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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Byl, B. (2004). Application de la technique ELISPOT à l'évaluation de réponses vaccinales (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.

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Université Libre de Bruxeiles

Faculté de Médecine

Laboratoire d’immunologie Expérimentale

ULB - Campus Erasme

Bibliothèque de Médecine - CP 607 Route de Lennick, 808 (Bât.E)

B- 1070 Bruxelles Tél.: 02/555.61.70

Application de la technique EUSPOT à l’évaluation de réponses vaccinales

Baudouin Byl

Promoteur : Professeur M. Goldman Co-promoteur : Professeur F. Mascart Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de

Docteur en Sciences Médicales

Année académique 2003-2004

ikomL

Université Libre de Bruxeiies

Faculté de Médecine

Laboratoire d’immunologie Expérimentale

Application de la technique ELISPOT à l’évaluation de réponses vaccinales

Baudouin Byl

Promoteur : Professeur M. Goldman Co-promoteur : Professeur F. Mascart Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de

Docteur en Sciences Médicales

Année académique 2003-2004

Nombreux sont celles et ceux qui m'ont accueilli et aidé, Nombreux sont celles et ceux qui m 'ont guidé, Nombreux sont celles et ceux qui m'ont soutenu, voire supporté, tout au long de ces travaux,

Qu 'elles et ils trouvent toutes et tous ici l'expression de ma gratitude.

Je tiens également à remercier les nombreux patients et volontaires qui y ont contribué.

Je dédie, modestement, cet ouvrage aux Maîtres qui m'ont initié à l'Art Médical et plus particulièrement dans le domaine des maladies infectieuses.

Baudouin Byl

Ces travaux ont bénéficié du soutien du Fond de la Recherche Scientifique Médicale Belge,

de la Fondation Erasme, de la Clinique des Maladies Infectieuses de l’Hôpital Erasme, de la

société OM-Pharma (Meyrin, Suisse) et d’un don de Roche Belgique.

Composition du Jury

Président

Pr Jacques Devière, Université Libre de Bruxelles

Secrétaire

Pr Michel Goldman, Université Libre de Bruxelles

Membres

Pr Nathan Clumeck, Université Libre de Bruxelles Pr Jean Content, Institut Pasteur de Bruxelles Pr Geert Leroux-Roels, Université de Gand

Pr Françoise Mascart, Université Libre de Bruxelles Pr Michel Moutschen, Université de Liège

Pr Jean-Paul Van Vooren, Université Libre de Bruxelles

Table des matières

Première partie : Dissertation de thèse e

Abréviations...7

1. INTRODUCTION... 10

1.1. Généralités sur la réponse immune... 10

1.1.1. immunité naturelie ou non spécifique... ...10

1.1.2. Le LPS... 13

1.1.3. Les cellules dendritiques... 16

1.1.4. Réponse spécifique et activation des lymphocytes T...24

1.1.5. Stimulation du lymphocyte B... 31

1.1.6. L’anatoxine tétanique... 31

1.1.7. Les superantigènes... 32

1.1.8. Les Heat Shock Proteins... 33

1.1.9. Anergie et apoptose... 33

1.1.10. Réponse de type 1 et de type 2... 34

1.2. Modulation de la réponse lymphocytaire... 41

1.3. Réponse vaccinale, immunomodulation pharmacologique et adjuvants... 45

1.3.1. Les différentes catégories de vaccins... 45

1.3.2. Immunomodulation en vaccinologie - les adjuvants... 47

1.3.3. Adjuvants immunostimulateurs... 49

1.3.4. Adjuvants particulaires et copolymères... 51

1.4. Réponse vaccinale à l’administration par voie muqueuse et modulation de l’immunité muqueuse... 51

2. OBJECTIFS DU TRAVAIL ... 55

3. MATERIEL ET METHODES ... 56

3.1. Analyse de la production de cytokines à l’échelon cellulaire par ELISPOT...56

3.2. Mise au point de la technique d’ELISPOT appliquée à l’énumération des cellules productrices de cytokines... 58

3.2.1. Cinétique de la production de cytokines après stimulation in vitro... 58

3.2.2. Cinétique de l’apparition de cellules productrices de cytokines au cours d’une réponse

vaccinale... 59

4. RESULTATS ... 61

4.1. Analyse à l’échelon cellulaire de la réponse des cellules T spécifiques de l’anatoxine tétanique chez des patients infectés par le VIH...61

Données complémentaires : Production d’IFN-y et d’IL-4 en réponse à une stimulation polyclonale au cours de l’infection aiguë par le VIH... 62

4.2. L’extrait bactérien OM-85 BV induit une production d’IFN-y dépendante de l’IL-12 par les lymphocytes CD4+ chez l’homme... 64

4.3. Etude in vitro de l’effet adjuvant d’un analogue du Lipide A, l’OM-197...65

5. DISCUSSION... ⁶⁶

5.1. Introduction... 66

5.2. Suivi de la réponse immune... 69

5.3. Altérations de la réponse immune au cours de l’infection par le VIH... 70

5.3.1. Restauration de la fonction immune... 75

5.3.2. Approche vaccinale... 76

5.4. Cellules dendritiques et adjuvants vaccinaux... ... 80

5.5. Immunisation par voie muqueuse... 81

5.6. Agents mimétiques du Lipide A et adjuvants...83

6. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ... 87

7. LISTE DES FIGURES...88

8. REFERENCES ... 89

Deuxième partie : Thèse annexe ¹⁰³ 1. RÉSUMÉ... 104

2. RÉFÉRENCES... 105

Annexe : Curriculum vitae io6

Première Partie : Dissertation de thèse

Abréviations

APC Antigen presenting cells, cellules présentatrices d’antigènes CD Cellules dendritiques

CpG ODN Oligodeoxynucléotide contenant des motifs Cytosine-phosphate

CTL

Guanosine

Cytotoxic T lymphocytes

ELISPOT Enzyme-linked immunospot assay HLA Human leucocyte antigen

HSP Heat Shock Protein LPS Lipopolysaccharide

MHC Major histocompatibility complex NK Natural killer, cellules tueuses naturelles PAMP Pathogen-associated molecular pattern PBMC Peripheral blood mononuclear cells PHA Phytohémagglutinine A

PPR Pattern récognition receptor TLR Toll-like receptor

TNF-a Tumor-necrosis factor-a

Résumé

Le développement des stratégies vaccinales a été initialement essentiellement basé sur une approche empirique, et le monitoring de la réponse immime naturelle ou vaccinale a longtemps reposé uniquement sur la titration des anticorps, négligeant ainsi les aspects de la réponse cellulaire. Cette approche a néanmoins montré ses limites, soulignées par les difficultés à mettre au point des vaccins efficaces contre une série de micro-organismes infectieux tels que certains parasites, virus responsables d’infections chroniques ou micro­

organismes infectieux intracellulaires.

Notre objectif a été de développer l’analyse de la production de cytokines à l’échelon cellulaire afin de l’appliquer à la réponse immune au cours de l’infection par le VIH et à la caractérisation de l’effet d’adjuvants vaccinaux naturels et synthétiques.

La technique développée, l’ELISPOT (enzyme-linked immunospot), permet à la fois de caractériser le phénotype et d’énumérer le nombre de cellules produisant activement des cytokines en réponse à une stimulation antigénique.

A l’aide de cette technique, nous avons pu étudier la réponse immune à des antigènes bactériens et des mitogènes chez des volontaires sains et des patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) investigués à différents stades de l’infection [Byl et al.

