Disponible à / Available at permalink :

- - -

- - -

Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Leclercq, G. (1973). Etude des relations entre la structure quaternaire et les propriétés catalytiques de la glutamino-carbamyl phosphate synthétase de Escherichia coli (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/214705/1/b0106d96-79d0-4833-9a98-26d8a440a96f.txt

(English version below)

Cette thèse de doctorat a été numérisée par l’Université libre de Bruxelles. L’auteur qui s’opposerait à sa mise en ligne dans DI-fusion est invité à prendre contact avec l’Université ([email protected]).

Dans le cas où une version électronique native de la thèse existe, l’Université ne peut garantir que la présente version numérisée soit identique à la version électronique native, ni qu’elle soit la version officielle définitive de la thèse.

DI-fusion, le Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles, recueille la production scientifique de l’Université, mise à disposition en libre accès autant que possible. Les œuvres accessibles dans DI-fusion sont protégées par la législation belge relative aux droits d'auteur et aux droits voisins. Toute personne peut, sans avoir à demander l’autorisation de l’auteur ou de l’ayant-droit, à des fins d’usage privé ou à des fins d’illustration de l’enseignement ou de recherche scientifique, dans la mesure justifiée par le but non lucratif poursuivi, lire, télécharger ou reproduire sur papier ou sur tout autre support, les articles ou des fragments d’autres œuvres, disponibles dans DI-fusion, pour autant que :

Le nom des auteurs, le titre et la référence bibliographique complète soient cités;

L’identifiant unique attribué aux métadonnées dans DI-fusion (permalink) soit indiqué;

Le contenu ne soit pas modifié.

L’œuvre ne peut être stockée dans une autre base de données dans le but d’y donner accès ; l’identifiant unique (permalink) indiqué ci-dessus doit toujours être utilisé pour donner accès à l’œuvre. Toute autre utilisation non mentionnée ci-dessus nécessite l’autorisation de l’auteur de l’œuvre ou de l’ayant droit.

--- English Version ---

This Ph.D. thesis has been digitized by Université libre de Bruxelles. The author who would disagree on its online availability in DI-fusion is invited to contact the University ([email protected]).

If a native electronic version of the thesis exists, the University can guarantee neither that the present digitized version is identical to the native electronic version, nor that it is the definitive official version of the thesis.

DI-fusion is the Institutional Repository of Université libre de Bruxelles; it collects the research output of the University, available on open access as much as possible. The works included in DI-fusion are protected by the Belgian legislation relating to authors’ rights and neighbouring rights.

Any user may, without prior permission from the authors or copyright owners, for private usage or for educational or scientific research purposes, to the extent justified by the non-profit activity, read, download or reproduce on paper or on any other media, the articles or fragments of other works, available in DI-fusion, provided:

The authors, title and full bibliographic details are credited in any copy;

The unique identifier (permalink) for the original metadata page in DI-fusion is indicated;

The content is not changed in any way.

It is not permitted to store the work in another database in order to provide access to it; the unique identifier (permalink) indicated above must always be used to provide access to the work. Any other use not mentioned above requires the authors’ or copyright owners’ permission.

05

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

Faculté des Sciences Service de Microbiologie

Blul-. de CHIMIE

ETUDE DES RELATIONS ENTRE LA STRUCTURE QUATERNAIRE ET LES PROPRIETES CATALYTIQUES DE LA GLUTAMINO-CARBAMYL PHOSPHATE

SYNTHETASE DE ESCHERICHIA COU

LECLERCQ Guy

Mémoire présenté pour l'obtention du grade légal de Docteur en Sciences Chimiques

1973

par l'oestradiol au niveau des cellules utérines serait due, dans une phase initiale, à l'interaction des récepteurs de cette hormone avec la chromatine. Cette interaction permettrait la transcription d'un ou de plusieurs gènes par une polymérase nucléaire.

.L. de CHIMIE

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

Faculté des Sciences Service de Microbiologie

^ O c

«>

tP

ETUDE DES RELATIONS ENTRE LA STRUCTURE QUATERNAIRE ET LES PROPRIETES CATALYTIQUES DE LA DLUTAMINOCARBAHYL PHOSPRATE

SÏNTHETASE DE ESCRERICDIA CDU

LECLERCQ Guy

Mémoire présenté pour l'obtention du grade légal de Docteur en Sciences Chimiques

1973

Messieurs J. M. Wiame et A. Piérard m'ont orienté dans la progression de mon travail. Leurs encouragements et leurs conseils ne furent pas seulement d'une grande aide, ils éveillèrent en moi un grand intérêt pour la recherche scientifique. C'est aujourd'hui, après plus ou moins deux ans d'éloignement du laboratoire, que je peux réellement réaliser combien leur enseignement me fut bénéfique.

Je voudrais remercier ici Messieurs N. Glansdorff et M. Mergeay pour les multiples renseignements génétiques qu'ils me fournirent.

Je dois beaucoup à Monsieur D. Gigot qui s'est chargé à maintes reprises de purifier l'enzyme que j'ai étudiée. Sans son aide, de

nombreuses expériences n'auraient pu être réalisées.

Ma reconnaissance va également à tous les membres de l'Institut de Recherche du C.E. R.I.A. qui, d'une façon ou d'une autre, ont

contribué à la réalisation de ce mémoire.

Je tiens enfin à remercier l'I. R. S. I.A. qui m'a donné les moyens d'accomplir ce travail ainsi que Madame R. Andries qui s'est chargée de la dactylographie de mon manuscrit.

- 3 -

table des MATIERES

PP.

INTRODUCTION 13

I. - PROPRIETES DES ENZYMES ALLOSTERIQUES 16

A. Structure quaternairé des enzymes allostériques 16

1. Etude expérimentale des systèmes macromoléculaires

en équilibre d'autoassociation 17

2. Aspect des fonctions qui relient les vitesses de

sédimentation d'une macromolécule à sa concentration 19 3. Structure spatiale des enzymes allostériques 22

B. Mécanismes de la transition allostérique 25

1. La transition allostérique sur la base d'un mécanisme

d'isomérisation 26

2. La transition allostérique sur la base d'un mécanisme

de polymérisation 27

n. - LA SYNTHESE DU CARBAMYL PHOSPHATE CHEZ E. COLI.

LES GLUTAMINO CARBAMYL PHOSPHATE SYNTHETASES. 2 9

A. Synthèse du Carbamyl Phosphate chez E. coli 29

B. Les Glutamino Carbamyl Phosphate Synthétases 30

m.

PROPRIETES CINETIQUES 33

A. Régulation de Pactivité de la GCPSase de E. coli en fonction

des besoins cellulaires en arginine et en pyrimidines 33

1. Existence chez E. coli d'une seule GCPSase pour les

biosynthèses de l'arginine et des pyrimidines 33 2. Activation de la GCPSase de E, coli par l'ornithine 35 3. Schéma de la régulation de l'activité de la GCPSase

de E. coli en fonction des besoins cellulaires en

arginine et en pyrimidines 36

4. Comparaison de la régulation de la synthèse du CP chez E. coli avec celle observée chez d'autres micro­

organismes 38

B. Régulation de l'activité de la GCPSase de E. coli en fonction

des besoins cellulaires en acides nucléiques 39

C. Données génétiques relatives à la biosynthèse du Carbamyl

Phosphate chez E. coli 41

D. Nature allostérique de la GCPSase de E. coli 43

E. Mécanisme de synthèse du Carbamyl Phosphate chez E. coli 43

F. Réaction globale de synthèse du Carbamyl Phosphate 47 chez E. coli

IV.- BUT DU TRAVAIL 49

MATERIEL ET METHODES 51

I. - PRINCIPAUX PRODUITS ET FIRMES D'ORIGINE 52

II. - SOUCHES - CULTURES - PROCESSUS EXPERIMENTAUX 53

1. Souches 53

2. Cultures 53

3. Dosage des protéinès

4. Dosage des activités enzymatiques 55

4.1. Glutamino Carbamyl Phosphate Synthétase 55

4.2. Uréase 58

4.3. Catalase 59

4.4. Alcool déshydrogénase 59

5. Comptage de la radioactivité par scintillation liquide 59 6. Sédimentation en gradient 5/20 de saccharose 59 7. Electrophorèse sur acétate de cellulose 64 8. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide 65

