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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Sels, A. (1960). Contribution à l'étude du métabolisme d'induction des hémoprotéines chez Saccharomyces cerevisiae (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
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de bruxelles
FACULTE DES SCIENCES
Servie* de Chimie biologique
CONTRIBUTION
A L’ETUDE
DU METABOLISME
D’INDUCTION DES
HEMOPROTEINES
■lEZ SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
Mémoire présenté pour l’obtention
du grade de
Docteur en Sciences Chimiques
Byluracile-5*-phosphate et celui de l'acide 5-méthyluridyli- que en utilisant de l'uracile-2-^^C,du
3w3-D-arabinofurano-TA. TA '
FACULTE DES SCIENCES
Sarvic* da Chlmia blolofique
CONTRIBUTION
A L’ETUDE
DU METABOLISME
D’INDUCTION DES
HEMOPROTEINES
CHEZ SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
Mémoire présenté pour l’obtention
du grade de
Docteur en Sciences Chimiques
André SELS
Nous tenons avant tout à exprimer notre profonde gratitude à Monsieur le Professeur Chantrenne.
Soucieux de notre formation, que nous lui devons
entièrement, il nous a assuré en outre l’entière liberté et les moyens de nous consacrer à ce travail, tout en nous faisant bénéficier cons tamment de son expérience personnelle et de ses précieux conseils.
Nous sommes très reconnaissants à Monsieur le
Professeur Brachet de nous avoir permis de faire usage des ressources de son laboratoire, dans lequel la majeure partie de nos recherches ont été poursuivies.
Nos remerciements les plus vifs s'adressent à nos camarades du service de biochimie qui n'ont cessé de nous témoigner toute leur sympathie.
ABREVIATIONS ATP CoA CTC Cyt.Pe'*’'*’ DPN DNP PAD PI*N Plav.P GSH LKGI2 MeB MIA PPC TPN YP YPA Acide adénosine-triphosphorique Coenzyme A
Cycle des acides tricarboxyliques (Cycle de Krebs) Cytochrome réduit,
Cytochrome oxydé
Diphosphopyridine nucléotide (Coenzyme I » Col) Dinitrophénol
Plavine adénine dinucléotide Phosphate de Riboflavine Plavoprotéine
Glutathion réduit
Levure Saccharomyces cerevisiae normale Bleu de Méthylène
Acide monoiodoacétique
Cycle des Pentoses Phosphates
PLAN GENERAL DU MEMOIRE
RESUME.
A. INTRODUCTION
Page A.I. Origine du travail... 1 A.2. Le phénomène d'induction enzymatique ... 1 A.3. Caractéristiques générales de l'adaptation
respiratoire chez la levure... 4 A.4. Potentialité génétique de la souche cellulaire.
La mutation "petite colonie" ... 7 A.5. Enzymes aérobies... 9 A.6. Localisation de la déficience respiratoire dans
le processus de biosynthèse des hémoprotéines. . 12 A.7. Evolution du contenu hémoprotéique durant le
cycle de croissance aérobie... 13 A.8. Importance de la nature du substrat carboné. . . 15 A.9. Energétique de l'adaptation respiratoire.
Etape critique... 16 A.10. Caractéristiques de la fermentation et évolution
de celle-ci pendant l'adaptation ... 17 A. 11. Spécificité de l'induction par l'oxygène .... 18
1ère PARTIE (+)
1.1. Techniques générales ... 22 1.2. Mesure des activités enzymatiques... 25 1.3. Facteurs qui modifient l'adaptation respiratoire 33
Ilième PARTIE (+)
II. ETAPES DE LA BIOSYNTHESE DES HEMOPROTEINES
II.1. Introduction
, Page Partie expérimentale
11.2. Etude cinétique de la biosynthèse induite des
enzymes hématiniques ... 53
11.3. Adaptation en croissance... ^3
11.4. Action du cytochrome c exogène... 65
11.5. Action de la protoporphyrine... 71
11.6. Séquence des biosynthèses chez la levure normale... 74
Illlème PARTIE (+) III. REGULATION DE LA BIOSYNTHESE DES PEROXYDASES 111.1. Nature de l'inducteur primaire in vivo .... 78
111.2. Effets de l'irradiation par les rayons X . . . 79
111.3. Systèmes enzymatiques générateurs des hydro peroxydes intracellulaires ... 88
111.4. Perméabilité de la cellule intacte au substrat exogène... 93
111.5. Conditions qui déplacent l'équilibre de , biosynthèse de la catalase... 98
ACTION DES DONNEURS D'HYDROGENE 111.6. Introduction Propriétés enzymatiques de la catalase .... 102
111.7. Action de l'éthanol sur la biosynthèse des peroxydases... 109
111.8. Altérations du métabolisme induites par l'acide formique... 120
REMARQUES GENERALES ... 146
CONCLUSIONS GENERALES ... 150
BIBLIOGRAPHIE ... 154
RESUME
L'étude de l'adaptation à l'oxygène d'un mutant à déficience respiratoire de la levure nous a permis de caractériser plus spécifiquement le déterminisme de la biosynthèse induite des enzymes peroxydasiques, c'est-à-dire la catalase et la cytochrome c peroxydase.
L'analyse cinétique d'une séquence de réactions nous a conduit à préciser d'abord les variables qui peuvent modifier l'amorce des biosynthèses; l'état physiologique de la cellule apparaît ainsi comme \ine composante très importante de l'induction. (1ère Partie)
L'analyse comparée des profils d'induction (Ilième Par tie) a montré que la synthèse du cytochrome c commence dès l'introduction de l'oxygène; simultanément, l'existence d'une latence importante pour l'induction de la cytochrome c peroxydase a permis d'exclure iin rôle initiateur de cet enzyme pour la biosynthèse d'une chaîne d'inductions peroxydasique.
La biosynthèse de la catalase, induite sans retard, se poursuit à vitesse constante pendant les premières heures d'aération; elle traduit un métabolisme d'induction particulier pour cette hémopro téine.
rendement de la biosynthèse de la cytochrome c peroxydase et l'insensi bilité de l'induction de la catalase dans ces conditions ont permis de dissocier les composantes de l'induction de ces deux enzymes, et ont orjenté nos recherches vers l'étude de la régulation intracellulaire des synthèses hémoprotéiques. Le fait que l'oxygène est nécessaire pour que le caractère initiateur du cytochrome c s'exprime, suggérait xine induc tion simultajiée par ces deux éléments.
L'effet activateur des rayons X pour la synthèse des deux enzymes peroxydasiques renforçait d'autre part l'hypothèse d'un pouvoir hautement spécifique des hydroperoxydes dans l'induction de ces hémoprotéines, puisque les rayons X provoquent la formation de peroxydes.
Ces observations nous ont conduit à rechercher les facteurs susceptibles de modifier l'assortiment normal d'enzymes de la cellule; cette étude devait nous permettre en même temps de préciser la nature des facteurs intracellulaires qui régissent la synthèse des hémo protéines individuelles. (Illième Partie). Notre hypothèse de travail conférait aux flavoprotéines du chemin d'oxydation des hexoses monophos phates un rôle important dans la formation intracellulaire de
La deuxième voie, qui nous fut suggérée par les proprié tés catalytiques complémentaires de la catalase en présence de et des donneurs d'hydrogène, nous a conduit à étudier l'action de l'éthamol et de l'acide formique.
Un mécanisme d'ajustement "peroxydasique" correspondant à une réduction de la concentration de l'eau oxygénée à l'état de régime devait en résulter; un tel effet semblait d'abord confirmé. Mais \ine légè re augmentation de la vitesse d'induction de la catalase, qui se produi sait en présence d'éthanol, s'intégrait mal dans un tel mécanisme d'ajus tement et ne pouvait être interprétée en accord avec nos autres observa tions. De plus, le catabolisme "peroxydasique" de HCXXDH était très limité; la méthode des traceurs a permis de le montrer clairement. L'effet de cet acide sur la biosynthèse ne pouvait donc pas s'expliquer par une réduction de la concentration en peroxydes.
