Disponible à / Available at permalink :

- - -

- - -

Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Najdovski, T. (1990). Dégradation des peptides de la famille cholécystokinine-gastrine: caractérisation du clivage par l'endopeptidase 24.11 (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/213155/1/8ba074e2-d0e9-4b01-b3cf-306cca8c4dbf.txt

(English version below)

Cette thèse de doctorat a été numérisée par l’Université libre de Bruxelles. L’auteur qui s’opposerait à sa mise en ligne dans DI-fusion est invité à prendre contact avec l’Université (di-fusion@ulb.be).

Dans le cas où une version électronique native de la thèse existe, l’Université ne peut garantir que la présente version numérisée soit identique à la version électronique native, ni qu’elle soit la version officielle définitive de la thèse.

DI-fusion, le Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles, recueille la production scientifique de l’Université, mise à disposition en libre accès autant que possible. Les œuvres accessibles dans DI-fusion sont protégées par la législation belge relative aux droits d'auteur et aux droits voisins. Toute personne peut, sans avoir à demander l’autorisation de l’auteur ou de l’ayant-droit, à des fins d’usage privé ou à des fins d’illustration de l’enseignement ou de recherche scientifique, dans la mesure justifiée par le but non lucratif poursuivi, lire, télécharger ou reproduire sur papier ou sur tout autre support, les articles ou des fragments d’autres œuvres, disponibles dans DI-fusion, pour autant que :

Le nom des auteurs, le titre et la référence bibliographique complète soient cités;

L’identifiant unique attribué aux métadonnées dans DI-fusion (permalink) soit indiqué;

Le contenu ne soit pas modifié.

L’œuvre ne peut être stockée dans une autre base de données dans le but d’y donner accès ; l’identifiant unique (permalink) indiqué ci-dessus doit toujours être utilisé pour donner accès à l’œuvre. Toute autre utilisation non mentionnée ci-dessus nécessite l’autorisation de l’auteur de l’œuvre ou de l’ayant droit.

--- English Version ---

This Ph.D. thesis has been digitized by Université libre de Bruxelles. The author who would disagree on its online availability in DI-fusion is invited to contact the University (di-fusion@ulb.be).

If a native electronic version of the thesis exists, the University can guarantee neither that the present digitized version is identical to the native electronic version, nor that it is the definitive official version of the thesis.

DI-fusion is the Institutional Repository of Université libre de Bruxelles; it collects the research output of the University, available on open access as much as possible. The works included in DI-fusion are protected by the Belgian legislation relating to authors’ rights and neighbouring rights.

Any user may, without prior permission from the authors or copyright owners, for private usage or for educational or scientific research purposes, to the extent justified by the non-profit activity, read, download or reproduce on paper or on any other media, the articles or fragments of other works, available in DI-fusion, provided:

The authors, title and full bibliographic details are credited in any copy;

The unique identifier (permalink) for the original metadata page in DI-fusion is indicated;

The content is not changed in any way.

It is not permitted to store the work in another database in order to provide access to it; the unique identifier (permalink) indicated above must always be used to provide access to the work. Any other use not mentioned above requires the authors’ or copyright owners’ permission.

D Al-(>k

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DES SCIENCES

Laboratoire Pluridisciplinaire de Recherche Expérimentale Biomédicale

Directeur du Mémoire : M. Deschodt-Lanckman Promoteur du Mémoire : J.E. Dumont

DEGRADATION DES PEPTIDES DE LA FAMILLE CHOLECYSTOKININE-GASTRINE :

CARACTERISATION DU CLIVAGE PAR L’ENDOPEPTIDASE 24.11

Mémoire présenté en vue

de l'obtention du Grade légal de Docteur en Sciences Chimiques

Tome MAJDOVSKI

Laboratoire Pluridisciplinaire de Recherche Expérimentale Biomédicale

Directeur du Mémoire ; M. Deschodt-Lanckman Promoteur du Mémoire : J.E. Dumont

DEGRADATION DES PEPTIDES DE LA FAMILLE CHOLECYSTOKININE-GASTRINE :

CARACTERISATION DU CLIVAGE PAR L'ENDOPEPTIDASE 24.11

Mémoire présenté en vue

de l'obtention du Grade légal de Docteur en Sciences Chimiques

Tome NAJDOVSKI

1990

A mes parents, à mon épouse, à Kristina, à Nicolas, à toi qui viens et que j’aime déjà.

