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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
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DBM 00723
_______________________________________ /
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
INSTITUT DE BIOLOGIE ET DE MEDECINE MOLECULAIRES
LABORATOIRE DE PARASITOLOGIE MOLECULAIRE ULB
Etude de composantes de la voie TOR : caractérisation de TbFKBP12, une protéine de la famille des PPIases (isomérases) impliquée dans l’homéostasie du flagelle chez
Trypanosoma brucei.
ULB - IBMM
BIBLIOTHEQUE
Thèse présentée par Anaïs Brasseur
en vue de l’obtention du titre de docteur en Sciences sous la conduite de Luc Vanhamme et d’Etienne Pays
Novembre 2009
Cinq années de thèse ça ne se traverse pas tout seul. Si je suis finalement arrivée au bout de ce travail, c’est grâce à des dizaines de personnes qui ont, chacune à leur manière, apporté une petite pierre à l’édifice.
Merci!
Merci à mes chers collègues. Au laboratoire on sait travailler en s’amusant. Je ne dérogerai pas à la règle et vous propose donc un petit jeu, histoire de vous donner du courage avant d’attaquer FKBP12.
LES TRYPAS ACROSS
1 2 1 Boîte à taitme rouge
3 Mr geek 5 Miss brirola
3 4 9 Indispensable et adniinistratif
10 Mi vida es la naturaleia (y la fiesta) 11 Oui nrais non enfin c'est clair tu
S
1* comprends?
16 De toutefaçon tout le nonde s'en ...
18 Notre mère à tous
20 Ma comparse de bencb (entre autres) 21 Celui par qiu tout arrive
•>
10
II i: 22 Tata —-
.3 M
DOW
!S lâ 2 YoUey-manga-gâteaux
4 Douce maman 6 *my little poney"
it
IH O 7 Tac tac tac (font ses petits pas)
8 Qiu vient de loin
11 Demandé pour le rmcroscope 12 Ou eliza
13 Dès le lever du soleil
14 Paaaas bien (mais on aime ça) 15 Beraache et nandou
16 Grand vendéen
--
17 Miss paris
19 171il5 sur la première
Je tiens également à remercier les membres de mon jury Laurence Van Melderen et Bruno André qui ont lu et commenté ce travail avec pertinence. Philippe Bastin de l’Institut Pasteur de Paris qui a accepté de T’évaluer et m’a conseillé avec gentillesse. Merci également au membres de son laboratoire pour leur accueil et l’aide qu’ils ont fournie pour l’étude du mouvement des trypanosomes.
Comme il n’y a pas que la thèse dans la vie, merci à ceux avec qui j’ai partagé le reste de mon quotidien ces 5 années (et bien avant) : mes parents et ma sœur, mes amies de toujours (les pouffes) et celles de bio (les miches) qui m’ont encouragée et supportée avec patiente.
A Ben finalement, merci pour TOUT. Je ne sais pas comment te le dire autrement...
Les résultats c’est par là!!
Ceux qui m’ont initiée au monde merveilleux du trvpa.
Pour certains le trypanosome est une passion (oui oui I). Non seulement ils la partagent mais ils nous la transmettent. Merci aux quatre « sages » du labo de m’avoir donné une part de leur enthousiasme pour la recherche :
Le Chef (21) m’a accueillie dans son laboratoire et m’a permis « d’avancer » dans mon travail.
Luc (13) m’a suivie quoiqu’il arrive durant toute ma thèse.
DPM (11D) ou David m’a encouragée et remotivée quand j’en avais besoin. Merci aussi pour tout le beau travail de microscopie électronique.
Didier (1 IA) m’a inondée de ses idées, même depuis le bout du monde.
Ceux qui nous aident pour tout et n’importe quoi.
Au laboratoire, on est quand même bien entourés ! Merci pour toutes vos (petites) mains qui nous facilitent la vie :
Madamannette (18) rend le labo aussi accueillant qu’une deuxième famille.
Poupou (16A) pimente nos journées et les parsème de petites attentions (carambouillas, calendriers et autres...).
Pat (7) est la première à m’avoir montré une manip, ça ne s’oublie pas ! Rien que d’entendre ses petits pas et je suis de bonne humeur.
Babette (12) remarque le moindre détail et puis en papote joyeusement autour d’un thé.
Nathalie (9) est toujours disponible pour régler les formalités de la vie quotidienne du labo.
Ceux oui continuent dans la même voie.
Pierrick (16D), Laurence (22) et Sophie (4) dignes représentants de la France, merci d’avoir répondu aussi clairement, précisément, raisonnablement, bref parfaitement à mes (bêtes) questions. Pas envie d’ouvrir un blog-conseil ? (problèmes de tap-tagging, de RT-PCR, biblio, nous sommes là pour vous aider!)
Max (19) fait une halte au labo et partage sa passion pour le jeu des dicos.
Ceux oui vivent du PRIA.
Donc en fait tous ceux qui sont comme moi :
Noémie (14), avec qui j’adore discuter et... fumer pendant notre petite pose journalière.
Gilles (3) parle (heu. . . presque) autant que moi sous ses airs timides. Je suis ravie d’avoir partagé ton bureau et débattu de mille et une choses. Tu ne te débarrasseras pas tout de suite de moi !
Aurélie (2) et Lara (6) qui ne continuent pas.... Sans vous, les fêtes auront un goût de trop peu.
Ali (8), you’Il hâve to learn French if you want to understand ... Anyway, thanksfor keeping me practicing my English this year.
Ceux oui ne sont plus là...Mais que l’on n’oublie pas II
Merci les petits gars d’avoir partagé les aléas de ma vie dans et hors du laboratoire. Grâce à vous j’ai découvert que travail et amitié étaient parfaitement compatibles. Franchement, on aura bien rigolé : Cécile (5) et Sarah (17) m’ont précédée et donc ouvert la voie (souvent en chanson) et pas qu’au sujet des parasites !
Ben (15) promis un jour on « vivra nos vies ».
Gégé (20), La comparse de thèse et donc de bonheurs, de malheurs mais aussi de futilités. Sans toi ce n’est vraiment plus pareil.
Cath (10) a eu le courage de partir faire ce qui lui plait... peut être que je l’envie un peu.
Wally-walla (1), toujours de bonne humeur, m’a fait découvrir Mme Jambon.
Merci aussi à « ceux d’à côté » : Sabrina, Aimable et Sébastien qui partagent nos repas quotidiens.
Finalement, bienvenue aux petits nouveaux, j’espère qu’ils profiteront de ces années autant que nous l’avons fait.
TABLE DES ABBREVIATIONS.
ADN : Acide Désoxyribonucléique APC: Anaphase Promoting Complex ARN: Aeide Ribonucléique
ARNdb: ARN double brin
AtFIP37: Arabidopsis interacting protein AUK : Aurora Kinase
BF : Bloodstream form CaM : Calmoduline CaN: Calcineurine CK: Cytosquelette
CMF: Component of Motile Flagella CPC: Chromosomal Passenger Complex CpN: Cyclophiline
CRK : Cdc2 Related Kinase CsA : cyclosporine A CYC : cycline
PLP : Dynamin Like Protein
DNAIl: Dynéine Axonémale Intermédiaire!