PARTIE EXPERIMENTALE 67

PREMIERE PARTIE - PURIFICATION DE LA GLUTAMINO

CARBAMYL PHOSPHATE SYNTHETASE 68

I. - Purification de la GCPSase 69

II. - Pureté de la préparation purifiée de la GCPSase 72

SECONDE PARTIE - ETUDE DE LA REGULATION D'ACTIVITE DE LA GLUTAMINO CARBAMYL PHOSPHATE

SYNTHETASE 74

Chapitre I - Etude des propriétés cinétiques de la réaction globale

de synthèse du Carbamyl Phosphate 75

I. Le complexe Mg ATP substrat réel de la GCPSase 78 II. Saturation de la GCPSase par ses substrats, le Mg ATP, la

glutamine et le bicarbonate 79

III. Influence de l'ornithine, de l'IMP et de l’UMP sur l'allure

des fonctions de saturation de la GCPSase par le Mg ATP 79 IV. Saturation de la GCPSase par la glutamine et le bicarbonate

en présence d'ornithine ou d'UMP 83

V. Influence de l'IMP et de l'ornithine sur l'allure de la fonction

de saturation de la GCPSase par le Mg ATP 84 VI. Influence du Phosphate sur l'activation de la GCPSase par

l'IMP et l'ornithine 85

Chapitre II - Etude cinétique de la GCPSase du mutant " uracile-

sensible " P 678 Ml 87

I. Comparaison des constantes d'affinité pour l'ornithine et

l'UMP des souches sauvage (P 678 R2 Ul) et mutée (P 678 Ml) 89

- 7 -

II. Saturation des GCPSases des souches sauvage P 678 R2 U1 et mutée P 678 Ml par le Mg ATP. Origine de l'hypersensibilité

du mutant P 678 Ml 90

Chapitre III - Eltude de la structure sous-unitaire de la GCPSase 92

I, Influence de l'anion Phosphate sur la vitesse de sédimentation

de la GCPSase 94

II. Hypothèse d'Anderson et Marvin relative à la structure de

la GCPSase 96

III. Choix d'une méthodologie expérimentale pour aborder l'étude de la structure sous-unitaire en équilibre rapide de la

GCPSase 98

IV. Allure générale des bandes de sédimentation de la GCPSase 100 V. Effet de la concentration de la GCPSase sur sa vitesse de ^

sédimentation 100

i VI. Effet de la concentration de la GCPSase sur sa vitesse

de sédimentation en présence d'ornithine, d'IMP ou

d'UMP 102

VII. Effet de la concentration de la GCPSase sur sa vitesse de sédimentation en présence de l'ion de la glutamine

et des composants du complexe Mg ATP 104

Chapitre IV - Relation entré l'activité de la GCPSase et son état de

poly mé ri s at ion 108

I. Relation entre l'activité de la GCPSase et sa concentration 111 II. Sédimentation de la GCPSase dans des gradients contenant

toutes les molécules nécessaires à sa catalyse enzymatique 112

pHMB, de SDS et de dioxane 117 II. Relation entre les bandes de sédimentation S 1 et S 2 de

la GCPSase obtenue en pHMB 10 M. Structure sous--4

unitaire du monomère de la GCPSase 118

III. Présence de deux bandes de sédimentation à des concen­

trations en SDS supérieures à 0.025% 119

Chapitre VI - Identité ou non identité des sous-unités de la

GCPSase 120

I. Electrophorèses de la GCPSase sur lamelle d'acétate de

cellulose en présence d'urée 8 M 123

II. Electrophorèses de la GCPSase sur gel de polyacrylamide

en présence et en absence d'agents dissociants 124

TROISIEME PARTIE - COMPLEMENTS D'INFORMATIONS SUR LE MECANISME DE SYNTHESE DU

CARBAMYL PHOSPHATE 127

Chapitre I - Absence d'une participation de la biotine ou du Pyridoxal-5'-Phosphate à la synthèse du Carbamyl

Phosphate 128

- 9 -

I. Absence d'une participation de la biotine à la biosynthèse

du Carbamyl Phosphate 129

II. Absence d'une participation du Pyridoxal-5'-Phosphate

à la biotynthèse du Carbamyl Phosphate 132

Chapitre II - Effets des groupements thiols sur l'activité de la

GCPSase 135

I. Effets de divers réducteurs sur les activités de la GCPSase

dépendantes de la glutamine et de l'ammonium 136 II. Modification par la cystéine des paramètres cinétiques

qui caractérisent les fonctions de saturation de la GCPSase

par là glutamine et l'ammonium 137

DISCUSSION 139

I. - REGULATION DE L'ACTIVITE DE LA GCPSase DE E. COLI 142

A. Etude cinétique de la réaction globale de synthèse du Carbamyl

Phosphate 142

1. Etude de l'influence des effecteurs de la GCPSase au niveau des fonctions de saturation de l'enzyme par ses substrats. Origine du caractère sigmoïde de la fonction de saturation de la GCPSase par le

Mg ATP 144

2. Existence d'au moins deux états actifs, l'un favorisé par le Mg ATP, l'autre par l'ornithine

et l'IMP 148

3. Diminution par l'anion Phosphate des activations

exercées par l'IMP et l'ornithine 149

B. Structure quaternaire de la GCPSase 150

1. Structure quaternaire en équilibre rapide

d'autoassociation 150

2. Travaux d'Anderson et Marvin 153

C. Schéma régulateur de l'activité de la GCPSase 155

II.- STRUCTURE SOUS-UNITAIRE DU MONOMERE DE LA

GCPSase DE E. COLI 159

A. Données favorables et défavorables à l'existence de

sous-unités identiques au sein de la GCPSase 159

B. Evidence de la présence de sous-unités distinctes

au sein de la GCPSase 161

C. Structure quaternaire du monomère de la GCPSase 162

D. Transfert du radical -NH^ du groupement amide de

' ^ "

la glutamine entre les sous-unités du monomère de la

GCPSase 167

E. Analogie de la structure quaternaire des enzymes qui utilisent la glutamine plutôt que l'ammonium comme

substrat aminé physiologique 169

F. Existence sur le chromosome de E. COLI de deux

gènes de structure de la GCPSase 172

m. - BILAN ET PERSPECTIVES 176

ADDENDUM . 180

RESUME 182

BIBLIOGRAPHIE 186

FIGURES 197

- ABREVIATIONS

ADP Adenosine-5'-diphosphate.

Arg-s (souche arg-s) souche Arginine sensible.

ATCase Aspartate Transcarbamylase.

ATP Adenosine- 5 ' -triphosphate.

AU" (souche AU ) souche biauxotrophe pour l'arginine et l'uracile.

CP Carbamyl Phosphate.

CTP C ity dine - 5 ' -1 r ipho s phat e.

DO Densité optique.

GCPSase Glutamino Carbamyl Phosphate Synthetase.

Mg-ATP Complexe Mg-ATP .

OTCase Ornithine Transcarbamylase.

p-HMB p-Hydroxy mercurybenzoate de sodium.

Pi Phosphate inorganique.

PLP Pyridoxal- 5 ' - Phosphate.

SDS Sodium dodecyl sulfate.

Tris Tris hydroxyméthyl aminométhane.

UMP Uridine Monophosphate.

ura-s (souche ura-s) souche uracile sensible.

Vit. B 1 Thiamine.

- 13 -

INTRODUCTION

t

1

)

L'un des plus remarquables développements que la biologie moléculaire a connu au cours de cette dernière décennie a été la découverte des mécanismes qui assurent aux microorganismes une possibilité de s'adapter à des modifications du biotope afin de se maintenir dans un état favorable à la vie.

Le jeu de l'induction et de la répression de la synthèse

de novo des enzymes d'une séquence métabolique constitue l'un de ces mécanismes. La construction comme la destruction d'une telle séquence requérant le plus souvent quelques heures, l'homéostasie biochimique se serait fortement compromise sans l'appoint d'un autre mécanisme qui contrôlerait à tout instant les flux métaboliques.

