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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Vandenbroere, I. (2003). Identification de nouveaux partenaires protéiques de la 5-phosphatase de type I et de SHIP 2 et étude du rôle des intéractions dans des cascades de transduction de signaux (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/211282/1/b2d2fec1-341a-4d08-9d7a-11fac529287c.txt
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DE BRUXELLES Faculté des Sciences
Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire
Identification de nouveaux partenaires protéiques de la 5-phosphatase de type I et de
SHIP2 et étude du rôle des interactions dans des cascades de transduction de signaux
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade légal de Docteur en Sciences
Promoteur de thèse : Dr I. Pirson
Vandenbroere Isabelle
mique : 2002-2003
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences
Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire
Identification de nouveaux partenaires protéiques de la 5-phosphatase de type I et de
SHIP2 et étude du rôle des interactions dans des cascades de transduction de signaux
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade légal de Docteur en Sciences
Promoteur de thèse : Dr I. Pirson
Vandenbroere Isabelle
Année académique : 2002-2003
Identification de nouveaux partenaires protéiques de la 5-phosphatase de type I et de SHIP2 et étude du rôle des interactions dans des cascades de transduction de signaux
Thèse privée soutenue le 2 avril 2003, à Gosselies Thèse publique soutenue le 30 avril 2003, à Gosselies Composition du jury :
Président du jury : Secrétaire du jury : Promoteur de thèse : Directeur de thèse : Co-promoteur de thèse : Rapporteur :
Rapporteur : Expert extérieur :
Pr. J. Urbain, IBMM, ULB Pr. J. Roscam, IBMM, ULB
Dr I. Pirson, IRIBHM, ULB Pr. G. Vassart, IRIBHM, ULB DrE. Pays, IBMM, ULB Pr. E. Dubois, IRMW, ULB Dr O. Léo, IBMM, ULB Pr. M.H. Rider
REMERCIEMENTS
Je tiens tout d'abord à remercier particulièrement les professeurs J.E. Dumont et G.
Vassart pour m'avoir accueillie au sein de leur laboratoire, ainsi que pour l'attention et llntérêt qu'ils ont accordés lors de la réalisation de ce travail.
Je voudrais aussi exprimer toute ma reconnaissance à Isabelle Pirson pour m'avoir épaulée et encouragée au cours de ces années de thèse. Merci pour ton intérêt pour mon travail. Tes nombreux conseils scientifiques, ton regard critique, ainsi que ton souci de perfection m'ont apporté beaucoup de choses tout le long de ce travail. Tes encouragements constants et ton attitude toujours franche m'ont permis d'apprécier à leur juste valeur ces quelques années sous ta direction.
Un grand merci également à Christophe Emeux pour ses conseils judicieux et pour sa passion scientifique "contagieuse". Je pense que nos étroites collaborations ont été fructueuses.
Dans notre petit labo "double-hybride", je voudrais remercier tout le monde pour leur bonne humeur journalière. Je voudrais remercier Christine qui m'a fait partager ses nombreuses histoires de lapin, puis de bébé. Merci aussi à Séverine et à Tanja pour leur soutien, leur amitié et pour les bons moments passés ensembles. Séverine, ta sportivité m'a transmis une énergie à affronter tout obstacle. Tanja, ton ouverture d'esprit et ton amitié m'ont appris à relativiser les choses et à profiter du bonheur de la vie.
Je tiens également à remercier les membres de l'équipe de Christophe pour leurs nombreux conseils et pour leur éternelle joie de vivre. Merci à toi, Colette, pour m'avoir initié avec patience et gentillesse aux techniques de dosages (d'activité et protéiques), de co-IP,... merci aussi pour ton écoute. Daniel, non seulement tes connaissances scientifiques m'ont beaucoup aidé lors de ce travail, mais surtout ton énergie débordante et tes pitreries m'ont fait bien rire. Et plus particulièrement, je voudrais remercier Valérie, Katrien et Nathalie pour les bons moments passés ensemble, pour leurs continuels encouragements et pour leurs efforts de re et relecture ainsi que de corrections de ma thèse. Je serai toujours présente pour une "expérience Cora ou Westland " ou soirée jeu de société.
Merci aussi à Hakim pour notre collaboration "double-hybride" et ton acharnement pour cette fameuse banque (on y est arrivé !). Encore désolé pour : "Mais tu as vu ta g... !".
Merci au labo 4*^ : Valérie, Sandrine, Sarah, Carine,... , à Maria, Nathalie, Vanessa du 5'^"^
et à Sophie et Pouic-Pouic de Gosselies. Je voudrais également remercier Stéphane Schurmans pour sa disponibilité, ses compétences et ses conseils scientifiques. Merci à tous
les membres de nRIBHN que je n'ai pas cité et qui ont contribué à un moment ou à un autre, à la réalisation de ce travail et à l'ambiance conviviale qui règne dans le laboratoire.
Merci beaucoup à Danièle et Kathy pour leur gentillesse et leur disponibilité. Désolé de vous avoir de nombreuses fois dérangé dans votre travail pour des soucis administratifs ou autres.
Tout mes remerciements s'adressent également à toutes les autres personnes que j'ai appris à connaître et à apprécier durant ma thèse : Fabrice (toujours cool, sauf en présence de Daniel), Nathalie (il faudrait quand même que je me remette au hiphop !), Sandrine (merci pour ton soutien et ton amitié), Xavier (avec son côté cool, sympa et mer rouge à la fois) et Anouk (merci de ton soutien). J'adresse également ma profonde amitié à Vanessa, toujours débordante d'énergie et de bonne humeur. Merci de m'avoir fait partager ton amitié (et m'avoir fait rencontrer Stéphane).
Un grand merci aussi à tous mes amis qui m'ont toujours soutenu durant toutes ces années et qui devront me supporter encore dans les années à venir : Marielle et Jean- François et leurs petits boutchous (merci pour tout ! Eh oui, c'est cette sacrée Isamini !) , Marilyn et Patrick (toujours là même quand je m'y attend pas ! Merci pour votre amitié !), Christina (j'espère à bientôt pour des vacances en Grèce ), Céline (merci de la part du petit Troll et de Caliméro), Samir et Didier (toujours prêt à faire la fête ! Mais qu'est-ce qu'on se marre !). Merci aussi à vous Bruno, Laurence (rendez-vous donc au pays des baleines !), Benet (à quand du crousti ?) et à vous tous pour votre amitié, votre soutien et votre présence.
Je tiens à remercier mes parents et mes frères, pour leur soutien dans les moments de joie comme dans les moments difficiles. Patrick, je te dédie plus particulièrement ma thèse et je pense beaucoup à toi. Toi qui voulait toujours savoir où en était mes expériences...tu me manques énormément.
Merci aussi aux parents, frères et sœur de Stéphane, ainsi qu'à Fabienne pour leur affection et leurs encouragements.
Merci à toi Stéphane pour ta patience, tes encouragements et pour le bonheur et l'amour que tu m'apportes.
