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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Dujardin, E. (1968). Les acides nucléiques des feuilles et des chloroplastes au cours de l'induction photopériodique de la floraison chez l'épinard (Spinacia oleracera L.) (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

Faculté des Sciences

Service de Chimie Biologique

REÇU le

2 1 HARS1968

Uép:...

LES ACIDES NUCLEIQUES DES FEUILLES ET DES CHLOROPLASTES

AU COURS DE L'INDUCTION PHOTOPERIODIQUE DE LA FLORAISON

CHEZ L'EPINARD (SPINACIA OLERACEA L).

Mémoire présenté pour l'obtention du grade

de Docteur en Sciences Chimiques.

DUJARDIN, Esther

1968

1.

AVANT-PROPOS

La. partie biochimique de ce travail a été réalisée au Laboratoire de Chimie Biologique de l'Université Libre de Bruxelles. La culture des plantes, ainsi que certains contrôles d'ordre physiologique, ont été faits au Laboratoire de Physiologie Végétale du Centre de Recherche de Gorsem.

Nous tenons à remercier Monsieur le Professeur Chantrenne pour son bienveillant accueil, ainsi que pour l'intérêt constant qu'il n'a cessé de

montrer au cours de la progression de notre travail. Que le Docteur Sironval, dont les conseils nous ont été précieux, trouve également ici l'expression de notre reconnaissance.

Messieurs les Professeurs Brachet et Schram, ont mis à notre disposition les appareils et le personnel nécessaire aux ultracentrifugations ; Messieurs les Professeurs Jeener et Thomas nous ont permis d'utiliser leurs spectrophotomètres Cary ; nous les en remercions vivement.

Le Docteur Bronchart a exécuté les coupes et a procédé à leur examen. Monsieur Brugmans, ingénieur technicien, nous a aidœpour les dosages et la chromatographie des acides nucléiques. Monsieur Verhulst, technicien, a réalisé les centrifugations analytiques. Qu'ils trouvent tous trois ici l'expression de notre reconnaissance.

La réalisation de la présente thèse a été grandement facilitée par la générosité de l"'Union Carbide European Research Associates". Il nous est particulièrement agréable de remercier Messieurs Gillette, Ruland et Tompa, Directeurs des Laboratoires de cette société, ainsi que les membres du personnel

qui nous ont aidés dans notre travail. Nous avons également bénéficié de l'aide de l'IRSIA (Institut pour l'encouragement de la Recherche Scientifique appliquée à l'Industrie et à l'Agriculture) dont l'intérêt pour les problèmes que nous avons

traités est considérable. ,

2.

APERÇU DU TRAVAIL

Notre matériel d'étude, l'épinard (Spinacia oleracea L. ) ne fleurit qu'en jours longs. Lorsqu'il est adulte, le transfert d'une durée de jour de 8 heures dans une durée de jour de 1 6 heures, ou un traitement par "éclair" lumineux au milieu de la nuit, induisent la floraison. Les mêmes traitements, appliqués à des épinards juvéniles, ntentraînent pas la mise à fleurs.

Dans la première partie de notre travail (chapitres I, II et III), nous avons examiné l'évolution du contenu des feuilles et des chloroplastes (en chlorophylle, sucres, lipides, protéines, ARN et ADN) chez des épinards juvéniles, d'une part, et chez des épinards adultes, d'autre part, lorsqu'on les transfère de jours courts (8 h. ) en jours longs (16 h. ).

Chez les épinards adultes, nous avons observé un abaissement de la teneur des chloroplastes en ARN en rapport avec l'induction dé la floraison.

En conséquence, nous avons entrepris d'extraire les acides nucléiques des plastes par la méthode au phénol et de les fractionner sur des colonnes d'albumine méthylée (chapitre IV). Nous avons étudié certaines de leurs propriété s.

Nous avons ainsi constaté notamment que la proportion des divers ARN était modifiée après le traitement inducteur.

Nous avons ensuite réalisé des expériences d'incorporation de précurseurs radioactifs (^^P) dans les acides nucléiques. Elles nous ont conduit à observer que l'ADN associé à la fraction plastidiale incorpore une quantité plus considérable du précurseur que l'ADN extrait de la fraction nucléaire.

Enfin, nous avons étudié (chapitre V) le comportement des ADN foliaires au cours de l'induction photopériodique de la floraison, en les séparant, après

3.

I. La mise à fleurs et la durée relative des jours et des nuits.

Depuis les époques les plus reculées, l'homme,-intéressé par la culture et l'utilisation des plantes qui l'entourent-, a constaté qu'elles fleurissent aux mêmes périodes de l'année - qu'elles "reconnaissent" les saisons. Il ne s'est demandé pourquoi il en était ainsi que beaucoup plus tard. On peut considérer ce problème comme l'un des principaux posés par l'étude physiologique et biochimique du développement des plantes.

a) La mise à fleurs.

Le développement d'une plante supérieure peut être sommairement décrit comme suit :

A partir de la graine en germination, la radiculeetla gemmule donnent

respectivement naissance à la racine primaire et à la tige principale. Ces deux organes croissent aux dépens des réserves accumulées dans la graine, puis aux dépens des produits photosynthétisés par les cotylédons verdissants.

La tige principale s'allonge. Elle se constitue à partir d'un bourgeon qui la termine vers le haut, en conséquence de l'activité d'un organe particulier : le méristème. Cet organe produit, outre l'axe de la tige, les ébauches dont dérivent les feuilles successives échelonnées le long de l'axe.

En absence d'un stimulus adéquat - dont nous parlerons plus loin - le méristème peut en principe former indéfiniment des feuilles insérées le long de la tige. Cette capacité de croissance continue (une sorte d' "embryogenèse"

continue)est une des caractéristiques du règne végétal.

Le déclenchement des processus conduisant de l'état végétatif (où la plante forme exclusivement des axes porteurs de feuilles) à l'état reproductif (où la plante produit des fleurs) s'exprime en général par une modification de la forme des feuilles et par l'allongement de l'axe principal. En même temps, le fonctionnement du méristème se modifie, de telle sorte qu'il construit finalement des organes d'un type nouveau constituant la, ou les fleurs. Dans le cas précis de l'épinard, les fleurs peuvent être mâles ou femelles (il y a des individus mâles et d'autres femelles) ; elles apparaissent à partir de bourgeons axillaires, un grand nombre de ces bourgeons se formant lelong d'un axe qui poursuit sa crois­ sance pendant des dizaines de jours (axe florifère). Chez les épinards mâles, l'axe porteur de fleurs meurt plus tôt que chez les épinards femelles.

4.

plus ou moins longue selon les espèces : elles restent latentes au sein de cellules particulières. Ensuite, un facteur intervient qui démasque ces potentialités : la plante passe de l'état végétatif à l'état reproductif. En quoi consiste ce facteur ?

b) L'action de la durée des jours sur la mise à fleurs.

11 est établi que plusieurs facteurs du milieu environnant ont une action sur la mise à fleurs. Cela ressort d'emblée du fait que, comme nous l'avons dit plus haut, chaque espèce fleurit à une époque déterminée de l'année, dans des

conditions de climat déterminées. Le plus remarquable de ces facteurs semble être la durée relative des jours et des nuits.

' La démonstration sans équivoque de l'influence de la durée des jours date

des années 1910-1920. A cette époque. Tournois (1912) sur le chanvre et le

houblon d'une part, puis Garner et Allard (l920, 1925) sur des tabacs (Maryland Mammoth) d'autre part,, ont constaté que la floraison se produit seulement

lorsque l'éclairement journalier atteint une certaine durée, longue ou courte selon les espèces. Ainsi, les tabacs de Garner et Allard se mettent à fleurir lorsque les jours deviennent suffisamment courts (moins de 10 heures) quelle que soit la date du semis. Si les jours sont maintenus longs (par exemple 16 heures), ces tabacs restent indéfiniment végétatifs.

Garner et Allard constatèrent que 1 e comportement du tabac Maryland Mammoth n'est pas une exception. Ils admirent qu'en général, les plantes supé­ rieures se classent en gros en trois catégories :

1) les plantes de jours longs, qui demandent pour fleurir une durée de jour supérieure à une certaine limite (+ 10 heures) ;

2) les plantes de jours courts, qui ne fleurissent au contraire que si la durée du jour est inférieure à une certaine limite ;

3) les plantes indifférentes qui fleurissent en jours courts, comme en jours longs, mais manifes tent 4'anq ou4'autre préfér r ncc particulière.