Cette carence est palliée par l'existence dans de nombreuses chaînes métaboliques d'enzymes dont l'activité peut être modifiée instanta­

nément quand la concentration d'un métabolite spécifique dépasse un certain seuil.

t Ces " enzymes régulatrices " ont été décelées à maintes

reprises au niveau des premières étapes des séquences métaboliques \ qui assurent la synthèse d'un produit essentiel. Dans ces cas, ce ' sont souvent ces produits qui règlent eux-mêmes leur production par

l'inhibition de ces enzymes situées en amont de leur chaîne bio­

synthétique. Un mécanisme régulateur qu'on peut considérer comme l'inverse de cette”rétroinhibition ” consiste en l'activation par un produit donné d'une des enzymes de la voie métabolique à laquelle elle

appartient. Ce type d'activation qu'exercent également des métabo­

lites appartenant à des chaînes parallèles, se présente le plus souvent au niveau des voies cataboliques. Dans les voies métaboliques, l'un des endroits où des enzymes régulatrices sont soumises à la fois à des activations et des inhibitions, se situe au niveau des branchements où sont synthétisés des précurseurs communs à divers produits

finaux (Umbarger, 1969). C'est ce dernier aspect de l'étude de la

- 15 -

" régulation d'activité " qui a fait l'objet de ce mémoire. L'enzyme étudiée fut la glutamino Carbamyl Phosphate Synthétase de E. coli, une enzyme qui participe aux biosynthèses de l'arginine et des pyrimidines.

D'une façon générale, ces métabolites qui modifient l'activité de ces enzymes régulatrices ne présentent aucune analogie structurale avec leur substrat. Cette observation a suggéré l'existence sur ces enzymes de sites de liaison pour ces " effecteurs " distincts des sites catalytiques. Ce point, qui a été démontré par Changeux (1961), a amené Monod, Changeux et Jacob (196 3) à qualifier ce type de

régulation '' d'allostérique Dans les années qui suivirent, on associa le terme d'allostérique aux enzymes régulatrices elles-mêmes.

L'étude de nombreuses enzymes allostériques a fait ressortir chezellœun ensemble de propriétés communes. Le plupart de ces propriétés ont été présentées et discutées dans d'excellents articles de revues (Koshland et Neet, 1968 - Kirchner, 1968). Sans vouloir reproduire leurs contenus, nous avons jugé qu'il convenait de rappeler certaines de ces propriétés avant d'aborder la présentation de l'enzyme étudiée dans ce travail, afin de permettre un exposé plus précis du but que nous y avons poursuivi.

allostériques, la première qui ait été décrite est l'allure sigmoide de leur fonction de saturation par leurs effecteurs. Cette propriété est à la base même des propriétés régulatrices de ces enzymes.

Elle est, en effet, responsable du fait que leurs effecteurs ne modi­

fient leur activité qu'au delà d'une certaine concentration. Cette fonction de saturation sigmoi'de distingue ces enzymes de celles qui obéissent à la cinétique michaelienne. Elle traduit ce que Hill a appelé un ” phénomène de coopérativité ”. Cette notion,introduite par ce chercheur (1913) pour exprimer le caractère sigmoide de la fonction de saturation de l'hémoglobine par l'oxygène, correspond à une hausse de l'affinité de l'enzyme suite à la liaison de la première molécule d'effecteur. Cette notion implique de ce fait l'existence

sur ces enzymes de plusieurs sites de liaison pour un effecteur.

Les enzymes allostériques présentent, d'une façon apparemment générale, une structure sous-unitaire appelée structure quaternaire.

Son altération s'accompagnant souvent de la disparition de l'allure

sigmoide des fonctions de saturation de ces enzymes, divers chercheurs ont proposé que cette structure devait être intimement liée, sinon

responsable,de l'existence de cette propriété cinétique particulière.

Son importance étant ainsi définie, c'est par sa présentation que nous commencerons ces quelques paragraphes relatifs aux propriétés les plus fondamentales des enzymes allostériques.

A. Structure quaternaire des enzymes allostériques.

La structure quaternaire des enzymes allostériques appartient à une classe générale de systèmes où des macromolécules sont asso­

- 17 -

ciées de façon réversible en une structure multimérique. De tels systèmes, en interactions, appelés communément ” systèmes

autoassociatifs ”, sont très fréquents dans le monde des macromolé­

cules biologiques. Les complexes enzymatiques, nucléo-protéiques ou antigène-anticorps, en sont quelques exemples.

1. Et^£_expéj‘imerdal£_d£^^y_sJ^ëmes_maci^i^]^^

en équilibre d'autoassociation.

Les systèmes autoassociatifs étant relativement fréquents dans le monde des macromolécules, diverses méthodologies expé­

rimentales ont été mises au point en vue de les étudier. La plupart d'entre elles reposent sur des mesures de masse moléculaire, ces mesures permettant une mise en évidence aisée des phénomènes d'autoassociation (Reithel, 1963 - Nichol, Bethune, Kegeles et Hess,

1964).

L'étude de ces systèmes macromoléculaires autoassociatifs est relativement simple quand les interactions entre les macromolé­

cules réagissantes sont très faibles ou très fortes. Dans l'un ou l'autre de ces deux cas, la macromolécule étudiée se présente sous une seule forme moléculaire soit dissociée, soit associée. La masse moléculaire de cette forme étant de ce fait constante, sa mesure ne pose généra­

lement qu'un minimum de problèmes.

L'étude de ces systèmes est, par contre, beaucoup plus complexe quand les forces de cohésion entre les macromolécules réagissantes ne sont pas négligeables, mais néanmoins insuffisantes pour assurer la formation d'un agrégat stable. Dans ce cas, les macromolécules réagissantes sont toujours en présence d'un ou de

plusieurs polymères qui résultent de leur association. Cette situation a pour conséquence que le système ne présente plus une masse moléculaire définie mais une '' masse moléculaire apparente '' qui correspond à la moyenne statistique des masses des espèces moléculaires présentes. Diverses relations expriment cette notion de masse moléculaire apparente ; la relation suivante est fréquem­

ment donnée :

,, Z)Ci Mi Z)Ci Mi

Z)ci C

Dans cette relation, C symbolise la concentration totale des espèces

moléculaires de masse Mi présentes aux concentrations Ci. |

i

Comme tous les équilibres physicochimiques, ces équilibres . d'autoassociation sont soumis à la loi d'action de masse. Cette

dépendance vis-à-vis de la loi d'action de masse se traduit par une augmentation de la concentration des formes moléculaires associées quand on augmente la concentration des macromolécules réagissantes.

Cette modification dans la répartition statistique des espèces molé­

culaires en présence se traduit par une augmentation de la masse moléculaire apparente du système. Cette relation qui lie la masse moléculaire apparente des macromolécules à leur concentration est l'une des caractéristiques les plus fondamentales de ces systèmes autoassociatifs. En théorie, à concentration nulle en macromolécules, dans le cas d'un monomère en équilibre avec ses polymères, la masse mesurée correspond à celle de ce monomère (Nichol et al., 1964).

- 19 -

2. _^£ect _d^ê.£l5Ë,î3?£îL“

tation d'une macromolécule autoassociative à sa J

concentration.

Des diverses techniques qui permettent des mesures de masse moléculaire, c'est principalement la sédimentation qui a été utilisée dans l'étude des systèmes en équilibre d'autoassociation.

Cette technique permet autant l'étude des " équilibres d'autoassociation lents ” (forces de cohésion entre macromolécules nulles ou très

fortes) que des '' équilibres d'autoassociation rapides ” (forces de cohésion non négligeables, mais insuffisantes pour assurer la formation d'un agrégat stable).

La fonction qui relie la vitesse de sédimentation (S) d'une macromolécule à sa concentration s'apparente à une fonction linéaire de pente négative. Cette décroissance progressive de la S qui s'opère conjointement à l'augmentation de la concentration en macromolécule provient d'effets hydrodynamiques dus à l'augmentation de cette

concentration (SchachmanJS59). L'allure de cette fonction est modifiée dans le cas des systèmes macromoléculaires en équilibre rapide

d'autoassociation. Dans ce cas, cette fonction correspond,en effet, à la résultante de deux forces opposées. La première tend à augmenter la masse moléculaire du système et par là sa vitesse de sédimentation ; cette force est due à l'application de la loi d'action de masse (par. 1).

La seconde tend à diminuer la vitesse de sédimentation du système ; cette force est due aux effets hydrodynamiques. Pour les systèmes sont la constante d'association est relativement faible, les effets hydrodynamiques l'emportent généralement sur les effets dûs à la loi d'action de masse. La fonction qui relie la vitesse de sédimentation de la macromolécule à sa concentration s'apparente de ce fait à une droite dont la pente n'accuse qu'une décroissance réduite sous l'influence des effets hydrodynamiques. Pour les systèmes dont la constante

)

d'association est relativement forte, à faible concentration en

macromolécule, les effets dûs à la loi d'action de masse l'emportent sur les effets hydrodynamiques. Ceci a pour conséquence que la fonction qui relie la vitesse de sédimentation de la macromolécule à sa concentration présente une variation positive aux faibles concen­

trations en macromolécules. Avec l'augmentation de concentration, cette variation positive diminue progressivement avant de décroître sous l'influence des effets hydrodynamiques.