Ce travail a pu être réalisé grâce aux soutiens financiers de la Fondation Alice et David Van Buuren, de l'ULB, de la Fondation Rose et Jean Hoguet et finalisé grâce aux bonnes œuvres du C.P.A.S..
TABLE DES MATIERES
ABRÉVIATIONS RÉSUMÉ
INTRODUCTION...1
1. Les interactions protéiques et la méthode du double-hybride...1
A. Méthodes classiques d’identification des interactions protéiques directes... 1
B. Méthodes in vivo d’identification des interactions entre protéines... 2
a) Le "Sos recruitment System" (SRS)... 2
b) La complémentation P-galactosidase...3
c) Le système double-hybride... 3
1) Principe de la méthode...3
2) Avantages et inconvénients de la méthode double-hybride...4
3) Exemples d’interactions mises en évidence par le double-hybride...5
4) Variations autour de la méthode du double-hybride...5
2. Métabolisme des phosphoinositides... 7
A. Métabolisme des phosphoinositides impliquant la PLC... 7
B. Métabolisme des phosphoinositides impliquant la PI 3-kinase... 8
3. Famille des 5-phosphatases d’inositols et de phosphatidylinositols polyphosphates..lO A. Généralités...10
B. La 5-phosphatase de type 1... 11
C. Les 5-phosphatases de types II... 13
a) Les 5-phosphatases INPP5P et OCRL... 13
b) Les synaptojanines... 14
c) LesSHIPs...15
SHIPl... 15
SHIP2... 17
4. La voie de signalisation de l’insuline... 22
A. Généralités... 22
B. Mécanisme d’activation du récepteur tyrosine-kinase de l’insuline... 22
C. Recrutement de protéines adaptatrices sur le récepteur à l’insuline...23
D. Voies de signalisation induites par le récepteur à l’insuline... 23
a) La voie de signalisation des MAP kinases... 23
b) La voie de signalisation passant par la phosphatidylinositol 3-kinase... 24
c) La voie de signalisation impliquant CAP/Cbl et TCIO...26
BUT DU TRAVAIL... 27
RÉSULTATS... 29
1.Développement du système double-hybride dans le laboratoire... 29
a) Généralités...29
b) Caractéristiques de la banque d’ADNc de thyroïde... 30
c) Caractéristiques de la banque commerciale d’ADNc de cerveau humain...30
2. Recherche des partenaires protéiques de la 5-phosphatase de type 1... 31
A. Criblage d’une banque d’ADNc thyroïdiens avec la 5-phosphatase de type 1... 31
a) Criblage et identification des partenaires protéiques obtenus... 31
b) Identification des acides aminés COOH-terminaux de la 5-phosphatase de type I importants pour l’interaction avec la pGGTase II...32
c) Confirmation de l’interaction entre la 5-phosphatase de type I et la sous-unité P de la GGTase II par coimmunoprécipitation en cellules COS-7... 33
d) Expériences de géranylgéranylation in vitro... 34
e) Effet de la sous-unité P de la GGTase II sur l’activité InsPs 5-phosphatase de la 5- phosphatase de type I... 35
f) Conclusion... 35
B. Criblage d’une banque d’ADNc de cerveau avec la 5-phosphatase de type 1... 36
a) Criblage et identification des partenaires protéiques obtenus... 36
b) Confirmation biochimique de l’interaction entre la 5-phosphatase de type I et la sous- unité ô de la phosphodiestérase par des expériences de "GST-pulldown"... 36
c) Confirmation de l’interaction entre la 5-phosphatase de type I et la sous-unité ô de la GMPc phosphodiestérase par coimmunoprécipitation en cellules COS-7...37
d) Effet de la sous-unité ô de la phosphodiestérase sur l’activité InsPa 5-phosphatase de la 5-phosphatase de type 1... 37
e) Conclusion... 38
3. Recherche des partenaires protéiques de SHIP2... 39
A. Analyse de la région riche en prolines de SHIP2... 39
B. Criblage d’une banque d’ADNc de cerveau avec SHIP2-pp et identifîcation des partenaires protéiques obtenus...39
C. Spécificité des interactions entre les partenaires identifiés et la région riche en prolines de SHIP2 et de SHIPl... 41
D. Etude de l’interaction entre SHIP2 et l’intersectine... 41
E. Etude de l’interaction entre SHIP2 et IBl... 43
a) Importance du site NPAY de SHIP2 pour son interaction avec IBl... 43
b) Confirmation de l’interaction entre SHIP2 et IBl par coimmunoprécipitation et expression dans des extraits de cerveau de souris et des lignées de cellules P- pancréatiques... 43
F. Etude de l’interaction entre SHIP2 et CAP... 45
a) Spécificité de l’interaction entre CAP et SHIP2 par double-hybride... 45
b) Identification du domaine de CAP important pour son interaction avec SHIP2... 45
c) Association entre CAP et SHIP2 dans les cellules de mammifères... 46
d) Relation entre SHIP2 et la voie CAP/c-Cbl...46
e) Concentration de SHIP2 dans la fraction membranaire Triton X-lOO-insoluble... 47
f) Conclusion...48
DISCUSSION ET PERSPECTIVES... 49
1. Identification de deux nouveaux partenaires protéiques potentiels de l’InsPa 5- phosphatase de type 1... 49
2. Identification de nouveaux partenaires protéiques potentiels de SHIP2... 53
BIBLIOGRAPHIE... 60
ANNEXES... 77
MATÉRIELS ET MÉTHODES... 77
1. Méthodes classiques de biologie moléculaire... 77
A. Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)... 77
B. Clonage d’un fragment d’ADN ou d’un produit PCR dans un vecteur... 77
C. Electroporation de bactéries DHIOB par de l’ADN plasmidique...79
D. Préparation d’ADN plasmidique par lyse alcaline... 80
E. Séquençage d’ADN... 80
2. Méthodes pour le criblage double-hybride... 81
A. Préparation d’ARN messager poly A+ de tissu de thyroïde de chien... 81
B. Synthèse de la banque d’expression d’ADN complémentaire... 81
C. Préparation du vecteur pour le clonage de la banque...81
D. Transformation de levures... 82
E. Milieux de culture des levures... 82
F. Criblage de banques d’expression par la méthode du double-hybride... 83
G. Préparation d’ADN plasmidique de levure...83
3. Méthodes biochimiques... 84
A. Production de la protéine InPs 5-phosphatase de type I recombinante...84
B. Géranylgéranylation in vitro... 84
C. Dosage de l’activité enzymatique InPs 5-phosphatase... 85
D. Séparation des protéines par électrophorèse sur gel... 86
E. Western blotting et immunodétection...86
F. Coimmunoprécipitation... 86