DRC: Dynein Regulatory System
EC50: half maximal Effective Concentration FAT : FRAP, ATM, TRRAP
FATC : FRAP, ATM, TRRAP FAZ: Flagellum Attachment Zone FC : Flagella Connecter
FCaBP : Flagellar Calcium Binding Protein FKBD: FK506 Binding Domain
FKBP: FK506 binding protein FP: Flagellar Pocket
FPC: Flagellar Pocket Collar
Fprl : FK506 sensitive proline rotamase
FRAP : FKBP 12 Rapamycin Associated protein FRB : FKBP Rapamycin Binding
GPI: glycosyl-phosphatidylinositol GST: Glutathione S-Transférase HA: Hémagglutinine
HAT: Human African Tiypanosomiasis
HEAT: Huntingtin, Elongation factor 3, A subunit of protein phosphatase 2A et TOR EFT: Intra- Flagellar transport
IgG: Immunoglobuline G IL-2 : Interleukine 2
IPjR : récepteur à l’inositol 1,4,5 triphosphate IPTG : Isopropyl jS-D-l-thiogalactopyranoside KIN : Kinésine
KO : Knock Out
LRTP: Leucine Rich repeat protein LS: Long Slender
MAP: Microtubules Associated Protein MIP : Macrophage Infectivity Potentiator MT: Microtubules
MTQC : Microtubules Organizing Center NMR: Nuclear Magnetic Résonance NRKC: NIMA-Related Kinase
OMS: Organisation Mondiale de la Santé
PAHX : phytanoyl CoA a hydroxylase Pb : paire de base
PBS : Phosphate Buffered Saline PCR : Polymerase Chain Reaction PPE : Phospho Di-Estérase PF ; Procyclic Form
PFC : PFR proteome component PFR ; Paraflagellar Rod
PIKK: phosphatidyl Inositol Kinase-related Kinase PLK : Polo-Like Kinase
PPIase : Peptidyl-Prolyl Cis-Trans Isomérase qRT-PCR : quantitative Real Time PCR RACKl : receptor for activated C kinase RE: Réticulum Endoplasmique
REL: Réticulum Endoplasmique Lisse RISC: RNA inducing silencing complex RNAi: RNA interférence
RNE: Redundant Nuclear Envelope Rpm: Rapamycine
RS : Réticulum Sarcoplasmique RvR : Récepteur à la Ryanodine S EM : Scanning Electron Microscopy SL : Splice Leader
SS : Short Stumpy
TAC : Tripartite Attachment Complex TAP : Tandem Affmity Purification TBBC: Tb basal body component TBCC : tubulin cofactor C T/3R : TGF |8 Receptor
TEM : Transmission Electron Microscopy TGF B: Transforming Growth Factor j3 TbFP: T.brucei Flagellum Proteome TLK: Tousled Like Kinase
TOR: Target Of Rapamycin TORC: TOR Complex
TPR : Tetra-trico-Peptide Repeat TSC : Tuberous Sclerosis Complex UTR : Untranslated région
VAP : Average Path Velocity VCL : Vélocité curvilinéaire
VSG : Variant Surface Glycoprotein VSL : Vélocité Straight line
Wt : wild type
TABLE DES MATIERES
INTRODUCTION... 5
I : GÉNÉRALITÉS... 5
1.1; T.brucei et les Kinétoplastides... 5
1.2 : La trypanosomiase...5
1.3 : Cycle de vie...6
1.4 : Intérêt de l’étude de T.brucei...7
1.4.1 : La transcription polycistronique...7
1.4.2 : Les antigènes de surface...8
1.4.3 : La variation antigénique...8
II : FORME ET FORMATION DU PARASITE... 9
2.1 : Morphologie générale d’un trypanosome africain... 9
2.2 : Forme : structure du trypanosome... 9
2.2.1 : les microtubules du cortex sous-pelliculaire... 10
2.2.2 : le complexe d’attachement tripartite (TAC)... 11
2.2.3 : le fuseau mitotique...11
2.2.4 : la poche flagellaire et la voie endocytaire... 11
2.2.5 : Le flagelle...12
a) Analyses des composants flagellaires...13
b) Structure du flagelle...13
Le corps basal... 13
L’axonème...13
Le PFR - ParaFlagellar Rod...14
Le FAZ - Flagellum Attachment Zone... 15
Le FC - Flagella Connector...15
La membrane et la matrice flagellaire...16
c) Formation du flagelle...16
2.3 : Formation : le cycle cellulaire... 17
2.3.1 : Evènements de la division cellulaire... 17
2.3.2 : Régulation du cycle cellulaire... 18
2.3.3 : Points de contrôle...19
2.3.4 : Lacytocinèse...20
2.3.5 : Différenciation et cycle cellulaire... 21
2.4 : Le flagelle : un organite plurifonctionnel... 21
2.4.1 : Cycle de vie...22
2.4.2 : Endocytose et évasion immune... 22
2.4.3 : Sensoriel... 22
2.4.4 : Motilité... 23
2.4.5 : Morphogenèse cellulaire... 24
2.4.6 : Taille de la cellule... 25
2.4.7 : Division cellulaire... 25
a) Positionnement du FAZ...25
b) Mouvement du flagelle...25
III: FKBP12; FK506 BINDING PROTEIN 12kD...28
3.1; Généralités...28
3.1.1 ; Découverte des Peptidyl-Prolyl Cis-Trans Isomérases ; PPIases... 28
3.1.2 ; PPIases et immunosuppression...28
3.1.3 ; Conservation des PPIases... 28
3.1.4 ; Activité enzymatique isomérase... 29
3.2 ; Structure et fonctions des FKBPs... 29
3.2.1 ; FKBP12, archétype des FKBPs...29
a) Structure de FKBP12 et du FKBD...30
b) Fonctions de FKBP12... 31
3.2.2 ; FKBP52, une FBCBP multi-domaine... 33
a) Structure de FKBP52... 33
b) Translocation des récepteurs aux stéroïdes...33
e) FKBP52 et le cytosquelette... 34
d) Activité chaperonne... 34
e) Autres interactions protéiques... 34
1
3.2.3 : FKBPs végétales... 34
3.2.4 : PPIases parasitaires...35
a) PfFKBP35... 35
b) TcMIP...35
c) TbCypA... 36
3.3 : FKBP12, TOR et Calcineurine : de la transduction de signaux à l’immunosuppression... 36
3.3.1 : FK506 et rapamycine... 36
3.3.2 : La phosphatase calcineurine...36
a) Structure de la calcineurine... 37
b) Fonction de la calcineurine... 37
c) Calcineurine-FK506-FKBP... 38
d) La calcineurine chez les Kinétoplastides...38
3.3.3 : La kinase TOR, contrôleur de la croissance cellulaire...39
a) Structure de TOR... 39
b) TOR, contrôleur de la croissance cellulaire... 39
c) TOR-Rapamycine-FKBP... 40
d) TOR chez T. brucei... 41
OBJECTIF DU TRA VAIL...43
RESULTATS...45
I : IDENTIFICATION DES FKBPS DE T.brucei... 45