En fait, ce schéma est cependant trop simple : tous les végétaux ne rentrent pas dans les trois catégories citées. Certains ont des exigences plus spéciales : Bryophyllum tubiflorum par exemple, est une plante de jours longs- jours courts. Elle fleurit en jours courts, à condition d'avoir reçu auparavant un certain nombre de jours longs. En jours courts continuels, ou en jours longs

continuels, Bryophyllum ne fleurit pas. D'autres espèces contrôlent leur floraison par la combinaison de deux ou de plusieurs facteurs (durée de jour et humidité relative du sol ou de l'air, durée de jour et température, et.).

c) L'hypothèse du florigène.

Garner et Allard ont tenté d'expliquer le mécanisme sous-jacent à

l'action de la durée des jours. Ils ont été les premiers à constater qu'en général, l'effet de la durée des jours est enregistré par la feuille en croissance, beaucoup plus que par le bourgeon terminal qui est souvent pratiquement insensible. Ce fait a été confirmé par Knott (1934) dans des expériences plus précises, puis par

contrai-5.

I

re, si les feuilles sont placées en joiirs longs, le bourgeon étant maintenu en jours courts, la plante forme des fleurs. L'épinard est une plante type "de jours longs".

Pour interpréter le résultat de son expérience, Knott admd; le transport d'un stimulus de la feuille vers le méristème, lorsque les jours sont longs. La substance responsable de ce stimulus serait synthétisé en jours longs dans la feuille.

L'hypothèse du stimulus "floral" a été précisée par la suite. En 1936, Moshkov constate qu'on peut obtenir en jours longs la floraison d'un axe du tabac de jours courts "Maryland Mammoth", à condition d'y greffer un tabac de la variété "Sampson" indifférente à la durée des jours. De même, utilisant des plantes de Perilla qui ne fleurissent qu'en jours courts, Cajlakjan (1937) réussit à les mettre à fleurs en jours longs, en leur greffant des feuilles isolées qui

s'étaient formées auparavant en jours courts. Il montre que ces feuilles, formées en jours courts, contiennent quelque chose qui fait fleurir, et il propose d'appeler cet agent inconnu "hormone florigène" ou "florigène". Cajlakjan mesure quantita­ tivement l'activité de cet agent. Il démontre qu'il s'accumule dans la feuille et prouve sans discussion possible qu'il peut se transporter des feuilles vers le méristème à travers une greffe, le transport se faisant de cellule à cellule.

Cependant, l'hypothèse du florigène s'est heurtée au cours des années à quelques complications. On a, par exemple, constaté que, dans certaines condi-- tions, l'effet du florigène, provenant d'un donneur déterminé, était d'autant plus marqué que l'accepteur était lui-même dépourvu de feuilles (Moshkov, 1937). Il apparut, par exemple, (Hamner et Sonner, 1938) qu'une feuille de Xanthium Pensylvanicum (plante de jours courts) cultivée en jours longs était capable de neutraliser l'effet produit par une feuille de la même piarteicdtivée en jours courts, à condition qu'elle se trouve située entre la feuille en jours courts et le méristème. Ces faits , et quelques autres du même ordre, ont conduit Lona (1948) à supposer que l'action du florigène pouvait se trouver neutralisée par la synthèse d'une ou de plusieurs substances "antiflorigènes". Lona a même proposé que la mise à fleurs était induite au niveau du méristème, non par l'apport d'une substance florigène, mais par la neutralisation des effets d'une substance antiflorigène. L'embarras est ensuite devenu d'autant plus grand qu'on n'a pas réussi à trouver une substance unique dont les propriétés correspondent à celles que devrait avoir le "florigène" postulé.

Un grand nombre d'expérimentateurs ont essayé à diverses reprises, et avec plus ou moins de succès, d'isoler des feuilles une substance qui soit capable de provoquer la floraison en toute circonstance. Jusqu'à présent, ces efforts sont restés vains. Des extraits lipidiques favorisant la floraison ont été préparés par Sironval (l957a), à partir de feuilles de fraisiers en fleurs. Leur activité est due en partie à leur contenu en vitamine E et en partie à leur contenu en stérols. L'action favorable de la vitamine E a été souvent observée (Mickniewicz et

Kamieska, 1966).La vitamine K augmente d'ailleurs, elle aussi, le nombre de fleurs chez Datura stramonium (Hemberg et Lowen ; 1954). Certains stérols interviennent probablement aussi (Sironval, 1957a ; Sironval, Clysters et Marcelle, 1963 ;

Donner et coll. , 1963). Des extraits lipidiques actifs ont é*^é préparés à partir

6.

substances connues, comme les auxines ouïes gibberellines , ne présentent l'acti­ vité que devrait posséder le florigène postulé par Cajlakjan.

Les caractéristiques de la vitesse de déplacement dans la plante différen cient notamment le florigène des autres hormones végétales connues (auxines, gibberellines, kinétines. . Les gibberellines qui activent fortement la floraison de beaucoup déplantés de jours longs, lorsqu'on les cultive en jours courts ne peuvent pas provoquer la floraison des plantes de jours courts cultivées en jours longs. Or, il est certain que l'hormone florigène doit être la même pour les plantes de jours courts et de jours longs [les expériences de greffage le prouvent

(voir ci-dessus l'expérience de Cajlakjan)].

d) Extrême sensibilité des plantes photopériodiquement sensibles aux

modalités de l'éclairement journalier ; le phytochrome.

Un autre aspect du contrôle de la durée des jours sur la mise à fleurs mérite de retenir l'attention.

Hamner et Bonner (1938), Moshkov (1940) puis Lang et Melchers (1943) ont observé que les limites de durée de jour, en-deça ou au-delà desquelles les variétés photopériodiquement sensibles sont induites à fleurir, sont étonnamment strictes. La variété de chrysanthèmes "Queen Mary" par exemple, ne fleurit que si la durée du jour est supérieure à 5 1/2 heures et inférieure à 14 heures (plante de jours courts). Hyoscyamus niger ne fleurit que si le jour excède 10 heures (plante de jours longs ; cette espèce ne fleurit pas si le jour est de 9 1/2 heures, etc. ).

Par ailleurs, des interruptions de la nuit, même par de courtes périodes lumineuses, peuvent être décisives. Un éclair donné au milieu d'une nuit longue, normalement inductrice de la mise à fleurs pour des plantes de Xanthium

pennsylvanicum, empêche totalement cette mise à fleurs (Hamner et Bonner; 1 938). Au contraire, Hyoscyamus niger (plante de jours longs), peut fleurir en jours courts si elle reçoit au milieu de la nuit un éclairement de deux heures (même de très faible intensité : Lang, 1965).

L'effet optimum de l'éclairement nocturne est obtenu pour des longueurs d'onde de 650-660 millimicrons. Il est possible d'effacer l'action de cette lumière rouge en la faisant suivre immédiatement par une lumière rouge-lointain autour de 730 mM.(Borthwick et coll. , 1952). Cherchant à interpréter ce fait, Borthwick et coll. ont découvert l'existence dans la plante d'un système protéine-pigment réversible. Ce système comporte deux formes ; la première absorbe la lumière rouge pour donner l'autre forme, laquelle absorbe dans l'infra-rouge. Lorsqu'on l'éclaire avec l'infra-rouge, ou lorsqu'elle reste à l'obscurité, la forme infra­ rouge donne à nouveau la forme rouge. Le système a été appelé "phytochrome". La protéine qui y correspond a été isolée. Le groupe chromatophore qu'elle

7.

e) Multiplicité des effets de la durée relative des jours et des nuits. Le déclanchement de la mise à fleurs n'est pas l'unique processus physiologique réglé par la durée des jours. La jiante réagit encore de plusieurs autres manières aux caractères de cette durée, l'état d'avancement du dévelop­ pement de végétal déterminant par exemple pour une bonne part la nature de sa réponse (‘^ironval, 1957a).

Certains végétaux, comme le fraisier des quatre-saisons forment des feuilles de forme différente selon que les jours sont courts ou longs. Chez d'autres, le régime photopéi indique détermine la formation des bulbes ou des tubercules. Les racines des légumineuses portent des nodules plus nombreux et mieux constitués en jours longs qu'en jours courts. La formation desstolons chez le fraisier dépend de la durée de l'éclairement journalier. Cette multiplicité des effets suggère que la durée des jours agit sur des aspects fondamentaux du méta­ bolisme, ces aspects influençant, selon le cas, tel ou tel processus morphogénéti­ que spécifique.