1999]. Nous avons montré que la réponse lymphocytaire à un mitogène induisait une production comparable d’IFN-y parmi les patients infectés et les témoins, tandis que la production d’IL-4 induite par le mitogène était profondément diminuée. Nous avons montré que la source des deux cytokines différait et que seuls les lymphocytes CD4+ étaient capables de produire de l’IL-4 en réponse à un mitogène. Par contre, après l’administration in vivo d’anatoxine tétanique, il est apparu que la réponse lymphocytaire à une stimulation in vitro par cet agent était marquée par une diminution de la production des deux cytokines analysées, production limitée aux lymphocytes CD4+.

Nos travaux sur un extrait bactérien, l’OM-85 BV, utilisé comme agent immunostimulant,

nous ont conduits à démontrer que son effet sur la production d’IFN-y nécessitait la

présentation par des cellules présentatrices d’antigènes et requérait la présence d’IL-12 [Byl et

al. 1998]. Parmi les cellules présentatrices d’antigènes, les cellules dendritiques jouent un rôle

fondamental dans l’initiation de la réponse antigénique. Ces cellules voient leurs capacités

immunostimulatrices réduites dans de nombreuses circonstances où l’on peut mettre en

évidence une atteinte fonctionnelle du système immunitaire. Les molécules capables d’induire

la stimulation et la maturation des cellules dendritiques pourraient être amenées à jouer un rôle important dans la modulation de la réponse immune, et certaines d’entre-elles pourraient être utilisées dans des vaccins thérapeutiques ou préventifs. Nous avons dès lors étudié les propriétés immunomodulatrices d’un analogue synthétique du LPS, l’OM-197, dépourvu des propriétés endotoxigéniques de ce dernier [Byl et al. 2003b]. Ce produit est apparu capable d’induire la maturation des cellules dendritiques du sang circulant ou dérivées des monocytes circulants ainsi que la production d’EL-12. Nous avons montré que cette maturation était efficace pour induire une réponse primaire in vitro caractérisée par la génération de lymphocytes sécrétant de l’IFN-y spécifique à l’antigène HBs chez des sujets naïfs pour cet antigène. Le profil de la réponse générée in vitro à l’aide de l’OM-197 correspond au profil qui théoriquement pourrait induire une réponse immune cellulaire adéquate. En effet, de nombreuses études ont mis en évidence que l’efficacité de la réponse immune et l’élimination d’un agent infectieux pouvait dépendre du type de cytokines produites dans les phases initiales de l’infection. D’autre part, les infections pour lesquelles les approches vaccinales empiriques n’ont pas encore abouti (telles que l’infection par le VIH ou par Plasmodium, ou la vaccination thérapeutique vis-à-vis de maladies cancéreuses) partagent la caractéristique de devoir probablement nécessiter une réponse dite de type T helper 1 (Thl), caractérisée par la production d’Interféron-y (IFN-y) et de lymphocytes cytotoxiques.

En conclusion, l’application de la technique ELISPOT à l’analyse à l’échelon cellulaire de

la production de cytokines par les lymphocytes nous a permis de préciser l’anomalie

fonctionnelle des lymphocytes CD4+ de patients infectés par le VIH, de mettre en évidence la

capacité d’un extrait bactérien à induire la production de cytokines de type Thl via l’action de

cellules présentatrices d’antigènes et la production d’IL-12, et de démontrer la capacité d’un

analogue synthétique du LPS à induire la maturation des cellules dendritiques et une réponse

primaire in vitro. L’ensemble de ces données souligne l’intérêt de l’analyse à l’échelon

cellulaire de la production de cytokines et suggère l’intérêt que pourrait avoir l’utilisation de

l’OM-197 pour induire une modulation de la réponse immune et l’orientation spécifique de

celle-ci vers un profil apte à maîtriser une infection virale chronique ou la prolifération de

cellules tumorales. L’OM-197 pourrait être utilisé comme adjuvant vaccinal ou pour puiser

des cellules dendritiques.

1 . Introduction

1.1. Généralités sur la réponse immune

L’évolution de la défense des organismes vivants vis-à-vis d’une agression par un agent extérieur est caractérisée par le développement de deux axes complémentaires et intimement liés : l’immunité non spécifique et l’immunité spécifique.

1.1.1. Immunité naturelle ou non spécifique

Lorsqu’un organisme étranger efffacte les barrières cutanéo-muqueuses d’un individu, il initie en premier lieu des réponses immunes non spécifiques conduisant à la réaction inflammatoire.

Elles sont apparues les premières dans l’évolution des espèces. Elles impliquent des médiateurs moléculaires et cellulaires. Les composants cellulaires comprennent les leucocytes polynucléaires, les monocytes et macrophages, les cellules dendritiques, les cellules NK {natural killer) et les lymphocytes yô. Les insectes et les vertébrés partagent une famille de récepteurs cellulaires impliqués dans cette réponse non spécifique. Ces récepteurs sont connus chez l’homme sous le nom de Toll-like receptors (TLR), par analogie au récepteur identifié chez la drosophile qui porte le nom de Toll protein. Ils sont présents à la surface des polynucléaires neutrophiles et des cellules présentatrices d’antigènes et reconnaissent des structures moléculaires dérivées de micro-organismes, telles que le lipopolysaccharide (LPS) de la paroi des bactéries à Gram négatif, l’acide lipoteichoique de la paroi des bactéries à Gram positif ou les ADN et ARN bactériens.

Il est plus récemment apparu que ces TLR sont également capables de reconnaître des molécules endogènes et que, plus largement, ils auraient un rôle de surveillance consistant à détecter les produits de dégradation de certaines macromolécules endogènes telles que les protéoglycans [Johnson et al. 2003]. Ceci explique que des agents exogènes qui ne sont pas capables de stimuler directement les TLR induisent malgré tout une réponse inflammatoire.

Celle-ci prend alors son origine au niveau de ces produits de dégradation de macromolécules

endogènes.

Les récepteurs TLR initient une cascade d’événements intracellulaires qui conduisent à la transcription de gènes impliqués dans le processus de l’inflanamation. Le site d’atteinte initiale, qui le plus souvent sera épithélial, libère d’importantes quantités de cytokines inflammatoires telles que l’Interleukine-1 et le Tumor Necrosis Factor-a (TNF-a). Ces cytokines induisent, par action autocrine ou paracrine, plusieurs voies d’activation intracellulaires, dont celle du nuclear factor-KB (NF-icB). Cette dernière voie d’activation régule notamment l’expression de nombreux gènes liés à l’inflammation cutanée tels que les gènes de l’E-sélectine, diverses chemokines et molécules d’adhésion vasculaire.

Au cours de la réaction inflammatoire, les leucocytes sont recrutés par chimiotactisme vers le site de la réaction et activés. Les monocytes sanguins arrivés au site de l’infection, une fois activés, se transforment en cellules effectrices puissantes, les macrophages. Ceux-ci constituent le pont entre immunité naturelle et immunité spécifique. Dans le cadre de la réponse immune non spécifique, les macrophages vont phagocyter et détruire les micro­

organismes présents. Ils vont également produire d’importantes quantités de cytokines inflammatoires telles que l’fL-l, l’IL-ô, le TNF-a, et l’IL-12. Ces diverses cytokines vont stimuler les cellules NK qui représentent une source importante d’ILN-y. Les macrophages vont également jouer le rôle de cellules présentatrices d’antigènes aux lymphocytes et initier ainsi la réponse immune spécifique.

Le TNF-a est produit principalement par les cellules mononucléées (monocytes et macrophages) en réponse à une stimulation par des molécules d’origine microbienne telles que le LPS. Cette dernière molécule est d’ailleurs l’inducteur le plus puissant de TNF-a. Les propriétés pro-inflammatoires du TNF-a sont multiples et comprennent notamment l’augmentation de la perméabilité capillaire, la stimulation de l’activité phagocytaire des polynucléaires, la stimulation de l’activité pro-coagulante et la stimulation des centres de contrôle de la thermogenèse.