Une ainalyse cinétique des propriétés enzymatiques de la catalase a permis à Clayton (49) de mettre l'accent sur l'importance très réduite d'un tel mécanisme d'ajustement; elle s'accorde au contrai re avec un effet activateur limité de l'éthanol pour la biosynthèse de la catalase.
Nous pouvons de ce fait proposer une inhibition sélec tive et distincte de la biosynthèse de la cytochrome c peroxydase. La grande sensibilité de la biosynthèse de cet enzyme à l'éthanol peut se comprendre si le métabolisme des lipides est déréglé en présence d'alcool et si la liaison de nombreuses hémoprotéines aux lipides associés aux structures cellulaires est requise pour la biogénèse des enzymes des oxydations.
de mettre en évidence plusieurs composantes distinctes de l'action de cet acide.
Une première observation se rapporte à l'altération de la membrane cellulaire pendant l'induction aérobie en présence de HCOOH ; la perméabilité limitée au substrat extracellulaire apparaît ainsi comme une cause importante d'erreurs dans les dosages de l'activité de la cata- lase dans les cellules intactes. L'action de HCOOHfixe l'activité de la catalase des cellules intactes à un niveau maucimum qui dépend seulement de la concentration extracellulaire en acide pendant l'induction.
La fermentation aérobie est fortement accrue dans ces conditions; l'action d'un analogue d'amino acide fait apparaître une com posante adaptative dans cet effet.
INTRODUCTION
A.I. Origine du travail
Les travaux de Pasteur sur la levure ont fait apparaî tre très tôt que le mode de vie cellulaire s'adapte aux conditions du milieu.
Le fait que le métabolisme cellulaire peut varier con sidérablement avec les conditions exogènes, et particulièrement dépendre de la présence ou de l'absence de l'oxygène, a été pré cisé par les travaux de Meyerhof et de Warburg. Presque simultané ment , Euler, Pink, Keilin et leurs collaborateurs ont établi la relation entre la capacité respiratoire de la levure et sa teneur en cytochromes. (79) (81) (82) (111) (148) (217)
La distinction entre levures respirantes et fermentantes n'était pas nette; la conversion possible d'un type en l'autre par l'aération et l'évolution qualitative des constituants hématiniques établirent le caractère adaptatif de cette transition. Dans aucun cas, la possibilité d'une mutation ou d'une sélection n'était ce pendant exclue.
Nous devons à Ephrussi et à ses collaborateurs d'avoir élucidé le déterminisme héréditaire de la respiration chez la levure et à Slonimski d'avoir précisé la contribution qui revient à des facteurs non héréditaires.
L'étude du métabolisme d'induction des hémoprotéines, qui s'intégre dans le problème général de l'adaptation enzymatique, nous permettra d'étudier expérimentalement le mécanisme de la
création des systèmes enzymatiques et de préciser les étapes qui régissent la biosynthèse des enzymes individuels.
A.2. Le phénomène d'induction enzymatique
Définitions générales
variété d'enzymes peut être provoquée spécifiquement. Il suffit d’exposer les cellules aux substrats des enzymes considérés ou à des substances étroitement apparentées à ces substrats. Une mo dification de ce type, dite phénotypique, se produit sans modifi cation des déterminamts génétiques; elle sera donc distinguée d'une modification de constitution enzymatique d'origine muta tionnelle. (52)
L'assortiment d'enzymes d'une cellule dépend donc dans une certaine mesure du milieu et des conditions de culture.
Selon la terminologie proposée par Monod (153), nous dirons qu'un accroissement relatif de la vitesse de synthèse d'un enzyme, résultant de l'action d'une substance spécifique, est une "induction enzymatique" et que toute substance induisant la syn thèse enzymatique est un "inducteur" d'enzyme.
Avant d'aborder la description du phénomène d'adaptation respiratoire, il nous paraît utile de définir le phénomène que constitue une "séquence d'inductions". En exposant un organisme à l'action d'un inducteur qui est également un substrat, on peut observer l'induction d'une séquence d'enzymes. La transformation de l'inducteur primaire exogène donne naissance à \me succession de métabolites intermédiaires, chacun d'eux servant à son tour d'inducteur pour l'enzyme qui le convertira en formant le membre suivant de la chaîne métabolique (153).
Ce phénomène permet d'interpréter le mécanisme de la création des systèmes d'enzymes et le principe de leur ajustement (37); si un substrat induit un enzyme, cet enzyme tend à faire dis paraître celui-ci; le système évolue vers un état de régime.
Ainsi, la capacité, acquise par la levure, de métaboli ser le galactose, correspond à l'acquisition de deux enzymes nou veaux, la galactokinase et la galactowaldénase (87); on imagine aisément une séquence d'inductions.
D'autres exemples sont fournis par l'étude du métabolis me du tryptophane chez Neurospora crassa (87), l'oxydation de l'a cide mandélique chez Pseudomonas fluorescens (211), le métabolisme de l'arginine chez Bacillus Subtilis (219).
Mécanisme de la formation des enzymes
utilisa-ble, qu'il s'agisse d'une source exogène ou de l'utilisation de réserves endogènes. (153)
L'arrêt de l'induction enzymatique en présence des agents découplants des phosphorylations (102) (152) (179) , 2,4 dinitrophénol et NaN^ par exemple, suggère - sans toutefois le démontrer parfaitement - que ce processus requiert de l'énergie.
Au cours de l'induction enzymatique, la cellule acquiert des protéines nouvelles. D'une manière générale, tous les agents qui bloquent la synthèse des protéines inhibent aussi la bio synthèse induite des enzymes.
Les acides aminés libres de la cellule semblent jouer un rôle privilégié dans l'élaboration des protéines nouvelles. Les expériences sur le rôle du réservoir intracellulaire des acides aminés libres pour la synthèse induite des enzymes ont permis à Spiegelmanet à ses collaborateurs d'établir les faits suivants :
1) la formation de l'enzyme est liée de façon rigide à l'utilisa tion des acides aminés libres
2) le premier intermédiaire stable est d'une complexité telle qu'il requiert l'utilisation simultanée de tous les acides ami nés nécessaires à l'édification de l'enzyme. (205)
Dans une étude de l'induction de la maltozymase chez la levure, ces auteurs établirent une corrélation étroite entre la capacité de synthèse enzymatique et la disponibilité en acides aminés libres intracellulaires.
Dans ce même ordre d'idées, un bel exemple est fourni par l'étude, par la méthode des traceurs, de la formation de (3 galactosidase chez Escherichia Coli. Chez ce microorganisme, en phase exponentielle de croissance, moins de 1% du carbone de la molécule d'enzyme provient de matériaux cellulaires présents avant l'addition d'inducteur; cette observation permet donc d'écarter l'hypothèse de la transformation d';in précurseur, simple ou comple xe, en enzyme actif. (182)
Si le chemin de synthèse protéique inclut l'utilisation simultanée des acides aminés constitutifs, on est conduit à consi dérer un mécanisme du type "matrice" ou "modèle".
acides ribonucléiques et de leurs précurseurs; ce phénomène s'in tégre d'ailleurs dans le bouleversement que provoque dans une cellu le une modification du milieu extérieur.
Dans ce travail nous n'étudierons pas le métabolisme des acides ribonucléiques. Nous citerons plus particulièrement les observations de Chantrenne (41) (42) (43) qui indiquent que, pen dant l'induction, des acides nucléiques se forment ou se modifient. Ce problème est actuellement étudié clans ce laboratoire par Gobert dans le cas de l'induction de la maltase chez la levure . (89) (90).
En résumé, le phénomène d'induction requiert plusieurs éléments :
a) une potentialité génétique de la souche cellulaire ,
b) la présence d'un inducteur agissant probablement au niveau d'un système formateur d'enzymes,
c) une potentialité énergétique de la cellule.
Après une description générale du phénomène d'adapta tion respiratoire chez la levure, nous envisagerons pli;is en détail les différents facteurs qui régissent cette adaptation à la vie aérobie.
A.3. Caractéristiques générales de l'adaptation respiratoire.