G. Anticorps utilisés en coimmunoprécipitation et immunodétection... 87
H. Cellules et milieux de culture... 87
I. "GST-pulldown assay"... 88
J. Purifîcation des radeaux lipidiques... 89
PUBLICATIONS
ABREVIATIONS
AMPc : adénosine monophosphate cyclique ArgBP2 : "Arg binding protein 2 "
ATPase : adénosine 5’-triphosphate phosphatase
POGTase II : sous-unité P de la géranylgéranyltransférase de type II P-gal : P-galactosidase
CAP : "c-Cbl associated protein"
CAT : "çhloramphenicol acetyltransferase"
CHO : cellules d’ovaires de hamster chinois
CHO-IR : cellules d’ovaires de hamster chinois exprimant le récepteur à l’insuline COS ; cellules de rein de singe vert d’Afrique
DAG : diacylglycérol
DAT ; domaine activateur de transcription DLA : domaine de liaison à l’ADN
ô PDE : sous-unité ô de la GMPc phosphodiestérase de rétine EEN-Bl : "Extra Eleven Nineteen-Bl"
EGF : facteur de croissance épidermique EH : domaine d’homologie à Eps 15 EVH1 : "Enabled VASP Homology i"
Ftase : famésytransférase
G-6-Pase : "glucose-6-phosphatase"
GAP : "GTPase activating protein"
GEF : facteur d’échange des nucléotides guanyliques GGTase I : géranylgéranyltransférase de type 1 GGTase II : géranylgéranyltransférase de type II GGPP : géranylgéranylpyrophosphate
GMPc : guanosine 3’, 5’-monophosphate cyclique GSK3 : "glycogen synthase kinase 3"
GST ; "glutathione-S-transférase"
GTPase : guanosine triphosphate phosphatase H1S3 : imidazole glycerolphosphate déhydratase vps34 : "yacuolar protein sorting 34"
IBl : "Islet-Brain i"
INPP5P : "Inositol Polyphosphate 5-phosphatase"
fNS : insuline Ins : inositol
Ins(l,4)P2 : inositol 1,4-bisphosphate lns(l,3,4)P3 : inositol 1,3,4-trisphosphate Ins(l,3,4,5)P4 : inositol 1,3,4,5-tétrakisphosphate
lnsP3 5-phosphatase de type I: inositol 1,4,5-trisphosphate 5-phosphatase de type 1 lnsP3 3-kinase : inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase
IPTG : isopropylthio-(3-D galactoside 1RS : "Insulin Receptor Substrate"
IRSp53 : "Insulin Receptor Substrate 53 kPa"
ITIM : "Immunoreceptor tyrosine-based inhibiteur motif' ITAM : "immunoreceptor tyrosine-based activation motif' ITSN : intersectine
JNK : "Jun kinase"
LEU2 : P-isopropylmalate déhydrogénase MAP ; "mitogen activated protein"
OCRL : "Oculoçerebrorenal Lowe syndrome"
PB S : "phosphate buffer saline"
PDGF : facteur de croissance dérivé des plaquettes sanguines PDKl : "_protein kinase phosphoinositide-dependent protein kinase-i"
PEPCK : "phosphoenolpyruvate çarboxylase kinase"
PH : domaine d’homologie à la pleckstrine ("Pleckstrin Homology"
PI 3-kinase : phosphoinositide 3-kinase PKB : protéine kinase B
PKC : protéine kinase C PLC : phospholipase C
PTB : domaine de liaison aux phosphotyrosines Ptdins : phosphatidylinositol
PtdIns(3)P : phosphatidylinositol 3-monophosphate PtdIns(4)P : phosphatidylinositol 4-monophosphate PtdIns(5)P : phosphatidylinositol 5-monophosphate PtdIns(3,4)P2 : phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate PtdIns(4,5)P2 : phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate PtdIns(3,4,5)P3 : phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate PTEN : "phosphatase and tensin homologue"
REP : "Rab escort protein"
SAM : "Stérile Alpha Motif "
SDS : dodécylsulfate de sodium
Polyacrylamide/SDS : électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS SGK : "sérum and glucocorticoid protein kinase"
SH2 : "Src Homology 2"
SH3 : "Src Homology 3"
SHIP : "Src Homology 2 containing inositol phosphatase"
SoHo : domaine d’homologie à celui de la sorbine SRS ; "Sos recruitment System"
TNT ; "transcription and translation "
UAS : "Upstream activating sequence"
URA3 : orotidine-5’-phosphate décarboxylase VASP : "Vasodilator-stimulated phosphoprotein"
X-Gal : 5-bromo-4-chloro 3 indoyl galactopyranoside YAP : "Yes associated protein"
RÉSUMÉ
Le métabolisme des phosphoinositides est à l’origine de la production de seconds messagers intracellulaires tels que rins(l,4,5)P3, l’Ins(l,3,4,5)P4, dont le catabolisme est régulé par l’InsP3 5- phosphatase de type I, ainsi que le PtdIns(3,4,5)P3 dont le catabolisme est notamment régulé par la phosphatidylinositol 5-phosphatase SHIP2. L’InsP3 5-phosphatase de type I est connue pour son rôle dans le contrôle de la réponse calcique, alors que SHIP2 joue un rôle important dans la régulation de différentes voies de signalisation dont celle de l’insuline. Nous avons entrepris, au cours de ce travail, la recherche et l’étude de nouveaux partenaires protéiques de ces deux protéines par la méthode double-hybride.
Dans une première partie du travail, deux nouveaux partenaires potentiels de l’InsP3 5- phosphatase de type I ont été identifiés : la sous-unité P de la géranylgéranyltransférase de type II (PCGTase II) et la sous-unité ô de la phosphodiestérase (ô PDE). L’interaction entre l’InsP3 5- phosphatase de type I et la pGGTase II a pu être confirmée en cellules intactes. Par contre, l’interaction entre l’InsP3 5-phosphatase de type I et ô PDE n’a pu être confirmée biochimiquement.
Les expériences de géranylgéranylation réalisées in vitro ont montré que l’InsP3 5-phosphatase de type I n’est pas substrat de la GGTase IL L’activité de l’InsP3 5-phosphatase de type I n’est pas non plus régulée par ces deux protéines. Aucun rôle fonctionnel n’a donc pu être attribué à ces interactions.
Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons identifié sept nouveaux partenaires protéiques de SHIP2 impliqués dans des phénomènes d’endocytose, dans la voie de réponse à l’EGF ou à l’insuline. Parmi eux, l’intersectine (ITSN) et la protéine "Islet Brain" (IBl) interagissent avec SHIP2 en système de surexpression. L’association entre SHIP2 et l’ITSN a également été démontrée dans des myoblastes C2C12 où ces deux protéines sont fortement exprimées. Le rôle de ce complexe dans les myoblastes reste à déterminer. Nous avons montré également que les protéines SHIP2 et IBl sont, quant à elles, coexprimées dans les cellules p-pancréatiques.