1.1 : Analyse bioinformatique dans le génome de T.brucei...45
1.1.1 : Identification des gènes FKBPs...45
1.1.2 : Identification des gènes TORs... 46
1.2 : Etude de l’expression des gènes FKBPs... 47
1.3 : Effet des drogues immunosuppressives FK506 et rapamycine sur T.brucei... 47
II : MISE EN PLACE DES OUTILS NECESSAIRES A LA CARACTERISATION DES FKBPS DE T.brucei... 49
2.1 : Expression de TbFKBP12 recombinantes... 49
2.1.1 : Expression et purification d’une TbFKBP12-6his... 49
a) Production de la protéine... 49
b) Production d’un anticorps spécifique... 49
2.1.2 ; Expression et purification d’une GST-TbFKBP12... 49
a) Production de la protéine...49
b) Production d’un anticorps spécifique... 51
c) Production de mutants GST-TbFKBP12... 51
2.2 : Identification du 5’UTR de TbFKBP12...51
2.3 : Parasites invalidés...52
2.3.1 : Interférence ARN... 52
a) Invalidation des différentes TORs...52
b) Invalidation des différentes FKBPs...53
2.3.2 : Complémentation de l’invalidation TbFKBP12...54
2.4 : Parasites sur-exprimant des formes FKBPs étiquetées avec un TAP... 55
III : CARACTERISATION DE L’INVALIDATION DES TbTORs... 56
IV : CARACTERISATION DE L’INVALIDATION DES TbFKBPs... 57
4.1: Croissance des parasites invalidés... 57
4.2 : Complémentation du RNAi TbFKBP12... 57
4.3 : Description du phénotype d’invalidation de TbFBCBP12... 58
4.3.1 : Formes procycliques... 58
a) Effet sur la motilité des parasites procycliques... 58
b) Effet sur la cytocinèse des parasites procycliques...59
c) Analyse de la morphologie des cellules procycliques invalidées... 60
4.3.2 : Formes sanguicoles... 61
a) Effet sur la motilité des parasites sanguicoles... 61
b) Effet sur la cytocinèse des parasites sanguicoles... 62
V : LOCALISATION CELLULAIRE DE TbFKBPll... 64
5.1 : Localisation par immunofluorescence... 64
TABLE DES MATIERES
5.1.1 : Utilisation d’anticorps anti-FKBP 12... 64
5.1.2 : Tentative de production de parasites exprimant une FKBP12 étiquetée...64
5.1.3 : Utilisation d’un anticorps anti-TAP... 65
5.2 : Détection par Western blot... 65
VI : IDENTinCATION D’EVENTUELLES INTERACTIONS PROTEIQUES... 66
6.1 : Tandem alTmity purification (TAP-tag)... 66
6.2: GST pull-down TbFKBP12-calcineurine... 67
VII : TENTATIVE DE COMPLEMENTATION CHEZ LA LEVURE... 68
VIII : ACTIVITE ENZYMATIQUE DE TbFKBPll... 69
8.1 : Complémentation du RNAi...69
8.2 : Activité peptidyl-prolyl cis-trans isomérase...69
8.3 : Agrégation de la citrate synthase... 71
DISCUSSION....72
MATERIEL ET METHODES....88
I : SOUCHES ET CONDITIONS DE CULTURE...88
1.1; Parasites...88
1.2 : Bactéries... 88
II : MANIPULATION DES TRYPANOSOMES... 89
2.1 ; Transfection de trypanosomes... 89
2.1.1 : Transfection de trypanosomes sanguicoles monomorphes 328.114... 89
2.1.2 : Transfection de trypanosomes procycliques 29-13 et ProAnv... 89
2.2 : Techniques d’invalidation de l’expression d’un gène et de surexpression... 89
2.2.1 :RNAi...89
2.2.2 : Complémentation du RNAi TbFKBP12 par différentes formes surexprimées du gène.... 90
2.2.3 : Surexpression de formes avec une étiquette TAP...90
2.2.4 : Surexpression d’une forme de TbFKBP12 avec une étiquette HA...91
2.3 : Sensibilité des trypanosomes à la rapamycine et au FK506... 91
III : SOUTHERN BLOT...91
3.1: Préparation d'ADN génomi que de trypanosome...91
3.2 ; Southern blot...92
IV : NORTHERN BLOT...92
4.1 : Préparation d’extraits d’ARN de tryfianosome... 92
4.2 : Préparation d’ARN messager de trypanosome... 92
4.3 : Northern blot... 92
V : IDENTIFICATION DES UTRs DE TbFKBP12...92
VI : PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL (qRT-PCR)... 93
6.1 : Transcription Reverse (RT)...93
6.2 : qRT-PCR...93
Vil : PRODUCTION DE PROTEINES RECOMBINANTES TbFKBP12 ET GENERATION D’ANTICORPS... 93
7.1 : Constructions et conditions d’induction... 93
7.1.1 : TbFKBP12-6his... 93
7.1.2 :GST-TbFKBP12... 94
7.2 : Purification des protéines d’intérêt... 94
7.2.1 : Purification à partir des corps d’inclusion bactériens {Schendel, 1997}...94
7.2.2 : Purification à partir de fractions bactériennes solubles... 95
7.3 : Production d’anticorps spécifiques dirigés contre TbKHCl... 95
7.3.1 : Ifroduction d’un anticorps en lapin... 95
7.3.2 : Fhirification de l’anticorps produit en lapin... 96
7.3.3 : Ifroduction d’un anticorps en rat... 96
VIII : WESTERN BLOT...96
8.1: Préparation d’extraits protéiques de trypanosome...96
3
8.2 : Préjjaration d’extraits de cytosquelette/flagelle de trypanosome... 97
8.3 : Western blot... 97
IX : TECHNIQUES DE MICROSCOPIE... 97
9.1 : Immunofluorescence... 97
9.1.1 : Fixation des trypanosomes au formaldéhyde... 97
9.1.2 : Fixation des trypanosomes au méthanol. (FAZ-PFR-BB)... 97
9.1.3 : Fixation de cytosquelettes de trypanosome...97
9.1.3 : Immunofluorescence... 98
9.2 ; Microscopie électronique à transmission TEM... 98
9.3 : Microscopie électronique à balayage SEM...98
X : ETUDES DES INTERACTIONS PROTEIQUES... 98
10.1 : Tandem Affmity Purification. {Rigaut, 1999}... 98
10.1.1 : Préparation de lysats de trypanosomes...98
10.1.2 : Purification TAP... 99
10.1.3 : Identifications des protéines...99
10.2 : GST pull-down. {Xu, 1998}... 99
XI : ACTIVITE ENZYMATIQUE...100
11.1 : Essai activité peptidyl prolyl cis-trans isomérase... 100
11.2: Agrégation de la citrate synthase... 100
BIBLIOGRAPHIE...105
1 : Introduction.
