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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Lambrecht, B. (1995). Etude fonctionnelle du peptide de fusion du virus SIV (Simian Immunodeficiency Virus) (Unpublished doctoral dissertation).

Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences

Département de Biologie Moléculaire Laboratoire de Chimie Biologique Directeur de thèse: Prof. A. BURNY

ETUDE FONCTIONNELLE DU PEPTIDE DE FUSION DU VIRUS SIV (SIMIAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS).

Thèse présentée pour l'obtention du grade légal de Docteur en Sciences.

LAMBRECHT Bénédicte

Avriï 1995

sion du virus siv Simia ...

SC- -TbCf-1 - - {35622-1001}

Titre de these annexe: "Le phenotype observe chez les porteurs de l'allele PiZ ou

PiM de l'c-antitrypsine humaine pourrait etre explique par une interaction

differentielle de la calnexine avec ces deux variants".

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences

Département de Biologie Moléculaire Laboratoire de Chimie Biologique Directeur de thèse: Prof. A. BURNY

ETUDE FONCTIONNELLE DU PEPTIDE DE FUSION DU VIRUS SIV (SIMIAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS).

Thèse présentée pour l'obtention du grade légal de Docteur en Sciences.

LAMBRECHT Bénédicte

Avril 1995

j e tiens à remercier au terme de ce travail tout ceux se sont trouvés à mes côtés p e n d a n t ces ([ue^ues années.

j e voudrais tout d ' é o r d remercier le professeur Arsène B u m y f i i m'a accueillie dans son l é o r a t o i r e et a p e r m i s grâce à son enthousiasme sans l i m i t e , sa g r a n d e gentillesse et son respect de l ' i n d i v i d u a l i t é , la progression et l'achèvement de ce t r a v a i l . M e r c i Arsène de cette confiance ([ut tu m'as toujours témoignée.

j e souhaite exprimer toute ma reconnaissance au p r o f e s s e u r j e a n - M a r i e R u j s s c h a e r t p o u r avoir suivi celte étude avec un intérêt constant, l e s discussions enrichissantes i f u e nous avons eues ainsi f i e vos c r i t i f i e s p e r t i n e n t e s m'ont été d'une grande a i d e , u n g r a n d merci p o u r la disponihilité et le soutien vous m'avez toujours accordés.

M e r c i à M a r i e Horth f i i a g u i d é mes premiers p a s dans ce monde de biologie moléculaire et cellulaire. C'est t o i , M a r i e ( f u i a suscité mon intérêt pour la virologie et t f u i m'a encouragée à entreprendre ce doctorat, entreprise ( f u e t u a s toujours suivie d'un oeil compétent a t t e n t f et p a r f o i s i n f i i e t (mais ça y e s t , elle est achevée '.}. M e r c i M a r i e p o u r toute cette chaleur i f u e tu m'as donnée.

j e tiens à remercier tout particulièrement M a r g u e r i t e Desckamps, mon virus inactivé, un cocktail détonant d'esprit s c i e n t i j i t f u e , de sens c r i t i t f u e et p r a t i f \ e , de courage, de honne humeur, de tai^uineries, de g a m i n e r i e s , de compréhension, d'attentions é ^ ' ' é ^ ' ' é ^ ' ' . M e r c i M a r g u e r i t e p o u r ce rôle essentiel f i e tu as joué dans mon épanouissement tant professionnel f i e personnel.

Robert Brasseur a réalisé des études t h é o r i f i e s f i i sont à l'origine d'une p a r t i e importante des résultats de cette thèse et son hypothèse d u p e p t i d e de f i s i o n o h l i f i e a tenu une p l a c e de choix durant toutes ces années de recherches.

j e voudrais associer à ces remerciements i s é e l l e M a r t i n et v é r o n i f i e v o n è c h e , toutes les deux adeptes d'une "certaine o b l i f û t é " m e l e s f d l e s j ' a i toujours p u travailler dans un esprit de f r a n c h e c o l l é o r a t i o n et de complémentarité.

j e suis très r e d e v é l e aux personnes f â m'ont donné tout le matériel i n d i s p e n s é l e à la réalisation de ce t r a v a i l : Clothilde i h i r i a r t [ s m i t h Kline Beecham Biologicals), j i m M u l l i n s ( u n i v e r s i t é de W a s h i n g t o n , usa) et Guy Meulemans ( i n s t i t u t N a t i o n a l de Recherches v é t é r i n a i r e s ) .

j e tiens à exprimer toute ma reconnaissance à la f o n d a t i o n j e a n Brachet sans l a f i e l l e j e n'aurais p a s eu l'occasion de p a r t i c i p e r à plusieurs congrès, ainsi f i ' à tout le département de Biologie Moléculaire f i i m'a p e r m i s de travailler dans un environnement s c i e n t i f f i e de g r a n d e f i d i t é et à f i i j e souhaite bonne continuation !

j e désire aussi remercier tous les membres présents et passés du l é o r a t o i r e , et en p a r t i c u l i e r : Y v e s ,

p o u r ces années ( t r o p courtes) de "petites" blagues, de rigolades et de conseils; Caroline, p o u r sa gentillesse

rassurante f a c e à mes angoisses, son coup de clavier hien utile dans la dernière ligne droite et tous ces bons

moments passés ensemble; les voisins BLV: l o u i s , isahelle, A n n e , Gosha et v é r o n i f i e pour leur présence et

leurs j e t s d ' é l a s t i t f u e s réputés à trajectoire déconcertante, un merci spécial à Y v e t t e et K a r e n , p o u r avoir été aussi attentives et optimistes f a c e à mon évolution; M o n i f j u e , J e a n , Jeanine et R o l a n d , f i savent si bien résoudre tous les tracas a d m i n i s t r a t i f s et tecknitjues; le service t e c h n i f i e sans l'aide d u f e l la construction du P2+ n'aurait j a m a i s p u se f a i r e et f â a été d'une grande compréhension vis à vis de nos exigences et nos p l a n s d'installations ( { u à f c p e u biiarroides. j e ne v o i d r a i s p a s non p l u s o é l i e r tous mes autres p e t i t s

camarades de labo: S a r a , A h d e l , M i c h e l , j i m m j , ? a i à , C h r i s t i a n , o d i l e , S o p h i e , E t i e n n e , c a r i n e , T h i e r r y , M a n u , Pierre, N u n o et S i l v i a .

u n mot spécial p o u r N a t h a l i e Becker, f c f a i réussi à apprivoiser après plusieurs années et (jui m'a été d'une g r a n d e aide lors de l ' é l é o r a t i o n de ma thèse annexe.

M e r c i aux dépanneurs de l ' i n f o r m a t i q u e , Serge et E r i c , écfuipe redoutable d ' e f f c a c i t é et de p a t i e n c e [et il en f a l l a i t l ) , ( f u i siègent dans le f o n d d'un coiàoir du laboratoire de physiologie animale.

Edwige et A n n i e , duo de choc de notre bibliothèifue, veuillez t r o u v a ici toute ma reconnaissance p o u r votre accueil chaleureux et si r é c o r f o r t a n t surtout lors de la dernière ligne droite.

A p r é s e n t , j e voudrais remercier M a r i o n , ma complice u n i f e de toutes ces années, j e veux te dire combien nos discussions à l ' i i f i n i , de tout et de rien m'ont détendue, aidée, rassurée et enrichie. M a l g r é tous les v i r u s , souris et couloirs f â nous s é p a r a i e n t , tu as toujours su te brancher m ma longueur d'onde et émettre "mes chansons p r é f é r é e s " . M e r c i M a r i o n d'avoir été p e n d a n t toutes ces années à mes côtés, si réceptive et soucieuse de mon bien-être.