L'adaptation respiratoire chez la levure résulte du développement du système hémoprotéique induit spécifiquement par l'oxygène. (73) (198) (38)
Ce phénomène, qui correspond à l'acquisition de la capacité respiratoire, a été étudié par Ephrussi et ses collabora teurs dans des conditions où les variations subies par le système respiratoire de la levure excluent toute modification génotypique et ne dépendent que de l'aération. Ceci est rendu possible par le fait que ce processus peut avoir lieu en l'absence d'une source extracellulaire d'azote assimilable, donc en l'absence de crois sance appréciable, ce qui exclut toute sélection de mutants. (200)
L'adaptation respiratoire se présente comme suit : une levure cultivée en anaérobiose voit sa capacité respiratoire augmenter rapidement pendant l'aération en tampon glucosé. La vitesse de respiration (exprimée en unités de QO2, =^10p/h/mg p.s) est multipliée par im facteur 15 environ au cours de l'adaptation.
Parallèlement, la fermentation aérobie du glucose, très intense en début d'expérience, décroît graduellement dans le temps.
Les changements spectroscopiques observés directement pendant l'aération de Saccharomyces cerevisiae (Souche normale) traduisent l’apparition rapide du cytochrome c dont la teneur croît parallèlement à l'augmentation du pouvoir respiratoire.
Les cytochromes b^ et a_ (hémochromogènes natifs de la cellule anaérobie et dont le"^rôle oiochimique est mal défini) disparaissent progressivement tandis que les cytochromes a, a , b et c apparaissent. Des transitions similaires s'observent d'ail leurs chez d'autres microorganismes. (157) (69) (184)
Chez la levure, le contenu héminique global subit rela tivement peu de changements; la vitesse de synthèse enzymatique n'est d'ailleurs pas accélérée par addition de ferroprotoporphyrine, constituant des cytochromes. (200) La biosynthèse des enzymes, induite par l'oxygène, semble donc se limiter à la partie protéique des enzymes (apoenzymes).
Un autre exemple est fourni par une étude de la biosyn thèse du cytochrome c par la méthode des traceurs. Chez deux sou ches de Saccharomyces cerevisiae, le degré de marquage du cyto chrome c (glycine -2-^^C) comparé à celui de l'ensemble des protéi nes est grand durant l'adaptation. (223) Ces observations confir ment bien qu'une synthèse "de novo" de la partie protéique de cette chromoprotéine se produit pendant l'adaptation respiratoire. Un accroissement significatif de la synthèse de "novo" de l'hème re quiert ime croissance active des cellules.
Conjointement à l'apparition du système des transporteurs d'électrons qui groupe les enzymes précités et les déshydrogénases spécifiques, le contenu en catalase de la cellule s'accroît dans des proportions considérables. (38) Les expériences de Chantrenne indiquent que la formation de la catalase correspond bien à un processus de synthèse protéique auquel participent les acides
aminés de la cellule. (36) Au cours de l'aération, il y a synthèse concomitante de plusieurs peroxydases (40) parmi lesquelles nous
retiendrons plus particulièrement la cyt. c peroxydase.
comporte, outre la biosynthèse des enzymes du système Warburg- Keilin, celle de catalase et de diverses peroxydeises.
L'oxygène induit donc la formation de plusieurs enzymes; on peut supposer que la formation simultanée des enzymes s'explique soit par leur parenté d'origine, soit par leur parenté de fonction (198)
L'expérience montre que les biosynthèses ne sont pas synchrones (200); le phénomène d'adaptation respiratoire pourrait donc être un cas d'inductions successives; cette hypothèse s'appuie d'autre part sur le fait que plusieurs enzymes considérés forment ensemble xme imité fonctionnelle. S'il en est ainsi, on peut sup poser que l'oxygène pourrait induire directement la biosynthèse d'un seul enzyme, celui-ci provoquant à l'étape suivante l'induc tion de l'enzyme suivant,
Sloniraski observe par ailleurs qu'il existe une certaine corrélation entre la position qu'un enzyme donné occupe dans la chaîne de transfert et l'amplitude de ses variations au cours de l'induction (196); l'enzyme qui réagit directement avec 0^ pré sente les variations les plus grandes.
On peut donc supposer que l'oxygène induit la formation du chaînon terminal et que le système s'organise de proche en pro che par une cascade d'inductions; la chaîne d'inductions suivant la même voie que le transfert des électrons et de l'hydrogène dans la respiration, mais en sens inverse.
On imagine ainsi que l'oxygène induirait la biosynthèse de la cyt. c oxydase ; la présence de cet enzyme permettrait la biosynthèse du cytochrome c qui, à son tour,induirait la formation des cytochromes c réductases et ainsi de suite.
A.4 Potentialités génétiques de la souche cellulaire» La mutation "petite colonie"
Bphrussi, Hottinguer et Chiraènes (70) ont décrit chez la
levure de boulangerie une mutation affectant la taille des colonies : la mutation "petite colonie". Tavlitzki (213) a pu établir une liai son entre la taille des colonies (non la taille des cellules) chez ce mutant et une diminution du rendement de croissance; simultané ment, Slonimski a montré que la souche mutante est caractérisée par une déficience respiratoire (l94), due à l'abolition de la formation de plusieurs constituants du système des cytochromes. (195) (19Ô)
L'étude génétique de ce problème (45) (7l) (74) a montré que le caractère normal de la respiration était conditionné chez la le vure par la présence simultanée de deux facteurs indépendants; un facteur cytoplasmique doué de continuité génétique et un facteur héréditaire nucléaire.
Ces observations, qui ont été résumées par Slonimski (198), indiquent que le facteur extranucléaire, particulaire et autorepro ductible, est indépendant du gène mendélien pour sa reproduction, mais qu'il en dépend pour son fonctionnement, de sorte que le phéno type "petite colonie" peut être dû à la mutation du gène nucléaire (petites ségrégeantes) ou à la perte (ou mutation) du facteur cyto plasmique (petites végétatives) ou bien aux deux causes à la fois
(petites doubles).
Les travaux de Slonimski (198) relatifs au système "petite colonie" se rapportent aux "petites végétatives".
Ces mutants se rencontrent avec une fréquence de 1 ^ environ, dans les cultures normales de plusieurs espèces.
L'action de 1'acriflavine (72) conduit au remplacement total par des cellules mutées; cette transformation est stable. D'autres agents montrent aussi un effet mutagène; parmi ceux-ci, les radia tions ultraviolettes (U.V.) induisent des changements héréditaires.
(176). Par croisement avec la petite végétative. Haut (l76) a montré qu'il s'agissait de la perte d'un seul gène; les résultats s'expliquent si les "petites" sont normales génétiquement, mais cytoplasmiquement déficientes, ce qui est aussi nécessaire pour la production du
système complet des cytochromes.
on observe également la disparition ou l'inactivation d'éléments "non géniques" capables d'autoduplication. Les rayons X n'exercent pas un tel effet.
La désintégration du P incorporé dans le génome de la cellule peut également induire la déficience respiratoire avant de manifester ses effets léthaux. (159)
Un autre facteur mutagène est la température (T) (224). L'absence de toute altération à température élevée si l'on opère en milieu glucosé non azoté indique une action au niveau de la " repro duction" du facteur cytoplasmique. Ce phénomène, confirmé par Sherman
(190), a été précisé et comparé à la mutation spontanée ou induite par 1'acriflavine. Cet auteur suggère d'autre part un rôle important des mitochondries dans le processus d'inactivation par la température.
En aucun cas, la mutation n'altère le métabolisme anaérobie de la cellule.
L'induction de la déficience respiratoire héréditairement stable par Mn++ dans des populations non proliférantes de Saccharo- myces cerevisiae apporte des renseignements complémentaires (183). L'effet mutagène de Mn++ fixé seulement par le rapport Mg++ /Mn++ et par le contenu en acides aminés libres a permis à Sarachek (183) de conclure à la dégradation de un ou plusieurs systèmes physiologiques essentiels résultant d'ione synthèse protéique anormale induite par ce toxique.
Il semble donc bien qu'une synthèse protéique active (celle- ci ne constitue pas nécessairement l'étape initiale dans l'établisse ment de la déficience spontanée) ou d'une manière plus générale une potentialité de synthèse est requise pour la mutation. L'établissement de la mutation chez la cellule "au repos", qui peut être le siège d'un métabolisme protéique et nucléique impcrtant et dont la croissance est ralentie fortement sans être arrêtée, ne sont donc pas en contradiction
avec la constatation antérieure de la nécessité d'une croissance pour l'apparition de la mutation.