Les deux situations décrites ci-dessus peuvent être

illustrées par l'allure des fonctions qui relient la vitesse de sédimen­

tation des P-lactoglobulines A et B à leur concentration. Dans

certaines conditions de pH et de température, la p -lactoglobuline A se trouve sous deux formes à l'équilibre, un monomère et un

tétramère. Dans ces mêmes conditions, la p -lactoglobuline B n'est sujette à aucun phénomène de polymérisation et se trouve uniquement sous forme monomérique. Dans le cas de la lactoglobuline B, la vitesse de sédimentation décline sensiblement avec l'augmentation de la concentration protéique sous l'influence des effets hydrodyna­

miques. Dans le cas de la p -lactoglobuline A, par contre, cette vitesse augmente aux faibles concentrations en protéines, ce qui indique un passage de cette protéine de l'état monomérique à l'état de tétramérique. Au delà d'une certaine concentration, cette vitesse de sédimentation commence à décroître, les effets hydrodynamiques devenant importants (Timasheff et Townend, 1963).

- 21 -

Relation entre les concentrations des (i-lactoglo- bulines A et B et leurs vitesses de sédimentations

à pH 4. 65, 2° C.

O--- O Valeurs expérimentales -A.

•---• Valeurs expérimentales p>-B.

d'après Timasheff et Townend (1963).

De ce qui a été dit plus haut, il apparaft qu'il est relativement aisé de mettre en évidence une structure macromoléculaire en équilibre rapide d'autoassociation. Il suffit, en effet, de montrer l'existence d'une variation positive de la vitesse de sédimentation d'une macromolécule conjointe à l'augmentation de sa concentration.

La détermination de la vitesse de sédimentation de chacune des espèces présentes est, par contre, beaucoup plus difficile, voire même impossible. Cette difficulté provient de l'existence de l'équi­

libre d'autoassociation qui s'oppose à l'isolement d'une espèce moléculaire particulière. Une estimation relativement bonne de ces vitesses de sédimentation peut néanmoins s'obtenir dans la mesure où l'on peut déplacer la répartition statistique qui existe entre ces diverses espèces en faveur d'une espèce particulière.

3. ®_^l2£t^£Î9H^®^

Monod, Wyman et Changeux (1965) ont proposé une structure quaternaire bien définie pour les protéines allostériques. Ces protéines sont des oligomères, c'est-à-dire des polymères composés d'un

nombre limité de sous-unités toutes identiques appelées protomères.

Chaque protomère est porteur des sites catalytique et régulateurs.

Dans le cas des enzymes allostériques composées de sous-unités catalytiques et régulatrices, tel l'Aspartate Transcarbamylase de E. coli, le protomère correspond, de ce fait, à un assemblage de ces deux types de sous-unités (Changeux, Gehart et Schachman, 196 7). A chaque effecteur capable de former avec la protéine un complexe stéréospécifique, correspond un seul site par protomère.

Selon Monod et al., les protomères occupent dans l'espace des positions équivalentes les uns par rapport aux autres. Il en va de même pour les sites de liaison qui présentent de plus la même

symétrie que l'oligomère. Ceci a pour conséquence que les oligomères sont centrés et possèdent au moins un axe de symétrie. Ce point a été vérifié par l'étude de la structure géométrique de quelques

protéines oligomériques. La diffraction des rayons X ainsi que la microscopie électronique ont permis la réalisation de ces études (Klotz, Langerman et Darnall, 1970).

Comme toutes les structures centrées, la structure oligo- mérique appartient aux groupes ponctuels dont les éléments de symétrie sont les axes d'inversion et de rotation. Au sein des oligomères, les éléments de symétrie par inversion ne peuvent toutefois être envisagés puisque les protomères, de par leur composition en acide L-aminé sont nécessairement différents de leur image dans un miroir. Ceci a pour conséquence que les symétries cubique, dihédrale et cyclique sont les seules à pouvoir être envisagées au sein des oligomères.

- 23 -

(Klotz, Langerman et Darnall, 1970). De ces trois symétries, seule la symétrie cyclique est compatible avec un nombre quelconque de protomères. Ce type de symétrie, qui s'observe dans la structure oligomérique où les protomères sont disposés aux angles d'un

polygone régulier, a été notamment mise en évidence dans l'arginine décarboxylase de E. coli (Boeker et Snell, 1968). Ce mode d'asso­

ciation assurant une structure moins stable que les structures cubiques et dihédrales, il n'est pas étonnant qu'elles aient été beaucoup moins observées expérimentalement que ces deux dernières (Klotz et al., 1970).

Selon Monod et al., la symétrie des oligomères pourrait être assurée par deux modes d'associations, les associations isologues et hétérologues (voir également Cornish - Bowden et Kosland, 1970).

Les asso£m^£n_s_iso^l^g^^ (schéma I) sont définies comme des associations où les aires de liaison de chaque protomère sont identi­

ques et disposées de façon symétrique par rapport à un axe rotationnel d'ordre 2.

Les £^s_0£m;ü£££_héj^éi:^]£gues_(schéma II) sont définies comme des associations où les aires de liaison diffèrent dans chaque protomère.

Ce mode d'association n'assure aucune symétrie au domaine de liaison.

Schéma I Schéma II

1

' Les trois règles d'association suivantes assureraient une / structure spatiale centrée aux oligomères (Monod et al., 1965 ; / Claverie, Hofnung et Monod, 1968).

/ . Les associations isologues strictes seraient limitées aux / dimères et tétramères, aucune structure fermée ne pouvant / s'obtenir pour l'association isologue de deux tétramères.

I

. L'emploi combiné de des deux modes d'association permettrait la formation d'oligomères composés d'un nombre minimal de six protomères.

L'étude de la structure quaternaire de l'ornithine transcarba- mylase catabolique de S. Fluorescens est compatible avec cette

hypothèse (Stalon, 1970). Cette enzyme dans sa forme native se f présente sous forme octamérique. Aucune structure spatiale

I

centrée ne pouvant s'obtenir par l'association isologue de deux | tétramères, cet oligomère devrait correspondre à une association

hétérologue de 8 monomères ou de 4 dimères isologues. Ce point a été vérifié expérimentalement, la dissociation de cette enzyme ne donnant jamais des tétramères mais des dimères ou des monomères (Halleux, Stalon, Piérard et Wiame, 1970).

La découverte d'une majorité d'oligomères dimériques et tétramériques (Klotz, 1967 ; Klotz et al., 1970) suggère que

ces associations seraient les plus fréquentes dans la nature. Dans le cas de ces tétramères, deux modes d'association peuvent être envisagés : l'association isologue de deux dimères, l'association hétérologue de quatre monomères. Ces deux modes d'association sont, en effet, les seuls à permettre la formation d'uns structure

)

- 25 -

tétramérique centrée (Monod et al., 1965 ; Meighen et Schachman, 1970). La dissociation de la plupart des tétramères s'accompagnant de la formation de dimères, on peut admettre que le premier de ces deux modes d'association devrait être le plus fréquent au sein de ces tétramères. La structure dimérique semblant ainsi un stade intermédiaire dans la construction des oligomères tétramériques, on peut imaginer que cette structure serait également impliquée dans la formation de nombreux autres oligomères composés d'un nombre pair de protomères. L'étude de la structure quaternaire de l'OTCase catabolique de S. Fluorescens est compatible avec cette idée puisque la dissociation de cette enzyme octamérique s'accompagne de la formation de dimères (Halleiix et al., 1970).

B. Mécanisme de la transition allostérique.

Comme nous l'avons dit plus haut, l'allure sigmoi’de des fonctions de saturation des enzymes allostériques est l'une de leurs propriétés les plus caractéristiques. Une allure sigmoïde traduisant souvent un changement d'état , divers chercheurs ont vu dans l'allure de ces fonctions de saturation l'indice d'un passage de ces enzymes d'un état ayant peu d'affinité pour un effecteur dans un état ayant plus d'affinité pour cet effecteur. Comme le caractère sigmoïde de ces fonctions semblait étroitement lié à la structure quaternaire de ces enzymes (cf par. A), ces chercheurs ont proposé que ces changements d'états devraient correspondre à des modifications de cette structure.