A mes super copains, France et M a r c , toujours p r ê t s à p a r t a g e r f o u s rires et discussions hautement

"philosophitfues" autour d'une bonne table. M e r c i également à tous mes autres copains de route: Catherine, S t é p h a n e , M i c h e l , P a t r i c k , T h i e r r y , Béatrice, F r é d é r i f i e , M a r i e - H é l è n e , Bruno, S i b y l l e , A n n e , A n n e -

Françoise, s y l v i a n e , E r i c , S e r g e , H e n r y , D a i s y , E p h r e m , S y l v i e , M a r c , I n g r i d , D i d i e r , M a r c , o l i v i e r et Didier p o u r leur amitié et tous ces coups de ji'/ S S S ( f u i f o n t tenir ! M e r c i aussi aux bouts de choux A d é l i e , l u c i e et V i r g i l e p o u r leurs babillages et autres f a ç o n s de s'exprimer f i i m'ont toujours permis de déconnecter si f a c i l e m e n t de ce t r a v a i l .

j e voudrais terminer en remerciant ma f a m i l l e , tjui m'a entourée p e n d a n t toutes ces années f i i

n'ont p a s toujours été f a c i l e s ( p o u r f i i . . . ? ) . M e r c i M a m a n p o u r ce frigo toujours rempli mais surtout pour ton accueil, écoute et soutien sans f a i l l e ; à Paps (jui sans en avoir l ' a i r a suivi ma progression de très p r è s ; à o l i v i e r et toute sa "petite" f a m i l l e p o u r leur gentillesse, leur sollicitude et aussi p o u r tous ces "Béééné"

encourageants; à Amélie et à tous les autres que j e ne p e u x citer mais avec lestjuels j ' a i passé de très bons moments.

A vous tous, merci de tout coeur.

La fusion raembranaire constitue une étape essentielle dans le cycle de vie du virus SIV.

D'une part, elle est nécessaire pour l'entrée de SIV dans les cellules cibles exprimant le récepteur principal de SIV, la molécule CD4. D'autre part, la formation de syncytia qui constitue un effet cytopathogène majeur de SIV résulte de la fusion entre la membrane des cellules infectées et non infectées. La fusion membranaire est réalisée par les glycoprotéines d'enveloppe, gpl20 et gp32, assemblées en oligomères à la surface des cellules infectées et du virion. L'interaction CD4-gpl20 à la surface de la cellule cible, induirait des changements de conformation au sein du complexe glycoprotéique viral gpl20/gp32. Ces changements permettraient principalement l'exposition d'une séquence hydrophobe appelée peptide de fusion, présente à l'extrémité amino-terminale de la gp32. Par sa forte hydrophobicité, le peptide de fusion pourrait interagir avec la membrane de la cellule cible, s'y insérer et favoriser la fusion des membranes virale et cellulaire. Le mécanisme moléculaire permettant au peptide de fusion d'induire la fusion entre les membranes reste inconnu à l'heure actuelle.

Des prédictions théoriques réalisées par R. Brasseur indiquent que, pour un grand nombre de virus inducteurs de syncytia, le peptide de fusion se structurerait en une hélice a amphipatique capable de s'insérer obliquement dans la membrane Upidique. L'insertion oblique du peptide de fusion dans la membrane de la cellule cible favoriserait une déstabilisation locale de l'organisation lipidique et entraînerait la fusion membranaire.

L'objectif de ce travail était de tester ce modèle théorique pour le virus SIV. Sur base de la modélisation moléculaire, nous avons modifié la séquence du peptide de fusion de SIV afin d'altérer son angle d'insertion théorique dans la bicouche lipidique.

Les modifications du peptide de fusion ont été introduites par mutagenèse dirigée dans la gp32 de SIV et les glycoprotéines ainsi mutées ont été exprimées dans des cellules eucaryotes grâce à des virus de la vaccine recombinants. L'expression, le clivage et la fixation au CD4 des précurseurs d'enveloppe mutés (gpl60) ainsi que l'expression des glycoprotéines matures mutées (gpl20/gp32) à la surface cellulaire ne sont pas affectés par les mutations du peptide de fusion. L'activité fusogène des glycoprotéines mutées exprimées dans des cellules cibles CD4+

infectées par les différents virus de la vaccine recombinants a été mesurée par comptage du

nombre de syncytia observés dans ces cultures cellulaires. Nos résultats renforcent l'hypothèse

selon laquelle une insertion oblique du peptide de fusion dans une bicouche lipidique serait

importante pour la formation de syncytia induits par les glycoprotéines SIV. Nous montrons

également que l'ordre des acides aminés au sein du peptide de fusion de SIV serait important

pour la formation de syncytia. Nous proposons que la réduction de l'activité fusogène des

glycoprotéines qui ont un peptide de fusion "désordonné" résulterait plutôt d'une altération de

l'activation de la fusion que du processus de fusion lui-même. Ces glycoprotéines mutées suite

à leur interaction avec la molécule CD4 ne subiraient pas les changements conformationnels nécessaires à l'induction de la fusion membranaire.

Etant donné que la fusion membranaire est également essentielle pour l'entrée du virus SIV dans les cellules cibles CD4+, nous avons étudié l'effet de ces mutations non plus dans le contexte des glycoprotéines isolées mais dans le contexte du virus. Nos résultats montrent que les mutations du peptide de fusion n'altèrent pas l'expression des protéines virales et la

production de particules virales matures. De plus, l'activité fusogène des virus mutés a été déterminée par mesure de leur infectivité pour les cellules cibles CD4+ et par comptage du nombre de syncytia qu'ils induisent dans ces cellules.

Nous avons mis en évidence qu'un motif Phénylalanine-X-glycine au sein du peptide de fusion de SIV, également présent dans un grand nombre de peptides de fusion des virus inducteurs de syncytia, pourrait contribuer à l'activité fusogène du virus SIV. Nos résultats montrent également que l'insertion oblique dans une bicouche lipidique du peptide de fusion ne semble pas nécessaire à l'infectivité de SIV mais serait essentielle pour une induction efficace de syncytia. Les processus d'infection et de formation de syncytia pourraient donc nécessiter des caractéristiques structurales différentes des glycoprotéines d'enveloppe virale ainsi que des mécanismes moléculaires différents et nous suggérons que l'insertion oblique du peptide de fusion de SIV serait une de ces caractéristiques.

Nous nous sommes également intéressés à la spécificité du peptide de fusion de SIV. Ce peptide a été substitué par le peptide de fusion de trois autres virus enveloppés fusogènes tels que le BLV, NDV et HTLV-I. Nous avons ainsi découvert que le peptide de fusion de SIV serait également impliqué dans la maturation et le clivage du précurseur gpl60 de SIV. Nos résultats montrent que le peptide de fusion de BLV dans le contexte des glycoprotéines SIV conserve une activité fusogène tandis que la substitution du peptide de fusion SIV/BLV dans le contexte du virus entraîne la perte d'infectivité de ce virus hybride pour les cellules cibles CD4+. L'échange de peptide de fusion SIV/BLV pourrait altérer certaines caractéristiques structurales des glycoprotéines d'enveloppe virale de SIV qui seraient dans ce cas-ci importantes pour l'infection virale.

Au cours de notre étude, nous avons donc pu mettre en évidence le rôle complexe que

jouerait le peptide de fusion de SIV tant lors de la maturation et du clivage des glycoprotéines

d'enveloppe que dans la fusion membranaire essentielle pour les processus d'infection et de

formation de syncytia.