On a montré par exemple chez Escherichia Coli, que deux popula tions bactériennes de génotype identique, proliférant dans des conditions identiques, peuvent se maintenir indéfiniment avec xin phénotype différent.(53)
A.5. Enzymes aérobies
En aérobiose, les enzymes de la respiration catalysent l'oxydation complète du glucose en CO^ et H^O.
Les cytochromes s’observent dans la cellule intacte après réduction par Na_S^O..
c c 4
Le spectre de la levure normale (59R) comprend les bandes c , °( b, a,/ib, /3c eto(Cj. Chez le mutant (59RA), par contre, on observe seulement les"^composantes c(c,/ic et a^. . De tous ces constituants, seul le cytochrome c est thermostable. (198)
Toutes les souches "petite colonie" actuellement étu diées présentent les mêmes déficiences cytrochromiales.
Malgré l'identité du spectre d'absorption et des pro priétés enzymatiques des cytochromes c isolés des deux souches, cette hémoprotéine n'est pas oxydée in situ par l'oxygène molécu laire chez la "petite"; chez cette levure, l'absence de respira tion est réellement due à l'absence de l'enzyme qui catalyse l'oxy dation du cytochrome c. Le cytochrome c endogène est cependant oxydé en présence de ou de ferricyaiiure.
Une preuve supplémentaire de la localisation de la déficience au bout de la chaîne respiratoire est fournie par l'incapacité de la cellule de dégrader les substrats respiratoi res, CH CCX)H, (66) (67), le lactate, le pyruvate ainsi que les acides du CTC. (198).
En aérobiose, plusieurs déshydrogénases sont couplées à la chaîne des cytochromes. Slonimski a fait une étude compara tive approfondie des réactions d'oxydo-réduction qui conduisent à l'O^ de l'air dans les deux souches. (198).
L'activité de la Col cyt, c réductase est la plus impor tante et semble être sur la voie principale du transfert des élec trons dans la respiration. Comme le fait remarquer Slonimski, si l'on admet que la Col cyt. c réductase de la levure met en jeu les mêmes transporteurs d'électrons que celle des tissus animaux, l'ab
sence d'activité de ce système chez le mutant peut résulter de l'absence du facteur sensible au 2,3 dimercapto-I-propanol. Cette idée est encore renforcée par le parallélisme des profils d'induc tion de la succino cyt. c réductase et de la Col cyt, c réductase chez la levure normale.
La présence de la diaphorase chez le mutant semble éta blie par l'étude de la réduction du bleu de méthylène en présence de malate ou d'éthanol; dans ce cas, ce n'est pas la flavoprotéine qui limite la vitesse globale de ces voies d'oxydation.
Contrairement à ce que l'on observe pour le DPNH, l'oxy dation du TPNH par la TPNH cyt. c réductase et le cytochrome c est active dans les deux types de cellules.
Localisation intracellulaire des enzymes - Mitochondries
L'étude de plusieurs enzymes respiratoires a permis à Chantrenne (35) de classer ceux-ci en deux groupes; il distingue les enzymes associés axix particules sédimentables de ceux qui restent en solution. Slonimski (198) confirme cette séparation préférentielle des enzymes respiratoires par rapport aux protéines non spécifiques et obseinre que la "petite" a perdu tous les enzy mes sédimentables. La validité de ce critère, qui n'est pas absolu, dépendra des techniques mises en oeuvre pour la préparation des extraits cellulaires; en effet, une trop grande labilité de la liaison de l'enzyme avec les structures entraînera line solubilisa tion de l'enzyme; des conclusions erronnées pourraient alors être tirées quant à son site d'activité dans la cellule.
L'étude de la répartition des hémoprotéines dans les particules cytoplasmiques après digestion des membranes cellulai res par le suc digestif d'Helix poinatia a permis de préserver au mieux l'intégrité de ces particules. (99) Ces observations per mettent de conclure à l'absence de cytochrome c extramitochondrial.
Une association du cytochrome c aux strcutures cellu laires dans les préparations de muscle de coeur était déjà suggé rée par l'altération des propriétés catalytiques de 1'hémopro téine extraite. (118)
normale, qui font défaut chez le mutant, sont associés aux parti cules sédimentables.
Une telle distinction a pu être établie par Chantrenne (40) pour les enzymes qui dégradent les peroxydes dans la cellule. Ainsi, la peroxydase de la benzidine, enzyme aérobie et sédimen- table, est associé au caractère normal, tandis que la catalase et la cyt. c peroxydase, enzymes "solubles” , ne sont pas touchés par la mutation.
Ephrussi et Slonimski (75) observent que la capacité de former les enzymes liés aux particules se comporte dans les croise ments entre normales et petites comme im caractère non mendélien. L'absence des enzymes en anaérobiose exclut leur identification avec le facteur cytoplasmique ; aussi ces auteurs ont-ils suggéré que la mutation pouvait correspondre à la perte des mitochondries ou à l'inactivation de leur fonction dans la synthèse de la cyt. oxydase. Yotsuyanagi (75), en éprouvant cette hypothèse, a montré avec certitude l'identité morphologique des mitochondries chez les deux souches. Ces particules cytoplasmiques ne concernent donc pas la mutation; on peut envisager cependant une inactivation fonction nelle des mitochondries chez le mutant ou encore une hétérogénéité de la population de mitochondries.
Arrangement spatial des enzymes
D'une façon générale, dans les mitochondries et dans les préparations de la chaîne respiratoire obtenues par fragmenta tion des mitochondries (192)(193), les cytochromes a,b,c,c^ et a sont tous présents et fortement liés à la même particule ; les systèmes Enzyme-DPN, Plav.P.-cyt.b,cyt,a -c semblent y former* des groupes moléculaires distincts figurant des niveaux d'oxydo-réduc- tion, (139) (140) (141) Ces systèmes doivent être liés pour permettre le transport rapide des électrons par l'intermédiaire des atomes de Fe du cyt, c vers le cyt. a et l'O^ de l'air. Chaque transporteur (ou groupe moléculaire) doit cependant être regardé comme une entité séparée, étant donné que le degré d'oxydo réduction à l'état de régime aérobique (respiration normale) de chaque cytochrome est différent et peut être influencé en sens divers par l'addition d'inhibiteurs.
A chaque instant, la vitesse de la respiration dépendra du nombre de molécules enzymatiques à chaque niveau électronique et de la capacité de turnover des centres réactionnels et mesurera l'intensité du courant électronique. (141)
A.6. Localisation de la déficience respiratoire dans le processus de biosynthèse des hémoprotéines
Slonimski a attiré l'attention sur l'existence d'une étape ou d'une réaction commune au développement non héréditaire et à la transmission héréditaire des enzymes respiratoires. (200).
La relation étroite entre ces deux phénomènes résulte de l'action polyvalente des acridines; en effet, une inhibition sélec tive de la biosynthèse de la cyt. c oxydase (non de l'activité de l'enzyme) est toujours associée à l'action mutagène.
Actuellement, il semble bien que la mutation concerne principalement la formation des apoenzymes. En effet, le cyt. a^ qui a été identifié à l'hémoglobine est toujours présent chez la "petite" qui n'acquiert jamais les composantes a et b.
Chez la levure normale qui prolifère en aérobiose Ycas (225) a pu démontrer un ajustement réciproque des teneurs relati ves en cyt. a et en cyt.a . L'inhibition spécifique de la bio synthèse induite de l'oxydase pourrait s'expliquer dans ce cas si le cyt. a_ est sur le chemin de la biosynthèse du cyt, a ou si l'hème aj"^est le précurseur du groupement prosthétique du cyt.a.
Le protohème est le groupement prosthétique du cyt.b aussi bien que du cyt. c, de la catalase et de la cyt. c peroxydase, dont les niveaux sont comparables dans les deux souches.