(http;//www.who.intytrypanosomiasis_african/disease/en/index.html)
INTRODUCTION
INTRODUCTION
I : GÉNÉRALITÉS
1.1 : T.brucei et les Kinétoplastides
Les K inétoplastides forment u n groupe a neestral de p rotozoaires p ossédant une s eule mitochondrie.
Celle-ci est caractérisée parla présence d’un kinétoplaste, structure interne contenant son ADN. Cet ADN mitochondrial très concentré et circulaire est visible en microscopie optique à la base du flagelle.
L’ordre des K inétoplastides (Levine, C orliss étal. 1980; Haag, O'HUigin étal. 1998) comprend la famille des T rypanosomatidés u ni-flagellés. E lie s e compose majoritairement de pa rasites t els que le s leishmanies ( Leishmania sp) et 1 es t rypanosomes. L es t rypanosomes s ont eux-mêmes s ubdivisés; les Stercoraria (ex .Trypanosoma cruzi)o\x trypanosomes américains, transmis via les fèces d’un insecte et les Salivaria ou trypanosomes africains transmis via la salive de l’insecte (ex : Trypanosoma brucei). Trois types de K inétoplastides sont pathogènes pour l’homme. Il s’agit de Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi et Leishmania sp.
T.brucei est le parasite étudié dans notre laboratoire. 11 en existe 3 sous-espèces semblables morphologiquement et bi ochimiquement mais c olonisant de s hôtes et des a ires gé ographiques différents : T.b.brucei, T.b.rhodesiense et T.b.gambiense.
1.2 : La trypanosomiase
T.b.gambiense et T. b. rhodesiense sont responsables de la maladie du sommeil ou trypanosomiase humaine a fricaine ( HAT), q ui t ouche 36 pa ys d’Afrique s ub-saharienne ( Fig, I.l) (W HO : W orld H ealth Organization : http:/A\vvw.vvho.int/topics/trspanosomiasis african/cn/ ; (Barrett, Burchmore et al. 2003).
Le pa rasite est t ransmis pa r T intermédiaire d’un diptère du genre glossina ou mouche t sé-tsé. 11 se multiplie dans le sang et les ganglions lymphatiques et, au second stade de la maladie, envahit le système nerveux central. Il y provoque alors une panoplie de désordres neurologiques graves, notamment des troubles du cycle circadien, d’où le nom de maladie du sommeil. Sans traitement, l’issue en est fatale (Greenwood and Whittle 1980). S elon l’OMS, 300 000 pe rsonnes p ouïraient être a ctuellement infectées et 55 millions d’individus habiteraient une zone à risque. Ceci constitue une évaluation puisque la surveillance médicale ne toucherait que 5% de la population concernée.
Les traitements disponibles actuellement (suramine et pentamidine au s tade sanguin, melarsoprol et eflomithine a u s tade a vancé) s ont dépassés, certains se révélant même toxiques pour les patients (Barrett, Boykin et al. 2007; Kennedy 2008).
5
EP/GPEET négative Repressed mitochodrion Terminal kinetoplast Non-Proliferative
METACYCLIC SLENDER
VSG positive EPA3PEET négative Repressed mitochondrion Terminal kinetoplast Proliférative
PROCYCLIC VSG négative EP/GPEET positive Elaborated mitochodrion Sub-terminal kinetoplast Proliférative
EPIMASTIGOTE
VSG positive Non-proliferative
Attached to salivary gland via flagellum etaboralion Proliférative
Figure 1.2 : Cycle de vie de T.brucei (Matthews 2005).
La forme long s/ender est la forme proliférative des trypanosomes dans le sang de mammifère. Leur fonction mitochondriale est réprimée. Ils se différencient en forme short stumpy, forme quiescente sanguicole dont la mitochondrie est activée partiellement. Ces 2 formes sont recouvertes d’une glycoprotéine hautement antigénique: le VSG.
Après piqûre par une mouche tsé-tsé, le parasite passe dans le système digestif de l’insecte où il se transforme en forme proliférative procyclique. Sa mitochondrie est active et il est recouvert d’une autre glycoprotéine: la procycline. Il migre vers les glandes salivaires en poursuivant sa différenciation en d’autres formes (non représentées) pour aboutir aux formes épimastigotes d’abord puis métacycliques. Ces derniers sont non prolifératifs et couverts d’un manteau composé de VSG, pour être prêts pour la transmission à un nouvel hôte mammifère.
INTRODUCTION
L'homme n’est pas la seule cible des trypanosomes africains : T.brucei, T.vivax et T.congoleme entre autres donnent la nagana au bétail. Ce fléau empêche l’élevage sur 17% de l’Afrique, provoquant un énorme manque à gagner dans des régions où la situation économique est déjà extrêmement difficile (FAO ; Food and Agriculture Organization : http://www.fao.org/index_fr.htm).
1.3 ; Cycle de vie
T.brucei est un parasite extracellulaire dont le cycle de vie se déroule dans deux hôtes très différents.
Il doit donc être capable de s’adapter de manière rapide et fréquente, en subissant des modifications structurales e t m étaboliques. P lusieurs f ormes s e succèdent a u c ours duc ycle pa rasitaire : c hez 1 es mammifères, 1 e pa rasite vit dans du sang à 37° Cet do it s e pr otéger des f acteurs 1 ytiques et du système immunitaire. Il est également capable de reconnaître et d’utiliser des signaux de son hôte tels que des facteurs de c roissance et de s c ytokines. L ors d’une p iqûre pa r 1 a m ouche t sé-tsé, 1 e pa rasite c hange r adicalement d’environnement : il s ubit une hoc t hermique en pa ssant à un e t empérature non c onstante estimée a ux alentoms de 27°C et doit interagir avec des cellules et un milieu totalement différents dans le tube digestif de l’insecte.
De plus, le cycle de vie de T.brucei est caractérisé par une alternance de stades prolifératifs adaptés à l’infection et de s tades non pr olifératifs couplés à 1 ’acquisition de la c ompétence à 1 a différenciation, permettant l’adaptation à de nouvelles conditions de croissance (Matthews, Ellis et al. 2004). On pense que l’alternance de ces phases de multiplication et de quiescence permet aussi la régulation de la densité de la population avant qu’elle n’atteigne un stade critique pour l’hôte. En effet, une mort précoce de celui-ci n ’est pas avantageuse p our 1 e parasite : i 1 doit a voir 1 e t emps d’être t ransmis de la mouche a u mammifère, et inversement.
Son cycle se déroule comme suit : (Vickerman 1985; McKean 2003) (Fig. 1.2)
La f orme pr oliférative des pa rasites s anguicoles est a ppelée long slender (longs m inces). Ses f onctions mitochondriales sont réprimées et elle métabolise le glucose grâce à des organites particuliers, les glycosomes dans lesquels s e pr oduit la glycolyse. L es t rypanosomes s ont a lors r ecouverts d’un manteau uniforme composé d’une glycoprotéine majeure très antigénique ; le VSG ou Variant S urface G lycoprotein. C et antigène est régulièrement remplacé ce qui permet au parasite d’échapper aux réactions immunitaires de son hôte.