Table des Matières

TABLE DES MATIERES 1 ABREVIATIONS 4

I. INTRODUCTION 6

A. Le SlV-macaque, comme modèle animal 6 B. L'infection par HIV-1 7

C. La structure de la particule virale 8 D. Le cycle viral 9

1. La phase d'établissement 9

a) L'adsorption du virus à la surface de la cellule cible 9 b) La fusion 10

c) La rétrotranscription de l'ARN viral 10 d) L'intégration 10

2. La phase d'expression 10

a) La synthèse des ARN et des protéines virales 10 b) L'assemblage du virion 11

E. Organisation génomique 11

F. Tropisme et cytopathogénicité du virus 15 1. Le tropisme 15

2. Mécanismes possibles de la destruction des lymphocytes T CD4+ 17 a) Effets cytopathiques directs 17

(1) La formation de syncytia 17 (2) La lyse de cellules isolées 18 b) Effets cytopathiques indirects 19

3. Diminution de l'expression en surface de la molécule CD4 20 4. Les monocytes/macrophages 20

G. Etude des glycoprotéines d'enveloppe 21

1. Synthèse et maturation du précurseur d'enveloppe, la gp 160 21

a) La glycosylation et la formation de ponts disulfures de la gpl60 21 b) L'oligomérisation de la gp 160 22

c) Le clivage de la gp 160 24 2. La protéine de surface: la gpl20 25

a) Le site de liaison de la gpl20 au récepteur CD4 25 b) Le domaine d'association gpl20-gp41 26

c) Le principal domaine neutralisant de HIV-1: la boucle V3 27

3. La protéine transmembranaire: la gp41 29

2

a) Le domaine intracytoplasmique 29 b) Le domaine transmembranaire 30 c) Le domaine extracellulaire 31

(1) Le domaine immunodominant 31 (2) Le motif de tirette à leucines 31 (3) Le peptide de fusion 32

H. La fusion membranaire virale 34 1. La fusion à pH acide 34 2. La fusion à pH neutre 34

3. Activation du processus de fusion 35

a) L'hémagglutinine du virus de l'influenza, comme modèle de référence 35

b) Activation du complexe gpl20-gp41 de HIV-l par sa liaison au récepteur CD4 37 4. Le processus de fusion 39

n . RESULTATS ET DISCUSSION 41 Ha. Approche théorique 41

A. Modélisation moléculaire d'un mode possible d'interaction du peptide de fusion de SIV avec une bicouche lipidique 41

B. Modifications théoriques du peptide de fusion de SIV 43 1. Les mutations M l et M2 44

2. Les mutations M3 et M4 44 3. Les mutations M5 et M6 44 4. Les mutations M9 et M10 44 nb. Approche expérimentale 44

A. Expression transitoire des glycoprotéines d'enveloppe SIV natives

ou mutées (Ml-M 10) dans des cellules eucaryotes infectées par des virus de la vaccine recombinants 45

1. Importance de l'insertion oblique du peptide de fusion de SIV dans une bicouche lipidique pour l'activité fusogène des glycoprotéines virales (Article n°l) 45

2. Importance de l'ordre des acides aminés du peptide de fusion de SIV pour l'activité fusogène des glycoprotéines virales (Article n°2, première partie) 56

B. Expression transitoire de virus SrVmacBK28 natif et mutés (Ml-MlO) dans des cellules eucaryotes (Article n°2, seconde partie) 57

C. Substitution du peptide de fusion de SIV par celui des virus BLV, NDV et HTLV-1 89 1. Expression transitoire des glycoprotéines SIV hybrides

dans des cellules eucaryotes infectées par des virus de la vaccine recombinants 87 a) Résultats 89

(1) Expression des glycoprotéines SIV hybrides 91

(2) Clivage des glycoprotéines SIV hybrides 91

(3) Expression des glycoprotéines SIV hybrides à la surface cellulaire 92 (4) Fixation des glycoprotéines SIV hybrides au récepteur CD4 93 (5) Activité fusogène des glycoprotéines SIV hybrides 93

b) Discussion 95

2. Expression transitoire du virus hybride SIV/BLV dans des cellules eucaryotes 98 a) Résultats 99

(1) Maturation et production des particules virales hybrides SIV/BLV 99 (2) Infectivité du virus hybride SIV/BLV 99

b) Discussion 100

m . CONCLUSION ET PERSPECTIVES 104 rv. MATERIEL ET METHODES 110

V. BIBLIOGRAPHIE 118

Abréviations

acides aminés:

Ala (A) alanine Arg (R) arginine Asn (N) asparagine Asp (D) acide aspartique Cys (C) cystéine

Gin (Q) elutamine Glu (E) acide glutamique Gly (G) glycine

His (H) histidine ne (I) isoleucine Leu (L) leucine Lys (K) lysine

Met ( M ) méthionine

Phe (F) phénylalanine Pro (P) proUne Ser (S) serine Thr (T) thréonine Trp (W) tryptophane Tyr (Y) tyrosine Val (V) valine ADN acide désoxyribonucléique ARN acide ribonucléique

BCIP 5-bromo-lchloro-3-indoyl phosphate BLV bovine leukemia virus

BSA bovine sérum albumine Ci curie

cpm coups par minute

EDTA éthylène diamine tétraacétate de sodium FBS foetal bovine sérum

FLG phénylalanine-leucine-glycine gp glycoprotéine

HA hémagglutinine

HIV human immunodeficiency virus

^assoc constante d'association

kb kilobase

kDa kilodalton

LFA-1 lymphocyte function-associated antigen 1 LTR long terminal repeat

NBT nitro blue tetrazoUum NDV newcasde disease virus

nt nucléotide

ra.o.i multiplicité d'infection

Mo-MuLV moloney m urine leukemia virus OPDA o-phénylenediamine dihydrochonde PCR polymerase chain reaction

PMSF phénylméthylsulfonyl fluoride RE réticulum endoplasmique RRE rev responsive élément

RMN résonance magnétique nucléaire RT reverse transcriptase

RSV rous sarcoma virus

sCD4 CD4 soluble

SDS sodium dodécyl sulfate

SIDA syndrome d'immunodéficience acquise SIV simian immunodeficiency virus

TE tampon Tris-HCl/EDTA

TK thymidine kinase

6

L INTRODUCTION

En 1981, les premiers cas de SIDA (syndrome d'immunodéficience acquise) ont été observés aux Etats-Unis (Gottlieb et al, 1981; Masur et al, 1981). Après une longue période asymptomatique correspondant à une altération progressive des fonctions immunitaires, cette maladie apparaît comme un syndrome d'immunodéficience caractérisé par des infections opportunistes, une incidence accrue de tumeurs et une dégénérescence du système nerveux central (revu par Wong-Staal 1991). En 1983, le rétrovirus responsable de ce syndrome a été isolé et appelé HIV pour Human Immunodeficiency Virus.

Les rétrovirus se caractérisent par un cycle de réplication unique, basé sur la

transcription de l'ARN génomique simple brin en ADNc double brin. Cette rétrotranscription est assurée par la transcriptase inverse. Les rétrovirus peuvent être classés en trois sous- familles en fonction de leur pathogénicité (revu par Coffin 1991). Les spumavirus (virus Foamy, par exemple) sont responsables d'infections bénignes et induisent la vacuolisation des cellules in vitro. Les oncovirus (RSV, HTLV-I et BLV, par exemple) peuvent être associés à différentes formes de cancer. Les lentivirus (virus de Visna et HIV, par exemple) sont des virus qui entraînent des pathologies à évolution lente et progressive, responsables de maladies

neurologiques et immunologiques. Ils ne semblent pas impliqués dans le processus de transformation cellulaire.

Le virus HIV est un rétrovirus humain du groupe des lentivirus. Actuellement, deux virus humains apparentés ont été isolés:

- HIV-1, originaire d'Afrique centrale, se propageant en Afrique, aux Etats-Unis, en Asie et en Europe (Barre-Sinoussi et al. 1983; Gallo et al. 1984).

- HIV-2, originaire d'Afrique de l'ouest, restant confiné dans ces contrées à l'état endémique (Clavel et al. 1986). HIV-2, bien que parfois associé au développement d'un SIDA, semble moins pathogène que HIV-1.

Un modèle animal est indispensable à la compréhension de la pathogénicité du SIDA et à l'élaboration d'approches vaccinales et thérapeutiques (Desrosiers 1990). Les chimpanzés et les gibbons sont les seuls animaux connus susceptibles d'être infectés par le HIV-1 (Francis et al.

1984; Fultz et al. 1986) mais ces espèces sont protégées et se reproduisent mal en captivité.

Par ailleurs, bien que l'infection persiste dans ces animaux, ils ne développent pas de SIDA (Gibbs et al. 1986).