Enfin, l’identification de la protéine CAP comme partenaire de SHIP2 nous a permis de mettre en évidence, pour la première fois, un lien moléculaire direct de SHIP2 avec la cascade de réponse à l’insuline. Nous avons montré que SHIP2 est capable de coprécipiter avec le récepteur insuline et d’interagir avec CAP et c-Cbl, trois protéines impliquées dans le recrutement membranaire de GLUT4 stimulé par l’insuline. De plus, SHIP2, tout comme CAP et c-Cbl, est concentré dans les cavéoles. Ces nouvelles données contribuent à expliquer le phénotype d’hypersensibilité à l’insuline des souris déficientes en SHIP2. Ces résultats suggèrent que, dans les cellules cibles de l’insuline, SHIP2 pourrait participer aux complexes multiprotéiques impliquant le récepteur à l’insuline, CAP et c-Cbl. En plus de l’activité catalytique PtdIns(3,4,5)P3 phosphatase de SHIP2, son interaction avec ces différentes protéines et son recrutement dans les rafts pourraient être importants pour son rôle in vivo dans la régulation négative de la cascade de signalisation de l’insuline.
INTRODUCTION
Introduction
INTRODUCTION
1. Les interactions protéiques et la méthode double-hybride.
Les mécanismes par lesquels un signal extracellulaire est reçu et interprété par une cellule cible sont loin d’être totalement compris et constituent un sujet de recherche important en biologie. La transmission des signaux de la membrane plasmique jusqu’au noyau dépend de la formation et de la dissociation de nombreux complexes multiprotéiques.
Les interactions protéiques jouent donc un rôle essentiel au niveau de la réponse cellulaire.
De plus, la découverte des partenaires avec lesquels une protéine interagit permet souvent de mieux comprendre sa fonction. C’est dans ce cadre de recherche que nous nous sommes proposés d’identifier les protéines capables d’interagir avec deux inositols et phosphatidylinositols polyphosphates 5-phosphatases : l’InsPs 5-phosphatase de type I et SHIP2 (Src Homology 2 containing inositol phophatase 2).
A. Méthodes classiques d’identification des interactions protéiques directes.
Depuis de nombreuses armées, d’importants efforts ont été consentis pour tenter de mieux comprendre le rôle de nombreuses protéines par l’utilisation de différentes méthodes d’identification de partenaires protéiques. Ces travaux reposent notamment sur l’utilisation de méthodes biochimiques comme la co-immunoprécipitation et la chromatographie d’affinité. Ces approches biochimiques ont permis d’identifier de nombreuses interactions protéiques telles que celle entre la protéine GAP (GTPase activating protein) et pl90 (Settleman et a/. 1992).
La biologie moléculaire a permis l’apparition d’un certain nombre de nouvelles méthodes telles que le criblage de banque d’expression et le système "phage display". Ces approches in vitro ont permis également l’identification et la purification de protéines partenaires dont de nombreux facteurs de transcription. Par exemple, le criblage d’une banque d’expression avec la protéine Myc produite en système bactérien, purifiée et marquée radioactivement a permis la mise en évidence de son interaction avec la protéine Max (Blackwood & Eiseiunan 1991).
1
Figure 1 : Principe du "Sos recruitment System
La protéine d’intérêt (X) est fusionnée avec la protéine Sos dans la levure. Les ADNc d’une banque sont clonés en aval d’une séquence de signalisation membranaire et les protéines de fusion générées (Y) sont également produites en levure. Lorsque la protéine X
interagit avec la protéine Y, le complexe est dirigé vers la membrane où Sos permet l’activation de la protéine Ras et la croissance des levures.
Introduction
Cependant, ces méthodes réalisées in vitro présentent les désavantages d’être réalisées dans des conditions expérimentales peu physiologiques et surtout de demander un temps important, une fois l’interaction mise en évidence, pour isoler l’ADN codant pour la protéine d’intérêt. De plus, la sensibilité de ces méthodes est souvent restreinte par des lavages nécessaires pour réduire les interactions non spécifiques.
Par la suite, plusieurs méthodes réalisées in vivo sont apparues et se sont révélées efficaces pour l’identification d’interactions entre protéines.
B. Méthodes in vivo d’identification des interactions entre protéines.
a) Le "Sos recruitment System" tSRSf
Dans ce système (Figure 1), une construction permettant l’expression de la protéine d’intérêt fusionnée au facteur d’échange GTP-GDP de mammifère (GEF) Sos est produite, ainsi que les ADNc d’une banque clonés en aval d’une séquence codant pour un peptide signal de localisation membranaire. Ces deux constructions sont introduites dans une souche de Saccharomyces cerevisiae contenant une mutation dans le GEF de levure couplé à Ras (cdc25-2). Lorsqu’une interaction entre la protéine étudiée et un partenaire a lieu dans la levure, le complexe protéique est dirigé vers la membrane où Sos va permettre l’activation de la protéine Ras et la croissance des levures. Cette méthode a permis d’isoler les protéines JDPl et JDP2 qui interagissent spécifiquement avec c-Jun (Aronheim et al. 1997). Une amélioration a été apportée à la méthode par l’introduction dans la souche de levure d’une protéine de mammifère activant la GTPase (mGAP) spécifique de la protéine Ras de mammifère et incapable de modifier l’activité de Ras de levure. L’expression de cette protéine a pour but d’empêcher la croissance des levures contenant un ADNc permettant l’expression d’une protéine Ras de mammifère fonctionnelle. En effet, ces clones de levures sont sources de faux-positifs, par l’activité presque constitutive de cette protéine (Aronheim
1997).
Contrairement au système double-hybride (point c), ce système ne se base pas sur une activité transcriptionnelle, ce qui pourrait faciliter l’étude d’activateurs ou de répresseurs de la transcription.
2
Figure 2: Principe de la complémentation P-galactosidase.
A. Lorsque les mutants p-gal Aa et A(0 sont fusionnés à des protéines qui n’interagissent pas, leur association n’est pas favorisée et l’activité P*gal n’est pas détectée.
B. Lorsque les mutants sont fusionnés à des protéines qui interagissent, la formation d’une P-galactosidase active est favorisée et son activité détectée.
(d’après Rossi et al., 1997).
Introduction
b) La complémentation B-galactosidase.
Le principe de base de cette méthode (Figure 2), réalisée en cellules eucaryotes intactes, est de fusionner à chacun des partenaires des mutants de délétion complémentaires de la p- galactosidase (P-gal) (Rossi et al. 1997). Ces mutants, seuls, sont incapables de reconstituer une activité enzymatique sauf lorsqu’ils sont réunis par les deux partenaires. La base moléculaire de l’incapacité des deux mutants de complémentation de s’associer indépendamment des deux partenaires reste inconnue.
Ce système pourrait théoriquement permettre la détection de complexes dans les différents compartiments subcellulaires (noyau, cytoplasme,...) (Rossi et al. 1997).
c) Le système double-hybride.
Le système double-hybride est une méthode d’analyse d’interaction entre protéines in vivo réalisée dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Elle a été mise au point, en 1989, par Fields et Song (Fields & Song 1989).
1) Principe de la méthode.
Cette méthode (Figure 3) se base sur les propriétés modulaires du facteur de transcription GAL4, activateur transcriptionnel des gènes GALl et GALIO impliqués dans le métabolisme du galactose chez la levure.