Lors de l’infection, 1 es f ormes slender se différencient progressivement en formes short stumpy (coimts trapus) non prolifératives, engagées sim la voie de différenciation en procyclique.
Une fois dans l’insecte (Vickerman, Tetley étal. 1988), les parasites traversent la membrane p éritrophi que, qui sépare 1 ’épithélium de l’intestin du lumen où ils se transforment rapidement en forme procyclique qui se divise activement, possède une mitochondrie opérationnelle (produisant de l’ATP par le cycle de Krebs) et est
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A: position relative du kinétoplaste chez les formes trypomastigotes sanguicoles et procycliques ainsi que chez la forme épimastigote en fonction de la position du noyau et de l'extrémité postérieure de la cellule. B; Images en contraste de phase de la différentiation de sanguicoles stumpy en procycliques. L’ADN nucléaire (N) et du kinétoplaste (K) est marqué au DAPI. Le kinétoplaste est progressivement repositionné (de la cellule du haut vers la cellule du bas).
INTRODUCTION
recouverte d’une glycoprotéine invariante: 1 a pr ocycline. Après 2 -3 jours, 1 eur m orphologie change, i Is s’allongent (jusqu’à 2 fois plus longs, avec augmentation de la taille du flagelle (Van Den Abbeele, Claes et al. 1999)) et arrêtent de serépliquer. Ils retraversent la membrane péritrophique et migrent vi a l’œsophage vers les glandes salivaires. Jusqu’ici, dans le sang et le tube digestif de l’insecte, le parasite se trouve sous la forme trypomastigote, c'est-à-dire que le flagelle émerge postérieurement par rapport au noyau (Fig. 1.3).
Dans le proventricule, une nouvelle étape de division s’enclenche, accompagnée d ’une différenciation en forme épimastigote :1e flagelle émerge du c ôté a ntérieur pa r rapport au noyau. Arrivés dans les glandes salivaires, ces parasites sont attachés aux microvillosités de la paroi des glandes salivaires par leur flagelle (Tetley and Vickerman 1985). La division se fait alors que les trypanosomes sont attachés à la paroi.
Petit à petit, la taille du flagelle régresse, les parasites se couvrent de VSG et adoptent une forme non proliférative trypomastigote. Voilà les métacycliques, prêts à être transmis à l’hôte mammifère. Une fois dans le sang, ceux-ci deviendront des long slender.
1.4 : Intérêt de l’étude de T.brucei
T.brucei étant responsable de la maladie du sommeil et de la Nagana, son étude offre évidemment un intérêt médical, agronomique et économique de premier ordre.
Il présente également de nombreux avantages pour la recherche fondamentale : Premièrement, s on cycle de vie relativement simple est extracellulaire et les stades slender et procyclique peuvent être cultivés in
vitro, clonés et conservés dans de l’azote liquide. Son second avantage est d’ordre t echnique : les parasites peuvent être transfectés par électroporation pour produire des « knock-out » (Clayton 1999) ou des « knock- down » (Wirtz and Clayton 1995) (Bellofatto and Palenchar2008). Déplus,son génomea été entièrement séquencé (El-Sayed, Hegde et al. 2000) (Hall, Berriman et al. 2003) (Berriman, Ghedin et al. 2005) nittp://\\vv\v.gencdb.or&A.
Mais c e s ont s urtout s es pa rticularités b iologiques q ui le r endent s i intéressant. E lies ont été développées pour permettre au parasite de s’adapter et de survivre au sein de différents environnements : le sang de mammifère, le tube digestif et les glandes salivaires de l’insecte. En conséquence les stades procycliques et s anguicoles pr ésentent des pa rtieularités s tructurelles et métaboliques a daptées à 1 a vi e parasitaire et aux différents milieux rencontrés lors du cycle de vie.
1.4.1 : La transcription polycistronique
Les gènes dut rypanosome codant po ur de s pr otéines s ont o rganisés e n u nités pol ycistroniques (Vanhamme and Pays 1995). Les seuls pr omoteurs de ces gènes identifiés à l’heure actuelle chez T.brucei sont ceux du VSG et de la procycline. I Is s ont transcrits par une ARN polymérase I (Clayton, Fueri et a 1.
1990; Rudenko, Le Blancq et al. 1990) (Zomerdijk, Ouellette et al. 1990) (Pays, Coquelet et al. 1990). Tous les autres gènes codant des protéines sont transcrits par une ARN polymérase II. La transcription primaire par
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B Parasite number
Time
Figure 1.4 ; Vagues de parasitémie à comptages réels (A) et stylisées (B).
Lors d’une infection de l’hôte mammifère suite à une injection de parasites, les trypanosomes (siender) se multiplient dans le sang de manière clonale. Un pic de parasitémie est observé après 7 à 10 jours, la population atteint sa densité maximale. Elle commence alors à diminuer suite aux attaques par les anticorps anti-VSG du système immunitaire et est remplacée progressivement par un nouveau clone muté possédant un autre VSG. Celui-ci se multipliera à son tour pour atteindre sa densité maximale 7 à 10 jours plus tard.
Cette fluctuation de la densité de population du parasite provoque un profil de « vagues de parasitémie ». Elle est associée à la différentiation de celui-ci en forme stumpy et au changement des antigènes de surface VSG. Cela permettra à son hôte de survivre suffisamment longtemps bien que son système immunitaire ne soit pas arrivé à éliminer totalement les trypanosomes. Ils auront ainsi le temps d’être transmis .
INTRODUCTION
cette polymérase II est constitutive (Palenehar and Bellofatto 2006). Cependant des gènes d’une même unité transeriptionnelle peuvent être exprimés à des stades différents du développement, il y a done un méeanisme de eontrôle po st-transcriptionnel (Clayton 2002). C e contrôle s e f ait a u ni veau de las tabilisation, de la maturation et de la traduction des ARNm. D’autre part, un contrôle post-traductionnel permet de réguler la stabilité des protéines synthétisées. L’initiation constitutive de la transeription dans la cellule permettrait à celle-ci de faire faee rapidement à un ehangement de milieu drastique, lors du passage d’un hôte à l’autre.
1.4.2 : Les antigènes de surface
La cellule e st recouverte d ’un m anteau de nse de gl ycoprotéines très antigéniques : le V SG e hez le s sanguicoles (10^ protéines sur toute leur surfaee), laproeycline chez 1 es procyeliques (6.10® protéines sur toute leur surface).
Le VSG est nécessaire à la survie des pa rasites : il m asque le s antigènes inv ariables que sont le s protéines membranaires au système immunitaire de l’hôte auquel il échappe par une variation régulière (Pays, Vanhamme étal. 2004). Il n’y a pas de mécanisme de variation a ntigénique c hez les procycliques. Leur manteau, constitué de procycline (Stebeck and Pearson 1994), les protège des enzymes digestives de l’insecte.