Afin de localiser les déficiences cytochromiales, De Deken (64) espère modifier le taux de mutation en altérant le métabolisme des porphyrines de la levure ou plus généralement en modifiant les conditions extérieures.
Cellules normales Etat instable "petite"
La perte des mécanismes de synthèse de l'hème, rend compte des déficiences en hémoprotéines chez de nombreux micro organismes ; ces exemples seront distingués des observations pour la levure; ils se rapportent à la réactivation des synthèses des hémoprotéines chez Saccharomyces cerevisiae (mutant nucléaire U.V.)
(176) (222), et chez Micrococcus pyogenes var. aureus en présence d'hème exogène (105) (106) (107). Dans un cas comparable, Beljsmski isole d'un mutant d'Escherichia Coli (hème ) l'apoenzyme de la catalase ; la protéine extraite, se combine in vitro à l'hème pour former l'enzyme actif. (16)
A.7. Evolution du contenu hémoprotéique durant le_cycle_de croiss^ce_ aérobie
Chez la levure qxii se multiplie en aérobiose, la majeure partie de la croissance se fait aux dépens de la fermentation aé robie; la respiration n'intervient qu'en fin de croissance pour oxyder l'alcool accumulé. (131)
Ephrussi et ses collaborateurs (76) ont pu établir une corrélation étroite entre l'amplitude relative des mécanismes aé robies du catabolisme du glucose et l'évolution du système hémopro téique respiratoire. Cette étude a mis en évidence la chute consi dérable de l'intensité de la respiration chez la cellule en crois sance rapide et les variations cycliques complémentaires des com posantes du spectre des cytochromes. Les variations importantes de la teneur relative en enzymes de la chaîne du transfert des élec trons traduisent d'autre part des écarts sensibles dans les vites ses de biosynthèse des divers constituants. Ce phénomène doit être distingué de la chute non spécifique du métabolisme cellulaire en phase stationnaire tardive.
être la cause de variations individuelles quantitativement différentes, (76)
L'effet spécifique du glucose est interprété au travers des variations complémentaires des systèmes fermentaire et respi ratoire , qui constituent les deux voies possibles du catabolisme de ce sucre. Les variations cycliques subies par la levure seraient dues à la prédominance alternée de l'effet Pasteur et du contre- effet Pasteur.
Le contre-effet Pasteur a été défini par Slonimski pour l'adaptation respiratoire chez la levure au repos, (200)
En modifiamt la concentration en glucose exogène on modifie aussi l'intensité de la fermentation aérobie; par contre, la vitesse de respiration n'est pas touchée (203). Dans ces conditions, l'adapta bilité respiratoire, exprimée en termes de AO^ = dQO^/dt, est optimale pour un QCO^Cair) de 150 environ.
Une fermentation aérobie plus intense, associée à une concentration en glucose élevée en début d'adaptation contrecarre l'établissement du métabolisme respiratoire, inhibiteur de la fermentation.
Dans des conditions comparables, Strittmatter (210) a pu relier l'inhibition de la synthèse adaptative des systèmes oxy datifs chez Saccharomyces cerevisiae à la présence en concentra tions élevées d'un sucre rapidement et entièrement fermentescible.
Dans certains cas, l'effet du glucose a pu être interpré té comme \xn mécanisme homéostatique par lequel des produits formés par le métabolisme du glucose peuvent inhiber la formation d'enzymes adaptatifs (dont l'activité pourrait augmenter le pool métabolique de ces produits) (143) (160)
Dans le cas de la levure, Slonimski interprète l'inhibi tion par le glucose conme le reflet d'un mécauiisme intracellulaire autorégulateur; la présence d'un pool métabolique fermentaire, en fournissant une énergie suffisante, pourrait inhiber partiellement la formation de systèmes adaptifs générateurs d'un excédent d'éner gie.
A.8. Importance de la nature du substrat carboné
Krebs a suggéré un rôle essentiellement anabolique pour les composantes du CTC, (124)
L'analyse de la simulteinéité des fonctions oxydative et énergétique du cycle ont conduit Wiame à conférer à cette voie importante du métabolisme le caractère d'im facteur de régulation et d'adaptation de la cellule aux conditions extérieures. (220). Wiame prévoit d'autre part le passage d'une forme d'activité à l'autre suivant l'état physiologique de la cellule; cette transi tion, qui s'accompagne d'une variation du flux de métabolites pas sant par chacune des réactions pourrait induire directement des variations considérables de richesse des différents enzymes.
Ces modifications pourraient influencer sélectivement les réactions du succinate et du fumarate, qui deviendraient quantitativement négligeables dans le cas où le cycle est essentiellement impliqué dans des réactions de synthèse. Les travaiix de Vanderwinkel (216) ont confirmé ces prévisions chez la levure ; il a pu démontrer l'existence du CTC complet fonctionnel au niveau des granulations mitochondriales après croisseince sur acétate ; il a mis en évi dence d'autre part la variabilité considérable de l'assortiment des enzymes oxydatifs avec la nature du substrat carboné. Il dis tingue les sucres d'une part, l'éthanol et l'acétate d'autre part. L'adaptation à l'acétate correspond à la biosynthèse induite du shunt glyoxylique et à la régulation spécifique des enzymes de la chaîne des oxydations, principalement au niveau des déshydrogéna- ses.
Cet auteur résume ses observations conme suit s la croissance sur glucose induit une fermentation aérobie intense et confère au CTC un rôle essentiellement anabolique; le chaînon acide succinique-acide fumarique est considérablement réduit.
L'acétate, substrat respiratoire, lorsqu'il est la sour ce unique d'énergie et des métabolites de synthèse, provoque l'aug mentation adaptative du taux en substrats oxydables, le succinate et le malate ; un accroissement du niveau des déshydrogénases cor respondantes (démontré pour le succinate) fournit à la cellule un cycle complet ; le fonctionnement énergétique du CTC couvre les besoins de la levure. (216)
pliquer l'asynchronisme observé pour la synthèse des systèmes réductasiques complexes et permettent de "concevoir un rôle in ducteur spécifique et distinct de l'oxygène d'une part pour les chaînons hémoprotéiques^ et des métabolites d'autre part^ pour la formation des déshydrogénases de la respiration."La dégradation du glucose en aérobiose chez la levure "au repos" évolue initiale ment par la seule voie fementaire, comme le prouve l'accumulation d'éthanol (6?). L'oxydation respiratoire subséquente via l'acide acétique et le CTC expliquent ainsi la dissociation adaptative des activités de la déshydrogénase succinique et du système de la succino cyt. c réductase (96),
Intégrant ses résultats dans le phénomène du contre- effet Pasteur, Vanderwinkel (216) a proposé un type de rétrocon trôle plus complexe : si l'excès d'énergie permet de prévoir un contrôle spécifique des systèmes adaptatifs producteurs d'énergie, il pourrait contrecarrer aussi "la synthèse des enzymes producteurs de métabolites susceptibles de conduire aux réactions productrices d'énergie".
A.9. Energétique de l'adaptation respiratoire. Etape critique.
Dans tous les cas où la biosynthèse de novo d'tine pro téine est établie, l'on a pu démontrer la nécessité d'une source d'énergie utilisable.
En l'absence d'une source de carbone exogène, la dégra dation aérobie des réserves endogènes, associée à une estérifica tion du P inorganique, permet une synthèse d'hémoprotéines a vitesse réduite. (Levure normale) (68) (198) (207)
entre l'apport énergétique et les matériaux de construction dis ponibles."
L'irréversibilité n'est cependant pas totale; l'absence d'inducteur, la présence d'analogues d'acides aminés, l'addition de glucose (qui provoque une fermentation aérobie excédentaire) arrêtent l'adaptation.
Ces observations et d'autres sur l'action du Benzimida- zole (200) ont conduit cet auteur à localiser ces phénomènes au niveau du système formateur des enzymes respiratoires; la vie moyen ne de ce système pourrait correspondre à la durée de l'étape cri tique ou à la durée de l'inhibition par la compétition fermentaire.