Celui-ci possède deux domaines nécessaires à ses propriétés activatrices : - un domaine activateur de la transcription (DAT)
- un domaine de liaison à l’ADN (DLA), capable de lier des séquences d’ADN spécifiques U AS (Upstream activating sequence) du promoteur de GALl et de GALIO et de positionner ainsi la partie activatrice près de sa cible.
Le système double-hybride consiste à exprimer deux protéines hybrides : l’une constituée du domaine de liaison à l’ADN de GAL4 fusionné à la protéine d’intérêt, et l’autre constituée de la cible ou du produit d’une banque d’ADNc fusionné au domaine activateur de la transcription de GAL4. Ces fusions sont exprimées dans la levure à partir de plasmides réplicatifs portant des marqueurs de sélection. Dans le génome de celle-ci, des gènes rapporteurs sont présents sous le contrôle de promoteurs précédés de la séquence UAS liant GAL4. Dans le clone de levure où les deux protéines de fusion interagissent, les
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Figure 3: Principe de la méthode double-hybride.
Les plasmides 1 et 2 introduits dans la levure et sélectionnables par croissance sur milieu carencé en certains acides aminés, permettent l’expression respectivement d’une protéine de fusion “domaine de liaison à l’ADN de Gal4 (DLA)-protéine d’intérêt X” et d’une protéine de fusion “domaine activateur de Gal4 (DAT)-protéine Y exprimée à partir d’une banque d’ADNc”. Lorsque les deux protéines de fusion sont capables d’interagir, le complexe obtenu permet l’activation des gènes rapporteurs.
Introduction
domaines du facteur GAL4 sont bien positionnés et peuvent stimuler la transcription des gènes rapporteurs. Les gènes rapporteurs fréquemment utilisés sont LacZ, lequel donne un phénotype quantifiable, et HIS3 et ADE2 qui permettent une sélection nutritionnelle des transformants. Lorsqu’un clone est positif pour les gènes rapporteurs, il faut vérifier que la stimulation de la transcription est bien dépendante de l’interaction du clone positif identifié avec la protéine d’intérêt étudiée. Ces clones positifs sont alors isolés et l’ADNc qu’ils contiennent est purifié et caractérisé.
2) Avantages et inconvénients de la méthode double-hybride.
Le système double-hybride présente de nombreux avantages :
- Les conditions d’interaction dans ce système se rapprochent plus des conditions physiologiques naturelles puisque le criblage se fait in vivo dans la cellule de levure.
- Ce système permet, par sa grande sensibilité, de détecter des interactions faibles avec ime constante de dissociation de l’ordre de 10 pM (Yang et al. 1995).
De plus, lorsque le clone positif est identifié, l'ADNc est immédiatement disponible sans nécessité de microséquençage protéique et d'amplification PCR avec des amorces dégénérées.
Ce système permet aussi d’identifier les régions des protéines responsables de l'interaction par mutations.
Certaines caractéristiques peuvent toutefois limiter l’utilisation du système :
- La toxicité éventuelle pour la levure de la protéine d’intérêt surexprimée, l'instabilité des fusions, un faible taux d'expression ou un transport nucléaire inefficace peuvent empêcher l'utilisation de ce système.
- Les modifications post-traductionnelles (phosphorylation, glycosylation...) peuvent ne pas avoir lieu selon les mêmes spécificités.
Les protéines capables de stimuler à elles seules la transcription, ne peuvent être utilisées à moins d'être délétées des parties responsables de cette stimulation.
Il faudra à plus long terme s'assurer de l'existence de l'interaction dans la cellule eucaryote supérieure que l'on étudie.
Les méthodes biochimiques sont donc complémentaires de ce système et permettent de vérifier in vitro, sous différentes conditions, les interactions identifiées en levures.
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Introduction
3) Exemples d’interactions mises en évidence par la méthode double-hybride.
Cette méthode a permis de mettre en évidence différentes interactions protéiques majeures, parmi elles :
L’interaction entre l’IGFl et son récepteur (Zhu & Kahn 1997).
L’interaction entre Ras associée à la membrane et la sérine/thréonine kinase Raf (Vojteketa/. 1993).
- L’interaction entre Shc, par son domaine SH2 (Src Homology 2), et le domaine cytoplasmique de la cadhérine, une protéine transmembranaire impliquée dans l’adhésion cellule-cellule calcium-dépendante (Xu et al. 1997).
- L’interaction entre la région catalytique de la protéine kinase C et une protéine nommée PlCKl, localisée dans la région périnucléaire (Staudinger et al. 1995).
4) Variations autour de la méthode double-hybride.
4.1 Le "piège à interaction ".
C’est un système basé sur le même principe que le double-hybride, mais les couples de fusion utilisés sont différents. Une des deux fusions est constituée du répresseur d'E. Coli LexA fusionné avec la protéine d’intérêt, tandis que la deuxième comprend des protéines synthétisées à partir d’une banque d’ADNc et fusionnées, soit à la séquence activatrice VP 16 de Vherpes simplex, soit à celle de la protéine B42 de bactérie (Brown & MacGillivray 1997;
Xu et al. 1997; Estojak et al. 1995). La séquence UAS de GAL4, placée en amont des gènes rapporteurs, est, dans cette méthode, remplacée par l’opérateur LexA.
4.2 Le double-hybride de mammifère.
Dans ce système, la protéine d’intérêt est exprimée sous forme d’une fusion au DLA de Gal4 et l’autre protéine est exprimée sous forme d’une fusion au DAT de la protéine VP 16 du virus de l’herpes simplex. Les vecteurs exprimant ces deux protéines de fusion sont cotransfectés avec un vecteur portant le gène rapporteur CAT (çhloramphenicol acetyltransferase) sous le contrôle de sites de liaison de Gal4, dans une lignée de cellules de mammifères. Une détection de l’expression du gène rapporteur CAT est observée lorsque deux protéines interagissent (Luo et al. 1997). Ce système double-hybride de mammifère est
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Introduction
souvent utilisé comme une approche complémentaire pour vérifier l’interaction entre deux protéines détectée par double-hybride dans la levure.
4.3 Le double-hybride inverse.
Dans cette méthode, l’interaction entraîne l’activation d’un gène rapporteur dont le produit est toxique pour la croissance cellulaire. Ceci permet de contre-sélectionner les interactions protéiques. Parmi les gènes rapporteurs utilisés, on trouve l’URA3 dont le produit est essentiel pour la biosynthèse de l’uracile, mais qui peut aussi catalyser la transformation de l’acide 5-fluoroorotique en composé toxique (White 1996; Vidal et al. 1996) ou CYH2, rendant les cellules dans lesquelles il y a une interaction, sensibles à la cycloheximide (Leanna & Hannink 1996). C’est par cette méthode qu’ont été identifiés les acides aminés du facteur de transcription E2F1 important pour son interaction avec la protéine du rétinoblastome (Shan et al. 1996).