Le VSG et la procycline représentent 10% des protéines totales du parasite, elles sont donc synthétisées en t rès grandes quantités, ce qui expliquerait l’emploi de l’ARN polymérase I (et donc d’un promoteur ribosomal) car celle-ci a une processivité beaucoup plus élevée que la polymérase IL
1.4.3 : La variation antigénique
Les protéines du manteau s ont a ncrées à 1 a membrane d u pa rasite pa r un e a ncre G PI ( glycosyl- phosphatidylinositol) (Blum, D own et a 1.1993) .R égulièrement (10'^ à 10 Vcellule/génération), le trypanosome sanguicole remplace son manteau. Son no uveau m anteau e st c omposé d’un autre VSG. Il lui permet d’échapper au système immunitaire. Ce phénomène est appelé variation antigénique. A l’échelle d’une population, lorsque les parasites couverts d’un type de VSG sont éliminés, quelques parasites exprimant un autre VSG vont se multiplier par expansion clonale, provoquant des vagues caractéristiques de parasitémie (Fig. 1.4). Cette chute régulière du nombre d’individus permet au trypanosome de réguler sa croissance. Il maintient son hôte en vie le temps d’assurer sa transmission au vecteiu" (Pays, Vanhamme et al. 2004).
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Sens de la nage Milochondrian VSG coel
Postérieur
Antérieur
Figure 1.5 : Morphologie générale d'un trypanosome (Overath and Engstler 2004).
Figure 1.6 : Mouvement d’un parasite sauvage (Hill 2003).
INTRODUCTION
II ; FORME ET FORMATION DU PARASITE
2.1 : Morphologie générale d’un trypanosome africain
L’architecture générale des parasites sanguicoles (15nm de long sur 2pm de large) et proeyeliques (20- 25pmde long et 3-5pmde large) (Fig. 1.5) est similaire, allongée et sous-tendue par un corset s ous pclliculaire de microtubules fortement p olarisés. Ces deux formes de développement s ont trypomastigotes : leur flagelle unique sort postérieurement par rapport au noyau et s ’enroule de manière lévogyre autour de la cellule donnant à l’ensemble une structure hélicoïdale. Par conséquent, lorsque le pa rasite a vance, il tourne sur lui-même et son mouvement ressemble à une vrille (Fig. 1.6). C’est de cette caractéristique qu’il tient son nom :engrec, soma signifie corps et trypanon vrille (Gruby and M. 1843; HÜ12003). Les trypanosomes nagent avec le flagelle qui guide. Ceci définit l’orientation de la cellule avec l’extrémité distale du flagelle définissant le côté antérieur et le corps cellulaire se trouvant du côté postérieur (Matthews, Ellis et al. 2004).
La structure la plus postérieure est la poche flagellaire, invagination de la membrane plasmique d ’où sort le flagelle et lieu unique d’endo- et exocytose (Overath and Engstler 2004). Le flagelle est constitué d’un axonème c onventionnel a ssocié à une structure rigide, le« paraflagellar r od » P FR, e t e st a ttaché à la membrane du corps cellulaire via le FAZ, le « flagellum attachment zone » (Ralston and Hill 2008) (Kohl and Bastin 2005) (Vaughan and Gull 2003) (Bastin, Pullen et al. 2000). Il est initié au niveau du corps basal, juste sous la poche flagellaire. Ce c orps b asal e st 1 ui-même lié a u ki nétoplaste pa r un complexe d’attachement (Ogbadoyi, Robinson et al. 2003). La réplication et la ségrégation du génome mitochondrial, du corps basal et du flagelle sont ainsi interdépendantes.
L’unique mitochondrie s’étend tout au long de lacellule. Sastructure est simplechez les sanguicoles puisque inactive. L’appareil de Golgi (He, Ho et al. 2004) est situé entre le noyau et le ki nétoplaste, de même que les endosomes et le lysosome, composant la voie endocytaire (Overath and Engstler 2004).
Il est primordial pour la cellule de coordonner et de réguler position, réplication et ségrégation de ces différents organelles tout au long du cycle cellulaire et delà cytocinèse. Laformation/position de l’un influençant, nous le verrons, celle de l’autre.
2.2 ; Forme : structure du trypanosome
Chez beaucoup de protozoaires, dont T. brucei, la forme de la cellule est définie par un cytosquelette. Il est responsable d U maintien de 1’architecture c ellulaire ainsi que de la modulation de celle-ci au cours du développement. Il est un de s nombreux reflets de l’adaptation du parasite à son mode de vie (Gull 1999) (Kohl a nd G ull 1998) . C ertains c omposants du cytosquelette sont c onservés durant t out 1 e c ycle de développement:!) les microtubules d u corset s ous-pelliculaire, 2) le T AC ou complexe d’attachement tripartite liant corps basal, flagelle et mitochondrie au cytosquelette, 3) le fuseau mitotique, et finalement 4) le
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y voit la polarité des MT du corset (en vert) et du flagelle (en rouge). B: Coupe transversale en microscopie électronique à transmission illustrant le flagelle attaché à la cellule et le corset de microtubules sous-pelliculaires.
INTRODUCTION
flagelle auquel nous consacrerons un chapitre. Le seul endroit de la cellule qui ne soit pas sous tendu par le corset sous pclliculaire est la pocheflagellaire, nous en parlerons également. Enfin, certaines structures du cytosquelette n’apparaissent qu’à un moment au cours du cycle. C ’est le cas des filaments responsables de l’attachement du parasite épimastigote à la paroi des glandes salivaires de la mouche (Tetley and Vickerman 1985).
2.2.1 : les microtubules du cortex sous-pelliculaire
Les microtubules (MT) sont les composants majoritaires du cytosquelette du parasite. On en trouve de différents t ypes. L es microtubules du corset s ous-pelliculaire, di sposés sous la membrane plasmique, déterminent la forme et la rigidité de la cellule. Nous reparlerons plus tard des microtubules du flagelle. Ces microtubules (cytosquelette et flagelle) sont très stables, ils résistent à une extraction à l’aide de détergent non ionique. Le cytosquelette du trypanosome peut ainsi être isolé et étudié (Robinson, Beattie et al. 1991).
Une c oupe t ransversale d ans un t rypanosome r évèle, j uste s ous 1 a membrane et 1 e manteau d e glycoprotéines qui la couvre, plus de 100 microtubules sous-nelliculaires. précisément ordonnés (Sherwin and Gull 1989) (Fig. 1.7). Ils sont espacés de manière régulière, arrangés en hélice le long de l’axe de la cellule et ont une longueur variable. Lorsqu’unMT s’arrête,les 2 tabules adjaeents s’assoeient. Laforme du parasite est ainsi modulée, aux extrémités plus fines de la cellule, et lors du passage d’un stade de vie à un autre.
Les microtubules s ont de s pol ymères de tubuline a et P gérant un pr otofilament p olarisé : un e extrémité +/plus s’allonge r apidement et u ne extrémité -/moins s’allonge lentement. C hez T.brucei les microtubules du cortex ont tous la même polarité, leur côté plus dirigé vers la partie postérieure de la cellule (Robinson, Sherwin et al. 1995). Seule exception : les 4 microtubules associés au FAZ, qui lie le corps cellulaire au flagelle, dont l’axonème est également de polarité opposée. La tubuline peut subir différentes modifications po st-traductionnelles : a cétylation de s MT stables (Schneider, Sherwin et al. 1987) (Woods, Sherwin étal. 1989), dé tyrosination lo rs du vieillissement de s MT (Sherwin, S chneider étal. 1987) et glutamylation (Schneider, P lessmann étal. 1997) . L a t ubuline y sert de marqueur pour les centres organisateurs des microtubules, les MTOCs (Microtubules Organizing Center) (Scott, Sherwin et al. 1997).