L’EL-12 est essentiellement produite par les cellules présentatrices d’antigènes telles que les

monocytes et les cellules dendritiques, mais aussi par les polynucléaires neutrophiles. L’EL-12

est une cytokine hétérodimère de 70 kD composée de 2 sous-unités liées de manière

covalente. Seul l’hétérodimère est actif Les deux composants sont régulés de façon

indépendante. Le monomère IL-12p40 est produit en large excès par rapport au dimère IL-

12p70. Il existe deux voies de production de l’IL-12 :

une voie indépendante des lymphocytes T : riL-12 est produite directement par les cellules phagocytaires et dendritiques en réponse à une stimulation par des produits bactériens, viraux, fongiques et parasitaires,

une voie dépendante des lymphocytes T : TEL-12 est produite par les cellules dendritiques et phagocytaires interagissant avec des lymphocytes activés via un signal de costimulation (le CD 40).

L’interleukine-12 joue un rôle charnière entre l’immunité spécifique et naturelle. Elle exerce un puissant effet sur les lymphocytes T et NK en induisant notamment la production de quantités importantes d’EFN-y. Par contre, le monomère p40 et la forme dimérique (p40)2 ont un effet antagoniste à celui de TEL-12 par blocage de la sous-unité pi du récepteur à TEL-12.

Un effet agoniste a cependant été observé chez des souris dépourvues d’EL-12p35 [Decken et al. 1998; Holscher e/a/ 2001].

D’autres cytokines partagent avec l’EL-12 le caractère hétérodimérique et la capacité à induire une production d’EFN-y ; riL-23 et l’EL-27 [Trinchieri 2003]. Ces cytokines composent la famille de TEL-12 et sont impliquées à différents stades de la réponse immune. L’EL-27 induit la prolifération clonale des lymphocytes CD4+ naïfs mais pas celle des lymphocytes mémoires. En cas d’infection, la nature de l’agent infectieux et la quantité présente induisent l’expression de profils variés d’interleukines de la famille de l’EL-12. Ceci explique pourquoi, chez un hôte spécifiquement déficient en une interleukine de la famille de riL-12, certains micro-organismes peuvent causer une infection chronique, alors que la réponse immune à d’autres micro-organismes est conservée [Brombacher et al. 2003].

Les lymphocytes NK participent à la réponse immune non spécifique. Doués de capacités cytotoxiques non spécifiques, ces lymphocytes n’expriment ni le TCR {T cell receptor spécifique des lymphocytes T), ni les immunoglobulines de surface spécifiques des lymphocytes B. Ils expriment irrégulièrement le CD16 et le CD56. Les lymphocytes NK sont activés par le contact avec des cellules dépourvues du complexe MHC de classe I autologue.

Avec les macrophages, ils constituent les composants cellulaires de la partie

phylogénétiquement la plus ancierme du système immunitaire, et jouent un rôle essentiel dans

la phase non spécifique de la réponse immune. Ils influencent également la réponse spécifique

des lymphocytes T, et, par le biais des interactions entre lymphoc}4es T et B, la réponse

humorale.

Les lymphocytes T yô représentent environ 10% de la population lymphocytaire. Ils se différencient des autres populations lymphocytaires T par la structure de leur TCR, composé des chaînes y et ô. Contrairement aux autres lymphocytes T porteurs du TCR ap, ils sont rapidement activés par les produits bactériens et sont capables, par la production secondaire d’IFN-y et de TNF-a, d’induire la production d’IL-12 par les cellules dendritiques et la stimulation consécutive des lymphocytes T. Une augmentation des lymphocytes Vy9Vô2 (qui représentent la population principale de lymphocytes yô chez l’homme) a été observée au cours d’infections telles que brucellose, ehrlichiose, listériose, salmonellose, tuberculose ou tularémie. Un certain nombre de composés naturels non peptidiques d’origine microbienne induisent l’expansion de cette sous-population lymphocytaire particulière [Eberl and Jomaa 2003].

Plus récemment, on a pu mettre en évidence une régulation de la production d’EFN-y des lymphocytes CD8+ indépendante de la production d’IL-12 ou des cellules NK dans un modèle murin d’infection par le LCMV {lymphocytic choriomeningitis virus) précédant de plusieurs jours l’expansion maximale de cette population CD8+ [Pien et al. 2002]. Cette voie d’activation apparaît directement dépendante de cytokines participant à la réponse non spécifique telles que l’IL-18 et les IFN-a et EFN-P, et illustre une autre voie de stimulation de la réponse spécifique au départ de la réponse immune non spécifique.

Parmi les cytokines faisant le lien entre immunité innée et acquise figurent en outre le GM- CSF, riL-15, l’IL-18, l’IL-1, et peut-être également TIL-2 (revu dans [Belardelli and Ferrantini 2002]). Citons encore pour mémoire l’effet des prostaglandines impliquées dans la réaction inflammatoire et qui agissent sur la maturation des cellules dendritiques [Morelli and Thomson 2003].

1.1.2. Le LPS

Le LPS ou lipopolysaccharide ou endotoxine est un composant glycolipidique présent dans la

membrane externe de toutes les bactéries à Gram négatif II est une des molécules clés dans le

déclenchement de la réponse inflammatoire. En particulier, certaines espèces bactériennes

possèdent un LPS extrêmement puissant à induire une coagulopathie ou un choc circulatoire.

La structure de tous les LPS adhère à un principe constant : un polysaccharide attaché à un composant lipidique appelé le Lipide A (figure 1). Le polysaccharide est composé d’un core et d’un polymère oligosaccharidique (l’antigène O) variable d’une espèce bactérienne à l’autre. La liaison entre le core polysaccharidique et le Lipide A se fait par l’intermédiaire d’un radical spécifique appelé l’acide 3deoxy-D-manno-2-octulosonique (KDO).

Le Lipide A est responsable de l’expression de cytokines induite par le LPS [Netea et al.

2002], Le LPS se lie au CD 14 (liaison facilitée par un couplage préalable à la LPS-binding protein ou LBP) et est présenté aux TLR. L’agrégation des CD14, TLR et d’autres protéines de surface conduit à la transmission du signal intracellulaire. Un effet lié à la dose peut être observé comme mis en évidence dans la relation entre la concentration sérique ou méningée de LPS de Neisseria meningitidis et les conséquences cliniques [Brandtzaeg et al. 2001].

Des expériences in vitro ont démontré une grande variation dans la capacité des LPS d’espèces bactériennes différentes d’induire la production de cytokines. Ainsi, le LPS de E.

coli, Salmonella sp., ou N. meningitidis est beaucoup plus puissant que le LPS de Rhodobacter sp.. Cette différence est liée notamment à la conformation tridimensionnelle du Lipide A. Cette conformation dépend de la longueur et de l’asymétrie des chaînes acylées et à la distribution des charges négatives (figure 2) [Seydel et al. 1993; Seydel et al 2003]. A l’état monomérique, le LPS stimule nettement moins efficacement les récepteurs qu’à l’état polymérique, mais c’est la structure monomérique qui induit la conformation supra- moléculaire des agrégats de LPS. La structure supra-moléculaire est lamellaire pour les formes cylindriques de LPS, et cubique ou hexagonale pour les formes coniques. Les Lipides A adoptant une conformation conique sont de puissants inducteurs de production de cytokines. Les Lipides A adoptant une conformation cylindrique ont un effet antagoniste sur les TLR par rapport aux formes coniques. Les cytokines produites en réponse au LPS dépendent ainsi de son origine. Par exemple, Porphyromonas gingivalis n’induit la production ni d’IL-12 p40 ni d’fFN-y mais induit par contre une production supérieure d’IL-5, EL-10 ou IL-13 à celle induite par le LPS d‘‘E. coli [Netea et al 2002]. Certains LPS (tels que celui de E. coli) stimulent préférentiellement TLR4, tandis que le LPS de Neisseria meningitidis stimule tant TLR4 que TLR2, et que d’autres LPS stimulent préférentiellement TLR2.