4.4 Le simple-hybride.
Le système simple-hybride est utilisé pour isoler des nouveaux gènes codant pour des protéines qui se lient à une séquence d’ADN spécifique connue. Cette méthode a permis notamment d’identifier le facteur de transcription OLFl (Wang & Reed 1993).
4.5 Le triple-hybride.
Le triple-hybride permet de mettre en évidence des protéines liant une séquence d’ARN ou des interactions impliquant trois protéines. Dans le premier cas, une protéine connue est fusionnée au DLA de GAL4 et à une séquence d’ARN connue, ainsi qu’à un nouvel ARN que l’on cherche à caractériser. Les protéines interagissant avec cet ARN peuvent alors être identifiées. Dans le cas où il implique 3 protéines, les levures sont transformées par une troisième construction exprimant une protéine chargée de faire le lien entre les deux autres protéines étudiées ou essentielle pour modifier une des deux protéines afin de permettre leur interaction. Cette méthode a notamment permis de mettre en évidence les interactions impliquant le complexe formé par le récepteur EGF (Epidermal growth factor), Grb2 et Sos (Zhang & Lautar 1996)
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Principaux domaines d’interactions entre protéines Nom du domaine Taille Structure Motif reconnu dans
la protéine associée
Exemples
SH3 50-70 aa 2 feuillets [3 ± R/KxxPxxP (classe I) Src (Src-Homology 3) (5 brins |3 anti-//) PxxPxR7K (classe II) Crk
SH2 -100 aa 1 feuillet P pYxxx Shc,
(Src-Homology 2) (3 brins (3 anti-//) + 2 hélices a
Grb2
PTB 100-150 aa 2 feuillets (3 xxNPx(p)Y Shc,
(phosphotyrosine orthogonaux IRS-1
binding) + 2 hélices a
WW 38- 40 aa 1 feuillet (3 PPLY Nedd4
(Tryptophane- (dont 2 W) (3 brins (3 anti-//) Tryptophane)
EH -100 aa 4 hélices a NPF Eps 15,
(^s 15 -Homology) ITSN
EVHl -llOaa 2 feuillets (3 D/EFPPPP VASP
(Enabled-Vasp- Homology jj
+ 2 hélices a
SAM -70 aa 5 hélices a domaine SAM EphA4
(Stérile Alpha Motif)
Principaux domaines protéiques liant les phosphoinositides
Nom du domaine Taille Structure Phosphoinositides Exemples associés
PH -120 aa 2 feuillets (3 ± PtdIns(4,5)P2, PtdIns(3,4)P2 PKB (Pleckstrin Homology) (7 brins (3 anti-//) PtdIns(3,4,5)P3
+ hélice a
C2 -130 aa 2 feuillets de PtdIns(4,5)P2, PtdIns(3,4,5)P3 PKC 4 brins P anti-//
PtdIns(3,4,5)P3
A
PIP5K 5-ppase SHIPl/2
^ PtdIns(3,4)P2
PI4K
PtdIns(3)P 4-ppase
PI3K 3-ppase
PTEN
PI3K 3-ppase PI3K 3-ppase
▼
t t1 ^PIP5K ^ P14K
PtdIns(4,5)P2 1 <--- ^ PtdIns(4)P
lî
Ptdins5-ppase
t
Ins(l,4,5)P3
^1P3K
---►
5-ppase I Ins(l,4)P2
--- ►
5-ppase I Ins(l,3,4)P3 ■
Inositol
Figure 4 : Représentation simplifiée du métabolisme des phosphoinositides chez les mammifères.
Dans le métabolisme des phosphoinositides, le Ptdlns(4,5)P2 est à l’origine de deux voies majeures qui vont mener à la production de nombreux seconds messagers (encadrés en rouge) :
- la voie lns(l,4,5)P3/calcium, impliquant la phospholipase C (PLC) qui induit la formation des inositols polyphosphates et du diacylglycérol (DAG).
- la voie impliquant la phosphoinositide 3-kinase (PI3K) et qui induit la formation des
phospholipides membranaires. (Figure adaptée de Emeux et al., 1998).
Introduction
2. Le métabolisme des phosphoinositides.
Le métabolisme des phosphoinositides est à l’origine de la production de seconds messagers intracellulaires qui peuvent engendrer une variété de réponses cellulaires suite à la stimulation des cellules par de nombreux stimuli tels que des facteurs de croissance, des hormones ou des neurotransmetteurs. Parmi ces seconds messagers, le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (Ptdlns(4,5)P2) joue un rôle central dans la signalisation cellulaire en régulant des phénomènes comme le trafic vésiculaire et l’organisation du cytosquelette (Corvera et al. 1999; Lassing & Lindberg 1988; Klein et al. 1998). Le PtdIns(4,5)P2 est synthétisé à partir du PtdIns(4)P par phosphorylation en position 5 par une PI 5-kinase (Zhang et al. 1997). Une voie de synthèse alternative implique la phosphorylation en position 4 du PtdIns(5)P par une PI 4-kinase (Rameh et al. 1997). D’autre part, les taux intracellulaires de PtdIns(4,5)P2 sont finement contrôlés par l’action de phosphatases (phosphatidylinositols polyphosphates 5-phosphatases, décrites dans le ehapitre suivant).
Outre son rôle de messager cellulaire, le PtdIns(4,5)P2 joue un rôle central dans le métabolisme des phosphoinositides et est à l’origine de deux voies majeures (Figure 4) :
l’une qui, par l’action de la phospholipase C (PLC), induit la formation des inositols polyphosphates et du diacylglycérol (DAG), couramment appelée voie inositol 1,4,5- trisphosphate (Ins(l,4,5)P3)/calcium (Berridge 1984; Berridge & Irvine 1989).
- l’autre qui, par la phosphoinositide 3-kinase (PI 3-kinase), induit la formation des phospholipides membranaires (Carpenter & Cantley 1996).
A. Métabolisme des phosphoinositides impliquant la PLC.
L’activation de eertains récepteurs couplés aux protéines G (récepteurs muscariniques, à la thrombine,...) et à activité tyrosine kinase (récepteur à l’EGF,...) stimule l’activité de la phospholipase C (PLCp-1 ou y-1) (Berridge 1993). Celle-ci hydrolyse alors le PtdIns(4,5)P2 en DAG et Ins(l,4,5)P3.
Le DAG active la sérine/thréonine kinase PKC qui phosphoryle alors de nombreux substrats importants pour la régulation de nombreux événements cellulaires (formation d’adhésions focales, eontraction musculaire,...) (Hyatt et al. 1994; Ikebe et al. 1985).
L’Ins(l,4,5)P3, généré par l’hydrolyse du PtdIns(4,5)P2, est un second messager important dans la mobilisation du calcium intracellulaire (Streb et al. 1983). Il agit par liaison à un
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Introduction
récepteur intracellulaire spécifique, le récepteur à l’Ins(l,4,5)P3. Celui-ci possède une activité intrinsèque de canal calcium, régulée par la concentration en calcium cytosolique. La liaison de rins(l,4,5)P3 à son récepteur permet le largage de calcium dans le cytoplasme à partir de réserves intracellulaires du réticulum endoplasmique (Ferris et al. 1989).