A. Le SlV-macaque, comme modèle animal.

Plusieurs SIV (simian immunodeficiency virus) ont été isolés chez des singes africains

tels que les mangabés couleur de suie, les singes verts d'Afrique, les mandrills et les chimpanzés

Antibodies to HIV Env

4-8 weeks Dp to 12 years 2-3 years

FIGURE 1.1: Evolution de l'infection par HIV-1 (Weiss 1993)

7

dans leur habitat naturel (Gardner 1989; Desrosiers 1990). Ces lentivirus ont été nommés respectivement, SlV^nmi' SlVagm, SlV^nd SIV^-pz- Dans leur hôte naturel, ces virus

établissent une infection persistante mais ne sont pas pathogènes pour ceux-ci. Chez des singes asiatiques tels que les macaques rhésus et les macaques à queue de cochon qui vivent en captivité, d'autres SIVs ont été découverts. Ces virus désignés respectivement, SlVj^ac

SlV^ine induisent chez ces singes asiatiques une infection persistante qui conduit généralement à une maladie fatale de type SIDA. Les SIVs sont similaires au HIV-1 tant au niveau de la structure, de l'organisation génomique, de l'utilisation de la molécule CD4 comme récepteur principal, de la cytopathogénicité ou encore de leur capacité d'induire après une longue infection persistante une maladie fatale.

Les virus SIV^p^ d'une part, et SlVsnjjn/SIVmac/SIVnine d'autre part, présentent, respectivement une parenté étroite avec les virus humains HIV-1 et HIV-2. Cependant, seuls les virus simiens SIVs^^j^, SlV^jac '^I^mne provoquent une maladie semblable au SIDA lors d'expérimentations sur des macaques. A l'heure actuelle, le système SlV-macaque est considéré comme l'un des meilleurs modèles animaux dont on dispose pour des investigations

expérimentales (Hirsch et Johnson 1992; Stott 1994).

La suite de cette introduction se rapporte plus spécifiquement au virus prototype HIV-1, plus étudié à ce jour que HIV-2 et SIV. Cependant, nous l'éclairerons le plus possible par les informations disponibles concernant SIV qui seront nécessaires à la compréhension de ce ttavail.

B. L'infection par HIV-1 (Figure I.l).

On distingue trois grandes phases dans le développement de cette infection: la phase d'infection primaire qui s'étale sur une période de plusieurs semaines, suivie d'une phase asymptomatique de durée variable et enfin la phase dite de SIDA, fatale (revu par Fauci et al.

1993; Ho et al. 1995; Wei et al. 1995).

Dans les quelques semaines qui suivent l'infection par HIV-1, le virus se réplique activement et un taux d'antigène viral, p24, important est détecté. C'est probablement pendant cette période que le virus se distribue dans les divers organes, notamment dans les tissus lymphoïdes qui constitueraient un site de réplication virale persistante tout au long de l'infection (Embretson et al. 1993).

La dissémination virale induit une réponse immunitaire cellulaire et humorale. Les patients entrent dans la phase dite de latence clinique caractérisée par des niveaux faibles de virus circulant, une expression virale persistante dans les nodules lymphoïdes et par une

diminution progressive du nombre de lymphocytes CD4+ (Embretson et al. 1993). Il apparaît à

présent qu'il existe chez ces individus, un processus dynamique d'infection correspondant à un

jeu continu de nombreuses nouvelles infections, de réplication virale et de destruction des ces

8

cellules CD4+ productivement infectées (Ho et al. 1995; Wei et al. 1995). Ainsi, le nombre de lymphocyte CD4+ qui sont détruits et à nouveau produits tous les jours chez un individu infecté serait de l'ordre de 10^ soit 5% de la population totale de lymphocytes CD4+ (Ho et al.

1995; Wei et al. 1995). Les virus HIV circulant semblent provenir de cellules nouvellement infectées et non pas de cellules qui produisent du virus chroniquement ou qui sont infectées de manière latente et qui seraient activés (Ho et al. 1995; Wei et al. 1995). Cependant ces

dernières cellules, très nombreuses, pourraient représenter une souce potentiellement importante de variants HIV, capables de résister aux drogues administrées.

Cependant la capacité regénératrice du système immunitaire n'est pas infinie. L'activation chronique de ce système aboutirait inévitablement à sa détérioration, sa dérégulation et

l'individu infecté entrerait alors dans la phase de SIDA déclaré. La virémie augmente à nouveau et est accompagnée par une chute dramatique du nombre de lymphocytes T CD4+. Le patient infecté présente des troubles du système nerveux central et une immunosuppression profonde qui le rend incapable de répondre aux agents pathogènes. La phase de SIDA aboutit à la mort du patient essentiellement suite à des maladies opportunistes (Cytomégalovirus, Pneumocystis cariniï) ou à des cancers de type lymphomes, cancer du col utérin et sarcome de Kaposi (Merill et Chen 1991).

C. La structure de la particule virale (Figure 1.2).

La particule virale ou virion ressemble à une sphère d'environ 100-140 nm de diamètre (Gelderblom 1991). La composition des virions de HIV-1 est d'approximativement 62% de protéines, 35% de Upides et 3% d'acides nucléiques (Aloia et al. 1988). Ces virions sont constitués d'une enveloppe, d'une matrice et d'une capside (Gelderblom 1991).

L'enveloppe virale est composée d'une bicouche Upidique d'origine cellulaire, acquise lors du bourgeonnement de la particule virale à la surface de la cellule infectée, dans laquelle sont ancrées 72 protubérances ou spicules. Chaque spicule est formée de deux glycoprotéines virales, les gpl20 et gp41, assemblées en oligomères. La sous-unité gpl20 (SU) est

extramerabranaire et est liée de manière non covalente à la sous-unité gp41 (TM), protéine transmerabranaire qui traverse de part en part la membrane cellulaire (Kowalski et al. 1987;

Helseth et al. 1991).

Directement sous l'enveloppe virale, une première couche interne, la matrice du virion (MA)

forme une structure icosaédrale complexe et une seconde couche interne constitue la capside

du virion (CA). La capside renferme la nucléocapside (NC) constituée du matériel génétique

viral correspondant à deux molécules identiques d'ARN qui sont associées aux protéines virales

de la nucléocapside. La capside contient aussi les enzymes virales requises aux événements

précoces de la réplication virale (l'intégrase, IN et la transcriptase inverse RT) (Haseltine 1991;

9

Levy 1993). Des molécules correspondant à la protéase virale (PR) sont trouvées dans l'espace entre la capside et la matrice.

Les différentes protéines qui forment la particule virale seront décrites plus en détails par la suite (chapitre E et G).

D. Le cycle viral.

On peut diviser le cycle viral en deux phases qui sont elles-mêmes une succession de plusieurs étapes (revu par Levy 1993).

1. La phase d'établissement (Figure I.3A).

a) L'adsorption du virus à la surface de la cellule cible.

L'infection débute lorsque les particules HIV-1 se fixent à la molécule CD4, leur principal récepteur membranaire présent à la surface des cellules cibles. La molécule CD4 est une glycoprotéine transmembranaire présente à la surface de certaines cellules effectrices du système immunitaire. La fixation du virus HIV-1 résulte de l'interaction à haute affinité

2.5 10'^ M) entre la glycoprotéine d'enveloppe virale, la gpl20 et la molécule CD4 (Lasky et al. 1987; Ivey-Hoyle et al. 1991). De nombreux arguments ont permis d'établir que la molécule CD4 est le récepteur principal du virus HIV-1 :

- La glycoprotéine gpl20 est immunoprécipitée avec la molécule CD4 (McDougal et al. 1986).

- Les cellules cibles majeures de HIV-1 sont les lymphocytes T CD4"'' qui se caractérisent par un grand nombre de CD4 à leur surface et les macrophages/monocytes présentant une concentration plus faible de CD4.

- L'infection virale par HIV-1 peut être bloquée par des anticorps monoclonaux dirigés contre certains sites spécifiques du CD4 (Dalgleish et Kennedy 1988) et par des molécules CD4 solubles (sCD4) délétées de leur domaine transmembranaire et cytoplasmique (Traunecker et al. 1989).

- Le transfert du gène codant pour le CD4 dans des cellules humaines n'exprimant pas

naturellement cette glycoprotéine rend ces cellules sensibles à l'infection par HIV-1 (Maddon et al. 1987).