Nous retirerons essentiellement de tout ceci que la mise à fleurs n'est qu'un des processus morphogénétiques contrôlés par la durée des jours chez les plantes supérieures. En durée de jour adéquate, un stimulus floral ou florigène est synthétisé dans les feuilles. Ce stimulus migre vers les méristèmes, au sein desquels il active les divisions cellulaires d'une manière telle qu'un organe nou­ veau, la fleur, y est produit. La nature chimique duâorigène est actuellement inconnue bien que divers produits ont été découverts qui sont doués de propriétés activantes à l'égard de la floraison._______________________________________________________________ IL Le métabolisme et la mise à fleurs.

a) L'absorption du et la durée des jours.

Une des premières questions que l'on se pose en étudiant la nature des modifications biochimiques accompagnant l'induction florale concerne l'activité

photosynthétique. L'absorption du CO2. et éventuellement l'émission correspon­

dante de l'oxygène, changent-elles en rapport avec cette induction ?

On admet en général qu'il n'existe pas de lien direct entre l'activité

photosynthétique et l'induction photopériodique. Les arguments les plus importants qui étayent cette conclusion sont les suivants :

1) l'induction photopériodique ne dépend pas de l'intensité lumineuse ; des

intensités très faibles suffisent à la provoquer ;

2) des éclairements de très courte durée peuvent être décisifs.

Cependant, lorsqu'on appauvrit l'air en CO2 pendant la nuit induc trice, la

floraison des Xanthium n'est pas induite. D'autres données encore font penser que

l'absorption du C02,ou son émission par la plante,ne sont pas étrangèi^ aux effets

8.

Kalanchoë blos sfel diana (P JC), démontrent que lesmodalités de cette absorption dépendent de la photopériode, comme c'est le cas de la mise à fleurs. En jours courts, Kalanchoë absorbe de l'anhydride carbonique dès le lever du jour. Une heure plus tard, l'absorption est remplacée par une émission qui croft jusqu'à un maximum situé 4 heures environ après le lever du jour ; durant la nuit, l'absorp- tion est très intense : dans ces conditions, les Kalanchoë fleurissent. En jours longs, le tableau est entièrement différent : l'absorption du CO^ dure tout le jour ; elle se réduit pendant la nuit ; on n'observe d'émission ni le jour, ni la nuit. Dans ces conditions, les Kalanchoë ne fleuris sent pas.

Spear (1959) relève les points suivants de convergence qui semblent lier

l'intensité de l'absorption du CO^ et le déclenchement de la floraison chez Kalan­

choë. 1) Les deux processus (absorption du CO2 et floraison) sont induits ou

augmentés par des jours courts (nuits longues). 2) La vitesse maximum d'absorp­

tion du CO2 se rencontre 11 à 12 heures après la tombée de la nuit : cette durée

correspond à la période obscure critique pour l'induction florale. 3) La fixation

du CO2 cesse après 16 heures d'obscurité ; cette durée correspond à la durée de

la nuit optimale pour l'induction de la floraison, ainsi que l'a montré Harder (1948).

4) Ni la fixation du CO2, ni l'induction florale n'ont lieu si elles nè sont pas

précédées par une phase de lumière, dans le cas de périodes obscures prolongées (48 heures). 5) Les deux processus sont inhibés lorsque les nuits longues sont interrompues par un éclairement. 6) Tous deux sont observés après que les Kalanchoë ont reçu un certain nombre suffisant de nuits longues (jours courts).

7) Lorsqu'on utilise des cycles de 96 heures, comportant une nuit longue de

84 heures interrompue à différents moments, on constate que les traitements qui

inhibent la floraison inhibent aussi l'absorption du CO2. 8) Enfin, il n'est pas

possible d'induire la floraison si la plante ne reçoit pas de CO2 pendant la période

obscure. Des résultats analogues sont actuellement obtenus par Marcelle (1967) sur Bryophyllum tubiflorum et Bryophyllum daigremontianum avec des techniques

améliorées.

Kunitake et coll. (1957) ont cherché à déterminer ce que devenait l^^C^

chez Kalanchoë selon que la photopériode est longue ou courte. Utilisant du ^ ^^2’

ils ont d'abord confirmé qu'en jours courts, le CO2 était fortement absorbé pendant

la nuit. Examinant la radioactivité spécifique des acides malique, aspartique, glutamique, citrique et isocifrique, succinique et fumarique, dans les feuilles de Kalanchoë induits et non induits, ils ont constaté que la radioactivité était

distribuée de la même manière entre les acides, en jours courts et'ên jours longs,

mais que la quantité de CO2 incorporé était plus comsîcJérable» en jours courts qu'eu

jours longs. Utilisant des mâiodes différentes,, Craiwiorë ((19 61) atrruv"© eu fa.it’à, la même conclusion chez une plante très différente : une variété de jours longs de Salvia splendens. 11 constate que,chez cette variété, le glucose incorpore plus

fortement la radioactivité du ^"^C02cn jours longs qu'en jours courts et que par

ailleurs le pool des précurseurs du glucose est plus abondant en 16 heures qu'en 8 heures.

b) Le contenu des tissus en divers acides organiques et en sucres.

Les changements dans l'absorption du CO2 par les feuilles en fonction du

9.

Becker montre en 1953 que pendant le jour, l'acidité des feuilles de Kalanchoë n'est pas la même en jours longs qu'en jours courts. Travaillant également sur Kalanchoë blossfeldiana, Queiroz (l 965)observe une accumulation plus forte des acides tricarboxyliques , en particulier de l'acide malique, en jours courts qu'en jours longs ; il remarque que cette accumulation est dépendante de la température. Un fait analogue est signalé chez l'épinard par Buckley (1961) ; en jours courts les acides malique, citrique et succinique s'accumulent. Au moment du transfert de 8h en 1 6h de jour, la quantité de ces acides (en particulier l'acide L-maliqne-) diminue puis se stabilise après quelques jours.

Murneek, en 1937, observe une accumulation des sucres dans la feuille de Soja hispida après induction photopériodique de la floraison. Sissakian et

Kobiakova (1940) montrent une influence de la photopériode sur le contenu des feuilles en saccharose. Rappelons qu'en 1918 déjà, Klebs avait mis en évidence des modifications allant dans le sens de l'accumulation de molécules ne contenant pas d'azote au moment de la mise à fleurs. Ses mesures nous paraissent actuel­ lement très grossières ; elles concernaient la valeur du rapport C/N dans différents organes, avant et après l'induction florale.

c) Les synthèses protéiques et la mise à fleurs.

11 est connu que la lumière agit sur les synthèses protéiques au sein des feuilles. Ainsi, De Deken-Grenson (195.4) observe une synthèse protéique accrue au niveau des chloroplastes de feuilles de chicorée étiolées lorsqu'elles sont

placées à la lumière. Cette synthèse est sans doute en rapport avec l’accroissement ‘ de certaines activités enzymatiques à la lumière : Holden (l96l) par exemple, mesure un accroissement de l'activité de la chlorophyllase dans les feuilles lorsque des pois étiolés sont éclairés. Keister et coll. (196Z) constatent que l'activité de la

transhydrogénase foliaire est plus faible chez les haricots étiolés que chez les haricots verdissants.

On peut dès lors s'attendre à ce que le passage d'un régime photopériodi­ que dans un autre provoque des variations dans la synthèse des protéines. En 1955, Metzner montre que la teneur des feuilles en protéines se modifie au cours de

l'induction photopériodique de la floraison. Gifford et Tepper (196Z) notent de même une variation de cette teneur dans les feuilles de Chenopodium album dès le début de l'induction florale.

L'effet du transfert d'une durée de jour non inductiiœ dans une durée de jour inductrice se manifeste aussi au niveau des synthèses protéiques au sein des méristèmes. Gifford et Tepper (196Z) trouvent que les cellules méristématiques de Chenopodium album augmentent leurs synthèses protéiques dès le début de l'induc­ tion photopériodique, tandis que Brondiart et Nougarède (1967), voient l'activité mitotique des cellules du méristème de Sinapis alba , augmenter au moment de l'induction photopériodique de la floraison. D'ailleurs, lors de la mise à fleurs, la prolifération accrue des cellules du méristème et la floraison qui en découle, peuvent être bloquées par divers inhibiteurs de synthèse protéique.

10.

inverse ne se produit pas (Zeevaart, 1962).

Il semble donc bien que de nouvelles protéines se forment dans la feuille et dans le bourgeon terminal, en particulier au niveau du méristème, au moment de l'induction. Ces changements suggèrent une participation des acides ribonu- cléiques et désoxyribonucléiques dans le processus de la mise à fleurs.

d) Intervention des acides nucléiques dans l'induction florale.

a. Une série de travaux concernent l'action d'inhibiteurs du métabolisme des acides nucléiques.