Ce travail a pu être mené à bien grâce au concours financier de

l’Institut pour l’Encouragement de la Recherche Scientifique

dans l’Industrie et l’Agriculture (I.R.S.I.A.), et grâce à une

bourse de la Fondation Belge de la Vocation.

Je pense aussi à Madame M. DESCHODT-LANCKMAN qui a mis toute sa compétence scientifique en oeuvre pour guider et soutenir mon travail.

Je pense au Professeur J.E. DUMONT qui a accepté la responsabilité de ce mémoire et qui a mis à notre disposition une partie de l’infrastructure de son laboratoire.

Je pense au Docteur S. PAUWELS, des Cliniques Universitaires St Luc, avec lequel nous avons étroitement collaboré pour une bonne part de notre travail.

Je remercie le Docteur P. KINNAERT, du Service de Néphrologie de l’Hôpital Erasme, qui nous a fourni les reins humains qui ont constitué le matériel de départ pour la purification de l’endopeptidase 24.11. A ses proches collaboratrices au sein du L.P.R.E.B., Madame N.

VANGEERTRUYDEN et Mademoiselle B. BOURNONVILLE pour le matériel si souvent partagé.

Je remercie le Docteur M. GOLDMAN et tous les membres de son unité de recherche pour les échanges constructifs que nous avons eus.

Je voudrais remercier Monsieur C. ERNEUX pour l’accueil qu’il a réservé à nos nombreuses sollicitations et pour le savoir-faire dont il nous a généralement fait profiter.

Je voudrais également remercier Madame C. CAPIAU, de Smith-Kline-Beecham, et Monsieur A. MICHEL, du Service de Chimie Biologique de l’Université de Mons-Hainaut, pour la compréhension témoignée et les encouragements prodigués durant la rédaction de ce mémoire.

J’adresse toute ma gratitude à Monsieur E. DEPREZ pour son aide technique irréprochable et pour son amitié.

Mes remerciements vont également à Monsieur A. VAN OPHALVENS pour la qualité des services rendus et l’amitié toujours renouvelée.

A vous tous que Je n’ai pas la possibilité d’énumérer, merci pour ces années privilégiées passées ensemble.

H me faut enfin exprimer ma gratitude à Mademoiselle S. NAJDOVSKI qui a participé

à la dactylographie et à la mise en forme définitive de ce mémoire.

4 TABLE DES MATIERES

I. INTRODUCTION ii

ti. peptides de la famille thoiécystokinine-gastritie 12

Z.1.1.La gastrine 14

1.1.1.1. Structure de la préprogastrine 15

1.1.1.2. Le gène de la gastrine 17

1.1.1.3. La localisation tissulaire de la gastrine 17 1.1.1.4. Les activités biologiques de la gastrine 19 - La stimulation de la sécrétion acide de l'estomac 19 - La stimulation de la motilité antrale 20 - L'effet trophique sur la muqueuse gastrique 20

1.1.2. La cholécystokinine 20

1.1.2.1. Les formes moléculaires de la CCK 21

1.1.2.2. Le gène de la CCK 23

1.1.2.3. La localisation tissulaire de la CCK 24 1.1.2.4. Les activités biologiques de la CCK 25 1.1.3. Le métabolisme des hormones peptidiques 26

t.2. t'endopeptidase 24.11 28

1.2.1. La structure primaire de l'endopeptidase 24.11 30 - L'endopeptidase 24.11 est une protéine membranaire

intégrale de type II 30

- La spécificité de l'endopeptidase 24.11 et la structure

de son site actif 31

- L'endopeptidase 24.11 est une glycoprotéine 34 - L'endopeptidase 24.11 est fortement conservée chez les

mammifères 35

1.2.2. Le gène de l'endopeptidase 24.11 36 1.2.3. L'endopeptidase 24.11 est une enzyme ubiquitaire à

large distribution tissulaire 37

1.2.3.1. En périphérie 38

1.2.3.2. Dans le système nerveux central 40

fUtl Les doseges des differentes activités enzymatiques ⁴³

11.1.1. Dosage de 1 ' endopeptidase 24.11 43 - Utilisation de la CCK-8 sulfatée comme substrat et

détection de la phénylalanine amide par HPLC. 43 - Dosage spectrofluorimétrique de 1'endopeptidase 24.11 44 11.1.2. Dosage de l'enzyme de conversion de l'angiotensine