Il est utile de noter que certaines préparations purifiées de LPS sont sensiblement contaminées

par diverses lipoprotéines qui, agissant sur d’autres TLR que le LPS, peuvent potentiellement

Figure 1 : Représentation schématique de la structure du LPS

Lipide A Inner core Outer core Chaîne O-spécifique r ^--- s/--- ^

O phosphate 0 glucosamine O ^heptose

Le LPS comporte une partie lipidique, le lipide A, composé quasiment toujours de 2 glucosamines phosphatées portant un nombre variable de radicaux acylés, et auxquelles sont fixés Yinner core (comprenant le KDO), l'outer core, et la chaîne 0- spécifique constituée d'unités répétitives de 3 à 8 sucres. Ces trois dernières structures composent la partie polysaccharidique du LPS,

Figure 2 : Conformation spatiale du Lipide A

Le nombre de chaînes acylées du lipide A contribue à déterminer sa conformation spatiale en formes plus ou moins cylindriques (schéma extrait de [Netea et al 2002]).

LPS d’E. coff hexaacylé

LPS de P. glngivalls

Précurseur tétraacylé du LPS

■ r ■ Æ)

) ( k (

O**.

fo, ) N-Ü ) V l

■- H U

/ r-OH

perturber certains résultats sur lesquels sont basées les connaissances actuelles de l’affinité entre les TLR et les différentes molécules de LPS [Hellman et al. 2003].

1.1.3. Les cellules dendritiques

Les cellules dendritiques (CD) sont les seules capables de stimuler les lymphocytes T naïfs quand elles sont pulsées avec des antigènes peptidiques et sont donc les cellules initiatrices de la réponse immune spécifique. Les cellules dendritiques humaines représentent un ensemble hétérogène de cellules dérivées de deux lignées distinctes, de phénotypes, de localisations et de missions différentes [Steinman et al. 1997; Banchereau et al. 2000].

La première lignée est celle des CD myéloïdes descendantes de progéniteurs médullaires. Ces cellules portent le marqueur CDl le et se différencient en cellules dendritiques épithéliales, les cellules de Langerhans (CDla et non-épithéliales ou interstitielles (CDla Ces cellules portent des marqueurs de surface communs aux macrophages et granulocytes. Les cellules interstitielles et de Langerhans diffèrent notamment par :

une meilleure capacité des cellules interstitielles à capturer les antigènes, une meilleure activité lysosomiale des CD interstitielles,

une capacité limitée aux CD interstitielles de stimuler les lymphocytes B,

un profil de production de cytokines différent : alors que ces deux sous-populations produisent de riL-12, seules les cellules dendritiques interstitielles produisent de l’IL-lO et sont capables d’induire la maturation des lymphocytes B.

Une deuxième lignée comprend les CD plasmacytoides (CDl le négatives). Ces cellules produisent d’importantes quantités d’IFN-a en réponse à une stimulation par des antigènes viraux. Elles sont essentiellement localisées dans la médullaire des ganglions et pourraient avoir une fonction dans le phénomène de tolérance immune par sélection négative et élimination des lymphocytes CD4+ par apoptose via Pas / Fas-ligand [Suss and Shortman 1996; Steinman and Inaha 1999].

(1) Recrutement des cellules dendritiques

Les CD s’accumulent très rapidement au site où se dépose un antigène et sont parmi les premières cellules à coloniser le site d’une inflammation muqueuse [MeWilliam et al. 1994].

Cette aecumulation est le fruit du recrutement des précurseurs médullaires. Ceux-ci migrent

dans un premier temps vers les tissus périphériques. La migration vers les différents sites est

dirigée par l’expression de récepteurs aux chemokines tels que CCRl, CCR5 et CCR6 et par des molécules d’adhésion. Ces différents récepteurs sont exprimés de façon variable à la surface des différents types de CD et ont une affinité variable pour les ligands que sont notamment les différentes chémokines MIP, RANTES (Regulated on Activation, Normal T cell-Expressed and Secreted),...

(2) Capture des antigènes

Pour capturer les antigènes, les CD immatures utilisent la macropinocytose, l’endocytose via les C-type lectine receptors ou le récepteur Fcy de type I, la phagocytose de particules telles que des débris cellulaires résultant de nécrose ou apoptose, et également le couplage des peptides aux heat shock proteins (HSP) de la membrane cellulaire. La capture d’antigènes induit le phénomène d’activation et de maturation des CD.

(3) Activation des cellules dendritiques

Pour être aptes à présenter un antigène aux lymphocytes, les cellules dendritiques doivent être activées. Cette activation est induite par l’action de cytokines de la famille du TNF telles que le TNF-a, Fas ligand, CD40 ligand et TRANCE et par la stimulation des pattern-recognition receptors (PRR) par les composants d’origine microbienne appelés pathogen-associated molecular pattern (PAMP). La plupart des PRR récemment identifiés appartiennent à la famille des récepteurs Toll. Dix TLR sont actuellement identifiés. La partie extracellulaire de ces récepteurs, composée d’un domaine riche en résidus leucines, a pour ligand un ensemble de molécules d’origines variées parmi lesquelles: les lipopeptides et lipoprotéines des mycoplasmes, mycobactéries et spirochètes (TLR2) ; les lipoprotéines et peptidoglycans de la paroi des bactéries à Gram positif (TLR2) ; les ARN viraux (TLR3) ; les acides lipoteichoiques des bactéries à Gram positif et le LPS des bacilles et coques à Gram négatif (TLR4) ; FHSP60 d’origine endogène ou exogène (TLR4) ; les flagellines bactériennes (TLR5) ; ou les CpG ODN (TLR9) [Kaisho and Akira 2002]. Le CD 14, quand il est exprimé, comme à la surface des monocytes, facilite l’interaction entre le LPS et le récepteur TLR4 ou TLR2. Le TLR4 est de plus couplé à une autre molécule indispensable à la recormaissance de ses ligands, le MD-2. Les récepteurs TLR forment des homodimères au niveau de la membrane cellulaire. Le TLR2 possède la particularité de nécessiter une dimérisation avec un autre TLR (TLR6 et TLRl notamment) pour déclencher l’activation intracellulaire. Les TLR possèdent une partie intracellulaire (TIR pour Toll/interleukinl receptor homology domain).

Cette partie intracellulaire interagit avec le myeloid différentiation factor 88 (MyD88).

Figure 3 : Voies de signalisation des TLR

Illustration schématique des voies de signalisation des récepteurs TLR4, TLR9 et TLR2 et de leur stimulation par les différents PAMP (d’après [O'Neill 2002; Kaisho and Akira 2002; UnderhIII and Ozinsky 2002; Akira 2003]).