L’Ins(l,4,5)P3 est métabolisé par deux voies distinctes. Il peut être déphosphorylé en inositol 1,4-bisphosphate (Ins(l,4)P2) par l’InsP3 5-phosphatase de type I et peut être phosphorylé en inositol 1,3,4,5-tétrakisphosphate (Ins(l,3,4,5)P4) sous l’effet des InsP3 3-kinases. Ces enzymes font partie d’un ensemble de kinases et phosphatases qui vont permettre la formation de nombreux inositols polyphosphates et le recyclage de ceux-ci en inositols indispensables pour la reconstitution des phospholipides membranaires.
B. Métabolisme des phosphoinositides impliquant la PI 3-kinase.
La stimulation de certains récepteurs à activité tyrosine kinase conduit à l’activation de la PI 3-kinase (de classe I) et par celle-ci, le PtdIns(4,5)P2 peut être phosphorylé en PtdIns(3,4,5)P3.
Les phosphoinositide 3-kinases (PI 3-kinases) sont des enzymes qui peuvent phosphoryler le Ptdins, le PtdIns(4)P et le PtdIns(4,5)P2 respectivement en PtdIns(3)P, en PtdIns(3,4)P2 et en PtdIns(3,4,5)P3. Les isoformes des PI 3-kinases sont réparties en trois classes principales selon leur spécificité de substrat in vitro, leur structure, ainsi que leur mécanisme de régulation (Vanhaesebroeck et al. 1997) :
Les PI 3-kinases de classe I sont des hétérodimères constitués d’une sous-unité catalytique de 110 à 130 kDa et d’une sous-unité régulatrice de 50 à 100 kDa. Elles sont divisées en deux sous-classes (IA et IB) selon le type de protéines régulatrices associées à la sous-unité catalytique (p85a et P, p55y pour IA et plOl pour IB). In vitro, elles phosphorylent en position 3 le noyau inositol du Ptdins, du PtdIns(4)P et du PtdIns(4,5)P2. Cependant, in vivo, leur substrat préféré semble être le PtdIns(4,5)P2 (Stephens et al. 1991; Hawkins et al. 1992).
Les PI 3-kinases de classe II sont des protéines de 170 à 210 kDa qui phosphorylent in vitro le Ptdins et le PtdIns(4)P. Elles sont caractérisées par la présence d’un domaine C2 qui leur permet de lier des lipides (Domin et al. 1997; MacDougall et al. 1995).
Les PI 3-kinases de classe III phosphorylent uniquement le Ptdins. Les seules enzymes connues de ce groupe sont la protéine vps34 (yacuolar protein sorting 34) de la levure
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Introduction
et son homologue humain h-vps34 (human-vps34) (Herman & Emr 1990; Volinia et al.
1995).
Le PtdIns(3,4,5)P3 est un second messager important pour l’activation de nombreuses voies de signalisation cellulaire. Sa concentration est finement régulée tant par des kinases que par des phosphatases (Rameh & Cantley 1999). La voie majeure de synthèse du PtdIns(3,4,5)P3 en réponse à des signaux extracellulaires est la phosphorylation du PtdIns(4,5)P2 par les PI 3-kinases de classe I. Une deuxième voie de synthèse, décrite dans les plaquettes sanguines stimulées par la thrombine et dans des fibroblastes stimulés par le PDGF, impliquent in vitro et in vivo les PI 5-kinases a et P qui peuvent phosphoryler le PtdIns(3,4)P2 (Cunningham &
Majerus 1991; Zhang et al. 1997; Tolias et al. 1998).
De nombreuses protéines, se caractérisant par la présence d’un domaine PH (Pleckstrin homology), peuvent lier le PtdIns(3,4,5)P3. Les domaines PH sont des domaines d’environ 120 acides aminés qui lient notamment les phosphoinositides PtdIns(3,4,5)P3 et PtdIns(3,4)P2. De tels domaines ont été identifiés dans de nombreuses protéines jouant un rôle dans la transduction de signaux, dans le trafic vésiculaire ou associées au cytosquelette (Bottomley et al. 1998). C’est le cas des protéines PKB (protéine kinase B) et PDKl (3- phosphoinositide-dependent protein kinase-i) dont le domaine PH présente une forte affinité pour le PtdIns(3,4,5)P3. Celui-ci semble important pour leur localisation à la membrane plasmique et leur activation (Currie et al. 1999; Stephens et al. 1998; James et al. 1996b).
D’autre part, plusieurs phosphatases sont capables d’hydrolyser le Ptdlns(3,4,5)P3. C’est le cas des phosphatidylinositols polyphosphates 5-phosphatases SHIPl et SHIP2 qui hydrolysent le PtdIns(3,4,5)P3 en PtdIns(3,4)P2 (Drayer et al. 1996; Pesesse et al. 1998). La phosphoinositide et tyrosine phosphatase PTEN (phosphatase and tensin homologue) peut également hydrolyser le PtdIns(3,4,5)P3 en PtdIns(4,5)P2 (Maehama & Dixon 1998). PTEN est plus connue pour son rôle de suppresseur de tumeur et des mutations de cette protéine ont été observées chez des patients atteints de certains cancers. Ces patients ont, pour la plupart, leur activité tyrosine phosphatase de PTEN déficiente, mais dans certains cas, c’est son activité PtdIns(3,4,5)P3 phosphatase qui est déficiente (Fumari et al. 1998).
Le Ptdlns(3,4)P2 provient donc de la déphosphorylation du PtdIns(3,4,5)P3 par des phosphatidylinositols polyphosphates 5-phosphatases (Stephens et al. 1991; Hawkins et al.
1992). D’autre part, dans les plaquettes humaines, le PtdIns(3,4)P2 peut également provenir
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Introduction
de la phosphorylation du PtdIns(3)P par une PI 4-kinase ou de la phosphorylation du PtdIns(4)P par des PI 3-kinases de elasse I ou II (Banfic et al. 1998; Carter et al. 1994).
Certaines protéines à domaines PH telles que la PKB et la PKCÇ peuvent lier le PtdIns(3,4)P2. La PKB peut lier in vitro les phosphoinositides suivant l’ordre de préférenee:
PtdIns(3,4)P2> PtdIns(3,4,5)P3 »PtdIns(4,5)P2. Les phosphatidylinositols PtdIns(3,4,5)P3 et PtdIns(3,4)P2 servent plus particulièrement à recruter et localiser la PKB à la membrane plasmique où elle peut alors être activée, notamment, par phosphorylation (Downward 1998;
Franke et al. 1997; James et al. 1996b; Stephens et al. 1998). Le PtdIns(3,4)P2 peut également réguler l’activité de la PKCÇ (Toker et al. 1994).