Les microtubules s ont f ortement interconnectés, e ntre eux mais a ussi pa r r apport à 1 a m embrane plasmique (Robinson, Beattie et al. 1991). Ces connections sont l’œuvre de MAPs : microtubules associated protein. P eu de M APs on été i dentifiées à ce j our che z 1 e t rypanosome (Afifolter, H emphill et a 1. 1994) , (Balaban and Goldman 1992), (Vedrenne, Giroud et al. 2002).
La régulation p hvsiaue de la 1 onguem des microtubules s e fait de 2 manières : pa r l’addition/soustraction de tubuline à l’extrémité du protofilament, ou par l’introduction de cassures internes au microtubule grâce à de s « microtubules s evering pr oteins ». R écemment, c es pr otéines i mpliquées d ans le fractionnement de s m icrotubules chez T.brucei ontét é caractérisées (Casanova, C robu étal. 2009) : l’invalidation de la katanine bloque la cytocinèse. Celle-ci est localisée au niveau de l’axe de clivage durant la division cellulaire. Lors de sa progression, la katanine remodèlerait la membrane et les MT du cytosquelette.
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A: Image en microscopie électronique au niveau de la poche flagellaire (FP). Le corps basal (BB) est connecté au kinétoplaste via: les filaments unilatéraux (petits crochets) qui lient le kinétoplaste à la membrane interne de la mitochondrie et, les filaments de la zone d’exclusion (grands crochets) qui lient la membrane externe de la mitochondrie au corps basal.
B: Représentation du TAC et de sa réplication pendant le cycle cellulaire .A gauche en G1, au milieu en S quand le kinétoplaste est en cours de ségrégation, que le pro corps basal est mature et que les deux nouveaux pro corps basaux sont formés. A droite quand les kinétoplastes et BB ont ségrégé.
INTRODUCTION
Au c ours de la division c ellulaire. le corset n’est jamais interrompu : de nouveaux microtubules viennent s’insérer entre les anciens. Chaque cellule-fille recevra donc un set entier de microtubules. La moitié de ceux-ci est nouvellement synthétisée, l’autre provient de la cellule-mère : on parle de di vision semi- conservative (Sherwin and Gull 1989).
2.2.2 : le complexe d’attachement tripartite (TAC)
En microscopie électronique à transmission, il est possible de visualiser une série de filaments denses aux électrons (Ogbadoyi, Robinson et al. 2003) qui maintiennent une cohésion entre le flagelle, le corps basal et lekinétoplaste (Fig. 1.8). Lors du cycle cellulaire, le TAC est conservé et dupliqué en même temps que les organelles qu’il relie. La ségrégation du kinétoplaste est dès lors intimement liée à la réplication du corps basal et donc du flagelle
2.2.3 : le fuseau mitotique
La structure principale du noyau en division du trypanosome est son fuseau mitotique, décrit pour la première fois en 1970 (Vickerman and Preston 1970). La mitose chez T.brucei se fait sans interruption de la membrane nucléaire. Le fuseau se forme donc à l’intérieur de celle-ci où il participe à la ségrégation de la chromatine qui n’est pas condensée. En microscopie électronique à transmission, on le voit s’étendre à partir des pôles du noyau et traverser le nucléole. Il est également localisé dans la zone de constriction entre les 2 noyaux en formation (Ogbadoyi, Ersfeld et al. 2000).
Chez la plupart des Eucaryotes supérieurs, comme chez T.brucei, les microtubules du fuseau sont initiés par un centre organisateur de microtubules MTOC, défini par la présence de tubulirty. Malgré l’absence de structure équivalente a u « spindle p oie body » e t au c entrosome, 1 e principe de 1 ’organisation e t de la formation des microtubules du fuseau serait conservé chez le trypanosome.
2.2.4 : la poche flagellaire et la voie endocytaire
L’extérieur du trypanosome est entièrement couvert de glycoprotéines. L’intérieur est sous-tendu par un corset de microtubules. Ces deux caractéristiques entravent les interactions avec le milieu et le trafic d e vésicules. Toutefois, le parasite a besoin d’internaliser macromolécules et nutriments. Ce dilemme est résolu grâce U ne s tructure p ermettant 1 e contrôle s ur une s urface 1 imitée des échanges a vec l’environnement : la poche flagellaire ( FP). E lie r eprésente 5% de la s urface t otale et n’est pa s s outenue pa r 1 e c ortex de microtubules. La formation de vésicules de la voie endocytaire et de sécrétion se fait uniquement dans cette poche (Ogbadoyi, Robinson et al. 2003; Overath and Engstler 2004) (Morgan, Hall et al. 2002; Morgan, Hall et al. 2002).
La po che f lagellaire est p hysiquement ancrée a u cytosquelette. D ’une pa rt e lie est t raversée pa r l’axonème du flagelle. D’autre part, on trouve au niveau de son orifice le FPC « Flagellar Pocket Collar », une structure du cytosquelette attachée au flagelle (Sherwin and Gull 1989) (Lacomble, Vaughan et al. 2009). Sa ségrégation lors du cycle cellulaire est coordonnée spatialement et temporellement avec d’autres éléments du
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CCVI
VSO 4 ni«d phase flutd phase only
CCV II
\1 \
ftAB6
RAB7
Figure I. 9 : La voie endocytaire de T.brucei (Overath and Engstler 2004).
A: Vue agrandie des structures de la partie postérieure d’un trypanosome. B:
Diagramme représentant la voie d’endocytose via différents compartiments cellulaires.
Les flèches noires indiquent le trajet du VSG lors de son recyclage à la membrane. Les flèches rouges indiquent les voies d’endocytose menant au lysosome.
Ax : axonème; BB: corps basal; CCV-G : vésicules provenant du Goigi et couvertes de clathrine; CCV I; vésicules couvertes de clathrine de type 1; CCV H: vésicules couvertes de clathrine de type 2; EE : endosome précoce; ER : réticulum endoplasmique; EXC ; transporteur d’exocytose; FAZ : zone d’attachement flagellaire;
FL : flagelle; FP : poche flagellaire; G : appareil de Goigi; K ; kinétoplaste; L : lysosome; LE : endosome tardif; Mt : mitochondrie; N : noyau; PFR : paraflagellar rod;
PMT: corset de microtubules sous-pelliculaires; RE : endosome de recyclage; SC : manteau de surface.
INTRODUCTION
cytosquelette, probablement sous l’influence du flagelle (Robinson and Gull 1991). Récemment, BILBOl a été identifiée comme étant la première protéine du cytosquelette de la poche flagellaire (Bonhivers, Nowacki et al. 2008). Elle est localisée au niveau du col et établit un réseau de cytosquelette po ur former la poche.