Deux mécanismes ont été envisagés comme base de cette ano_s_téiûqimJ' : l'isomérisation ainsi que la polymérisation.

allostérique où l'oligomère existe dans au moins deux états carac­

térisés chacun par une disposition spatiale différente de leurs

protomères. Ces deux états se différencient par la distribution et/ou l'énergie des liens interprotomériques. Tous deux présentent des propriétés catalytiques distinctes, l'un assure la catalyse (état actif R), l'autre ne l'assure pas (état inactif T). Les activateurs ayant plus d'affinité pour l'état actif, les inhibiteurs pour l'état inactif, ces effecteurs permettent le passage de l'oligomère d'un état dans un autre (voir également Rubin et Changeux, 1967).

Ces deux états sont toujours à l'équilibre. De plus, ils se caractérisent chacun par une répartition symétrique des protomères autour du

centre de symétrie de l'oligomère. La conformation d'un protomère dépend, de ce fait, de son association avec les autres protomères.

L'originalité essentielle de ce modèle réside dans l'idée que la symétrie globale du système se conserve lors du passage de l'oligomère d'un état dans un autre. Ceci a pour conséquence que la transition allostérique se caractérise par une absence totale d'états hybrides asymétriques où certains des protomères seraient dans leur conformation active, les autres dans leur conformation inactive.

Cette idée d'une conservation de la symétrie globale de l'oligomère au cours de la transition allostérique distingue ce modèle d'un autre proposé par Koshland,Nemety et Filmer (1966) (voir

également Harber et Koshland - 1967).

Pour Koshland et al., la liaison d'un effecteur à un protomère provoque un changement conformationnel au niveau de ce protomère. Ce changement, modifiant les interactions qui existent

entre ce protomère et un autre protomère, induit au sein de ce dernier un changement de conformation tel que la liaison de

l'effecteur y est facilitée. De tels changements s'opérant ainsi de proche en proche jusqu'à la saturation de tous les sites de liaison, cette transition s'opère avec formation de nombreux états hybrides asymétriques.

2 • JL:*®:

L'étude de nombreuses enzymes allostériques a montré que les effecteurs de ces enzymes provoquent souvent une modifi­

cation de leur état de polymérisation (cf. Iwatsuki et Okazaki, 1967).

Ces observations ont amené Nichol, Jackson et Winzor à proposer un modèle qui devrait permettre d'expliquer de nombreuses obser­

vations expérimentales (voir également Nichol, Smith et Ogston, 196 9 - Nichol, Smith et Winzor, 196 9).

Ce modèle consiste en un système où un monomère coexiste en équilibre avec ses polymères. Chacune de ces formes molécu­

laires se caractérise, de plus, par une affinité distincte pour un effecteur.

Ce modèle étant basé sur un équilibre rapide d'autoassociation, toute augmentation de la concentration en enzyme s'accompagne d'un phénomène de polymérisation (cf. par. 1). Dans le cas où le domaine de polymérisation est identique ou étroitement associé au site de liaison, la polymérisation et la liaison se présentent

comme des phénomènes compétitifs. Cette possibilité de compétition entre la polymérisation et la liaison se traduit par l'existence de fonctions de liaison diverses dont la sigmoïde.

Ce type de transition allostérique étant basé sur un phénomène de

compétition entre la polymérisation de l'enzyme et la liaison d'un effecteur à cette enzyme, elle se caractérise par une étroite

dépendance vis-à-vis de la concentration enzymatique. Cette concen­

tration règle, en effet, la concentration relative des divers polymères en présence (cf. par. 1). Cette propriété distingue ce mécanisme de ceux basés sur un équilibre d'isomérisation. Elle a été observée

notamment dans le cas de l'isoenzyme de la lactique déshydrogénase (Hathaway et Criddle, 1966), l'hémoglobine (Wyman, 196 7) et la

glutamine déshydrogénase (Frieden, 1967). Pour l'une et l'autre de ces diverses enzymes, on a montré, en effet, l'existence d'une relation entre l'allure de la fonction de liaison des effecteurs et la concentra­

tion enzymatique. Pour Nichol et al., l'existence de tels exemples est une preuve du bien fondé de leur hypothèse.

ceo H

CHj_ JCef^KoA

IX

CuOH U

-► CHo CM~Slhi JCc'f^l trüni^eVüîe _

C-CO H

glutamate

CooH

N acétyiglutamate N acétyiglutamate 5 phosphate

N acétyiglutamate semialdéhyde

M aceîyi ornithins

LE CP ET LA BIOSYNTHESE DE L'ARGININE

NK.

C =Nh

I M H

\ Ch,I '' CH^

I

Ch~Nt\

OH

-f-

CCChj

I

On K OH

I

NH

■

û.h(^loiooJocccpQig Ch^_

CcN- CH - Ldou

I J

CH,

Nfi\

ace'^^l fhi ijîe

V

O I,

/€ I

CooH

Jumarate

ARGININE

-«t

COûH

argininosuccinate

PC /\Tfi A M 0 d-oye.*-tiXï.

1

L^O1 D 1

NH

^

J

Ofin 1 Chi'fx', ■ Ch, C rj n ^ ti ^ h d. r>'‘, M lü c

CH,

CH ~ NiH)

I

tûûH

citrulline

l

CH -NH,

I ^

Coüti

ornithina

CA> 0t\

NMi.

aspartate

- 0^o^aS€ \ W

^ H CoOH

carbamylaspartate ( uréidosuccinate)

dihydroorotate

®-^0 -CHv O

orotate o

LE CP ET LA BIOSYNTHESE DES PYRIIMIDiNES

h\

‘CH 1 H cf

OH

I 11

il

®a©-o®- 0-

CTP

(ê>-0-CH^O

VlC ^v*"‘

OH^ cJc/co^boXyleLic

UTP

RNA

krC ^UMP

■^OCHi

Are Ah£

•ATP .£TP

orotidilyte

- 29 -

II. LA SYNTHESE DU CARBAMYL PHOSPHATE CHEZ E. COLI.

LES GLUTAMINO CARBAMYL PHOSPHATE SYNTHETASES.

A. Synthèse du Carbamyl Phosphate chez E. coli.

Ce mémoire a été consacré à l'étude de la régulation d'activité de la Carbamyl Phosphate Synthétase de E. coli. Cette enzyme, dont la découverte chez cet organisme revient à Piérard et Wiame (1964), assure la production du Carbamyl Phosphate (CP)

(HgN - COO - POg ), un métabolite précurseur de l'arginine et des pyrimidines chez les microorganismes (voir schémas I et II).

Cette enzyme, découverte tout d'abord chez Agaricus Biosporus (Levenberg, 1962), utilise plusieurs substrats, l'ATP, le bicarbonate ainsi que la glutamine comme donneur physiologique d'azote. La stoechiométrie de la réaction qu'il assure a été établie par Kalman, Duffield et Brozozowski (1965) ainsi que par Anderson et Meister (1965).

Le point intéressant de cette stoechiométrie est l'utilisation de deux molécules d'ATP pour la synthèse d'une molécule de CP.

2 ATP + CO2 + glutamine--- ►Mg^^ CP + glutamate + ADP + Pi

L'utilisation de la glutamine comme donneur physiologique d'azote distingue cette Carbamyl Phosphate Synthétase de celle

présente dans le foie des vertébrés uréotéliques (Cohen, 1962). Cette dernière, qui assure l'entrée du dioxyde de carbone et de l'ammonium dans le cycle de Krebs-Henseleit (1935), utilise l'ammonium comme substrat azoté ; en outre, elle exige la présence d'un activateur, le N-acétylglutamate (NAG). Dans le but de différencier cette enzyme de celle qui utilise la glutamine, Piérard, Glansdorff, Mergeayet

Wiame (1965) ont proposé pour cette dernière le nom de " Glutamino Carbamyl Phosphate Synthétase " (CGPSase). La dénomination de CPSase I pour la synthétase hépatique et de CPSase II pour la synthé­

tase qui utilise la glutamine est également utilisée.

B. Les Glutamino Carbamyl Phosphate Synthétases.

La présence d'enzyme de synthèse du CP qui utilise la glutamine comme substrat azoté a été détectée chez de nombreux microorganis­

mes. Outre Agaricus biosporus et E. coli, des GCPSases ont été observées chez Saccharomyces Cerevisiae (Lacroute, Piérard, Grenson et Wiame, 1965), CoprinusRadiatus (Cabet, Gans, Hirsch, Prévost, 1965), Neurospora Crassa (Davis, 1967), Aerobacter

aerogenes (Rognes, Roon et Levenberg, 1969), Candida Utilis (idem), Salmonella Typhimurium (Abd-El-Al et Ingraham, 196 9), Chlamy- domonas Reinhardii (Strijkert et Sussenbach, 196 9) et Bacillus Subtilis (Issaly, Issaly et Reissig, 1970). Chez ces divers micro­

organismes, cette enzyme participe à la biosynthèse de l'arginine et des pyrimidines.