Cependant l'expression du récepteur CD4 ne suffit pas toujours à sensibiliser la cellule à

l'infection par HIV-1. En effet, des cellules de souris, de chat, de lapin et de singe qui

expriment le CD4 humain à leur surface de même que certaines cellules humaines qui

expriment naturellement la molécule CD4-I- ne sont pas sensibles à l'infection par HIV-1

(Maddon et al. 1987; Clapham 1991). Lorsque l'ADN génomique viral est introduit dans le

cytoplasme de ces cellules, elles sont cependant capables d'assumer le cycle viral de HIV-1

suggérant que l'entrée virale serait l'étape limitante. Le fait que le virus HIV-1 soit incapable

d'entrer dans ces cellules CD4+ suggèrent que des composants cellulaires de surface, autre que le CD4, pourraient jouer un rôle de co-récepteur de HIV-1 (Dragic et al. 1992 et 1993;

Harrington et al. 1993).

b) La fusion.

L'interaction CD4-gpl20 à la surface de la cellule cible induirait un changement de conformation au sein du complexe glycoprotéique viral gpl20-gp41 permettant l'exposition de nouvelles régions du complexe nécessaires à l'entrée virale. La gp41 présente à son extrémité amino-terminale une courte séquence hydrophobe appelée peptide de fusion. Par sa forte hydrophobicité, le peptide de fusion pourrait interagir avec la membrane de la cellule cible, s'y insérer et favoriser la fusion des membranes virale et cellulaire (Eiden et Lifson 1992). La capside rétrovirale est alors introduite dans le cytoplasme de la cellule cible.

c) La rétrotranscription de l'ARN viral.

Dans le cytoplasme, l'ARN génomique viral est alors rétrotranscrit en un ADN double brin linéaire par la transcriptase inverse virale. La transcriptase inverse, grâce à son activité ADN polymérase-ARN dépendante, synthétise un brin d'ADN complémentaire en utilisant l'ARN viral comme modèle. L'activité ribonucléase H de l'enzyme dégrade le brin d'ARN original et l'activité ADN polyraérase ADN-dépendante de la transcriptase inverse synthétise le second brin d'ADN en utilisant le premier comme modèle.

d) L'intégration.

Après la rétrotranscription, la molécule double brin d'ADN est transportée jusqu'au noyau de la cellule infectée, et est intégrée dans le génome cellulaire de l'hôte grâce à l'intégrase virale (Busham et al. 1991). L'ADN viral ainsi intégré est appelé provirus et se réplique en même temps que l'ADN de la cellule infectée. Le provirus peut alors rester silencieux pendant une longue période ou s'exprimer activement en produisant de nouveaux virions. D'autre part, l'ADN viral peut également rester de manière stable non intégré, sous forme circulaire.

2. La phase d'expression (Figure I.3B).

Cette seconde partie du cycle du virus, c'est-à-dire la production de nouvelles particules virales, n'est pas systématique. Elle débute après acùvation du provirus (revu par Antoni et al.

1994).

11

a) La synthèse des A R N et des protéines virales.

L'ARN polyraérase II de la cellule hôte transcrit le provirus en molécules d'ARNm qui migrent vers le cytoplasme. Certains de ces ARNm seront traduits par la machinerie cellulaire en protéines virales alors que d'autres constituront le matériel génétique de la nouvelle génération de particules virales.

b) L'assemblage du virion.

Les particules virales immatures s'assemblent sous la face interne de la membrane plasmique à partir des deux précurseurs polyprotéiques viraux: GAG et GAG-POL. Les protéines de la matrice, de la capside et de la nucléocapside sont les produits de chvage du précurseur GAG alors que les protéines enzymatiques du virion proviennent du chvage du précurseur GAG-POL. Ces deux précurseurs s'associent à la face interne de la membrane cellulaire grâce à un acide myristique présent à leur extrémité amino-terminale (Gôttlinger et al.

1989). Progressivement, ces deux précurseurs polyprotéiques s'agrègent sous la membrane et s'associent à deux brins d'ARN viral. Le complexe nucléoprotéique ainsi formé bourgeonne en emportant un fragment de la membrane cellulaire dans lequel sont ancrées les glycoprotéines d'enveloppe virale. Une interaction entre les gp41 et les protéines de la matrice virale serait responsable de l'incorporation sélective de la glycoprotéine gp41 dans le virion (Dorfman et al.

1994). La maturation du virion se produit pendant ou peu après le bourgeonnement. Le précurseur GAG-POL présente une activité protéolytique qui assure son propre chvage et sa maturation ainsi que celle du précurseur GAG. Les protéines de structure et les protéines enzymatiques qui résultent de cette maturation, s'organisent et forment la matrice, la capside et la nucléocapside d'un virion mature. Cette étape de maturation qui impUque un changement de morphologie du virion, détectable par microscopie électronique, est essentielle à l'infection du virion. Les glycoprotéines gpl20/gp41 emportées par le virus lors de son bourgeonnement servent à infecter de nouvelles cellules et le cycle viral peut alors recommencer. La gpl20, Uée de manière non covalente à la gp41 se dissocie spontanément du virion. La quantité de gpl20 libérée est dépendante de la température, de "l'âge" des particules et de l'isolât considéré. Cette dissociation coïncide avec une diminution progressive de l'infectivité du virus HIV-1

(McKeating et al. 1990).

E. Organisation génomique (Figure 1.4).

Le génome de HIV-1 d'une longueur approximative de 9.5 kilobases (kb) présente à

chaque extrémité une séquence répétée appelée LTR (Long Terminal Repeat). Ces longues

répétitions terminales comportent trois régions appelées U3, R et U5 en raison de leur origine

respective dans l'ARN génomique viral (Unique en 3', Répété aux deux extrémités et Unique

tat.

LTR

DOl •01

vpr env ^•

LTR

Exons CD C ³

4A ( 4B [

CD 6D

5 0 Late m R N A s

gag Q-§-Ts—§

gag-pol ©— ©

vifmRNA g h ^ ^ ^ vpr mRNA 0 -

îat mRNA 0 - env/vpu mRNA (0*

tat mRNAs • 0 - tev/tnv mRNA @-

rev mRNAs " ^

nef mRNAs • ®"

vp/" S/AT

Early m R N A s

1.4.7 1.2.4.7 1.3.4.7 1.4.6D.7 1.4A/4B.7 1.2.4A/4B.7 1.3.4A/4B.7 1.7

1.5.7 1.2.5.7 1.3.5.7

FIGURE 1.4: Représentation schématique du génome et des profils d'épissage de HIV-l.

T, TAR; C, CRS; R, RRE. Le site donneur d'épissage majeur (SD) est représenté par un

triangle et les sites accepteurs d'épissage (SA) par des triangles inversés, fs indique le site de

changement de cadre de lecture des ribosomes qui a lieu durant la traduction de l'ARNm gag-

pol. L'épissage des exons dans les ARNm précoces est montré sur la droite (Vaishnav et

Wong-Staal 1991)

12

en 5'). Les régions LTR sont générées durant le processus de rétrotranscription virale et sont impliquées dans l'intégration du provirus dans le génome cellulaire, dans l'initiation et la régulation de la transcription et dans la régulation de l'expression des gènes viraux (revu par Antoni et al. 1994). Les séquences situées entre les deux LTRs codent pour les protéines de structure GAG, POL et ENV, communes à tous les rétrovirus et pour 7 autres protéines dites auxiliaires dont certaines régulent l'expression virale (revu par Vaishnav et Wong-Staal 1991).

L'ensemble des protéines de HIV-1 est produit à partir d'un ARN précurseur primaire. La régulation de l'expression des différentes protéines résulte d'un processus complexe d'épissage du transcrit primaire et de l'exploitation de plusieurs cadres de lecture.