L’invalidation par RNAi de cette protéine perturbe la formation de la FP et suite à une série de malformations morphologiques impliquant le golgi, le flagelle et la cytocinèse, provoque la mort des parasites.
Le trafic de vésicules de/vers la poche flagellaire est contrôlé en fonction du stade de vie : il est de 10 à 100 fois plus rapide chez les sanguicoles. Chez ceux-ci, le trafic remplirait une fonction supplémentaire : la régénération du VSG. En effet, de part son ancrage GPI, la protéine est mobile au sein de la membrane. Elle est donc c onstamment po ussée vers 1 a F P p ar 1 es f orces hyd rodynamiques r ésultant d u dé placement du trypanosome (Dean and Matthews 2007; E ngstler, P fohl étal. 2007). Le V SG es t e ndocyté, recyclé et/ou remplacé : 1) pour éliminer les anticorps qui y sont attachés, 2) lors de la variation antigénique, 3) lors d’un changement de milieu et donc de forme de vie. Il faut en moyenne 12.5 minutes à la cellule pour remplacer l’entièreté de son manteau (Engstler, Thilo et al. 2004)! Cette rapidité est autorisée vu la petite taille de la poche flagellaire et de la voie endocytaire. L’endo/exocytose est confinée à la partie postérieure de la cellule : les endosomes, l’appareil de golgi, le lysosome et autres vésicules de la voie endocytaire se trouvent entre la poche flagellaire et le noyau, à l’exception du réticulum endoplasmique.
L’architecture de 1 a voie e ndocvtaire des t rypanosomes est un ique t out en étant c onstituée de compartiments classiques et conservée au cours de l’évolution. (Fig. 1.9) Ces différents compartiments sont caractérisés par différentes GTPases, les protéines Rab. Des anticorps dirigés contre ces protéines permettent donc de localiser spécifiquement chaque partie de la voie endocytaire (Morgan, Hall et al. 2002).
L’endocytose est dépendante de la clathrine. Son invalidation provoque un agrandissement de la poche flagellaire qui s e s olde pa r la mort de s pa rasites s anguicoles (Allen, G oulding et a 1. 2003) .Cep hénotype appelé « BigEye » est dû à un arrêt de l’endocytose, sans arrêt concomitant de l’exocytose et de la fusion de membrane au niveau de la poche. Chez les procycliques aussi la protéine est essentielle mais son invalidation ne produit pas les mêmes effets. L’invalidation de l’actine produit également un phénotype de « BigEye » en sanguicole (Garcia-Salcedo, P erez-Morga et a 1. 20 04), pr ouvant s on r ôle dans le t rafle c ellulaire et l’endocytose. Elle s erait né cessaire à la formation des vésicules c ouvertes de clathrine à partir de la poche flagellaire, mais pas à l’export de protéines nouvellement synthétisées : les voi es d’endocytose et de sécrétion ne seraient ainsi pas liées (Garcia-Salcedo, Perez-Morga et al. 2004). Chez les procycliques, l’actine n’est pas essentielle.
2.2.5 : Le flagelle
Le trypanosome est un modèle de premier ordre pour l’étude du flagelle puisque sa structure de base est conservée. Mais il comporte aussi des structures uniques aux Kinétoplastides (et à quelques espèces proches) :
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Les structures principales sont indiqués et les doublets externes de microtubules sont annotés selon la nomenclature conventionnelle.
En bleu: les 4 microtubules spécialisés du FAZ. DRC: dynein regulatory complex;
IFT: transport intra-flagellaire; FAZ: zone d’attachement du flagelle; PFR:
paraflagellar rod; MT; microtubules.
INTRODUCTION
le paraflagellar rod et la flagellar attachment zone. Celles-ci peuvent donc constituer des cibles privilégiées pour la formulation de médicaments antiparasitaires.
a) Analyses des composants flaeellaires
La possibilité de purifier le flagelle (Robinson, Beattie et al. 1991) ainsi que la technique d’interférence ARN on tp ermis de dé finir 1 epr otéome flagellaire et de 1 e comparera vecd ’autres espèces. L e CMF « Component of M otile F lagella » (Baron, R alston et a 1. 2007) , 1 e T bFP « T.brucei Flagellum Proteome » (Broadhead, Dawe et al. 2006), les PFCs « PFR proteome component » (Portman, Lacomble et al.
2009) et finalement une analyse protéomique approfondie (Hart, L au e t a 1. 2 009) en forment les données principales. Decelles-ei, il ressort que T.brucei possède plus de pr oléines flagellaires (plus de 700) que d’autres espèces. Cette abondanee pourrait refléter l’aspect unique du mouvement du flagelle du trypanosome ou de son organisation asymétrique, bordée par le PFR qui nécessiterait une régulation particulière.
bl Structure du flagelle (Fig. I.IO) (revu dans (Bastin, Pullen et al. 2000; Vaughan and Gull 2003; Kohl and Bastin 2005; Ralston and Hill 2008; Ralston, Kabututu et al. 2009)
Le corps basal
Le corps basal est l’équivalent du centriole mammalien. Sa structme à partir de laquelle l’axonème du flagelle est nucléé, contient 9 triplets de microtubules (Sherwin and Gull 1989). Le eorps basal sert ainsi de MTOCs pour les microtubules de l’axonème, mais également pour des MT subpelliculaires. En effet, les 4 MT du FAZ t rouvent leur o rigine à s on niveau. De p lus, c ette s tructure c ontrôle la s égrégation de s kinétoplastes grâce à leur interaction physique via le TAC (Ogbadoyi, Robinson et al. 2003).
Les protéines suivantes : tubuline gamma (McKean, Baines et al. 2003), KMPl 1 (Li and Wang 2008), centrinl (Selvapandiyan, Kumar et al. 2007),TBBC (Tb basal body eomponent) (Dilbeek, B erberof étal.
1999), TbLRTP (Leucine Rich repeat pr otein) (Morgan, D enny étal. 2005) et T bNRKC ( NIM A-related kinase) (Pradel, B onhivers et a 1. 2006) ont t outes é té localisées a u ni veau du e orps ba sal. L ors d e l’invalidation de ces deux dernières, des corps basaux surnuméraires sont créés. Elles jouent donc un rôle dans leur duplication. L’invalidation de TBBC chezles formes de l’insecte engendre des cellules sans FAZni flagella connecter dont le flagelle est détaché (Absalon, Kohl et al. 2007). La protéine TbRP2 est une TBCC (tubulin cofactor C) flagellaire (Stephan, Vaughan et al. 2007). Elle interagit avec la tubuline destinée à être incorporée da ns 1 es M T axonémaux. D ’ailleurs, s on i nvalidation i nduit 1 a pr oduction de c ellules à flagelle plus court chez les formes procycliques. Elle co-localise avec le corps basal mature, qui pourrait s ervir de contrôle qualité aux protéines entrant dans le flagelle.
L’axonème
Classiquement, 1’axonème de T.brucei est c omposé d’une pa ire c entrale de microtubules internes entourée de 9 doublets de microtubules externes (outer MT). Ils sont reliés à 1 a pa ire c entrale via les ponts
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