La découverte de Glutamino Carbamyl Phosphate Synthétases dans divers organismes supérieurs semble indiquer une distribution très générale de cette enzyme dans le monde biologique. Sa présence a,

été détectée, en effet,chez des végétaux ainsi que chez des vertébrés.

Chez les végétaux, cette présence a été montrée dans une dizaine de plantes de diverses familles (Kleczkowski et Reifer, 1967), ainsi que dans le petit pois (O'Neal et Naylor, 196 9) et sa plantule

(Kleczkowski, 1965). Chez les vertébrés, cette présence a été démontrée dans le cytosol de divers tissus qui se caractérisent par un taux élevé de multiplication cellulaire. Nous citerons notamment :

- 31 -

. les oeufs non fertilisés de la grenouille (Lon, Sellach et Cohen, 196 9) ;

. la ratte (Tatibana et Ito, 1967) ainsi que d'autres tissus hématopoi’étiques dont le thymus, la muqueuse intestinale, l'estomac et les testicules (Tatibana et Ito, 196 9) ;

. les cellules du foie de pigeon (Hager et Jones, 1967 b) et de l'embryon de poulet (Maresh, Kwan et Kalman, 196 9) ; . les cellules du foie foetal (Hager et Jones, 1967 b) où elle a

été isolée et différenciée de la CPSase qui participe au cycle de Krebs Henseleit dans les mitochondries (Nakanishi, Ito et Tatibana, 1968) ;

. des tumeurs : les ascites d'Erlich (Jones et Hager, 1965 - Hager et Jones, 1967 a), le sarcome de Rous et la tumeur mammaire du rat ("Ylpet Knox, 1970) ;

. les lymphocytes (Ito et Uchino, 1970) ;

. le placenta de la ratte (Shambaugh, Metzer et Freinkel, 1971) ; . la glande mammaire en état de lactation (Yip et Knox, 1972) ; . les cellules muqueuses de la vessie (Murphy et Martin, 1972).

La localisation de ces diverses GCPSases de cellules de vertébrés dans la fraction cellulaire qui contient l'ATCase jointe à leur inhibition par les nucléotides pyrimidiques^suggère la participa­

tion de cette enzyme à la synthèse des pyrimidines. La validité de cette hypothèse a toutefois été mise en doute par Natale et Tremblay (196 9) qui ont montré que, in vitro, le CP nécessaire à cette biosynthèse pouvait être produit dans une large mesure par la CPSase mitochon­

driale.

Voir par. III - A.

“1“

A ces diverses GCPSases présentes chez les vertébrés, il convient d'ajouter une GCPSase découverte chez le limaçon

(Strapholeus Oblongus). Cette GCPSase présente la particularité de montrer des caractéristiques communes aux, deiox GCPSases des mammifères uréotéliques. Cette GCPSase ne fonctionne, en effet, qu'en présence de NAG ; elle utilise en outre la glutamine comme substrat azoté (Tramell et Campbell, 1970). La localisation de cette enzyme dans les tissus hépatiques de cet animal suggère sa participation à la synthèse de l'arginine (idem).

- 33 -

III. LA GLUTAMINO CARBAMYL PHOSPHATE SYNTHETASE DE E. COLI, LA REGULATION DE SON ACTIVITE, SES PROPRIETES CINETIQUES.

A. Régulation de l'activité de la Glutamino Carbamyl Phosphate Synthétase de E. coli en fonction des besoins cellulaires en arginine et en pyrimidines.

1. Ex^t^£e_£h^_^._ccü^^'un^s^^_GCPS^£j)£ui^]^

b^£ynts££ d£ P arginine_j^£irnidme£.

Chez E. coli, l'absence de Glutamino Carbamyl Phosphate Synthétase dans des souches biauxotrophes pour l'arginine et l'uracile indiqua la participation de cette enzyme aux biosynthèses de l'arginine et des pyrimidines (Piérard et Wiame, 1964).

Il y a une dizaine d'années, on pensait que la régulation des étapes communes à plusieurs métabolismes s'opérait par la multipli­

cation de ces étapes en unités enzymatiques distinctes, contrôlées chacune de façon spécifique. Cette multiplication, qui avait été

observée à maintes reprises, semblait le moyen le plus efficace pour éviter des interférences métaboliques (cf. Wiame, 1965). Chez E. coli, on avait des raisons de croire à une duplication de la synthèse du CP.

Novik et Maas (1961), tout comme Gorini et Kalman (1963) avaient isolé des mutants dont la croissance est normale en milieu minimum, mais fortement ralentie quand ce milieu contient de l'uracile. Ces mutants rappelaient singulièrement les souches " uracile-sensibles "

observées chez la levure, un organisme où une duplication de la GCPSase venait d'être découverte (Lacroute, Piérard, Grenson et

en arginine, leur source unique en CP étant inhibée (Lacroute et al., 1965).^ Cette hypothèse relative à la duplication de la GCPSase de E. coli était toutefois sujette à la discussion. L'existence des mutations biauxotrophes pour l'arginine et l'uracile semblait s'opposer à cette idée. Ces mutations AÜ" résultaient, en effet, d'une seule mutation ; de plus, une dizaine d'entre elles avaient été localisées en un même locus génétique (Piérard, Glansdorff, Mergeay et Wiame, 1965).

Dans le but de déterminer l'origine du phénotype " uracile- sensible " chez E. coli, Piérard et al. recherchèrent un mutant sensible à ce composé. Ils obtinrent ainsi une souche présentant une hypersensibilité à l'uracile (souche P 678 Ml). La localisation de cette mutation P 678 Ml dans la région contenant toutes les

mutations AlT sembla contraire à l'idée d'un cistron correspondant à une GCPSase spécifique de la biosynthèse des pyrimidines. Afin d'expliquer l'hypersensibilité à l'uracile du mutant P 678 Ml, Piérard et al. étudièrent l'influence des nucléotides pyrimidiques sur l'activité de la GCPSase des souches sauvage et P 678 Ml.

Dosant la production du CP par une méthode basée sur la mesure de la quantité de citrulline formée en présence des substrats de la GCPSase, d'ornithine et d'un excès d'OTCase , Piérard et al.

observèrent que les nucléotides pyrimidiques inhibent fortement la synthèse du CP. De ces nucléotides, l'UMP s'avéra l'inhibiteur le plus efficace : son inhibition était totale dans le cas de l'enzyme de la souche P 678 Ml, de l'ordre de 50 à 60% dans le cas de l'enzyme sauvage. Il était plus que probable que cette différence était étroite­

ment liée à l'hypersensibilité du mutant P 678 Ml.

Méthode de dosage de la GCPSase (Levenberg, 1962) : voir Matériel et méthodes : 4. 1. 1.

^ Voir par. 4 de ce chapitre.

- 35 -

Piérard et al. étudièrent égalenaent l'action de l'UMP sur l'activité des GCPSases de ces deux souches après leur croissance en l'absence et en présence d'arginine et/ou d'uracile. Ils obser­

vèrent ainsi que ces deux enzymes étaient inhibées de façon analogue, que ces souches aient été ou non cultivées en présence de l'un ou l'autre de ces deux produits finaux. Cette observation, incompatible avec l'idée de deux GCPSases réprimées indépendamment l'une de l'autre, fut un argument supplémentaire en faveur de l'existence d'une seule enzyme de synthèse du CP.

Cette dernière observation, jointe à la localisation de la mutation P 678 Ml dans la région contenant toutes les mutations Au ,amena Piérard et al. à proposer la présence chez E. coli d'une seule GCPSase.

2. A£Uv^mn_d£GCPSa_s_e_c^_^._cj^^£^J.hmnüM

Suite à la mise en évidence chez E. coli d'une seule GCPSase pour les biosynthèses de l'arginine et des pyrimidines, il parut logique que l'activité de cette enzyme fut sous un contrôle mixte de ces deux produits finaux. Si un contrôle régulateur de cette activité avait été mis en évidence dans le cas des pyrimidines (par. 1), il n'en fut pas de même dans le cas de l'arginine. On ne put, en effet, jamais observer une influence de cet acide aminé

sur l'activité de la GCPSase. Ce point amena Piérard à se demander si l'arginine n'exerçait pas son contrôle régulateur de façon indirecte.