• Le gène gag (group-specific antigen) code pour le précurseur polypeptidique PrSSS^ë qui est traduit à partir de l'ARN viral complet. Le précurseur Pr55g^g est clivé lors de la maturation du virion par la protéase virale générant ainsi les différentes protéines GAG: pl7, p24, p9 et p6. Ces protéines constituent les éléments de la matrice (pl7), de la capside (p24) et de la nucléocapside (p9 et p6).

• Le gène pol (polymerase) code pour la protéase, la transcriptase inverse, la RNAse H et l'intégrase. Le précurseur polypeptidique PrlôOS^g'PO^ est traduit à partir du transcrit primaire, suite à un changement de cadre de lecture au cours de la traduction. Cet événement se produit à une fréquence de «5% (Jacks et al. 1987). La protéine précurseur GAG-POL est cUvée par la protéase virale pour donner les trois enzymes virales: la protéase plO, la transcriptase

inverse/RNAse H (p66/p51) et l'intégrase (p32).

• Le gène env (enveloppe) code pour un précurseur glycopolypeptidique gpl60, synthétisé à partir d'un ARNm qui a subi un seul événement d'épissage correspondant à la délédon des gènes gag et pol. Ce précurseur s'associe en oligomères dans le réticulum endoplasmique et est clivé dans le Golgi afin de donner les deux glycoprotéines d'enveloppe virale, les gpl20 et gp41 (Willey et al. 1988).

• Le gène tat (fran^-activator) code pour la protéine TAT, de 15 kilodaltons (kDa), localisée essentiellement dans le noyau des cellules infectées. TAT est un puissant /ram-activateur de la transcription et est indispensable à la réplication virale (CuUen 1992). TAT agit au niveau d'une séquence TAR (TAT-responsive séquence), localisée dans la région R du LTR, qui est

transcrite et présente à l'extrémité 5' de chaque messager viral (Rosen et al. 1985). Dans les ARNm, la région TAR peut se présenter sous la forme d'une structure locale stable en épingle à cheveux reconnue par TAT (Berkhout et al. 1989). Cependant, la transactivation virale

optimale nécessiterait la présence simultanée de TAT et de facteurs cellulaires se liant à TAT et

à la séquence TAR (Roy et al. 1990; Sheridan et al. 1993).

• Le gène rev (régulation of virion protein) code pour la protéine REV, de 20 kDa, également localisée dans le noyau et indispensable à la synthèse des protéines de structure (Cullen et al.

1988). Initialement, juste après l'infection, seuls les ARNm épissés plusieurs fois qui codent pour les protéines TAT, REV et NEF parviennent dans le cytoplasme et sont traduits en protéines (Rosen et al. 1988; Felber et al. 1989; Cochrane et al 1991). Les autres ARNm, non épissés ou simplement épissés, sont retenus dans le noyau par des séquences CRS (cw-acting repression séquence), présentes uniquement dans les longs ARNm. Lorsque la concentration de REV dépasse un seuil critique, les longs ARNm sont acheminés vers le cytoplasme et traduits en protéines. Le transport vers le cytoplasme requiert une interaction spécifique entre des multimères REV et une séquence RRE (REV responsive élément) locahsée dans le gène env, présente uniquement dans les ARNm longs (Malim et al. 1989; Malim et al. 1991).

Comme dans le cas de TAT, des facteurs cellulaires se liant à REV ou au complexe REV- RRE sont probablement nécessaires à l'activité de REV (Luo et al. 1994; Shukla et al. 1994).

• Le gène nef (négative factor) qui chevauche partiellement le LTR3' code pour une protéine de 27 kDa qui est myristilée. Produite très rapidement après l'infection, elle s'associe à la membrane plasmique des cellules infectées (GuateUi et al. 1990). In vivo l'utilisation d'un modèle simien révèle que le gène nef est essentiel pour une réplication virale élevée et la présence du gène nef est associée au développement d'une maladie de type SIDA chez ces singes infectés (Kestler et al. 1991). NEF jouerait donc in vivo un rôle capital dans la

pathogenèse du SIDA. Par contre, in vitro, le rôle de NEF reste très controversé. Il n'est pas nécessaire à la réplication virale en culture cellulaire (Fisher et al. 1986; TerwilUger et al.

1986). L'expression de ne/dans plusieurs Ugnées cellulaires CD4+ entraîne une diminution de la densité de CD4 à la surface de ces cellules. La modulation du CD4 induite par NEF résulte d'une rapide intemalisation du CD4 de surface qui est ensuite dégradé, probablement dans le compartiment lysosomial (Rhee et al. 1994). NEF est également capable de réduire l'expression du complexe gpl20-gp41 à la surface des cellules infectées (Schwartz et al. 1993).

• Le gène vif (virion infectivity factor) code pour une protéine cytoplasmique, de 23 kDa (Strebel et al. 1987), dont une fraction est associée à la face interne de la membrane plasmique de la cellule infectée (Goncalves et al. 1994). Bien que VIF ne soit pas nécessaire à la

transcription et à la production virale (Sova et al. 1993), elle augmente l'infectivité des

particules jusqu'à un facteur 1000 en fonction de la lignée cellulaire CD4+ qui produit ces

particules mutées (Strebel et al. 1987; Sakai et al. 1993). Comme la protéine VIF n'est pas

présente dans les virions, elle doit agir lors des étapes tardives du cycle de réplication virale

(Hôglund et al. 1994), alors que les conséquences de son activité se révèlent lors des étapes

précoces de l'infection virale (Strebel et al. 1987). VIF pourrait moduler la quantité de gpl20 à

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la surface des virions nouvellement produits et ainsi influencer l'infectivité (Sakai et al. 1993) ou encore affecter l'intemalisation de la nucléocapside lors de l'assemblage des virions à la membrane plasmique des cellules infectées (Sova et al. 1993).

• Le gène vpr (viral protein R) code pour une protéine de 15 kDa, la seule protéine auxiliaire associée à la particule virale qui constitue 10% du contenu protéique du virion (Cohen et al.

1990a et b; Gelderblom 1991). Bien qu'elle ne soit pas nécessaire à la réplication virale in vitro, elle accélère cependant celle-ci par un mécanisme encore inconnu (Ogowa et al. 1989; Cohen et al. 1990a et b). Sa présence dans la particule virale suggère qu'elle joue un rôle soit dans des étapes précoces de l'infection, lors de l'initiation de la transcription de HIV-1, soit dans les étapes tardives du cycle viral.

. Le gène vpx est uniquement présent dans le sous-groupe de lentivirus de primates SIVsmm/SIVfnac/SIVmne/HIV2 (Guyader et al. 1987; Chakrabarti et al. 1987). La comparaison des séquences primaires de vpr et vpx fait apparaître une certaine homologie de séquences suggérant que le gène vpx résulte d'une duplication de vpr (Gibbs et Desrosiers 1993; Tristem et al. 1992). Tous les autres sous-groupes de

lentivirus de primates dont HIV-1 n'ont qu'une seule copie de ce gène, vpr. Le produit du gène vpx et du gène vpr sont associés aux particules virales de HIV-2 et SIV^i^c

(Henderson et al. 1988; Hu et al. 1989).

• Le gène vpu (viral protein U) code pour une protéine phosphorylée, de 16 kDa, localisée dans le compartiment périnucléaire de la cellule et qui serait associée aux membranes (Strebel et al. 1988). Le gène vpu est spécifique au sous-groupe de lentivirus SIVcpz/HIV-l et semble absent chez les autres lentivirus de primates. Le produit du gène vpu semble jouer un rôle lors des étapes tardives du cycle viral en favorisant un assemblage efficace et une production importante de particules virales par la cellule infectée (Strebel et al. 1989; Geraghty et al.

1993). En l'absence de VPU, les nouvelles particules virales ne se détachent pas de la cellule infectée (Yao et al. 1993). VPU sous forme d'oUgomères pourrait jouer le rôle de pompe à ions (Subbramanian et Cohen 1994).