Ligands

LPS coniques HSP60

Taxol

;

ADN bactérien CpG ODN

TLR9 i

LPS cylindriques lipopeptides peptidoglycan

i

IFN-p IL-12p70 IL-ip , TNF

, IL-e

Maturation CD40, CD80, CD86

IL-8, IL-12p40

IL-13, IL-5, IL-10

L’activation des TLR induit une voie de stimulation commune conduisant, via le MyD88, IRAK {IL-1 receptor associated kinase) et NF- k B, à la production d’IL-1, d’IL-6 et de TNF- a. Cette voie d’activation est cruciale pour la production de cytokines en réponse à une stimulation par le LPS comme en témoigne l’abolition de cette réponse des macrophages déficients en MyD88. Cette déficience n’influence pas l’expression des molécules costimulatrices CD40, CD80 et CD86 à la surface de la CD. Le contrôle de cette expression semble emprunter une autre voie, celle du TIR domein-adaptingprotein / MyD88-adapter-like (TERAP / Mal) [Kaisho and Akira 2002], Il semble que Ton ne soit qu’au début de l’identification des TLR adapters et d’autres molécules apparaissent potentiellement impliquées dans la voie d’activation des TLR [O'Neill et al. 2003]. Le TLR4 induit en outre spécifiquement la production d’EL-12 p70, et, ainsi que le TLR3, peut induire Vinterferon regulated factor 3 (IRF-3), un facteur de transcription essentiel à la production d’IFN-p. Les ligands de TLR2 induisent plus spécifiquement la production d’BL-4 et d’IL-5, d’EL-12p40 et de moins de TNF-a, probablement par l’activation d’une autre voie impliquant notamment la PI3 kinase et Racl [Akira 2003] (figure 3).

Au-delà du signal généré par la stimulation spécifique de l’un ou l’autre TLR, il est probable qu’un degré supérieur de complexité est obtenu par différentes combinaisons de stimulations de récepteurs TLR distincts [Underhill and Ozinsky 2002; Lorenz et al. 2002; Jouault et al.

2003]. La régulation fine de la réponse immune tant dans son orientation vers un profil Thl ou Th2 que dans le contrôle de l’intensité de la réponse pourrait ainsi reposer principalement sur l’interaction entre les CD et les différents micro-organismes pathogènes (revu dans [Pulendran et al. 2001]). Cette régulation est d’ailleurs parfois détournée par le micro­

organisme infectieux. Ainsi, Plasmodium falciparum et le virus rougeoleux bloquent la maturation des CD, tandis que Schistosoma mansoni en bloque la migration.

Les CD expriment également une série de lectines qui comprennent un ou plusieurs carbohydrate récognition domain médiant la reconnaissance des carbohydrates autologues ou dérivant de structures pathogènes. Ces lectines interagissent avec les glycoprotéines du soi pour médier les réactions cellulaires telles que la différenciation et la migration des CD.

Après liaison aux antigènes, les lectines contribuent également à l’internalisation de ceux-ci

par le biais de leur région cytoplasmique qui régule l’endocytose. L’interaction entre lectines

et micro-organismes infectieux peut contribuer à la pathogénie de l’infection comme c’est le

cas dans l’infection par le VIH : celui-ci se lie spécifiquement à la lectine DC-SIGN {DC-

specifîc intercellular adhesion molecule-grabbing nonintegrin), et, non seulement, échappe à

la dégradation endosomiale mais de plus peut être de nouveau extemalisé et contribue à l’infection ultérieure d’un lymphocyte CD4+ [Geijtenbeek et al. 2000], De même, certains antigènes tumoraux expriment de multiples résidus carbohydrates et peuvent, par liaison simultanée à de nombreuses molécules de lectines, bloquer la dégradation de l’antigène et sa présentation [Engering et al. 2002],

(4) Migration et maturation des cellules dendritiques

L’activation des cellules dendritiques induit un ensemble de modifications dans l’expression de récepteurs de surface des CD, augmentant les capacités migratoires selon des profils différents en fonction du territoire concerné (localisation muqueuse, espaces interstitiels ou muscles et peau) (revu dans [Steinman and Pope 2002]). Durant leur migration vers les organes lymphoïdes secondaires, elles subissent des modifications phénotypiques et fonctionnelles reprises sous le nom de maturation. Ce processus conduit à l’augmentation de l’expression à la surface des molécules impliquées dans le recrutement et la costimulation des lymphocytes T (CD54, CD86), du CD83, des molécules MHC I et MHC H, de la production de cytokines (dont l’IL-12) et de diverses chemokines. On voit également une régulation négative de l’expression de certains récepteurs aux chémokines (CCRl et CCR5), tandis que d’autres voient leur expression augmenter (CCR7, CXC, CXCR4,...). A ce stade de maturation, les CD perdent leur capacité à phagocyter et processer des antigènes. Quand elles atteignent les zones T-dépendantes des organes lymphoïdes, les CD ont par contre acquis les capacités d’immunostimulation et de recrutement des lymphocytes T naïfs par présentation au niveau du MHC des épitopes antigéniques [Reis e Sousa et al 1997].

(5) Le complexe MHC

Le complexe MHC {major histocompatibility complex) est un ensemble de protéines membranaires dont le rôle consiste à présenter les antigènes aux lymphocytes. Les protéines constituant le MHC appartiennent à la superfamille des immunoglobulines. Deux structures différentes existent : le MHC de classe I et le MHC de classe E. Trois loci du chromosome 6 codent principalement pour le MHC de classe I (désignés HLA-A, -B, -C) tandis que 3 autres codent pour des protéines dites de classe I b. Les molécules de classe E principales sont les molécules HLA-DR, -DQ, et -DP.

Le nombre d’allèles pour chaque molécule est variable. La présence de deux allèles pour

chaque locus HLA contribue à la diversité de la réponse immune, et les populations

présentant un moindre polymorphisme dans les allèles HLA semblent présenter une relative

limitation de leux capacité à présenter des antigènes. De la même façon, l’absence de réponse à certains vaccins ou la rapidité de l’évolution de l’infection par le ’VIH sont corrélées au génotype des allèles MHC de l’individu [Carruth et al. 1999],

MHC de classe I

Le complexe de classe I est composé d’une chaîne lourde polymorphique liée de façon non covalente à une chaîne légère invariante : la p2 microglobuline. Les peptides présentés par le MHC de classe I sont généralement dérivés de protéines cytoplasmiques ou nucléaires, qui subissent une dégradation enzymatique par un complexe nommé le protéosome. Ils sont ensuite transportés au niveau du réticulum endoplasmique où ils sont couplés au dimère MHC de classe I. Le complexe formé est ensuite transporté via l’appareil de Golgi au niveau de la membrane cellulaire ou il est assemblé en tétramères.

Les molécules de classe I sont exprimées par toutes les cellules nucléées, à l’exception des cellules dérivées des crêtes neuronales et du tissu trophoblastique.

MHC de classe II

Le complexe de classe II est constitué d’un hétérodimère ap de glycoprotéines transmembranaires synthétisées au niveau du réticulum endoplasmique, couplé à un troisième constituant nommé la chaîne invariante, qui empêche la fixation de peptides endogènes dans la cavité formée par les domaines a et p. Ce complexe forme une structure polymérique exportée du réticulum endoplasmique vers l'appareil de Golgi et ensuite vers le compartiment lysosomial. A ce niveau, la chaîne invariante subit une dégradation progressive tandis que le complexe MHC acquiert la capacité de se lier à un peptide provenant de l’internalisation d’une protéine extracellulaire en cours de dégradation enzymatique à l’intérieur de la vésicule de pinocytose.

La transcription des gènes MHC de classe II, incluant celui de la chaîne invariante (li) est largement dépendante de l’expression de CIITA {class II trans activât or).

Les protéines MHC de classe El et le CIITA sont exprimés constitutivement par les cellules

thymiques épithéliales et les APC. Les cellules dendritiques et de Langerhans en présentent

les plus fortes densités, tandis que les macrophages et lymphocytes B matures présentent des

densités plus faibles.

Modulation de l’expression des molécules du MHC

L’expression des molécules du MHC est modulée par les cytokines. L’EFTSl-y stimule l’expression de molécules de classe II sur les APC, et peut également induire l’expression de molécules de classe II sur des cellules épithéliales, endothéliales, endocrines ou stromiques.

Par contre, l’induction des molécules de classe D peut être antagonisée par la présence de certains produits bactériens tels que le LPS, les prostaglandines ou les corticoïdes. Les molécules de classe I peuvent être induites par l’IFN-y, l’IFN-a, l’BFN-P et le TNF-a.