Salisbury et Bonner (i960) trouvent que l'application de 5-fluorouracile et de 5-fluoro-désoxyuridine à des Xanthium dans le cours d’une longue nuit

inductrice empêche la floraison si ces produits sont appliqués, soit à la feuille avant la production du stimulus floral, soit au bourgeon avant l'arrivée du

stimulus. L'action inhibitrice du 5-fluorouracile et de la 5-fluorodésoxyuridine est levée par l'addition de précurseurs normaux des acides nuclâques.

L'intervention des inhibiteurs de la synthèse d'acides nucléiques au niveau des feuilles a été étudiée par Heslop-Harrison (i960). Heslop-Harrison applique du 2— thiouracile à des feuilles de chanvres indiens et empêche ainsi leur florai­ son. L'examen microscopique révèle dans les feuilles des aberrations dans la dif­ férenciation des cellules, ainsi que des modifications importantes au niveau de la structure des chloroplastes et de leur contenu en chlorophylle.

Watson et Matthews (1966) vont encore plus loin. Ils trouvent que l'acti- nomycine D et le 2-thiouracile inhibent la floraison de Chenopodium amaranticolor (plante de jours courts) si on les applique à la fin de la période obscure inductrice. Analysant ce qui se passe au moment de l'induction» Watson et Matthews mettent

en évidence la présence d’un ARN marqué au résistant à la ribonucléase, dans

le bourgeon apical des plantes induites. Par fractionnement sur colonne d'albumine méthylée, ils constatent que cet ARN particulier est associé à de l'ADN, probable­ ment sous la forme d'un hybride ARN-ADN. L'hybride ne peut être détecté, ni chez les plantes non induites, ni chez celles qui ont été transférées dans une durée de jour inductrice en présence d'actinomycine^ ou de 2-thiouracile. Watson et Matthews pensent que l'ARN trouvé, associé à de l'ADN, pourrait être un ARN spécifique qui apparaîtrait au moment du déclenthement de la mise à fleurs.

Notons qu'on a parfois rencontré certains effets inattendus lors de l'admi­ nistration d'inhibiteurs de la synthèse des acides nucléiques. Brown (1962) par exemple a observé que des analogues de la thymidine (la 5-iododésoxyuridine et la 5-bromodésoxyuridine) induisent la floraison de la plante de jours longs Arabidopsis Thaliana Heyn. De même, Marcelle (1966) trouve que la floraison de Bryophyllum tubiflorumn'est pasinWbéepar l'application de 2-thiouracile en jours courts continuels. De toute manière, l'ensemble de ces données indique que la synthèse de certains ARN dans les feuilles est nécessaire au déclenchement des processus qui conduisent à la mise à fleurs. Nous ne considérons ici que pour mémoire les autres faits

P. D'autres travaux concernent le contenu en acides nucléiques.

Gulisch (i960) fut l'un des premiers à analyser les changements du conte­ nu des feuilles de Kalanchoê blossfeldiana ' en ces acides au cours de l'induction florale. Il a constaté que ce contenu variait en rapport avec l'induction.

Hess (1961 a et b) a mesuré pour sa part le contenu en acides nucléiques des

feuilles de Streptocarpus induits, en fleurs, ou végétatifs. Le contenu des feuilles en ARN et ep ADN est modifié pàrr'l'induçticm.de lé^£lorais,on,mais il est difficile d'apprécier le sens des modifications à partir des données de l'auteur. En particu­ lier, le rapport ARN/ADN s'abaisse au cours de l'induction tandis que le rapport G/C dans les ARN augmente légèrement. D'autre part, le TMV ne se multiplie pas dans la feuille au moment de l'induction, tandis qu'il se multiplie normalement avant ou après celle-ci. Hess pense qu'au cours de l'induction les ARN sont diffici­ lement synthétisés par la feuille, et qu'après l'induction, la feuille contient un ou plusieurs ARN spécifiques de la floraison. Il trouve également que les feuilles des plantes induites incorporent moins de phosphate radioactif dans leurs ARN que celles des plantes végétatives.

Cependant les faits se présentent différemment au niveau des méristèmes. L'examen histochimique révèle un enrichissement en ARN des cellules méristéma- tiques de Sinapis alba au moment de l'induction florale. L'enrichissement est no­ table quelques heures seulement après le début du traitement inducteur (Bernier et coll. 1967). A ce moment, la thymidine radioactive s'incorpore plus activement dans l'ADN du méristème, aussi bien nucléaire que cytoplasmique. Un travail de Bernier et Bronchart (1963), indique une incorporation importante dans des struc­ tures cytoplasmiques du méristème qui pourraient être des proplastides ou/et des promitochondries.

En gros, l'examen des données biochimiques indique que la mise à fleurs des plantes supérieures correspond à des transformations multiples du métabolis­ me .

Il est difficile de dire jusqi'^à quel point telle ou telle de ces transforma­ tions précède, coîhcide ou résulte du déclenchement de la floraison. Certaines d'entre elles,en particulier celle qui concerne les acides nucléiques et la synthèse protéique, pourraient cependant jouer un rôle essentiel qu'il paraît utile de considé­

rer de plus près.

--- —r III. Les chloroplastes et l'induction florale.

Une série d'arguments qui seront développés ci-dessous (en c) impliquent les pigments des plastes dans l'action de la durée des jours sur la mise à fleurs et

le développement des plantes. Les chloroplas tes sont par là concernés. '

- I ... ■ ,

(’L C'est pourquoi nous leur avons consacré l'essentiel de

12.

a) L'ARN plastidial et la synthèse des protéines au sein des plastes.

Les chloroplastes sont des organites caractéristiques des végétaux verts. Chez les plantes supérieures, on les trouve surtout dans les feuilles. Ils possèdent une double membrane périphérique, dont les invaginations donnent naissance à un système de membranes, appelées lamelles, baignant dans une matière non lamellai­ re appelée stroma. Les lamelles sont constituées de lipoprotéines portant les

pigments chlorophylliens.

La microscopie électronique montre que les chloroplastes contiennent des ribosomes ; ces ribosomes se trouvent dans le stroma du plaste et dans les espaces interlamellaires. Leur taille est différente des ribosomes cytoplasmiques. On peut les isoler par centrifugation différentielle ; leur coefficient de sédimentation est différent de celui des ribosomes cytoplasmiques (Lyttleton, 1962 ; Sissakian et coll. , 1967).

Chez l'épinard, les ribosomes chloroplastiques contiennent un ARN de composition différente de celle des ribosomes du cytoplasme (Lyttleton, 1962 ;

Statz et Noll, 1967). Les ribosomes plastidiaux peuvent participer à la formation de polyribosomes et selon Clark et coll. (1964), la formation de ces polyribosomes est influencée par la lumière ; on peut observer leur formation quelques minutes après le lever du jour ; les chloroplastes des plantes placées à l'obscurité semblent ne contenir que des ribosomes isolés.

Outre les ribosomes et les polyribosomes, les chloroplastes contiennent des enzymes d'activation des acides aminés et de l'ARN soluble (Sissakian, 1964 ). Cependant, il se pourrait qu'au sein des plastes, la synthèse protéique suive en partie des voies particulières ; Sissakian a en effet montré que la fraction lipidique

extraite de chloroplastes auxquels on avait fourni des acides aminés marqués , était fortement radioactive ; il a même pu isoler des lipides portant de petits groupes polypeptidiques marqués.

14

Les chloroplastes de différents organismes végétaux incorporent du ^‘^2.

dans la fraction protéique précipitée par l'acide trichloracétique (Chantrenne et coll., 1953 ; Brachet et coll.j 1955). Les protéines de structure du chloroplaste semblent avoir une activité spécifique supérieure à celle des protéines solubles (Parthier, 1963). Cette incorporation est également réalisée par des chloroplastes isolés ; elle semble plus importante à la lumière qu'à l'obscurité (Eisenstadt et Brawerman, 1963 ; Sissakian, 1967).

Il est actuellement admis que les chloroplastes synthétisent de l'ARN. Les chloroplastes d'Euglena gracilis, par exemple (Brawerman, Pogo et Chargaff, 1962) accumulent de l'ARN lorsqu'on fait passer les euglènes de l'obscurité à la lumière. De Deken-Grenson (l954) a de même observé une augmentation du contenu plastidial en ARN lors du verdissement à la lumière de feuilles de chicorées étiolées. Les chloroplastes isolés à partir de feuilles de tabac sont d* ailleurs capables d'in­ corporer des ribonucléotides dans leur ARN(Semal et coll. , 1964 ; Kirk, 1967).