VPU induit également une dégradation intracellulaire de la molécule CD4 (Willey et al. 1992a et b). En l'absence de VPU, le précurseur d'enveloppe virale, la gpl60, s'associe au CD4 dans le reticulum endoplasmique (RE) et le complexe gpl60-CD4 ainsi formé, reste bloqué dans ce compartiment cellulaire. Lorsque la protéine VPU est présente, elle interfère avec la formation de ce complexe en se liant à la molécule CD4 et induit la dégradation rapide du CD4. La

gpl60 libre peut s'acheminer vers le Golgi afin de poursuivre sa maturation. VPU pourrait ainsi

participer à la réduction du nombre de CD4 à la surface des lymphocytes T infectés par HIV-l.

• Le gène tev (tat-env-rev fusion protein) code pour une protéine contenant le premier exon de tat, un exon non décrit précédemment de env et le second exon de rev. In vitro cette protéine possède les activités transactivatrice de TAT et régulatrice de l'expression des protéines virales de REV (Benko et al. 1990; Salfeld et al. 1990).

F. Tropisme et cytopathogénicité du virus.

1. Le tropisme.

Le virus HIV-1 a été détecté dans un grand nombre de tissus humains tels que le système hématopoéïtique, le cerveau, la peau et le foie (revu par Levy 1993). Le tropisme de HIV-1 est essentiellement restreint à l'entrée virale puisque la transfection d'un clone moléculaire HIV-1 infectieux dans un grand nombre de cellules humaines et animales conduit à la production de particules virales (Adachi et al. 1986; Kim et al. 1990). Les cellules cibles majeures du virus HIV-1 sont les lymphocytes T CD4-I- et les monocytes/macrophages. Tandis que les

lymphocytes T CD4-I- représentent les cellules infectées de manière prédominante dans le sang circulant, les monocytes/macrophages correspondent au type cellulaire majeur infecté dans la plupart des tissus (Gendelman et Meltzer 1990; Embretson et al. 1993). La molécule CD4 à la surface de ces cellules est très probablement le principal récepteur du virus HIV-1.

D'autres cellules exprimant des taux très faibles de CD4, telles que les cellules

dendritiques, les cellules de Langerhans, les cellules NK (Natural Killer), certains lymphocytes B et des macrophages du cerveau sont sensibles à l'infection par HIV-1 (revu par Levy 1993).

De même, des astrocytes, et des neurones de cerveau qui ne semblent pas exprimer la molécule CD4 ont une susceptibilité limitée à l'infection par HIV-1. Généralement, ce type d'infection requiert une large dose virale ce qui permet cependant l'infection d'un nombre limité de cellules, résultant probablement d'une entrée virale inefficace. On ne peut exclure pour les cellules exprimant un faible taux de CD4 que l'interaction de HIV-1 avec le CD4, initie l'entrée virale. Par contre, pour les cellules CD4 négatives qui peuvent être infectées par HIV-1, d'autres mécanismes d'entrée virale doivent exister (chapitre H.2). Harouse et ses

collaborateurs (1991) ont démontré que la gpl20 pouvait se lier à un galactocéramide présent à la surface des cellules neuronales et épithéliales, qui serait donc un récepteur potentiel de HFV-l pour ces cellules.

Les différents isolats de HIV-1 semblent présenter in vitro un tropisme cellulaire

préférentiel. En général, tous les isolats, qu'ils proviennent directement d'individus infectés ou

qu'Us soient propagés in vitro, sont capables d'infecter les phagocytes mononucléaires et les

lymphocytes T CD4-I- primaires (Valentin et al. 1994). Certains isolats ne sont cependant pas

capables de se répliquer efficacement dans la plupart des lignées lymphoïdes T CD4-I- alors

qu'ils infectent efficacement les macrophages. Ils sont dits macrophage-tropes. En général, ils

16

se répliquent lentement et ne produisent que peu de particules virales. Ce sont des virus

faiblement cytopathiques qui n'induisent que rarement des syncytia (chapitre F. 2a; Fenyô et al.

1988; Tersmette et al. 1988). Inversement, d'autres isolats se répliquent efficacement dans les hgnées de cellules T CD4+ mais faiblement dans les macrophages (Cheng-Mayer et al. 1988;

Fenyo et al. 1988). Ils sont dits lympho-tropes. Ils se répliquent rapidement à un taux élevé et induisent la formation de syncytia (Fenyo et al. 1988; Tersmette et al. 1988).

Cette différence de tropisme parmi les isolats de HIV-1 serait déterminée essentiellement au niveau de l'entrée du virus et impliquerait des régions du gène d'enveloppe qui ne font pas partie du domaine de fixation au CD4. Plus précisément, le domaine V3, correspondant à la troisième région variable de la gpl20 (chapitre G.2c), serait responsable du ttopisme

préférentiel pour les macrophages (Hwang et al. 1991; Shioda et al. 1992). Ainsi, la

substitution d'un ou quelques acides aminés du domaine V3 d'un isolât HIV-1 lympho-trope par les acides aminés correspondant d'un isolât macrophage-trope, confère à cet isolât la capacité de se répUquer dans certaines Ugnées de monocytes (Shioda et al. 1992; Gu et al.

1993). Par contre, ces substitutions altèrent sa capacité de se répliquer dans les Ugnées

lymphoïdes T CD4+. Les séquences spécifiques associées à l'infection de Ugnées lymphoïdes T sont plus nombreuses et moins bien définies, quoique toujours limitées au gène d'enveloppe.

Des régions de la gp41 et de la gpl20 teUes que le domaine V3 seraient impUquées dans le tropisme de HIV-1 pour les cellules T CD4+ (Fujita et al. 1992; WiUey et al. 1994).

Plusieurs études ont montré qu'U existe une corrélation entre le phénotype biologique, plus particulièrement la cytopathogénicité d'un isolât in vitro et l'évolution de l'infection in vivo (Asjo et al. 1986; Cheng-Mayer et al. 1988; Tersmette et al. 1988; Connor et al. 1993). Les isolats provenant de patients en phase asymptomatique sont, en général, capables d'infecter in vitro les monocytes/macrophages. Ces isolats se répUquent lentement à un taux faible et induisent dans les ceUules infectées un effet cytopathique minimal. Ces isolats, pour la plupart, sont macrophage-tropes et persistent pendant tous les stades de la maladie. Durant la phase asymptomatique, une réponse immunitaire efficace de l'hôte peut exercer une pression de sélection en faveur de l'émergence de ces isolats macrophage-tropes. En effet, les virus qui se répUquent rapidement constitueraient une meUleur cible pour le système immunitaire de l'hôte et seraient alors éUminés.

Le plus souvent, les isolats provenant de patients à un stade avancé de la maladie se répUquent rapidement à un taux élevé dans les Ugnées lymphoïdes T CD4-I-. Ds induisent la formation d'un grand nombre de syncytia dans ces cultures ceUulaires. On observe donc une émergence, au cours de l'infection, d'isolats à tropisme pour les lymphocytes T. La présence de ces virus hautement cytopathiques serait étroitement Uée à la destruction des lymphocytes T CD4+ et à une immunosuppession fatale (Tersmette et al. 1989; Schuitemaker et al. 1991 et

1992; Koot et al. 1993). La corrélation entre la cytopathogénicité in vitro et l'évolution de

l'infection in vivo est cependant controversée. Il faut mentionner deux études contradictoires

utilisant des souris SCID (severe combined immunodeficiency) humanisées infectées par différents isolats. La première montre que des isolats HIV-1 non cytopathiques sont capables d'induire une déplétion des cellules CD4+ dans ces souris (Mosier et al. 1993) alors que la seconde confirme la corrélation entre le tropisme in vitro et la pathogenèse in vivo (Kaneshima et al. 1994).

2. Mécanismes possibles de la destruction des lymphocytes T €04+.

La déplétion des lymphocytes T CD4''" est le phénomène le plus flagrant dans la pathogenèse du SIDA. De récents résultats montrent que la déplétion des cellules CD4+ est directement hée à la présence de HIV-1. En effet, des agents anti-protéases qui diminuent de manière très efficace mais transitoire la charge virale, provoque une augmentation immédiate du nombre de cellules CD4+ (Ho 1994 et 1995; Shaw et al. 1994). Plusieurs mécanismes par lesquels HIV-1 pourrait induire une diminution progressive des lymphocytes T sont

actuellement proposés.

a) Effets cytopathiques directs.