(6) Présentation des antigènes parles cellules dendritiques

Présentation via le MHC de classe I

La présentation de l’antigène via le MHC de classe I est nécessaire pour activer une réponse générant des lymphocytes CD8+ cytotoxiques (CTL). Deux voies de présentation sont connues. La voie endogène permet la présentation d’un antigène consécutive à l’infection de la CD. Après infection, la CD synthétise les protéines de l’agent infectieux. Ces protéines sont clivées au niveau du protéosome, et des fragments peptidiques sont transportés au niveau de l’appareil de Golgi où ils sont couplés au MHC de classe I qui est ensuite extériorisé, conduisant à l’expression des protéines virales à la surface de la cellule présentatrice. La voie exogène de la présentation via le MHC de classe I permet l’endocytose de protéines d’origine infectieuse, par exemple par le biais de leur couplage avec les HSP, qui sont ensuite clivées dans le cytoplasme et subissent le même transport vers l’appareil de Golgi [Wang et al. 2002].

Cette voie exogène permet aux CD de présenter des antigènes qui ne se répliquent pas (tels que par exemple les antigènes vaccinaux) aux CD8+. Elle permet également la présentation de fragments peptidiques internalisés par la CD alors qu’ils sont déjà intégrés dans des complexes immuns (via le FcyR), ou qu’ils sont présents à la surface de cellules nécrotiques.

Présentation via le MHC de classe II

La même séquence exogène que décrite ci-dessus via des récepteurs de la CD tels que le CD205, et l’endocytose vers le compartiment lysosomial induit la présentation du peptide couplé au MHC II et au CD86.

Présentation via le CDl

Les CD expriment diverses molécules de la famille du CDl en fonction notamment de leur

origine (ainsi, les cellules de Langerhans d’origine épidermique expriment le CD la, tandis

que les mêmes d’origine dermique expriment le CDlb).

Contrairement aux MHC de classe I auxquels les récepteurs CDl sont structurellement apparentés et aux MHC de classe H, les récepteurs CDl sont spécialisés dans la présentation de lipides et de glycolipides aux lymphocytes T.

Ç7) Différenciation des celiules dendritiques et tolérance

La production d’IL-12 et d’IL-4 lors de la réponse immune non spécifique et l’activation suivie de la maturation des cellules dendritiques constituent le processus qui finalement aboutit à la polarisation de la réponse immune en réponse de type 1 ou de type 2 tels que définis plus loin. La nature des composants d’origine microbienne va induire par le biais des TLR une polarisation de la réponse des CD. Ainsi, une stimulation par le LPS ou les CpG ODN induit des CD capables d’orienter les lymphocytes T vers une réponse de type Thl, on les appelle DCl, par opposition aux CD stimulées par des antigènes glycoprotéiques dérivés de nématodes ou de la toxine cholérique etc. qui orientent la CD vers un profil Th2 (DC2).

L’activation de CD qui sécrètent de l’IL-10 mais pas d’IL-12 {Tr-driving DC ou DCr) oriente les lymphocytes T naïfs vers un profil de lymphocytes T régulateurs (lymphocytes Tr).

En l’absence d’un signal de costimulation et en présence d’APC produisant de l’IL-lO, les lymphocytes induits sont également de type Tr. Les cellules dendritiques jouent par ce biais un rôle important dans le phénomène de tolérance en maintenant la tolérance périphérique quand elles sont stimulées par un antigène en l’absence de molécule adjuvante [Hawiger et al.

2001; Lutz and Schuler 2002].

Certains éléments suggèrent également que les CD immatures induisent des phénomènes de tolérance. Ainsi, des CD immatures pulsées avec un peptide du virus de l’influenza induisent une diminution de la réponse des lymphocytes CD8+ spécifiques de cet antigène produisant de l’IFN-y au profit des lymphocytes CD8+ producteurs d’IL-10 [Dhodapkar et al. 2001].

Il semble que ces différents types fonctionnels de CD soient le fruit d’une différenciation dépendant des antigènes présents plutôt que de lignées différentes.

(8) Génération de cellules dendritiques in vitro

Les CD peuvent être générées au départ de plusieurs types cellulaires et plusieurs cytokines peuvent être utilisées pour induire leur maturation (revu dans [Nestle et al. 2001]).

Les cellules mononucléées du sang périphérique cultivées en présence de GM-CSF et d’IL-4

génèrent des cellules dendritiques myéloïdes de phénotype immature ressemblant aux cellules

dendritiques interstitielles. Elles nécessitent une étape de maturation obtenue par divers

stimuli tels que le LPS pour exprimer ensuite les marqueurs de cellules matures capables de stimuler les lymphocytes.

Une autre source de CD repose sur l’expansion in vitro des précurseurs médullaires. Cultivés en présence de GM-CSF et de TNF-a, ces précurseurs mènent à une population composée des deux sous-types de cellules dendritiques : intersitielles et de Langerhans. De plus, ces cellules dendritiques ne requièrent pas de maturation ultérieure, dans la mesure où le TNF-a a déjà induit celle-ci. Enfin plus récemment des CD myéloïdes ont été générées à partir de monocytes humains cultivés en présence d’IL-3 et d’IFN-p.

1.1.4. Réponse spécifique et activation des lymphocytes T

Le développement d’une réponse inflammatoire non spécifique induit secondairement une réponse spécifique aux antigènes détectés. Cette réponse spécifique est le friait de la présentation des antigènes aux lymphocytes T et B. Les cellules présentatrices d’antigènes sont les cellules dendritiques, les monocytes et leurs dérivés activés que sont les macrophages, et, pour les antigènes polysaccharidiques uniquement, les lymphocytes B. En outre, les cellules infectées peuvent également présenter des épitopes antigéniques du micro­

organisme infectieux via le MHC de classe I.

(1) Structure du TCR

L’activation des lymphocytes T est une étape essentielle du développement d’une réponse immune spécifique. Seuls les lymphocytes qui expriment le TCR aP sont capables de générer une réponse immune spécifique après activation. Le TCR est associé à un complexe de faible poids moléculaire appelé CD3, lui-même composé de 5 chaînes polypeptidiques. Le TCR détermine la spécificité antigénique du lymphocyte, tandis que le CD3 est impliqué dans la transduction du signal délivré au niveau du TCR lors de la reconnaissance antigénique.

Le complexe TCR / CD3 est associé à un autre site, soit CD4 soit CD8, qui interagit respectivement avec les molécules MHC de classe II ou de classe I.

(2) Présentation de l’antigène aux lymphocytes et costimulation

Les antigènes accèdent directement aux organes lymphoïdes via les canaux afférents, à la rate

via le sang, et au MALT {mucosal associated lymphoid tissué) via les cellules M qui

transportent les antigènes au travers de l’épithélium des muqueuses, ou indirectement, par la

migration des cellules dendritiques. Celles-ci se localisent dans les aires T du tissu lymphoïde sous la forme de cellules dendritiques interdigitées.

La nature de la cellule présentatrice et le type d’antigène présenté détermineront le lymphocyte auquel le complexe MHC / antigène sera présenté:

• présentation à un lymphocyte cytotoxique (CD8+) via le complexe MHC de classe I,

• présentation à un lymphocyte T helper (CD4+) via le complexe MHC de classe n.

Cependant, on a pu également mettre en évidence des lymphocytes cytotoxiques de phénotype CD4-I- dans une série d’infections virales telles que l’infection à virus herpes zoster, la rougeole, l’hépatite B, et l’influenza [Kundu and Merigan 1992].