Tous ces faits indiquent que le chloroplaste possède, outre des systèmes qui lui permettent de former des sucres, de l'ATP et des acides aminés à la

13.

pourraient être spécifiques du plaste (Criddle, 1967),ainsi que la synthèse des enzymes nécessaires à la synthèse de l'ARN et de l'ADN (Gibor, 1967).

b) L.*ADN des chloroplastes.

On sait que les observations anciennes de Renner (1934) l'avaient

conduit à suggérer que le chloroplaste pouvait être le porteur de certains caractères de l'hérédité cytoplasmique. En 1958, Brachet montrait que les chloroplastes

d'acétabulaires incorporent de la thymidine tritiée ; par la suite, il constatait que de l'ADN était présent dans les chloroplastes de cette algue (Baltus et Brachet, 1 963). Metzner avait abouti dès 1952 à une conclusion analogue en étudiant des plastes de plantes supérieures. Chiba et Sugahara sont parvenus en 1957, à extraire de l’ADN à partir de chloroplastes d'épinards fortement purifiés.

Cependant, ce n'est qu'au cours des dernières années qu'on a acquis la certitude que les chloroplastes contiennent de l'ADN grâce à la microscopie élec­ tronique d'une part, et grâce à la technique d'ultracentrifugation sur gradient de densité de chlorure de césium, des différents ADN cellulaires, d'autre part.

Isolant l'ADN associé aux chloroplastes d'Euglena gracilis, Ray et Hana- walt (1964), Edelman, Schiff et Epstein (1965), Brawerman et Eisenstadt (1964), ont montré que cet ADN avait une composition en bases différente-de celle de l'ADN nucléaire. L'ADN plastidial est spécifique du chloroplaste, puisque les

souches d'euglène incapables de former soit des proplastes, soit des chloroplastes, ne semblent pas contenir cet ADN(Ray et Hanawalt, 1965 ; Schiff et Epstein, 1967). Chez 1' euglène, la densité de l'ADN chloroplastique est inférieure à celle de l'ADN nucléaire. Au contraire, chez les organismes supérieurs étudiés jusqu'ici, sa densité est supérieure à celle de l'ADN du noyau (Chun, Vaughan et Rich, 1963). L'ADN plastidial possède une structure çn double hélice ; son point de fusion est supérieur à celui de l'ADN nucléaire.

La présence d'un ADN particulier dans les chloroplastes permet d’expli­ quer non seulement la nature de l'hérédité cytoplasmique découverte par Renner et d'autres, mais encore l'autonomie relative dont jouit le chloroplate au sein de la cellule végétale. Les expériences d'énucléation ont prouvé que des acétabulaires anuclées survivent pendant des semaines après leur énucléation ; au moment de l'énucléation, on observe des synthèses accrues de protéines, d'ARN et d'ADN dans les chloroplastes (Brachet et coll. , 1955 ; Janowski, 1965).

L'ADN semble pouvoir en partie régir la synthèse d'ARN au sein des plastes. Sissakian et coll. (1967), observent par exemple, un abaissement de 40% du taux de synthèse d'ARN dans les plastes isolés de pois en ajoutant de la

désoxyribonucléase au milieu d'incubation. L'actinomycine D exerce une inhibition analogue sur un système de chloroplastes isolés à partir d'acétabulaires (Goffeau et Brachet, 1965).

La propriété la plus surprenante de l'ADN chloroplastique (pu . 2

xèxtranucléa.ire) , réside dans le fait qu'il se renouvelle constamment au sein de la cellule ; son turnover est considérable par rapport à celui de l'ADN nucléaire. Ceci est vrai aussi bien chez les végétaux inférieurs que supérieurs (Green et

14.

Comme des divisions de chloroplastes n'ont pas encore été observées clairement chez les végétaux supérieurs, (chez les mousses et les algues, on les a remarquées depuis longtemps J- Sironval, 1947;'' Grahidc, 1,961) - , certains auteurs (Frey- Wyssling, 1967 ; Miihlethaler, 196/) s'appuyant sur des observations au microsco­ pe électronique, pensent que les proplas tides, ou même les chloroplastes, peuvent bourgeonner. 11 est dès lors possible que deux mécanismes de synthèse d'ADN existent simultanément dans le plaste ; une réplication qui coihciderait avec la di­ vision ou le bourgeonnement, et un renouvellement continuel non lié à la division ou au bourgeonnement plastidial. Sampson et coll. (1963) inclinent cependant à attribuer surtout à 1'ADN"satellite"le rôle d'un "ADN métabolique", pouvant se comporter différemment selon l'état de développement du végétal et les conditions du milieu ambiant.

Ajoutons qu'au sein des plastes, l'ADN seiaitlocalis é dans des zones transparentes aux électrons. Kislev, Swift et Bogorad (1967) pensent qu'il est distribué au hasard dans le stroma chloroplas tique interlamellaire, dans des zones nucléoplasmiques qui ressemblent à celles des bactéries. CependantjBisalputra et Bisalputra (1967) trouvent que, chez l'algue brune Egregia menziesii, l'ADN est localisé aux deux pôles du chloroplaste, au niveau des terminaisons lamellai­ res auxquelles il serait associé.

c) Les pigments des plastes et la durée des jours.

Dans la cellule foliaire, les pigments des chloroplastes réagissent nettement à l'action de la durée des jours et à l'induction de la mise à fleurs.

Dès 1937, Murneek travaillant sur Soja hispida, avait mesuré des varia­ tions nettes dans le contenu des feuilles en carotènes et en xanthophylles selon la durée de jour appliquée, et l'état induit ou non-induit des plantes. Reprenant cette observation, Bode (l94Z) démontra un peu plus tard que les feuilles de Kalanchoe depuis longtemps en fleurs en jours courts sont enrichies en chlorophylle par rapport aux feuilles de témoins végétatifs. Taranez (1950) trouve des faits analo­ gues sur Perilla.

Partant de ces observations, Sironval (l957b) étudie le métabolisme des pigments chlorophylliens chez le fraisier des quatre-saisons. Il décrit des varia­ tions diurnes dans le contenu des feuilles. Ces variations sont fonction du régime photopériodique. Par ailleurs, l'induction provoque un ralentissement de l'accu­ mulation des chlorophylles dans la feuille de formation. Ce ralentissement est par la suite observé par le même auteur chez d'autres espèces en liaison avec la mise à fleurs. Pour Sironval, l'essentiel des effets de la durée des jourssur le contenu en pigments concerne l'activation ou au contraire le ralentissement parfois consi­ dérables, de l'accumulation des chlorophylles dans la feuille, observés lors du transfert brusque des plantes d'une durée de jour dans une autre, (effet de

transfert). Chez le chanvre, par exemple, le transfert de jours courts en jours longs arrête la mise à fleurs, tandis que la'quantité de chlorophylles dans la feuille peut tripler en 48 heures. Cette circonstance parait d'autant plus remar­ quable que la teneur des feuilles en pigments hématiniques reste constante

15.

Selon Sironval (1962), il est erroné de rechercher une règle générale qui imposerait à toutes les plantes de jours courts une teneur en pigment plus élevée en jours courts, et à toutes les plantes de jours longs une teneur plus élevée en jours longs. Cette position est pourtant implicitement adoptée par von Witch (1959).

D'autres facteurs que la durée des jours ayant une action sur la mise à fleurs agissent aussi parallèlement sur le contenu en chlorophylle des plantes. C'est notamment le cas de la gibbérelline (Marcelle, 1966).

Nous avons déjà cité plus haut les expériences de Heslop-Harrison (i960). Une autre coihcidence de même genre concerne les effets de la lumière rouge et infra­ rouge, dont le rôle dans le contrôle morphogénétique au niveau de l'organisme en­

tier s'accompagne d'effets sur ^ le contenu en chlorophylle, Mego et

Jagen-dorf (1961) notamment,montrent que chez les haricots étiolés, la formation de la chlorophylle à la lumière est favorisée par un court édairement rouge et que cet effet favorable peut être supprimé si l'éclairement rouge est immédiatement suivi par un éclairement rouge-lointain de courte durée,

A cet égard, les expériences de Frédéric et De Greef (1966) sont remar­

quables. Travaillant sur une hépatique. Marchanda polymorpha, ces chercheurs constatent que le système rouge-infra-rouge règle à la fois certains aspects de la morphogenèse du thalle et le contenu en chlorophylle. Des faits du même genre sont obtenus par Mohr et ses élèves (1964) sur la fougère Dryopteris filix Mas. Mohr observe que l'action morphogénétique de la lumière sur les prothalles de cette fougère est liée à son action sur les fonctions et la structure des chloro- plastes. Sironval (1947) avait d'ailleurs montré que la forme des plastes change très nettement en rapport avec les étapes du développement du protonéma de la mousse Funaria hygronnétrica étapes qui sont elles-mêmes contrôlées par les con­ ditions de la culture, en particulier par les conditions de son éclairement.