3. Les inositols et phosphatidylinositols polyphosphates 5- phosphatases.
A. Généralités.
La production et la dégradation de ces seconds messagers dépendent donc de l’action de kinases et de phosphatases. Parmi ces phosphatases, les inositols et phosphatidylinositols polyphosphates 5-phosphatases enlèvent sélectivement le phosphate en position 5 du cycle inositol.
Dans les cellules de mammifères, cette famille d’enzymes comprend une série de gènes distincts et de variants d’épissage différents. Des protéines homologues ont été identifiées dans d’autres organismes comme Saccharomyces cerevisiae ou Caenorhabditis elegans. Les inositols et phosphatidylinositols polyphosphates 5-phosphatases peuvent être classées en différents types selon leur spécificité de substrats. Elles peuvent utiliser comme substrat les inositols polyphosphates solubles telles que l’lns(l,4,5)P3 et/ou l’Ins(l,3,4,5)P4 et/ou les phosphoinositides membranaires telles que le PtdIns(4,5)P2 et/ou le Ptdlns(3,4,5)P3. Les membres de la famille des 5-phosphatases contiennent un domaine catalytique 5- phosphatase d’environ 300 acides aminés dans leur partie centrale. Dans cette région, deux séquences GDL/FNF/YR et PA/SW/YC/TDRI/VL/I hautement conservées sont nécessaires à l’activité enzymatique de la protéine. En plus de ce domaine, elles contiennent des modules protéiques variés (domaine SH2, séquence riche en prolines, site de prénylation,...) probablement responsables de la localisation cellulaire spécifique des enzymes, de leur association avec d’autres protéines et de leur régulation.
10
Structure Substrats 5-phosphatases
5-phosphatase de type I INPP5P
OCRL
Synaptojanine SHIPl
SHIP2 PIPP SKIP
InsPj, InsP4
I
L J I I I I
InsPj, InsP4
PtdIns(4,5)P2, PtdIns(3,4,5)P3
InsP4 PtdIns(3,4,5)P3
^ PtdIns(3,4,5)P3 InsP3, InsP4 PtdIns(4,5)P2
1—1 1
Domaine Domaine Site
SH2 SACl NPXY
Domaine catalytique
Région riche Site de Domaine en prolines prénylation SAM
Figure 5: Famille des inositols etphosphatidylinositols polyphosphates 5-phosphatases.
La famille des inositols et phosphatidylinositols polyphosphates 5-phosphatases comprend différentes enzymes dont l’InsP3 5-phosphatase de type I (5-phosphatase de type I), l’inositol polyphosphate 5-phosphatase II (INPP5P), OCRL (Oculoçerebrorenal Lowe syndrome), SHIPl et SHIP2 (SH2 domain containing inositol 5-phosphatase 1 et 2), PIPP (Proline-rich Inositol Polyphosphate 5-Phosphatase ou IP5Pase) et SKIP (Skeletal muscle and Kidney enriched Inositol Phosphatase). (Figure issue de Erneux et ai, 1998;et adaptée avec les données de Mochizuki et ai, 1999; Ijuin et al, 2000).
Introduction
Cette famille (Figure 5) comprend différents membres dont fait partie l’InsPa 5-phosphatase de type 1 et les 5-phosphatases de type II, décrites dans ce chapitre. D’autres phosphatidylinositols polyphosphates 5-phosphatases telles que PIPP (Proline-rich Inositol Polyphosphate 5-Phosphatase ou IPSPase) et SKIP (Skeletal muscle and Kidney enriched Inositol Phosphatase), moins bien caractérisées, ont été récemment identifiées (Mochizuki &
Takenawa 1999; Ijuin et al. 2000).
B. L’InsPj 5-phosphatase de type I.
a) Clonage et activité de l’InsPa 5-phosphatase de type I.
Les ADNc des InsPa 5-phosphatases de type I humain et de chien ont été clonés au sein du groupe de C. Emeux et codent pour des protéines de 412 acides aminés (De Smedt et al.
1994; Verjans eta/. 1994; Laxminarayan et a/. 1994).
L’InsPa 5-phosphatase de type I peut hydrolyser l’Ins(l,4,5)Pa et l’Ins(l,3,4,5)P4, respectivement, en Ins(l,4)P2et Ins(l,3,4)Pa (Connolly et al. 1987). L’activité Ins(l,4,5)Pa et Ins(l,3,4,5)P4 5-phosphatase de cette enzyme a été initialement décrite dans les membranes d’érythroc5ttes humains (Downes et al. 1982). Par la suite, cette même activité a été identifiée dans des cellules eucaryotes (COS-7, astrocytes) surexprimant l’InsPa 5- phosphatase de type I et au niveau de l’enzyme purifiée en système bactérien (Commimi et al. 2001; Veijans et al. 1994; Emeux et al. 1995).
L’activité de l’InsPa 5-phosphatase de type I est régulée par plusieurs mécanismes :
l’interaction directe de l’enzyme avec d’autres protéines. Dans les plaquettes humaines, la plekstrine et la 14-3-3 Ç peuvent former, toutes les deux, un complexe avec l’InsPs 5-phosphatase de type I et augmenter son activité catalytique d’un facteur 2 et 4 respectivement (Auethavekiat et al. 1997; Campbell et al. 1997).
la phosphorylation de l’InsPs 5-phosphatase de type I par la Ca^’^/calmoduline kinase IL Celle-ci induit une inhibition d’environ 70 % de l’activité Ins(l,4,5)P3 et Ins(l,3,4,5)P4 5-phosphatase dans des lignées cellulaires d’astrocytes de rats stimulés au carbachol (Commun! et al. 2001).
le ciblage membranaire de l’enzyme par isoprénylation de celle-ci. L’activité spécifique de l’enzyme particulaire isoprénylée est 6 fois plus faible que celle de la forme soluble non isoprénylée (De Smedt et al. 1996). Ce changement suggère une régulation au niveau de la membrane, soit par modification conformationnelle de
II
Types d’isoprényltransférase Motifs reconnus Exemples de protéines substrats
Farnésyltransférase CAAX (X= M, G ,Q, T, Ras, s.U. a de GMPc PDE
H, D, S, A ou C)
Géranylgéranyltransférase CAAL RhoB, s.u. P de la GMPc PDE
de type I
Géranylgéranyltransférase XXCC, XCXC, CCXX Rabl, Rab3, Rab5
de type II (X= aa quelconque)
cxxx Rab8
Figure 6: Motifs de reconnaissance des isoprényltransférases.
proloin substrate (pM)
Figure 7: Cinétiques de modification de la 5-phosphatase de type Ipar la protéine farnésyltransférase (Ftase).
Les expériences de prénylation in vitro sont réalisées en présence de 50 ng de Ftase, de 2 |iM de famésylpyrophosphate[H^] et de quantités différentes de 0 à 20 |iM de 5-phosphatase de type I recombinante (■), Ha-Ras-CVLS (•), ou de Ha-Ras-CVLL (contrôle négatif)(T). Les réactions sont ensuite déposées sur filtres et la quantité de pmoles de F[H^] transférées au niveau des protéines substrats est déterminée.
(Figure issue de De Smedt et al., 1996).