A.10. Caractéristiques de la Fermentation et évolution de celle-ci
pendant l'adaptation. (198)
En anaérobiose, le catabolisme des glucides se fait par la seule voie fermentaire; la mutation n'affectant pas les enzymes de la fermentation, les levures normale et petite seront caractérisées par des fermentations anaérobies comparables
(QCO^-N^)
L'introduction de l'oxygène fait apparaître des diffé rences nettes entre les deux souches ; à une respiration hémopro téique importante chez la levure normale est associée une fermen tation aérobie QCO^-air réduite si on la compare à la valeur en anaérobiose.
A la faible respiration des petites (respiration insen sible aux inhibiteurs de la respiration normale) où les flavopro- téines autoxydables jouent le rôle principal, est associé xin QCOg-air voisin du QCO^-N^.
L'emploi d'inhibiteurs ayant vine spécificité étroite pour les enzymes de la fermentation et de la respiration
Une sensibilité différente de la triose P déshydro- génase et de l'enolase chez les deux souches en aérobiose, indique cependant des différences au niveau des mécanismes fermentaires en aérobiose. (198)
A.11. Spécificité de l'induction par l'oxygène.
Parmi les nombreux accepteurs d'électrons qui peuvent oxyder une partie du système respiratoire, aucun ne remplace l'oxygène en tant qu'inducteur des enzymes de la respiration; ceux-ci peuvent cependant stimuler ou modifier les synthèses en présence d'oxygène. (198) (203)
La biosynthèse de la catalase et de la cyt.c peroxy- dase en présence de 0_ serait induite par les peroxydes qui se forment dans la cellule; ces enzymes seront l'objet d'une étude plus approfondie. (II ième et III ième Partie)
Une conséquence directe de 1'aérobiose est le boule versement complet du métabolisme des prophyrines libres (197)(198).
En anaérobiose, l'accumulation des porphyrines dans le milieu extérieur est considérable et ne s'arrête que dans les dernières heures de culture; 1'aérobiose, par contre, réduit presque totalement cet effet. L'analyse qualitative du pool des porphyrines libres extérieures a permis de distinguer cette voie métabolique du catabolisme des chromoprotéines, et de la proto- porphyrine en particulier, et suggère la mise en jeu, en l'absence d'oxygène, d'une voie distincte de synthèse des tétrapyrrolles à partir d'un précurseur commun. La comparaison des souches "grande" et "petite" permettent de rapporter ce phénomène à une déviation spécifique de l'sinabolisme du cytochrome c.
Chez de nombreux microorganismes, on a pu mettre en évidence une différentiation qualitative des processus oxydatifs de la cellule suivant la tension d'oxygène. Ces observations, intégrées dans le problème de l'adaptation respiratoire, attire ront notre attention sur la multiplicité des mécanismes autorégu lateurs qui peuvent fixer dans la cellule la contribution relative de chemins d'oxydations complémentaires.
Coli. (157). Qiez cette bactérie, l'02 spécifiquement l'oxydase, mais la biosynthèse évolue à vitesse optimale aux
faibles tensions d'oxygène. Chez Aerobacter aerogenes en croissance aérobie, Moss (158) a pu, en modifiant la pression partielle de 0^ de la phase gazeuse d'aération, dissocier les biosynthèses des composantes a^ et b^. Dans tous les cas, la teneur en enzymes rejoint les valeurs'^caractéristiques des cultures anaérobies aux très faibles concentrations d'O^, mais la plus forte synthèse du cyt. a^ est observée pour des concentrations d'inducteur qui limi tent encore la respiration des cellules.
Moss a suggéré un mécanisme d'ajustement au niveau de l'activité catalytique de!l'enzyme; une capacité oxydative constan te serait maintenue par un équilibre cinétique des concentrations d'enzyme et de "substrat inducteur". La spécificité du mécanisme d'autorégulation au niveau du cyt. a^ pourrait encore s'expliquer dans ce cas par une inactivation du groupement prosthétique de la protéine aux fortes tensions d'oxygène. (158)
Un autre exemple d'ajustement enzymatique s'observe chez Pseudomonas fluorescens (132); dans ce système, une tension d'oxygène croissante induit un nivellement progressif et opposé des hémoprotéines d'une part (le cyt, c, la catalase, et la cyt.c peroxydaae) et des flavoprotéines d'autre part. Une déviation des chaînes de transfert par des systèmes d'oxydo^^éduction exogènes, l'action d'inhibiteurs spécifiques des enzymes et des carences dirigées en ions métalliques ont permis à Lenhoff et al. de propo ser deux chemins distincts pour le transfert des électrons, l'im portance relative de ces voies d'oxydation étant fixée par la con centration en 0_ du milieu d'aération. A une pression partielle en Og réduite, les électrons seront transférés via le Pe hémo- proteique jusqu'à la cyt. c peroxydase ; aux tensions en 0_ élevées, l'oxydation directe des flavoprotéines catalyse les oxydations cellulaires.
Divers changements enzymatiques s'obtiennent aussi chez Neurospora crassa (162); ces observations, qui comprennent les actions dirigées, additives et antagonistes des ions métalliques peuvent traduire dans ce cas la mise en jeu d'vtn mécanisme d'équi libration au niveau des enzymes oxydatifs.
Il en résulte que, si la contribution de la respiration flavoprotéique directe paraît très réduite chez la levure normale, mais non chez la "petite", nous devrons toujours retenir l'hypo
Chez la levure qui prolifère en présence de CN , inhibiteur puissant de la respiration hémoprotéique, Pett (173) a mesuré un enrichissement considérable en composés flaviniques.
1ère PARTIE
Page
I.I. Techniques générales 22
1.1.1. Nature du matériel biologique ... 22 1.1.2. Milieux de culture... 22 1.1.3. Milieux de sélection - Pureté du matériel
biologique... 22
1.1.4. Techniques de culture et d'aération .... 24 1.1.5. Mesure de la quantité de matière vivante. . 24 1.1.6. Dosage des protéines... 24
1.2. Mesure des activités enzymatiques 25
1.2.1. Catalase... 26 1.2.2. Cytochrome c peroxydase ... 27 1.2.3. Cytochrome c... 29
1.3. Facteurs qui modifient l'adaptation respiratoire 33
1.3.1. Introduction - La lipogénèse et sa liaison
avec le phénomène d'adaptation respiratoire 33
1.3.2. Croissance en anaérobiose complète... 34 1.3.3. Rendements de croissance... 35
Biosynthèse des lipides en aérobiose. ... 36 1.3.4. Adaptabilité de la levure durant le cycle de
croissance anaérobie... 37 1.3.5. Importance de l'âge physiologique de la
levure - Cas de YPA... 37 1.3.6. Anomalies de la biosynthèse des hémoprotéines 38 1.3.7. Etats physiologiques transitoires ... 39 1.3.8. Période de "préinduction"
I.I. Techniques générales
I.I.I. - Matériel biologique
1. Levure normale Saccharomyces cerevisiae : Souche Yeast Poam
2. Mutant "Petite colonie" diploïde provenant du laboratoi re du Professeur B. Ephrussi : Y.P.A.
3. Levure normale Saccharomyces cerevisiae ; Souche LKG12
Les souches sont conservées sur milieu solide gélose (milieu A additionné d'agar 2.J3%) en chambre froide à 4“c et entretenues par des repiquages mensuels.
1,1.2. - Milieux de culture
Milieu A
Milieu liquide contenant, par litre, 50 gr. de glucose, 1.43 gr. de sulfate de Magnésium, 0.53 gr. de chlorure de Sodium, 10 gr. de phosphate monopotassique, 1.2 gr. de sul fate d'ammoniimi, 0.53 gr. de chlorure de Calcium,
1 ml d'une solution à 1% de chlorure ferrique et
3 gr. d'extrait de levure. (Bacto Yeast Extract Dehydrated) La stérilisation du milieu se fait à l'autoclave pendant 20 min. à 120*.
Milieu B (d'aération)
Milieu liquide contenant, par litre, 40 gr. de glucose, 0.2 gr. de sulfate de Magnésium et 0.45 gr. de phosphate rnonopotassique,
Le système est tamponné par le couple acide succinique- succinate de Na 0.02 M de pH 4.2.
Milieu solide gélosé
Milieu A additionné de 27.5 gr. d'agar par litre.