(ACE) 46

11.1.3. Dosage des activités de type amlnopeptidase 48 - Utilisation d'un peptide de la famille de la

cholécystokinine comme substrat 48

- Dosage spectrofluorimétrique 48

11.1.4. Dosage de la kallikréine 49

ÏL2, tes organes ⁵¹

11.2.1. Les reins de transplantation 51

11.2.2. Les reins d'autopsie 51

11.2.3. Traitement des organes 52

- Prélèvement du cortex rénal 52

- Préparation d'un culot enrichi en membranes de la bordure

en brosse des tubules contournés proximaux. 52

- Homogénéisation du cortex rénal 52

- Enrichissement en membranes de la bordure en brosse 52

- Solubilisation des membranes 53

ÎL3. La purification de Tendopeptidase 24.11 ⁵⁴

II.3.1. La chromatographie sur résine échangeuse d'ions 54 - Equilibration de la colonne

- Préparation de l'échantillon - Charge et lavage

- Elution de 1'endopeptidase 24.11

6 11.3.2. La Chromatographie sur hydroxylapatite 55

- Equilibration de la colonne - Préparation de l'échantillon - Charge et lavage

- Elution de l'endopeptidase 24.11

11.3.3. La chromatofocalisation 56

- Equilibration de la colonne - Préparation de l'échantillon - Charge et lavage

- Elution de l'endopeptidase 24.11

11.3.4. La filtration moléculaire 57

- Equilibration de la colonne - Préparation de l'échantillon - Elution de l'endopeptidase 24.11

11.3.5. Dénaturation - renaturation de l'endopeptidase

24.11 58

tL4. L’analyse et Sa purffîtatîon des échantilSons de |>eptides 59

11.4.1. Les méthodes de détection 59

- La détection U.V. à 214 nm - La détection de la fluorescence - Les dosages radioimmunologiques

- Les analyses de composition en acides aminés

11.4.2. L'identification des peptides 60

ÎS3. L”hydrolyse des peptides de la famltle

cholecystokinîne-gastrine in vitro ⁶ⁱ

11.5.1. Incubation des peptides avec l'endopeptidase 24.11 11.5.2. Incubation des peptides avec l'arylsulfatase

îi.6. L’hydrolyse des peptides de type gastrine in vivo ⁶¹

III. RESULTATS 62

IILI. Purification de Tendopeptidase fiumaine 63

111.1.1. L'endopeptidase 24.11 de rein bumain de

transplantation 63

111.1.1.1. La DEAE-sépharose 63

111.1.1.2. L'hydroxylapatite 64

111.1.1.3. La chromatofocallsatlon 65

111.1.1.4. Bilan de la purification 66

111.1.2. L'endopeptidase 24.11 de rein d'autopsie 68

111.1.2.1. La DEAE-sépharose 68

111.1.2.2. L'hydroxylapatite et la chromatofocalisation 68

111.1.2.3. La filtration moléculaire 71

111.1.2.4. Bilan de la purification au départ de rein d'autopsie 71

111.1.3. Dénaturation - renaturation de l'endopeptidase

24.11 72

111.1.4. Comparaison des deux préparations d'endopeptidase

24.11 74

111.1.5. Sensibilité de l'endopeptidase 24.11 à différents

inhibiteurs 75

111.1.6. L'endopeptidase 24.11 urinaire 76 111.1.6.1. Stabilité de l'endopeptidase 24.11 urinaire 76 111.1.6.2. Quantification de l'endopeptidase 24.11 urinaire chez