Comme le mutant P 678 Ml présentait une inhibition totale par l'UMP, Piérard pensa que l'inhibition partielle observée dans le cas de la souche sauvage pouvait provenir de deux effets anta­

gonistes. Un effet inhibiteur exercé par l'UMP, un effet activateur qui aurait disparu chez le mutant P 678 Ml.

Dans la mesure où cette hypothèse était correcte, on pouvait

penser que cet effet activateur pouvait être exercé par un précurseur de l'arginine situé dans la voie de synthèse de cet acide aminé avant l'intervention du CP, Cette idée était basée sur le fait que l'arginine règle le pool de ses intermédiaires par un mécanisme de rétro­

contrôle au niveau de la première enzyme de sa chaîne biosynthé­

tique (Maas, 1961). Piérard se demanda si l'ornithine n'était pas cet activateur. Cette hypothèse était due au fait que, jusqu'alors, il avait dosé l'activité de la GCPSase par la production de la

citrulline formée en présence des substrats de la GCPSase, d'orni- thine et d'un excès d'OTCase. En vue d'échapper à l'interférence éventuelle de cet acide aminé, Piérard dosa directement la production du CP. Dans ces conditions, l'inhibition par l'UMP de la GCPSase fut totale. Cette donnée favorable à l'idée que l'ornithine pourrait être l'activateur recherché se renforça par la suite. En effet, des divers intermédiaires biosynthétiques de l'arginine, seul cet acide aminé provoqua l'activation de l'enzyme.

3. j;^giü^i^_j^J.^^Uv:^^de_l^GCPS^je_

pyrimidines.

Des travaux de Piérard et ses collaborateurs (1965 et 1966), il ressort que les effets antagonistes de l'UMP et

l'ornithine règlent la production du CP en fonction des besoins cellu­

laires en arginine et en pyrimidines. La régulation de ce branchement métabolique peut se schématiser de la façon suivante :

- 37 -

l'cti'oinh’ibit'iort ' i-ctroinhi bition ApPAftTAie-

MC(^

GLÜTAMIWe- ATP

CARBAMVL.

ASPARTATE

î,j\JtVEûti6ÊS

‘f,'yP>)H/^l<îüÊ5

carbamyu

'phosphatb

AnbdiqoniAirtp 'Ole loi ►'♦Irroihi.

bition.

i

OUITAMATE- ACETYL_^

! GLUTAMATE

ACETYL_

ornithiwe

>)orn^ine}- -^•CITRULLINE- •-*fAR6IMINE|

(

I

______ Jl

retroinhibition

(d'après Piérard, 1966).

Comme on peut le voir sur le schéma ci-dessus, les

activités de la GCPSase et de l'aspartate transcarbamylase (ATCase) sont sous le contrôle des nucléotides pyrimidiques. L'UMP inhibe la GCPSase ; le CTP inhibe l'ATCase (Gehart et Pardee, 1962). Toute augmentation de la concentration intracellulaire de ces nucléotides réduit de ce fait la synthèse du CP ainsi que son utilisation pour la synthèse des nucléotides pyrimidiques.

L'arginine contrôle sa biosynthèse par un mécanisme de rétroinhibition au niveau de 1' acétylglutamate synthétase, la

première enzyme de sa chaîne biosynthétique (Maas, 1961). Toute concentration intracellulaire élevée en cet acide aminé empêche de ce fait la production d'orm^i^. Ceci a pour conséquence qu'à haute concentration en arginine, la synthèse du CP est sous le contrôle exclusif des nucléotides pyrimidiques.

I Toute diminution du pool d’arginine s'accompagne de la levée de / l'inhibition qu'exerce ce métabolite au niveau de l'acétylglutamate- I synthétase. Cette levée d'inhibition permet une certaine accumulation / en orm^ii^. Cette augmentation du pool d'ornithine active la GCPSase / et réverse l'inhibition qu'exercent les nucléotides pyrimidiques.

■4. Cony)^ai_s^n de 2^ régulation de synthèse du Carbamyl Phosphate chez con_aye(^c^el^_obsery;^^ c^e_z_d^^

Comme nous venons de le voir, chez E. coli la synthèse du CP est assurée par une seule enzyme (Piérard et al., 1965). La dupli­

cation de la GCPSase en deux unités enzymatiques distinctes , contrôlées de façon indépendante par l'arginine et les pyrimidines, semble un stade ultérieur dans l'évolution de la régulation de la synthèse du CP. Une telle situation s'observe, en effet, chez la levure (S. Cerevisiae) où deux GCPSases ont été mises en évidence (Lacroute, Piérard, Grenson et Wiame, 1965) ;

- une (GCPSase) arg soumise à la répression de l'arginine ; - une (GCPSase)ura soumise à la répression de l'uracile

ainsi qu'à l'inhibition de l'UTP.

Le CP synthétisé au niveau de l'une ou l'autre de ces deux GCPSases pouvant être utilisé sans distinction à la production d'arginine ou de pyrimidines, cette duplication n'assure qu'une autonomie partielle de ces deux voies métaboliques (Lacroute et al., 1965),

Cette dernière situation n'existe pas chez le Neuospora Crassa ou leCoprinusRadiatus. Chez ces deux organismes où une duplication de la GCPSase a été également démontrée, il existe deux pools de CP autonomes ; le CP synthétisé par la (GCPSase) ura ne sert qu'à

I

- 39 -

la production de pyrimidine ; le CP synthétisé par la (GCPSase)arg ne sert qu'à la production d'arginine (N. Crassa = Davis, 1963 et

1967 ; C. Radiatus = Cabet, Gans, Hirsch et Prévost, 1965). Ceci a pour conséquence que ces deux voies métaboliques sont indépen­

dantes l'une de l'autre. Cette autonomie n'existe pas, toutefois, dans des souches (GCPSase)ura affectées au niveau de l'ornithine transcarbamylase (OTCase). Dans ces souches, le CP produit par la (GCPSase)arg ” déborde ” sur la voie de synthèse des pyrimidines, ce qui a pour effet de masquer leur exigence en uracile (N. Crassa : Mac Dougall et Woodword, 1965 - C. Radiatus : Cabet et al., 1965 ; Motta, 1967 ; Gans et Masson, 1969).

B. Régulation de la Glutamino Carbamyl Phosphate Synthétase en fonction des besoins cellulaires en acides nucléiques.

Anderson et Meister (1966 b) ont observé que les nucléotides puriques, et tout particulièrement l'IMP, activent la GCPSase.

Piérard et ses collaborateurs ayant montré que les nucléotides pyri- midiques inhibent l'activité de la GCPSase (par. A), Anderson et Meister ont proposé que les effets antagonistes de ces nucléotides régleraient la synthèse du CP en fonction des besoins cellulaires en nucléotides pyrimidiques utilisés pour la synthèse des acides nucléiques.

Cette coordination dans la production des nucléotides ne s'opé­

rait pas seulement au niveau de la synthèse du CP, elle s'exercerait également au niveau de l'ATCase, la seconde enzyme de la chaîne biosynthétique des nucléotides pyrimidiques. Comme on peut le voir

sur le schéma ci-dessous, cette enzyme est activée par l'ATP et inhibéepar le GTP et le CTP (Gehart et Pardee, 1962).

d'après Anderson et Meister, 1960 b.

L'analyse de ce schéma révèle que ce sont les premiers nucléotides synthétisés par l'une ou l'autre de ces deux chaînes

biosynthétiques qui s'assurent le contrôle de l'activité de la GCPSase.

Dans le cas de l'ATCase, ce contrôle est par contre exercé par les nucléotides terminaux.

- 41 -

L'examen de ce schéma fait également apparaître que l'ATCase est à la fois activée et inhibée par des nucléotides pyrimidiques : l'ATP l'active, la GTP l'inhibe. La GCPSase, quant à elle, est uniquement activée par tous les nucléotides puriques. Cette situation a amené Anderson et Meister à émettre la proposition suivante. Toute argumentation du pool des nucléotides puriques devrait provoquer une activation de la synthèse du CP.

Ce CP pourrait être utilisé à la synthèse d'arginine et des pyri- midines. L'augmentation de la concentration intracellulaire en GTP qui en résulterait provoquerait l'inhibition de l'ATCase. Cette

inhibition aurait pour conséquence que le CP synthétisé pourrait être utilisé uniquement à la synthèse d'arginine. Pour Anderson et Meister, ces divers contrôles seraient un lien régulateur entre les biosynthèses des protéines et des acides nucléiques.