1.1,3. - Milieux de sélection
Milieu S.I.
Ce système très restrictif pour Y.P.A. contient pour 100 ml, O.I gr. de glucose, 0.05 gr. de phosphate monopo tassique, 0.4 gr. d'acétate de Sodium, 0.2 gr. de Bacto- peptone, O.I gr. d'extrait de levure, 1 goutte d'une solu tion de PeCl_ à 1%.
Le pH est ajusté à 5 et le milieu liquide additionné de 3% d'agar.
Milieu S.II.
1) Milieu A sans glucose additionné de 20 gr. de lactate de Sodium par litre; Y.P.A. ne peut s'y multiplier. 2) Milieu A contenant, par litre, 20 gr. de lactate de
Sodium et 1 gr. de glucose; il ne permet qu'une multipli cation très réduite de Y.P.A.
Ces deiix systèmes sont solidifiés par 3^ d'agar.
Pureté du matériel biologique
Le critère macroscopique qui permettra de distinguer les souches normale et mutante sera la taille de la colonie. En aérobiose, la dégradation d'une quantité limitante de glucose (apport fixé par la diffusion du sucre) par voie respiratoire, assure à la souche normale un apport énergé tique élevé comparé au seul métabolisme fermentaire chez le mutant.
Par ailleurs, tout substrat énergétique ne pouvant être dégradé que par la seule voie oxydative (ex. lactate, acétate..) restera inutilisé par la "petite".
Ces propriétés ont permis l'établissement de miliexix de sélection du type S.II. pour la purification des souches
Ensemencement sur milieu sélectif
La levure issue d'une culture sur milieu A solide est re piquée sur le même milieu liquide (5 ml) et incubée 24 h. à 28°c.
Les cellules prélevées en phase stationnaire de croissance sont diluées stérilement dans de l'eau distillée.
L'incubation se fait à 28“ et les cellules sont distinguées par la taille des colonies.
Un examen microscopique termine ces observations.
I.I.4. - Techniques de culture
Pour la culture des levures en anaérobiose, 500 ml de mi lieu A sont ensemencés avec 5 ml d'une préculture de 24 h.; le ballon est rempli jusqu'au haut du col et fermé par xm bouchon de verre; il est mis à incuber 24 h. à 28-30“.
Aération
La levure est récoltée, lavée trois fois avec de l'eau distillée et remise en suspension dans le milieu B, La concentration de la suspension est déterminée par la mesure de son opacité et ajustée à 3-3»5 mg. de matière
sèche par ml.
Cette suspension est ensuite répartie en portions de 40-50 ml dans des boîtes de Roux d'un litre qu'on dispose horizontalement sur un plateau agité d'un mouvement pendu laire (70 oscillations par minute) dans une étuve à
28-30“.
I.I.5. - Mesure de la quantité de matière vivante
La croissance des cultures de levure est définie comme l'accroissement de la substance sèche de la population et est mesurée par néphélométrie.
Les concentrations des suspensions cellulaires ont été dé terminées grâce aux courbes opacimétriques donnant la den sité optique en fonction du poids sec de levure par ml. Nous rapporterons nos mesures d'activités enzymatiques à la queintité de protéines ou, plus précisément, à la teneur en tyrosine des extraits à doser.
I.I.6. - Dosage des protéines (selon Lowry et al. (138)
Cette méthode très rapide se révèle être très avantageuse dans notre cas ; de par sa grande sensibilité elle convient au dosage de petites quantités de protéines.
de nombreiix échantillons similaires, conme c'est le cas dans le présent travail où l'erreur due à la diversité des protéines n'intervient pas.
Technique de la méthode
L'extrait protéique (enzymatique) est précipité par l'acide trichloracétique (TCA) 10%, isolé par centrifugation et dissous dans NaOH 1 N. Après une heure à la température ordinaire, on ajoute à 1 ml de Réactif C (solution alcaline de Cuivre (138) 100 X de l'hydrolysat alcalin, puis 10 min. plus tard 200 \ de réactif de Polin.
Avec les précipités récalcitrants, il faut chauffer à 100® avant l'addition des réactifs; les mesures dans ces conditions restent reproductibles.
Les lectures au colorimètre Spekker se font 45 min. plus tard.
Cuvettes : Epaisseur traversée 1 cm. Capacité 0,5 ml. Filtres : Gris H508 et Rouges 0R2 de part et d’autre. Pour les lectures au Spectrophotomètre Beckman le maximum d'absorption se situe à 750 my^.
On prend comme témoin de mesure une cuvette contenant tous les réactifs, l'extrait protéique excepté. Le système de référence s'obtient par une série linéaire de dilutions d'une solution étalon de tyrosine; elle est répétée pour chaque série de déterminations. Nous avons toujours effec tué nos dosages aussitôt après les mesures d'activités enzy matiques.
1.2. La mesure des activités enzymatiques
L'étude de la biosynthèse des enzymes repose essentielle ment svir les mesures des activités enzymatiques.
Celles-ci nous permettront d'évaluer la quantité d'un enzyme donné.
I.2.I. - La Catalase
A. Préparation des extraits (39)
La levure recueillie par centrifugation, est lavée deux fois avec de l'eau distillée; le culot est transféré dans \in mortier et broyé avec du sable.
La pâte est épuisée par un voliane connu de tampon de phosphate de Potassium 0.02 M. de pH7 et le liquide est centrifugé 15 min. à 10.000 g. Toutes ces opérations sont effectuées à 5®c,
Le liquide surnageant constitue l'extrait dans lequel l'activité catalasique est mesurée.
B. Mes\ire de l'activité catalasique
La catalase provoque la décomposition de l'eau oscygénée suivant l'équation globale s
H2O2 + ——> 2 H^O + 0^
La décomposition de H^O^ obéit initialement à la cinéti que d'une réaction monomoléculaire (171). La vitesse de réaction, pour ime concentration donnée en substrat, est Tine fonction linéaire de la concentration de la catalase dans nos conditions d'expérience.
Le dosage de la catalase se fait suiveint la méthode de von Euler et Josephson (78).
La température du système réactionnel dont le pH est fixé à 7 par du tampon de phosphate de Potassium 0.02 M est abaissée à 0®; la vitesse de réaction est optimale dams ces conditions (78).
Après des durées d'incubation bien déterminées, la réac tion de décomposition de H^O^ par l'enzyme est bloquée instantanément dams H^S^O^ 2%. La concentration résiduel le en substrat est évaluée par titration permainganimétri- que de celui-ci.
C. Expression des résultats
La quaintité de KMnO^ requise est proportionnelle à la concentration résiduelle en eau oxygénée.
ke I t
log no no- X
k est la constante cinétique de la réaction globale e la concentration molaire en enzyme
no (ml de KMn04) mesure la concentration initiale en no- X (ml de KMnO.) mesure la concentration en substrat
au temps t de la réaction.
Graphiquement, si l'on porte log no/no- x en fonction du temps d'incubation, l'on aura l'expression de ke par la mesure du coefficient angulaire de la droite obtenue. Nous utiliserons l'expression de ke pour chiffrer l'ac tivité catalasique de l'extrait.
Notre but étant de comparer les activités d'extraits semblables, il nous suffira d'évaluer ces "constantes" ke ; celles-ci seront rapportées à une même quantité de protéines ou plus précisément à une même quantité de tyrosine.
1.2.2. - La Cytochrome c Peroxydase
A. Préparation de l'extrait (40)
La levure récoltée par centrifugation est lavée deux fois avec de l'eau distillée, puis étalée sur une feuille de papier filtre et laissée 24 h. à la température du laboratoire.
La levure ainsi séchée est finement broyée dans un mor tier et mise en suspension dans un petit volume d'eau en présence d'une goutte de toluène. La suspension est ensuite incubée 24 h. à 25-30°.
Ces opérations provoquent l'autolyse du système.
La suspension est ensuite centrifugée (a) Centrifugeuse Corda ; 5 min. à 3.000 tours (b) Centrifugeuse Sorval ; 20 min. à 10.000 tours.
Le surnageant clair est dialysé à 4° pendant 4 h. contre du tampon de phosphate de K 0.02 M de pH 7.2.