Ajoutant qu'en expérimentant sur des acétabulaires , Terborgh et Thimann (1964) ont également trouvé des effets de la photopériode sur le contenu en pigments, soit sur algues entières, soit sur algues anucléées depuis plusieurs semaines.

Ces travaux sur le contenu en pigments verts suggèrent une participation active ' du chloroplaste dans les processus morphogéné^iquesqui chez les plantes supérieures accompagnent le déclenchement de la floraison.

Cette participation est d'autant plus probable que, comme nous l'avons indiqué plus haut, les chloroplastes sont des organites évolués relativement indépendants au sein de la cellule, tant par les synthèses dont ils sont capables que par l'information qu'ils contiennent, et au niveau desquels le régime lumineux est susceptible d'intervenir pour provoquer des effets considérables se répercu­ tant nécessairement dans l'ensemble de l'organisme végétal.

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16

.

Ainsi les faits connus nous amènent à constater :

1. que la mise à fleurs des végétaux supérieurs semble dépendre de la

production d'une hormone florale, synthétisée dans les feuilles lorsque les condi­ tions de milieu, -notamment de durée des jours-, sont favorables ; mais qu'on n'a pas trouvé jusqu'ici un produit unique qui corresponde à cette hormone d'une manière univoque ;

Z. que la mise à fleurs implique des changements dans le métabolisme des acides nucléiques et des protéines des feuilles, changements qui ne vont pas nécessairement dans le même sens au niveau du méristème terminal et au niveau des feuilles ;

3. que le chloroplaste est certainement influencé dans son contenu, et peut-être dans ses fonctions, par les facteurs qui, comme la durée des jours, agissent sur la mise à fleurs, mais que, jusqu'à présent, cet organite n'a pas fait l'objet d'une étude particulière à cet égard.

C'est cette étude que nous tentons d'aborder dans le travail expérimental qu'on va lire.

Nous y recherchons dans quelle mesure le contenu des chloroplastes change lorsqu’;on applique à la plante des conditions de milieu qui vont déterminer sa mise à fleurs, et dans quelle mesure de tels changements pourraient être en rapport de cause et effet avec le déclenchement de la floraison.

Dans ce but, nous étudions les effets de la durée des jours sur des plastes d'une variété choisie d'épinards qui ne fleurit pratiquement qu'en jours longs. Nous examinons ces effets aussi bien à des étapes juvéniles du développe­ ment (cotylédons), au cours desquelles l'épinard est incapable de fleurir, qu'à l'état adulte de ce développement, qui correspond à la mise à fleurs normale.

Sur les plantes à l'état adulte, nous cherchons à voir en particulier si certains changements se produisent dans le plaste pendant les premières heures de l'induction de la floraison.

17.

A. L'ESPECE VEGETALE UTILISEE.

Nous avons choisi d'expérimenter sur l'épinard, Spinacia, oleracea L. Diverses raisons ont motivé notre choix :

1) Les plastes d'épinards servent depuis longtemps de matériel d'étude,

tant au physiologiste qu'au biochimiste qui s'occupent de la photosynthèse.

Z) Les chloroplastes d'épinards résistent relativement bien à l'isolement et à la purification.

3) L'épinard est une espèce photopériodiquement sensible. La plupart de ses variétés fleurissent en jours longs, à condition que la germination ait lieu à une température suffisamment élevée (vernalisation). Lorsque des épinards ont germé à une température supérieure à 10°C, la floraison est obtenue en quelques semaines si la durée de l'éclairement journalier est supérieure à 12

heures ; au contraire, si cette durée est inférieure à 10 heures (au moins 14 heures de nuit), da floraison n'a lieu qu'après 5 à 6 mois et elle ne concerne qu'un nombre

restreint d'individus (quelques pour cent). On dit qu'après avoir été semé à une température élevée, l'épinard est photopériodiquement sensible, et on le définit comme une "esppce de jour long".

Nous avons travaillé sur trois variétés : Monstrueuse de Viroflay, Géante de Cavalhuis et Viking. Il s'agit de variétés horticoles reproduites par graines, qui ont été obtenues par sélection à la suite de divers croisements. Il s'est avéré que la variété Monstrueuse de Viroflay était la plus stable du point de vue de l'homogénéité des plantes et que, par ailleurs, elle montrait les

caractères photopériodiques les mieux définis. C'est elle que nous avons généralement utilisée.

Les épinards ont été cultivés, soit en pleine terre, soit dans des pots contenant un mélange de terre de jardin et d'argile en proportion l/l. Les pots ont été placés selon les expériences, soit à l'air libre (dans ce cas, ils étaient enterrés sur une hauteur d'une vingtaine de centimètres), soit dans une serre ordinaire, à température et à humidité non réglées, soit dans des chambres conditionnées, dont la température a été maintenue à 20° C et l'humidité de l'air à 80%, l'éclairement éfent fourni par des tubes Phytor (ACEC). Les tubes pouvaient être éloignés à volonté des plantes, ce qui permettait de régler l'intensité lumineuse à certaines valeurs définies que nous indiquerons dans le texte.

Fig. 1. Coupe dans un culot de chlor.oplastes non lavés, lamelles grana amidon

goutte s de s

19.

une obscurité de l'ordre de celle qu'on rencontre normalement la nuit. Le volume d'air laissé, dans ce cas, autour des plantes a été d'environ 0,25 mètre cube pour six pots ; par ailleurs, le dispositif laissait passer facilement les gaz de l'extérieur vers l'intérieur et inversement.

Lorsque des jours longs ont dû être obtenus pendant l'hiver en serre, on a prolongé lé jour ordinaire pàr l'éclairement fourni par une batterie de tubes Phytor ; l'intensité lumineuse au niveau des plantes était de 4000 lux. L’arrêt de l'éclairement supplémentaire a été réalisé à l'aide d'un coupe-à-temps. Dans certaines expériences, les plantes ont été cultivées dans des jours courts de 8 heures et la nuit longue (de 16 heures) a été interrompue dans son milieu par un éclairement de 2 heures fourni par une batterie de tubes Phytor insérés sous les panneaux obscurcissants. Nous verrons plus loin que ce traitement provoque

la mise à fleur des épinards (p. ). L'éclairement nocturne a été déclenché

par un combinateur Crouzet.

B. LES CHLOROPLASTES.

1. Préparation des chloroplastes.

Les chloroplastes sont préparés de la manière suivante : les feuilles d'épinard sont soigneusement lavées à l'eau ordinaire, séchées entre deux papiers buvard, pesées, puis broyées manuellement dans vm mortier (en absence de sable) en présence du tampon Tris (6,6. 10“^M)-MgCl2 (5,40“^M)-NaCl (0,4 M), pH : 6,é, refroidi à 2-3“C, ou en présence d'un tampon phosphate (0,025 M) contenant du saccharose (0,5 M), pH : 7,5, . Le de.uxième de ces tampons préserve mieux les plastes que le premier.

Les gros débris de tissus sont éliminés par filtration du broyât à travers trois couches de mousseline ; il faut prendre garde, au cours du broyage et de la filtration, de ne pas exercer de pression exagérée si on désire obtenir un rendement convenable en plastes entiers. Le filtrat est centrifugé à froid (+/- 3°C) pendant une minute à 1. 500 g ; on élimine ainsi des cellules entières ou une partie des noyaux, voire certains petits fragments de tissus. Le surnageant est récolté et centrifugé à 1. 500 g pendant 7 minutes. Le culot contient essentielle­ ment des chloroplastes ainsi qu'on peut le voir sur la figure 1. Il est repris dans un peu de tampon et recentrifugé à 1. 500 g pendant 7 minutes. Le culot est récolté et les chloroplastes sont remis en suspension dans un volume connu de tampon pour les analyses.