Le phénomène conduisant à la présentation de l’antigène est initié par des interactions non spécifiques entre différents récepteurs lymphocytaires et leurs correspondants au niveau des cellules présentatrices; ICAM et CD2 à la surface du lymphocyte d’une part, et récepteurs de la famille LFA {leucocyte-function-associated antigen) sur les APC d’autre part. Ces interactions non spécifiques stabilisent transitoirement l’adhésion entre APC et lymphocytes.

La recormaissance du complexe MHC-peptide par le TCR constitue le premier signal d’activation du lymphocyte et induit l’expression de CD40 ligand (CD40L ou CD154) à la surface du lymphocyte T. Le CD40L interagit ensuite avec le CD40, exprimé constitutivement par les APC et dont l’expression est notamment augmentée par le GM-CSF et riL-3, deux cytokines produites par les lymphocytes dont le TCR est engagé dans une interaction avec le MHC.

La voie d’activation CD40-CD40L représente un système clé dans la régulation de la présentation d’antigènes par les APC, l’activation des lymphocytes T, l’activation des macrophages, et l’extravasation des leucocytes par le biais de l’interaction avec l’endothélium vasculaire (revu par [Grewal et al. 1997]).

La liaison CD40-CD40L induit l’expression sur F APC de molécules stimulatrices B7-1 (CD80) et B7-2 (CD86), ligands de deux molécules présentes à la surface des lymphocytes T, le CD28 et le CTLA-4 (CD152). Stimulé par ces molécules, le CD28 délivre un co-signal, le deuxième signal d’activation du lymphocyte, qui entraîne l’activation complète de celui-ci.

L’interaction du CD28 du lymphocyte T avec le B7-1 de l’APC est indispensable, en

particulier pour la réponse immune primaire. L’absence de ce signal de costimulation entraîne

l’anergie du lymphocyte T. Les cellules dendritiques expriment constitutivement B7-1, tandis

que les monocytes et les lymphocytes B, T et NK doivent préalablement être activés pour

l’exprimer. L’interaction entre le CD40 et son ligand entraîne également au niveau de la

cellule présentatrice une stimulation de la production d’IL-la et IL-ip, IL-6, IL-8, IL-10, EL-

12, TNF-a, Mff-a, et une augmentation de l’expression des ICAM-1 (CD54), LFA-3 (CD58).

Par le biais de la stimulation des APC via l’interaction CD40-CD40L entre lymphocytes T CD4+ et APC s’exerce l’effet helper des CD4+ sur la stimulation des lymphocytes CD8+ : les APC engagés dans une interaction CD40-CD40L augmentent fortement leur capacité de présentation aux CD8+. A contrario, l’altération de cette interaction, comme démontré sur des souris déficientes en CD40-L, entraîne une diminution de l’induction des CD8+ mémoires impliqués dans la CTL [Borrow et al. 1996]. L’activation du TCR est également favorisée par la coaggrégation du complexe TCR-CD3 avec le CD4 ou le CD8, et l’interaction entre ces structures et le MHC. Enfin, il semble que le CD45 sous l’une ou l’autre de ses isoformes soit également indispensable à l’activation du TCR. L’activation du TCR conduit à la transmission d’un signal transmembranaire induisant l’augmentation de Ca^"^ intracellulaire, l’activation de la tyrosine kinase et de la protéine kinase C. Une cascade de réactions enzymatiques conduit ensuite à la transcription des composants nucléaires contribuant à Tactivation du gène de l’IL-2 et à l’induction de la prolifération cellulaire.

La stimulation adéquate des lymphocytes T et B par les monocytes implique im contact cellulaire entre ces différentes cellules et un effet paracrine des différentes cytokines.

L’activation des lymphocytes T par des antigènes dits de rappel tels que l’anatoxine tétanique se fait essentiellement par la voie des molécules présentatrices de classe II et des lymphocytes CD4+. D’autres antigènes parmi lesquels les allo-antigènes HLA sont capables d’induire une activation des lymphocytes CD4+ par le biais soit d’auto-APC ou d’allo-APC, mais également une activation des lymphocytes CD8+ après présentation par des allo-APC [Via et al. 1990].

Au cours d’une stimulation immunitaire, en plus de la réponse spécifique à l’antigène présenté, on peut mettre en évidence une activation lymphocytaire non spécifique. C’est notamment le cas au cours de diverses infections virales [Tough and Sprent 1996]. Cette stimulation résulte de l’action des cytokines induites, et notamment parmi celles-ci des IFN de type 1 (a et P), et ne nécessite aucune activation du TCR .

Le CD80 et le CD86 se lient également au CTLA-4, récepteur dont la présence à la surface du

lymphocyte T est induite dans la phase tardive de l’activation (environ 48 heures). Il en

résulte ime régulation négative [Lenschow et al. 1996],

{3} Réponse primaire

La réponse primaire, résultant d’une première exposition à un antigène, implique des lymphocytes T qui n’ont jamais été activés au travers de leur TCR. Lors de l’activation cellulaire et la prolifération, les cellules naïves produisent essentiellement de riL-2, mais elles enclenchent la différenciation qui leur permettra plus tard de produire d’autres cytokines après restimulation antigénique [Ehlers and Smith 1991; Picker et al. 1995].

Après activation par la cellule présentatrice, les lymphocytes expriment désormais les marqueurs d’activation et de différenciation en cellules effectrices ou mémoires [Esser et al.

2003]. Ils expriment également des marqueurs les différenciant en fonction de la zone épithéliale correspondant au ganglion où ils ont été activés. Les cellules provenant du tractus gastro-intestinal portent notanunent le marqueur de l’intégrine a4p7, tandis que les cellules provenant de l’épithélium cutané portent le marqueur CLA (cutaneous lymphocyte antigen).

Après immimisation ou exposition à un agent infectieux, la première phase de la réponse est caractérisée par l’expansion considérable de la population lymphocytaire spécifique de l’antigène. Au niveau des lymphocytes CD8+, il semble exister une certaine proportionnalité entre la charge antigénique et la proportion de cellules spécifiques de cet antigène induites.

Généralement, l’infection naturelle induit une réponse de plus grande amplitude que celle induite par une immunisation vaccinale. Très rapidement, une seconde phase va conduire à l’apoptose la toute grande majorité des cellules activées, tandis que certains lymphocytes vont évoluer au cours d’une troisième phase en lymphocytes mémoires CD4-I- et CD8-I-.

L’amplitude de cette phase « mémoire » est généralement déterminée par celle de la phase d’expansion initiale. L’expression du récepteur aux chémokines CCR7 et du CD62L permet de différencier parmi les lymphocytes mémoires deux sous-populations : l’une exprime le CCR7 et le CD62L et n’a pas de capacité effectrice immédiate {central memory T cells - Tcm) (prédominant dans le tissu lymphoïde) tandis que l’autre sous-population, qui n’exprime pas ces récepteurs, est pourvue d’une capacité effectrice immédiate {effector memory T cells - Tem) et prédomine dans les tissus périphériques [Sallusto et al. 1999]. Le maintien de lymphocytes mémoires tant CD8-H que CD4+ nécessite la présence de cytokines, en particulier pour les lymphocytes CD8+. L’IL-15 joue un rôle important dans celte fonction.

En outre, le maintien d’une CTL par le biais de lymphocytes mémoires nécessite également la

présence de lymphocytes CD4+ helper, ce qui est illustré par la perte de la réponse des

lymphocytes CD8+ en cas de déplétion en lymphocytes CD4+ dans plusieurs modèles

d’infection ou au décours de l’infection par le VIH [Shedlock and Shen 2003; Sun and Bevan 2003]. Les lymphocytes mémoires représentent environ 40% des lymphocytes CD4+ circulant chez l’homme. Les mécanismes de régulation des populations de lymphocytes CD4+ et CD8+

semblent différents et conduisent à une diminution plus précoce des lymphocytes CD4+.