1'homme 7 7

111.1.6.3. Caractérisation chromatographique de l'endopeptidase

24.11 urinaire sur DEAE-sépharose. 79

8

HI.2. L*hydrolyse des |»eptides de fe famille gastrine-CCK par

Tendopeptidase ²⁴⁴ II so

111.2.1. Hydrolyse des peptides de type CCK par

1 > endopeptidase 24.11 82

111.2.1.1. Publication n°l : Hydrolyse de l'octapeptide C-terminal de la CCK-8 par des membranes de rein de rat :

caractérisation du clivage par 1'endopeptidase 24.11. 82

- En résumé 91

111.2.1.2. Publication n°2 : Dégradation de la CCK-8 par

1'endopeptidase 24.11 : mise en évidence d'analogues

résistant à l'hydrolyse. 92

- En résumé : (1) Les analogues de la CCK-7 comportant

un acide aminé D. 103

(2) L'analogue de la CCK-7 comportant

B Ala en position 7. 103

(3) Les analogues de la CCK-8 comportant

un Trp^ modifié. 103

(4) L'analogue comportant B Asp en

position 7. 104

(5) Dégradation des pseudo-peptides

apparentés à la CCK-8. 106

111.2.2. La dégradation des peptides type gastrine par

1'endopeptidase 24.11 108

111.2.2.1. Publication n°3 : Dégradation in vitro et in vivo de la G-17 par 1'endopeptidase 24.11. 110 - En résumé :- Dégradation in vitro de la G-17 par

1'endopeptidase 2A.11. 121

- Métabolisme de la G-17

in vivo chez 1'homme : rôle de

1'endopeptidase 24.11 122

111.2.2.2. Publication n°4 : Dégradation in vitro de la gastrine et de la CCK par 1'endopeptidase 24.11

humaine : comportement différentiel des peptides

sulfatés et non-sulfatés. 122

En résumé 130

IV. DISCUSSION 131

IV.1. Métabonsme de la CCK-8 ¹³²

IV.1.1. Métabolisme de la CCK-8 par le rein

(Publication n°l) 132

- L'endopeptidase 24.11 133

- L'aminopeptidase M 134

- Une peptidase typique des reins de rongeurs 135 - Le mécanisme de dégradation des peptides par les reins 135 IV.1.2. Métabolisme de la CCK-8 par le foie 136 IV.1.3. Métabolisme de la CCK-8 dans le cerveau 137

IV.1.4. En résumé 139

1V,2. Les modifications chimiques de la CCK-Bet leurs effets

enzymatique par Tendopeptidase 24,lt ⁱ⁴ⁱ

IV.2.1. La dégradation de la CCK-8 native par

1'endopeptidase 24.11 (Publication n°l) . 141 IV.2.2. Dégradation d'analogues de la CCK-8

(Publication N°2) 143

- Protection contre les exopeptidases 143

- Remplacement des Met par des Nie 143

- Remplacement de l'acide aspartique en position 7 144 - Les peptides contenant des liaisons réduites

(-CHj-NH-) 145

- L'introduction d'acides aminés D en position 5 ou 6 146 - Les modifications de la chaîne latérale du Trp en

position 5 146

fV.3. Purification de Tendopeptidase 24.11 i4S

10

IV4, Métabolisme de ta gastririe bumaine isi

IV.4.1. Dégradation, in vitro, de la 6-17 bumaine par

1 *endopeptidase 24.11 purifiée (Publication n**3). 152 IV.4.2. Métabolisme de la 6-17, in vivo, chez l'homme 153

Effet de la sulfatation sur Thydrolyse, în vitro, de ta <3-^17et de ia CCK-8par Tendopeptidase 24.11 (Publication n^4} i56

IV.5.1. La CCK-8 est un meilleur substrat pour

1'endopeptidase 24.11 lorsqu'elle est sous forme

sulfatée 158

IV.5.2. La 6-17 est un meilleur substrat pour

1'endopeptidase 24.11 lorsqu'elle est sous forme

non sulfatée. 158

IV.5.3. L'endopeptidase 24.11 est plus efficace pour la dégradation in vitro de la CCK-8 que pour celle de

la 6-17. 159

IV.5.4. La sulfatation de la 6-17 influence les voies de

dégradation du peptide par 1'endopeptidase 24.11. 159

IV.5.5. Conclusions. 165

V. CONCLUSION GENERALE ⁱ⁶⁶

VI. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 168

12

14. Us peptMes 4e la famille cholécystokmine-gastilne:

Les peptides de la famille cholécystoklnlne-gastrine font partie du groupe, plus général, des hormones gastro-intestinales dont la découverte remonte au début du vingtième siècle.

