmen­

tation de la perméabilité des membranes mitochondriales à H"*”

découple les phosphorylations oxydatives de la respiration.

L'accumulation active de Ca’*"*’ dans la mitochondrie est éga­

lement perturbée par l'accroissement de la perméabilité des

membranes -. ( 20 ) .