2. Comptage des chloroplastes.

Lorsqu'on désire les compter, un aliquot de la suspension des chloroplastes est prélevé à l'aide de la pipette d'un hémacytomètre et dilué 100 fois ; une goutte de la solution diluée est placée sur la plaque de verre réticulée ; le comptage se fait au microscope à contraste de phase (grossissement : 1600 X). Dix détermi­ nations différentes sont effectuées et la moyenne est calculée. Les dix détermi­ nations sont faites sur trois prélèvements de la suspension dilués chaque fois

20.

3. L'âge des chloroplaste s.

a. L'âge des plastes défini par l'âge foliaire.

Dans l'introduction de ce travail, nous avons dit qu'un végétal supérieur est constitué, dans sa partie aérienne, d'un axe porteur de feuilles formées

successivement. Au sommet de l'axe se trouvent les feuilles les plus petites, c'est-à-dire les plus jeunes. Lorsqu'on descend de noeud en noeud le long de l'axe, on rencontre des feuilles de plus en plus âgées et de plus en plus grandes, jusqu'à une taille maximum (voir fig. 7). On dit généralement qu'une feuille est

"adulte" lorsqu'elle a atteint cette taille maximum.

Nous acceptons cette définition qui entrafne les suivantes :

1) les feuilles situées trois noeuds (ou plus) en dessous des feuilles adultes seront dites "vieilles" ;

2) les feuilles dont la nervure principale mesure la moitié de celle des feuilles "adultes" seront dites "demi-étalées" ;

3) les feuilles situées trois noeuds (ou plus) au-dessus des feuilles demi-étalées seront dites "jeunes".

Les plastes seront "jeunes", demi-étalés", "adultes" ou "vieux" selon l'âge de la feuille à partir de laquelle ils ont été préparés.

Cette classification est indispensable à la comparaison des plastes provenant d'une série de plantes, ayant reçu un traitement donné, avec ceux provenant d'une autre série , ayant reçu un autre traitement : il va de soi qu'on ne peut comparer que des plastes de même âge. Par exemple, la comparaison des chloroplaste s vieux appartenant à une série de plantes avec des chloroplastes jeunes provenant d'une autre série n'a aucun sens (deux facteurs variant à la fois : le traitement des séries et l'âge des chloroplastes).

b. L'âge des plastes défini par leur contenu.

Au cours de la croissance foliaire, les plastes grandissent, tandis que la feuille passe de la jeunesse à l'âge adulte. Dans les cotylédons jeunes, par exemple, leur plus grand diamètre mesure environ 3,5|U ; au fur et à mesure que les chloroplastes gagnent en âge, le diamètre s'accroît jusqu'à 5u environ (fig. 13).

p M c h lo ro p h y lle /g .P F

21.

Fig. 2. Evolution de la quantité de chlorophylle en fonction du contenu en cytochromes chloroplastiques f + b^.

En abscisse : A = différence entre la densité optique à SbOmp (trajet optique de 1 cm) d'une suspension de poudre acétonique de chloro- plastes extraits à partir d'un gramme de poids frais foliaire, avant et après addition d'une pincée de Na2S204.

La poudre est mise en suspension dans 10 ml de tampon phosphate 0,0 67 M, pH 7,0.

En ordonnée : contenu en chlorophylle corre spondant.

Fig. 3. Evolution du contenu en cytochromes des chloroplastes en fonction de l'âge de la feuille dont ils sont extraits.

En ordonnée : le contenu en cytochromes

est exprimé par le (voir légende de

la fig. 2)

Les chloroplastes (décolorés) contenaient 10 micromoles de chlorophylle et étaient en suspension dans 10 ml de tampon phosphate (0,0 67 M, pH 7,0).

En abscisse : âge de la feuille à partir de laquelle les chloroplastes sont préparés. + et* se rapportent à deux séries d'expé­ riences différentes.

22.

les extrêmes trouvés dans l'ensemble de nos mesures). On peut admettre que, lorsqu'un échantillon de plastes contient moins de 0,8 micromole de chlorophylle par 10*^ chloroplastes, les plastes qui le constituent ne sont pas adultes. Ce critère n'est cependant pas suffisant pour définir un plaste adulte. Nous en avons utilisé un autre : les chloroplastes adultes sont tous caractérisés par la présence d'une microstructure lamellaire organisée d'une manière précise. Fonctionnellement, elle correspond à l'existence, dans les lamelles, des unités photosynthétiques qui furent postulées dès 1932 par Emerson et Arnold. La présence de ces unités a pour conséquence l'existence d'un rapport constant entre le contenu en chlorophylle et le contenu en certaines enzymes participant au transfert des électrons à l'intérieur des lamelles. C'est en particulier le cas pour le contenu en cytochromes f et b^,.

Nous avons mesuré le contenu en cytochromes des plastes en suivant la méthode mise au point par Hill et Scarisbrick (1951), légèrement modifiée (voir Sironval et Englert-Dujardin, 1963). 11 est apparu que, par rapport à la quantité de chlorophylle, la quantité de cytochrome f est constante dans les plastes adultes : 1 molécule de cytochrome f pour 200 à 300 molécules de chlorophylle totale selon les mesures. La même proportion est mesurée pour le cytochrome b^,. Cette proportion est respectée, que les plastes adultes aient accumulé peu ou beaucoup de chlorophylle (dans les limites de 0,8 à 1,9 micromoles/l09 plastes). Elle ne dépend donc pas de l'abondance des lamelles à l'intérieur du plaste (laquelle peut varier selon les conditions de culture) mais bien de la structure macromoléculaire de ces lainelles Nous donnons sur la figure 2 la quantité des cytochromes f + b^ observée dans des plastes adultes chez lesquels nous avons volontairement fait varier le contenu en chlorophylle dans des proportions considérables par des méthodes de culture appropriées.

On peut donc définir biochimiquement un chloroplaste adulte comme étant un plaste qui contient une molécule de cytochrome f ou b^ par 200 à 300 molécules de chlorophylle.

La figure 3 montre qu'à cet égard le plaste vieillissant (c'est-à-dire le plaste qui a atteint sa taille maxima depuis un certain temps) a plus ou moins les mêmes caractéristiques que le plaste adulte. Mais il n'en va pas de même pour les plastes en pleine croissance, chez lesquels le contenu en cytochrome est anormalement élevé par rapport au contenu en chlorophylle (ceci correspond au fait que, pendant la formation de la lamelle, les cytochromes sont mis en

23.

4. Pureté des préparations de chloroplastes.

Nous avons effectué des contrôles par microscopie électronique sur des préparations de chloroplastes adultes mis en suspension dans du tampon Tris(6,6. 10"2M)-NaCl(O,4 M)-MgCl2(5. 10"^ M), pH : 6,9. (Ce traitement ne préserve pas l'intégrité de la membrane extérieure des plastes). L'activité photochimique de tels plastes, préparés dans le tampon Tris, est bien conservée lorsque la préparation est faite rapidement (bonne "activité de Hill" ; bonne

réduction du NADP à la lumière, surtout en présence d'un donneur d'électrons convenable). La figure 1 donne l'image d'une préparation. On y voit quelques mitochondries au milieu d'un grand nombre de lamelles plastidiales et de granas. Il n'y a pas de débris nucléaires de grande taille. Il est probable que dans une telle préparation les noyaux ne sont représentés que par des fragments désagrégés, ainsi que par des molécules d'ADN libres. Notons

à cet égard que les tampons utilisés jusqu'à récemment pour préserver l'intégrité de des noyaux ne permettaient pas de préserver l'intégrité des chloroplastes.

C. METHODES GENERALES D'ANALYSE.

1. Détermination des poids secs.

Tous les poids secs (de feuilles, de plastes, ou de poudre acétonique) ont été mesurés après séchage de l'échantillon dans un pèse-filtre adéquat à

i03°C. La pesée a eu lieu à la température ordinaire, après refroidissement du matériel dans un excicateur. Dans certains cas, le poids frais d'une surface déterminée de limbe a été mesuré ; le prélèvement consistait alors en une série de pastilles prises à l'emporte-pièce à la surface du limbe, en dehors de la nervure principale.

2. Quantité de lipides.

24.

3. Dosage des protéines.

Le dosage des protéines a été effectué sur un aliquot de poudre acétonique prélevé avant l'extraction des acides nucléiques. On a procédé comme suit : la poudre est mise en présence d'acide chlorhydrique 6 N dans une ampoule scellée. On laisse pendant 15 heures à 125“C. L'hydrolysat est évaporé à sec au bain-marie à 100“C. Le résidu est dissous dans un volume connu de tampon citrate 0,2 M, pH 5. Le dosage est effectué par la méthode à la ninhydrine (Moore et Stein, 1948). On mesure l'absorption à 570 mju dans un spectfophotomètre Beckman DU ; une

solution de leucine de concentration connue sert d'étalon.