L'infection in vitro des lymphocytes T CD4+ par HIV-1 provoque la mort de ces cellules essentiellement par l'induction de la formation de cellules géantes multinucléées ou syncytia et par la lyse de cellules isolées .

( / ) La formation de syncytia.

Le processus d'infection par HIV-1 débute par la frxation de la gpl20 au récepteur CD4 à la surface des cellules cibles et se poursuit par la fusion entre les membranes virale et

cellulaire. Un processus analogue est observé in vitro entre des cellules infectées exprimant à leur surface le complexe gpl20/gp41 et des cellules CD4+ non infectées, provoquant ainsi la formation de cellules géantes polynucléées. Les processus d'infection et de formation de syncytia sont tous les deux inhibés par des anticorps neutrahsants et par le sCD4. L'induction de syncytia dépend fortement de la densité à la fois des glycoprotéines virales à la surface des cellules infectées et des molécules CD4 à la surface des cellules cibles. La formation de syncytia semble nécessiter un plus grand nombre d'interactions CD4-gpl20 que l'entrée du virus (Helseth et al. 1990a). Les concentrations d'anticorps neutrahsants et de sCD4 requises afm d'inhiber la formation de syncytia sont beaucoup plus élevées que celles nécessaires pour bloquer l'infection virale (Moore et al. 1991). La formation de syncytia dépend également de la présence d'une autre molécule de surface, la molécule d'adhésion LFA-1 (HUdreth et al. 1989).

LFA-1 en interagissant avec son hgand stabihse les agrégats cellulaires et favoriserait ainsi la

fusion entre les membranes des cellules infectées et non infectées CD4-I- (Golding et al. 1992).

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La formation de syncytia est généralement accompagnée d'un effet cytopathogène caractérisé par l'arrondissement, le gonflement et la lyse cellulaire (Popovic et al. 1984; Wong-Staal et al.

1985). Cette cytopathologie correspond le plus souvent au premier signe de l'infection par HIV-1 in vitro. Elle pourrait rendre compte in vivo de la mort d'un grand nombre de cellules exprimant la molécule CD4 à leur surface à partir d'une petite population de cellules infectées, quoique la formation de cellules multinucléées n'est que rarement mise en évidence dans le sang des individus infectés par HIV-1. Il est probable que les structures fragiles des syncytia n'aient qu'une durée de vie très courte dans le sang des patients. Cependant, cet effet

cytopathique est largement observé chez des singes infectés par SIV. En effet, la plupart des organes (ganglions lymphatiques, rate, intestin, foie et système nerveux central) de singes infectés soit par S I V s j ^ soit par SIV^j^c contiennent de nombreuses cellules polynucléées (revu par Lackner 1994).

(2) La lyse de cellules isolées.

La formation de syncytia n'est pas le seul processus qui pourrait rendre compte de la perte des cellules CD4+. Dans certaines cultures infectées par HIV-1, en l'absence de syncytia, la lyse de cellules isolées est observée (Dedera et Ratner 1991). La mort de cellules isolées peut impUquer différents mécanismes qui ne sont pas mutuellement exclusifs:

- L'adsorption et la pénétration des particules virales HIV-1 entraînent des modifications de perraéabUité de la membrane cible. Si la cellule cible est infectée par un grand nombre de virions (superinfection), ces altérations membranaires peuvent être létales pour la cellule (Volsky et al. 1992). De même, un bourgeonnement massif de particules virales endommage l'intégrité de la membrane cellulaire (Grewe et al. 1990).

- Une accumulation de multiples copies d'ADN viral non intégré (Robinson et Zinkus 1990), pourrait être toxique pour la cellule comme cela a déjà été décrit pour les virus de la leucémie féline (Mullins et al. 1986) et aviaire (Robinson et Miles 1985). Pour HIV-1, aucune

corrélation n'a encore été démontrée entre un taux élevé d'ADN non intégré et la mort cellulaire ou l'induction de la maladie. Seuls, des dommages neurologiques dans le cerveau ont été associés à la présence d'une grande quantité d'ADN viral non intégré dans les monocytes/macrophages infectés (Pang et al. 1990).

- Les protéines virales peuvent également avoir un effet cytotoxique sur la cellule. Dans les

cellules CD4-I- exprimant les glycoprotéines d'enveloppe de HIV-1, des complexes CD4-

gpl60 s'accumulent autour des pores nucléaires ce qui pourrait perturber le transport

nucléaire (Koga et al. 1991). La glycoprotéine Uransmembranaire virale, gp4I, aurait un rôle

cytolytique: dans son domaine intracytoplasmique, eUe présente une séquence qui formerait

une ou deux hélices amphipatiques chargées positivement. Ces hélices sont strucmrellement

similaires à celle d'une famille de peptides cytolytiques qui sont produits comme moyen de

défense par certains insectes (Miller et al. 1991). Ils s'insèrent sous forme de multimères dans la membrane cible en créant des pores dans ceUe-ci ce qui désorganise sa structure et son intégrité osmotique (Jaynes et al. 1989). Des études de mutagenèses dirigées réalisées dans ce motif de la gp41 affectent la cytopathogènicité due à HIV-1 (Fisher et al. 1986; Lee et al.

1989). De plus, des peptides sjoithétiques correspondants sont capables de former des pores dans une bicouche lipidique et d'induire la lyse de cellules procaryotes et eucaryotes (Miller et al. 1991; Chemomordik et al. 1994).

- Récemment, il a été montré que l'infection par HIV-1 serait capable de déclencher dans la cellule infectée, une série d'événements physiologiques conduisant à l'apoptose ou mort cellulaire programmée (Ameisen et al. 1992). Ce mécanisme se caractérise par une augmentation de la concentration cytosolique d'ions calcium et l'activation d'une endonucléase endogène qui va fragmenter de manière régulière l'ADN cellulaire. Cette fragmentation particulière de l'ADN cellulaire a été observée dans le nucléoplasme de cellules CD4"'" infectées in vitro par HIV-1 (Laurent-Crawford et al. 1991). De même, l'apoptose peut être déclenchée dans des cellules T CD4+ provenant d'un patient infecté, en phase asymptomatique, après l'activation de ces cellules (Meyaard et al. 1992). La glycoprotéine virale gpl20 semble un bon candidat pour induire l'apoptose, comme cela a été démontré in vitro. La gpl20 soluble se fixe au récepteur CD4 à la surface de lymphocytes non infectés et l'ajout d'anticorps anti-gpl20 à la culture cellulaire permet la réticulation des molécules CD4 à la surface cellulaire. Ces cellules seraient prédisposées à l'apoptose lors de leur activation (Banda et al. 1992). De même, les complexes gpl20/gp41 ancrés dans la membrane de cellules infectées par HIV-1 peuvent interagir avec les molécules CD4 des lymphocytes T voisins non infectés et prédisposer ces cellules saines à l'apoptose ou encore induire

directement l'apoptose de ces cellules T non activées (Gougeon et Montagnier 1993). Il reste cependant à déterminer la signification biologique de ces observations. L'utilisation de

modèles simiens indiquent qu'il existerait une corrélation entre l'induction de la mort cellulaire programmée et l'évolution vers un SIDA. La mort cellulaire a été observée suite à l'activation de lymphocytes T provenant de macaques infectés par SlVmac alors qu'elle n'est pas induite après activation de lymphocytes T infectés de chimpanzés, animaux sensibles à l'infection par HIV-l mais qui ne développent pas de SIDA (Gougeon et Montagnier 1993).

b) Effets cytopathiques indirects.

L'infection par HIV-l peut également conduire à la destruction de cellules CD4-I- par des mécanismes indirects.

- Les lymphocytes T CD4+ infectés par HIV-1 sont éUminés par la réponse immunitaire (revu par Levy 1993).

- In vitro 50% de la gpl20 est Ubérée spontanément dans le milieu extracellulaire résultant de

son association non covalente facilement perturbable avec la gp41(Willey et al. 1988; Earl et