Cette différence justifie l’importance des rappels dans le maintien d’une réponse des lymphocytes CD4+, elle-même indispensable au maintien de la CTL.

Un ensemble de données expérimentales suggère que les sous-populations Tcm et Tem ne sont pas indépendantes l’une de l’autre et qu’une différenciation de Ton en Tem est possible au niveau des lymphocytes CD4+ et CD8+. La différenciation en l’une ou l’autre des sous- populations peut être modulée en fonction des cytokines présentes. Il semble que la balance entre ces deux sous-populations dépende également de la quantité d’antigènes présente et qu’elle pourrait se déterminer très tôt dans les premiers jours de l’infection, peut-être selon une évolution linéaire des cellules effectrices d’abord vers les lymphocytes Tem et ensuite Ton. Les conséquences que pourrait avoir la persistance de l’antigène sur cette balance sont actuellement inconnues.

(4) Réponse secondaire ou de rappel

Le phénotype du lymphocyte mémoire reste modifié par rapport au lymphocyte naïf II conserve une taille supérieure, un contenu plus riche en ARN, et exprime plus de récepteurs impliqués dans l’adhésion aux APC ou à l’endothélium vasculaire. Des différences fonctionnelles importantes existent entre les lymphocytes naïfs et les lymphocytes mémoires lors de leur activation. Les lymphocytes mémoires sont doués d’une plus grande capacité à proliférer de façon spécifique, à répondre à des stimuli chémotactiques, à migrer et adhérer aux endothéliums vasculaires. Par contre, ils prolifèrent moins bien en réponse à des mitogènes. Leur production de cytokines n’est pas non plus la même. On note en particulier une production d’IL-2 moindre, et une plus grande production d’IL-4 et peut-être d’IFN-y [Picker et al 1995]. L’acquisition d’altérations permanentes dans l’expression d’adhésines semble être responsable de l’orientation vers un circuit de circulation différent de celui des cellules naïves. En réponse à une activation, une synergie se développe entre les lymphocytes naïfs et les lymphocytes mémoires, chacun des deux phénotypes induisant l’amplification de la réponse de l’autre population via les cytokines produites [Akbar et al. 1991].

La persistance de la mémoire immunitaire fait actuellement l’objet de beaucoup

d’interrogations. Si la persistance de l’antigène n’apparaît pas indispensable pour le maintien

d’une réponse humorale, plusieurs éléments suggèrent que, par contre, le maintien d’une

réponse Thl par des lymphocytes CD8+ nécessite la persistance de l’antigène, et la présence continue d’IL-12 pourrait également être requise [Seder and Hill 2000],

A ce titre, il est intéressant de noter que si l’on a cra que des réponses cellulaires pouvaient persister à vie malgré l’élimination présumée définitive de l’antigène et que l’on citait volontiers l’exemple de la rougeole, du génome rougeoleux a été identifié par PCR chez des patients âgés, signant une persistance à bas bmit de l’antigène [Katayama et al. 1995].

(5) La réponse immune cellulaire

La réponse immune cellulaire comporte la participation des lymphocytes T helper et des lymphocytes cytotoxiques (CTL), essentiellement de phénotype CD8+. L’activation des lymphocytes CD8+ requiert, dans la plupart des cas, l’interaction de trois types cellulaires distincts ; les lymphocytes CD4+, les lymphocytes CD8+ et les APC. L’aide apportée par les lymphocytes CD4+ l’est en fait par l’intermédiaire de l’activation des APC. L’engagement du CD40L à la surface du lymphocyte CD4+ activé avec le CD40 présent sur l’APC augmente fortement la capacité de présentation des antigènes par les APC et la costimulation permettant l’activation des lymphocytes CD8+. Cet engagement séquentiel permet ainsi au départ de l’activation de quelques lymphocytes CD4+ d’activer un grand nombre de lymphocytes CD8+. Les lymphocytes CTL utilisent essentiellement deux mécanismes : l’exocytose de granules de perforine et de granzyme, et le mécanisme d’apoptose par la voie de Pas / FasL.

En plus de leur action cytotoxique, les lymphocytes cytotoxiques produisent de grandes quantités de cytokines telles que l’rPN-y et le TNF-a. La qualité de la réponse cytotoxique dépend de l’avidité du lymphocyte pour l’antigène cible, mais au-delà de l’avidité du TCR, l’avidité fonctionnelle du lymphocyte peut varier au cours de l’infection suite à une variation de l’efficience de la transduction du signal d’activation au départ du TCR [Berzofsky et al.

2001 ].

(6) Les lymphocytes T régulateurs

Plusieurs catégories de lymphocytes T régulateurs possédant des caractéristiques phénotypiques et des modes d’action distincts ont été identifiées [McGuirk and Mills 2002;

Mittrucker and Kaufinann 2004].

On distingue :

• Les lymphocytes Tri, lymphocytes CD4+ caractérisés par un profil de production de

cytokines distinct des profils Thl et Th2 car produisant de l’IL-lO, de l’IL-5 mais ni IL-4,

ni TGF-p. Leur caractère régulateur semble médié par la production d’BL-lO.

• Les lymphocytes Th3, lymphocytes CD4+ dont l’action est médiée par le TGF-p.

• Les lymphocytes CD4+CD25+. Leur effet régulateur semble dépendre à la fois de la production de cytokines régulatrices (parmi lesquelles l’lL-10 et le TGF-P), et également de contacts cellulaires, notamment probablement par le biais du CTLA-4 {cytotoxic T- lymphocyte antigen 4). Le même épitope peut d’ailleurs induire en parallèle une réponse de type helper et une réponse de type « régulation » caractérisée par une production d’IL- 10 en l’absence d’IL-4 comme décrit dans l’infection chronique à HCV [MacDonald et al.

2002 ],

Chez la souris, la sous-population lymphocytaire CD4+CD25+ provient essentiellement du thymus mais des études réalisées chez la souris thymectomisée suggèrent une possible différenciation en lymphocytes régulateurs au niveau des tissus périphériques.

La différenciation en lymphocytes régulateurs semble être le fruit de l’activation par un sous- type spécifique de cellules dendritiques. Les lymphocytes régulateurs présentent différents profils d’expression de récepteurs aux chemokines (de la famille CCR). Ces récepteurs jouent un rôle important dans la régulation de la fonction suppressive et la relation entre lymphocytes régulateurs et APC. En particulier, les lymphocytes CD25+ expriment en abondance le CCR4 dont un ligand est abondamment produit par les CD myéloïdes mais pas par les CD plasmacytoïdes. Cette collaboration facilitée avec les CD myéloïdes, impliquées dans la capture d’antigènes du soi vers les ganglions lymphatiques, pourrait contribuer au mécanisme de la tolérance [D'Ambrosio et al. 2003].

Les lymphocytes régulateurs jouent un rôle important dans le contrôle de la réponse immune notamment par le biais de la production d’IL-10 et de TGF-(3. Il est intéressant de noter que de nombreux micro-organismes infectieux, parmi lesquels de nombreux agents d’infections chroniques, modulent la production de ces deux cytokines, avec en plus parfois une dérégulation de la production d’LL-12, ou possèdent des homologues de l’IL-10 (revu dans [McGuirk and Mills 2002]).

Des lymphocytes T régulateurs spécifiques de Bordetella pertussis ont été mis récemment en

évidence. La FHA {filamentous hemagglutinin A) de cette bactérie induit une augmentation de

la production d’IL-10 et une réduction de celle d’IL-12 par les cellules dendritiques, dont la

résultante est l’expansion d’une sous-population de lymphocytes régulateurs de phénotype

CD4+ CD25+. Ceci est le premier exemple d’une stratégie des micro-organismes favorisant

spécifiquement la réponse suppressive au site de l’infection [McGuirk et al. 2002].