On a vérifié que l'extraction des acides aminés et des petits peptides hors de la poudre acétonique totale des feuilles et des plastes, par le lavage à l'acide perchlorique 0,2 N et par le mélange éther-alcool, livrait un poids d'acides aminés négligeable par rapport au poids des protéines contenues dans la même quantité de poudre acétonique. On a de même vérifié que l'extrait acétonique des feuilles ou des plastes ne contenait pratiquement pas de protéines.

4. Mesure des quantités de chlorophylle.

La chlorophylle est extraite d'un poids frais déterminé de limbe foliaire par broyage au mortier dans un mélange d'acétone (80)-eau (20) (volume/volume) en présence d'un peu de sable. . Lorsqu'il s'agit de chloroplastes, un volume déter­ miné de leur suspension (voir § B. 1. ) est additionné d'acétone pure, de manière à obtenir le mélange acétone (80)-eau (20)(volume/volum^. La solution acétonique est filtrée à travers un buchner et la poudre acétonique est lavée deux fois par le mélange acétone-eau. Les filtrats réunis sont amenés à un volume connu avec le même mélange.

L'absorption de la solution est mesurée dans un spectrophotomètre Beckman DU à 645, 652, 663 et 710 mu. La quantité de chlorophylle est calculée à partir des formules de Mackinney(l911) et de Bruinsma(1963). Deux valeurs sont ainsi obtenues ; on prend la moyenne des deux (les deux valeurs sont souvent très proches). Le ^rapport a/b est déterminé d'après Mackinney (1941).

5. Extraction et dosage de l'ARN.

L'ARN est extrait d'un poids connu de poudre acétonique de feuilles, ou • de chloroplastes, par la méthode d'Ogur et, Rosen(195l). La poudre est agitée dans de l'acide perchlorique 0,2 N à 2°C pendant- une heure. La suspension est

centrifugée à 3. 000 g pendant dix minutes à +/- 3°C. Le surnageant est écarté. Le résidu est traité avec les mélanges suivants :

a) trois fois successivement avec un mélange éthanol-éther (3/l en volume) ; b) trois fois avec un mélange éthanol-éther (l/3 en volume) ;

c) trois fois' avec de l'éther pur.

25.

de chloroplastes isolés d'épinards.

Pour les détails expérimentaux voir Matériel et Méthodes C. § 5.

Fig. 5. Spectre d'absorption de l'ADN extrait au PCA 0,5 N à 70° C à partir de chloroplastes isolés d'épinards.

Fig. 6. Spectre d'absorption obtenu selon la méthode de Ceriotti appliquée à l'ADN.

A ; spectre obtenu à partir d'ADN de thymus de veau (échantillon préparé dans le laboratoire du Professeur Desreux, Université de Liège).

Z 6.

Ce dernier est agité dans de l'acide perchlorique N à Z“ C pendant une nuit. Il est ensuite centrifugé à 3. 000 g pendant dix minutes à +/- 3°C. Le surnageant est récolté. Le résidu est agité à nouveau dans de l'acide per­ chlorique N à Z°C, les opérations étant renouvellées plusieurs fois jusqu'à épuisement total de l'ARN. Les divers surnageants récoltés sont réunis et amenés à un volume connu.

L'ARN est dosé spectrophotométriquement à l'aide d'un spectrophoto- mètre Beckman DU. Nous avons d'ordinaire pris le spectre complet de l'ARN de ZZO à 3Z0 m|a. La figure 4 donne l'allure des spectres obtenus. On voit que ces spectres sont caractéristiques d'oligoribonucléotides ; le rapport des

absorptions à Z 60 et à Z30-Z35 mu est toujours supérieur à Z, tout au moins

lorsqu'il ne s'agit pas des dernières fractions extraites. Le rapport des absorptions à Z60 et à Z80 rnu est en général compris entre 1 , 5 et Z, ce qui indique que des

protéines sonjt présentes dans l'extrait. Cependant, certains extraits ont présenté des rapports'A^

Le calcul de la quantité d'ARN a été feit en admettant que 34 microgrammes d'ARN par millilitre donnent une densité optique de 1,000 sur une épaisseur de

solution de 1 cm. oette valeur a été contrôlée en soumettant une quantité pesée d'ARN purifié de levure aux traitements décrits ci-dessus pour l'extraction de l'ARN des feuilles ou des plastes.

60/^Z80 supérieurs à Z.

6. Quantité des polysaccharides : amidon et cellulose.

L'amidon + cellulose a été estimé dans les chloroplastes de la manière suivante : on a pesé la poudre acétonique sèche après extraction des pigments, des lipides totaux, de l'acido-soluble (extrait au PCA 0,Z N) et de l'ARN. On a soustrait de ce poids la quantité de protéines correspondantes, dosées par la méthode de Moore et Stein (voir ci-dessus).

7. Extraction et dosage de. l'ADN.

Le résidu obtenu après extraction de l'ARN est traité par l'acide perchlorique 0,5 N à 70°C pendant 15 minutes, l'agitation étant réalisée à l'aide d'une tige en verre mue par un moteur électrique. On refroidit ensuite rapidement à la température ordinaire et on centrifuge à 3. 000 g pendant 10 minutes. Le surnageant est récolté et le culot est lavé avec de l'acide per­ chlorique 0, 5 N à froidr. On recentrifuge une nouvelle fois comme ci-dessus. Le liquide de lavage est réuni au premier surnageant récolté.

27.

La mesure de la quantité d'ADN dans l'extrait est effectuée de deux manières :

a) Par spectrophotométrie : la densité optique de la solution dans le PCA 0,5 N est mesurée à 267 mp. ; en général, le spectre entier est étudié. Il est apparu que ce spectre était rarement correct, la contamination par les protéines étant importante (fig. 5). Ceci nous a amenœà éliminer la plupart des dosages et à ne conserver que ceux qui présentaient un spectre jugé convenable. Nous avons observé en particulier que le spectre des oligodésoxyribonucléotides extraits de feuilles adultes ou demi-étalées se présentait en général mieux que le spectre correspondant des oligodésoxyribonucléotides extraits de feuilles jeunes ou vieilles.

b) Par la méthode de Ceriotti : nous avons utilisé la méthode de Ceriotti (1952) pour circonvenir l'imprécision de la spectrophotométrie. Comme on le verra plus loin, cette méthode nous a toujours donné des valeurs plus faibles que la spectrophotométrie, bien que le rapport des valeurs obtenues par les deux méthodes sur le même extrait ait toujours eu une valeur relativement constante, indépendante des extraits.

La méthode de Ceriotti permet de mesurer avec une grande spécificité des quantités faibles d'ADN (de 3 à 15 pg/ml). Elle utilise la réaction de l'indole avec le groupe désoxyribose de l'ADN. Le produit de la réaction est coloré : il absorbe à 490 mp . La figure 6A en donne un spectre typique obtenu à partir d'une

solution d'ADN purifié de thymus de veau traité comme le sont les extraits de nos poudres acétoniques. La figure 6B donne les spectres correspondants obtenus à partir de ces poudres. Nous avons appliqué la méthode décrite par Ceriotti sans y apporter de modifications. La courbe étalon a été obtenue en appliquant la méthode à des solutions d'ADN purifié de thymus de veau.

8. Technique d'extraction au phénol des acides nucléiques à partir du matériel foliaire.

Nous avons extrait les acides nucléiques soit de feuilles entières, soit de la fraction chloroplastique , soit de la fraction nucléaire isolée de ces feuilles. L'extraction s'est faite par la méthode au phénol.

1 . Pour les feuilles entières ;

1 à 5 g de feuilles entières (ou de cotylédons) sont broyées à ± 2°C dans un mortier en présence de sable, le tampon étant une solution de T ris (6, 6.

MgCl2(5. 10“^M)-, NaCl(0,4 M), pH 6,9, contenant 0,5% de dodécylsulfate de sodium

(SDS) . On ajoute au broyât un volume égal de phénol froid frafchement distillé et saturé du même, tampon. On agite pendant 20 minutes à ± 2°C. On centrifuge à froid à 20. 000 g dans une centrifugeuse Servall (type SS-l), pendant 20 minutes. On recueille le surnageant contenant les acides nucléiques ; le résidu, la phase phénolique et l'interphase sont traités par un volume égal du tampon Tris (6, 6. 10“^