C. Données génétiques relatives à la biosynthèse du Carbamyl Phosphate chez E. coli.

Près de quatre vingt mutants affectés dans la biosynthèse du CP ont été localisés sur le chromosome de E. coli en un locus situé entre les régions " Thréonine " et ” Leucine " (Piérard et al., 1965 ; Mergeay, 196 9). Il existe de bonnes raisons de penser que ce locus pourrait correspondre à une seule unité fonctionnelle. Les données suivantes en sont l'indice.

. Des essais de complémentation, in vitro, entre des extraits enzymatiques de mutants biauxotrophes pour l'arginine et l'uracile situés aux extrémités gauche et droite de ce locus n'ont jamais pu rétablir l'activité de la GCPSase (Piérard et al., 1965).

. L'analyse fonctionnelle de ce locus, par transduction abortive ou utilisation de méro diploïde s stables, n'a jamais permis la mise en évidence de plus d'un cistron (Mergeay, 196 9).

Mergeay a évalué la longueur de ce locus à 9. 5 unités de recombinaison. Sur la base du concept de colinéarité " gène- enzyme " (Yanovsky, 1967), Mergeay a proposé que la masse du polypeptide correspondant à ce locus devrait être de l'ordre de 70, 000 daltons. Cette estimation a été obtenue par comparaison de la longueur de ce locus à celle de la Tryptophane Synthétase de E. coli, une enzyme dont on connaît la structure primaire complète et, par là, la masse moléculaire exacte.

Les mutations localisées dans ce locus s'expriment par des phénotypes divers. Mergeay nous en a donné le plus large aperçu.

Il a isolé notamment :

- des souches biauxotrophes pour l'arginine et les pyrimidines (souches AIT) ;

- des souches sensibles vis-à-vis de l'arginine et/ou de l'uracile (souches arg-s, ura-s, .. ) ; ces souches dont la croissance est normale en milieu minimum se

caractérisent par un très net ralentissement de leur croissance quand le milieu contient l'un de ces produits finaux ;

- des souches dont la croissance est stimulée par l'arginine.

Parmi ces trois types de mutations, Mergeay a encore discerné des différences phénotypiques supplémentaires. Il a ainsi observé que le dioxyde de carbone stimule la croissance de certaines souches biauxotrophes. Cette molécule supprime également la sensibilité à l'uracile des souches ura-s localisées dans la région centrale de ce locus.

D'une façon générale, ces mutations se localisent tout au

long de ce locus. Il existe toutefois des regroupements phénotypiques.

La région centrale est ainsi riche en mutations ura-s, la région située à droite de ce locus contient les mutations arg-s.

- 43 -

D. Nature allostérique de la GCPSase de E. coli.

Comme nous l'avons signalé dans les paragraphes précédents, la balance entre les pools d'ornithine et d'UMP règle l'activité de la GCPSase en fonction des besoins en arginine et en pyrimidines.

De même, les concentrations intracellulaires en UMP et en IMP règlent l'activité de l'enzyme en fonction des besoins cellulaires en nucléotides pyrimidiques utilisés à la synthèse des acides nucléiques.

L'existence de ces divers contrôles au niveau de l'activité de la GCPSase a suggéré que cette enzyme pourrait être de nature allostérique. Cette idée s'est renforcée suite à l'étude d'Anderson et Meister (1966 a et b) relative aux propriétés cinétiques de la GCPSase. Ces auteurs ont montré, en effet, que la fonction de satu­

ration de l'enzyme par un de ses substrats, l'ATP, présente une allure sigmoi'de. L'UMP et l'IMP modifient l'allure de cette fonction.

En présence de ces nucléotides, l'affinité apparente de l'enzyme pour l'ATP est modifiée : l'IMP augmente cette affinité apparente, l'UMP la réduit. Ces effecteurs modifiant ainsi l'allure de cette fonction de saturation ; Anderson et Meister ont proposé que son

caractère sigmoi'de serait dû à l'existence d'interactions coopératives.

E. Mécanisme de synthèse du CP chez E. coli.

Kalman, Duffield et Brozozowsky (1965), ainsi que Anderson et Meister (1965) ont établi la stoechiométrie de la réaction assurée par la GCPSase. Cette enzyme utilise, outre la glutamine et le bicarbonate, deux molécules d'ATP poiir la synthèse d'une seule molécule de CP.

2 ATP + glutamine + HCO” + HgO —*-CP + ADP + Pi + glutamate.

In vitro, la GCPSase peut également synthétiser le CP à partir d'ammonium, l'affinité pour ce substrat étant toutefois moindre que pour la glutamine. Il est intéressant de noter que la stoechiométrie de la réaction est identique en présence de l'un ou l'autre de ceô deux substrats.

Ayant observé qu'avant de réagir avec la glutamine, la GCPSase doit se trouver sous forme d'un complexe GCPSase —anhydride

carbonate-phosphate activé, Anderson et Meister (1965) ont proposé un mécanisme de synthèse du CP.

GCPSase + ATP + HCO. GCPSase

GCPSase jjcOg PO^J ~ + glutamine + HgO' ■GCPSase

CO3PO3

-]

NH^COJ

GCPSase j^NH2C02j + ATP

+ glutamate + Pi GCPSase + CP + ADP

Ce mécanisme fut confirmé, un extrait purifié de GCPSase cata­

lysant les trois réactions suivantes (Anderson et Meister, 1966 a).

1. ATP + H2O

HCQ3

-I -I 4-

Mg K

ADP + Pi

2. Y glutamyl hydroxamate + H2O

ATP Mg HCO "

O

glutamate + NH2OH

K

3. ADP + CP + H2O

Mg

tt—► NH. +HCO., + ATP

++ 4 3

1ère réaction ATPase dépendante du bicarbonate.

HCO„“

ATP + H2O

Mg"^ K

ADP + Pi

- 45 -

Cette première étape correspond à la formation du complexe GCPSase—anhydride carbonate-phosphate . Le taux minimal de cette réaction représente 10% du taux maximal de la réaction globale de synthèse du CP. Le bicarbonate est nécessaire au clivage de l'ATP en ADP.

L' effet de la concentration en ATP ou en HCOg~ sur la

vitesse de cette réaction s'exprime par des hyperboles michaeliennes.

Km HCO3- ¹ •-H

0

Km ATP 7 10-4 M

2ème réaction Hydrolyse d'un y glutamyl hydroxamate.

ATP

Y glutamyl hydroxamate + H_0 ■ ► glutamate + NH-OH

^ HCOg' K

Cette réaction représente 90% de la réaction globale de synthèse du CP, pour autant qu'elle soit activée par le HCO^ et l'ATP. Cette exigence pour l'ATP et le HCO^” suggère que le complexe GCPSase j^COg POgj" formé dans la première étape est nécessaire au clivage du radical NH2 de l'amide de la glutamine. Ces deux premières

étapes seraient donc intimement liées.

L'observation que la glutamine,, contrairement à l'ammonium, protège la GCPSase de l'inactivation thermique à 54° C (Anderson et Meister, 1965), a suggéré que ces substrats pourraient se lier à

l'enzyme en des sites distincts. Cette idée a été confirmée par Khedouri, Anderson et Meister (1967) par l'emploi d'un analogue de la glutamine (l'acide 2 amino-4 0x0 -5 chloroplutanoique ; appelé également

" chlorocitrone I "). En présence de cet analogue, l'activité dépendante de la glutamine est, en effet, fortement inhibée alors que l'activité dépendante de l'ammonium reste inchangée.

Sur la base de cette observation, Khedouri et al. ont émis l'hypothèse que le radical -NH„ de l'amide de la glutamine serait transféré du site accepteur de la glutamine en un autre site qui pourrait également lier l'ammonium. Selon ces chercheurs, une attaque du centre électro- phile G 5 de la glutamine par un groupe nucléophile de la GCPSase

pourrait être à la base de ce transfert.

Mergeay (1969) ainsi que Haskel et Thatcher (1969) ont isolé des mutants de E. coli dont l'activité de synthèse du CP est faible en présence de glutamine, mais normale sinon plus élevée en présence d'ammonium. L'isolement de ces souches est un argument supplé­

mentaire en faveur de l'hypothèse de la présence sur la GCPSase de sites distincts pour l'ammonium et la glutamine.

3ème réaction Synthèse d'ADP à partir de CP et d'ATP.

ADP + CP+H„0 ---NH+ + HCO„" + ATP

2 Mg"^ ^ ^