B. Réduction du cytochrome c
Cette nouvelle méthode (40) a le grand avantage de n'introduire aucune substance parasite dans la solution de cytochrome c. L'hémoprotéine ainsi obtenue est
réduite à 90-95^.
C. Dosage de l'enzyme
Dans les autolysats qui ne contiennent pas de cyt. oxyda se, la peroxydase du cytochrome est dosée selon Abrams et al. (1) à l'aide d'un spectrophotomètre Beckman muni d'un diaphragme permettant d'effectuer les mesures sur 1 ml de solution.
La solution de cytochrome c réduit selon la méthode dé crite ci-dessus ne contient pas de peroxydes; auctine oxydation du cytochrome c n'est observée en présence de peroxydase avant l'addition d'eau oxygénée ou d'un hydro peroxyde.
Dans la méthode d'Abrams, la réaction est déclenchée par l'addition au mélange de cytochrome réduit et d'en zyme d'une quantité suffisante d'eau oxygénée pour at teindre une concentration finale de 5.10“^ M.
De 1'hydroperoxyde d'éthyle (Conc.finale 2.10 ^M) sera utilisé comme oxydant à la place de
Comme le fait remarquer Chantrenne (40), il est indis pensable de rechercher au préalable si l'autolysat ré duit le cytochrome c oxydé. Lorsque cette réduction est très lente, le chiffre de l'activité cyt. c peroxydasi- que peut être corrigée. Si la réduction est trop rapide, l'enzyme doit être soiomis à une dialyse prolongée.
D'une façon générale, ce phénomène devient négligeable après 4 h. de dialyse,
L'hydroperoxyde d'éthyle a été préparé selon Bayer et Williger par M. Chantrenne et la concentration des so lutions est déterminée par des mesures spectrophotomé- triques à 225 m M et 250 m ^ en utilisant les données numériques de Rieche (181).
Test spectrophotométrique
L'activité cyt. c peroxydasique d'un autolysat est dé terminée par observation spectrophotométrique de la vi tesse d'oxydation du cytochrome c réduit par H_0_ ou C^H,,00H.
Abrams et al. (l) (4) trouvent que cette réaction obéit à l'équation cinétique - d log (Cyt Pe'*^'*') = K.e
dt
où (Cyt Pe ) est la concentration en cytochrome c réduit.
Ils définissent l'unité d'activité cyt.c. peroxydasique comme la quantité de peroxydase donnant la valeur
Imin.”^ pour -dlog (Cyt.Pe^'*') dt
Mode opératoire
Dans la cuvette spectrophotométrique, le système réac tionnel dont le pH est fixé à 7.2 par le tampon de phos phate de K 0.02 M comprend l'extrait enzymatique et du Cyt. Pe"^^. Les proportions relatives dépendront des exi gences expérimentales; dans tous les cas, une extinction
voisine de l'unité à l'instant initial assurera une ob servation favorable : (Cyt Pe^^) est voisine de 10”% dans ces conditions.
Une valeur constante de l'extinction permet d'exclure une réduction complémentaire non spécifique du substrat. La réaction d'oxydation est déclenchée par EtOOH à la concentration finale de 2.10”% et l'extinction à
550mesurée toutes les 30 bec.
Depuis peu, un système enregistreur automatique (Varian) permet l'analyse d'un profil de réaction continu.
Lorsque la réaction se ralentit, le cytochrome c est oxydé par le ferricyanure Pe (CN)4- ,
6
D. Expression des résultats
Les propriétés cinétiques générales de la réaction étant semblables au cas de la catalase, les résultats s'expri meront de façon analogue.
La connaissance des activités relatives d'autolysats analogues, rapportées à une même teneur en tyrosine des extraits, suffira pour l'interprétation de nos expérien ces.
.2.3. - Le Cytochrome c
nous ont pas permis de déceler la bande °( - 550 m du cytochrome c réduit.
A. Extraction du pigment (d'après Keilin (112)
Le cytochrome c peut s'extraire de levure séchée ou traitée à l'acétone. Le processus d'extraction de Keilin (112) a été appliqué à de petites quantités de leviirej l'extrait contient en plus du cytochrome c une quantité importante de protéines et de sels (dialysa- bles).
Une méthode de dosage consiste à établir successivement les spectres du cytochrome c sous les formes oxydée et réduite dans l'échantillon à doser. Les coefficients d ' absojrption étant connus pour chacune des deux fomes, on pourra calculer la concentration du pigment d'après les absorptions mesurées à 550 m |A .
L'équivalence des concentrations ainsi évaluées est une garantie de la non interférence de pigments étrangers, dont les spectres se superposent au spectre propre du cytochrome c.
Les extraits aérobies sont riches en lipoprotéines dis soutes et une observation spectrophotométrique spécifi que nécessite les extractions répétées de ces composés lipidiques.
Cette méthode appliquée à des échantillons de volxime très réduit et nécessitant des manipulations nombreuses nous apparut rapidement impropre à la comparaison même semi-quantitative de suspensions cellulaires pauvres en cytochrome c.
B. Observation spectrophotométrique d'une suspension de cellules intactes.
L’observation du spectre de hémochromes à la tempéra ture de l'air liquide et l'établissement de spectrogram- mes analysant la lumière diffusée en avant d'une suspen sion cellulaire opaque seront envisagés dans l'avenir pour l'étude des mécanismes enzymatiques in vivo.
C. Observation spectroscopique de la suspension cellulaire
La turbidité des suspensions denses rend difficilement applicable les méthodes spectrophotométriques directes. La méthode spectroscopique décrite par Keilin (116) et Keilin et Wang (115) a été utilisée pour mesurer la concentration intracellulaire en cytochrome c. A l'origine, le dispositif expérimental comprend un spectroscope couplé à un microscope : microspectroscope. La préparation à examiner est placée sur le plateau du microscope et est traversée par un rayon lumineux d'in tensité réglable.
Grâce à un prisme comparatif, le spectroscope présente dajis le même champ le spectre d'une solution de cyto chrome c réduit placée dans une cuve en coin (une con tre-cuve contient le solvant) et illuminée par iine sour ce limiineuse d'intensité réglable.
Dans notre travail, nous avons préféré remplacer le mi crospectroscope par un spectroscope de R. & J. Beck (London) à prisme comparatif très sensible pour des suspensions pauvres en pigment.
La préparation et la cuvette étant en place, les inten sités des sources lumineuses sont d'abord ajustées de manière à obtenir deux spectres montrant des intensités de fond semblables aiox environs de 550-m/1. La position de la cuvette est ensuite ajustée jusqu' à ce que les intensités des bandes à 550-m/isoient égales dans le spectre expérimental et le spectre de référence.
La concentration en cytochrome c (réduit chimiquement par Na^S^O^ dans les deux systèmes) peut alors être calculée partir de la concentration et de la densi té optique de la solution standard.
Le cytochrome c^qui est thermostable, est dosé après chauffage de la suspension de levure pendant 20 min. à 80
®.
Précision de la méthode
Si la méthode spectroscopique est caractérisée par sa grande sensibilité, l'appréciation visuelle des intensités spectrales relatives limite certainement la précision des mesures.
Expérimentalement, le résultat noté est la moyenne de 6 lectures successives ; initialement la position du chariot qui supporte le système de référence est fixée alterna tivement au-delà et en deçà de la valeur réelle.
Nous avons vérifié avec des suspensions additionnées de pigment exogène que l'imprécision n'excédait pas 15 à 20% et diminuait avec un enrichissement de l'échantillon en hémoprotéine.
Le profil d'induction du cytochrome c apparaîtra claire ment par cette méthode spectroscopique. Une étude plus quantitative d'un ajustement hémoprotéique dans la cellu le nécessitera la mise au point d'une technique spectro- photométrique plus précise. (Section B)
D. Concentration absolue en Cytochrome c de la cellule
SI Suspension cellulaire 0.5 cm Solution de référence
Soient c la concentration molaire de la solution de référence
e épaisseur de la solution en cm X nombre de moles de cyt.c/cellule N nombre de cellules dans 1 cm^ de
la suspension cellulaire
e . c . lO”'’ On peut établir la relation X =>