Le terme hormone a été proposé par Bayllss et Sterling à la suite de leurs travaux sur le jéjunvun de chien (1). Ils remarquèrent que l'instillation d'acide chlorhydrique dans la lumière de cet organe provoque la sécrétion du fluide pancréatique. L'effet persiste après dénervation du jéjunum et l'injection intraveineuse d'un extrait de muqueuse jéjunale le reproduit parfaitement. Par contre, l'injection intraveineuse directe de l'acide ne provoque aucune réaction du pancréas.

De ces observations, Bayliss et Sterling postulent l'existence d'une substance chimique, qu'ils nomment la sécrétine, qui serait libérée dans la circulation sanguine par la muqueuse intestinale et qui serait capable d'induire, en réponse, la sécrétion de bicarbonate et d'eau par le pancréas.

La sécrétine est ainsi la première hormone décrite et sa définition jette les bases de la théorie hormonale.

Dans les années qui suivirent, de nombreuses autres hormones gastro- intestinales furent découvertes parmi lesquelles la gastrine et la cholécystokinine. De nombreuses tentatives de purification et de caractérisation suivirent immédiatement leur découverte mais les difficultés furent telles que plusieurs dizaines d'années s'écoulèrent avant que leur nature peptidique ne soit mise en évidence et que leur séquence ne soit déterminée sans équivoque.

Leur purification et la détermination de leur séquence étant devenues

possibles, une caractéristique importante des hormones gastro-intestinales, en

général, de la gastrine et de la cholécystokinine, en particulier, a été mise

Extrémité Extrémité

N-terminale C-terminale

G-34 (G-34 non sulfatée)

pGlu-Leu-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Pro-His-Leu-Val-Ala-Asp-Pro-Ser-Lys-Lys- Glu-Gly-Pro-Trp-Leu- (Glu)5-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NHj G-34s (G-34 sulfatée!

pGlu-Leu-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Pro-His-Leu-Val-Ala-Asp-Pro-Ser-Lys-Lys- Glu-Gly-Pro-Trp-Leu- (Glu)5-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2

(SOjH)

NTG-34 rfrapment trvpsiaue N-terminal de la G-34')

pGlu-Leu-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Pro-His-Leu-Val-Ala-Asp-Pro-Ser-Lys-Lys

G-17 (G-17 non sulfatée ou G-17I)

pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu- (Glu)5-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 G-17s (G-17 sulfatée ou G-17II')

pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu- (Glu)g-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 (SO

H)

1-13 G-17 (tridécapentide N-terminal G-17 non sulfaté ou 1-13 G-17I') pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu- (Glu)g-Ala-Tyr-Gly

1-13 G-17s (tridécaneptide N-terminal G-17 sulfaté ou 1-13 G-17II) pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu- (Glu)5-Ala-Tyr-Gly

(SO

H) G-14 (minlgastrine non sulfatée)

Trp-Leu- (Glu)g-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 G-1411 (minlgastrine sulfatée)

Trp-Leu- (Glu)g-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 (SO

H)

Figure 1: Séquences des peptides de la famille gastrine.

en évidence: les hormones peptidiques existent souvent sous des formes moléculaires multiples qui se distinguent par des modifications importantes dans

leur maturation post-traductionnelle.

14 La consécration arrive enfin pour les peptides gastro-intestinaux lorsque leur présence dans divers neurones périphériques et dans le système nerveux central est démontrée. Ils reçoivent alors le titre de neuropeptides et des travaux, de plus en plus nombreux, tendent à les impliquer dans le contrôle de phénomènes aussi importants que la satiété ou la perception de la douleur voire même dans des fonctions cognitives et dans les pathologies qui leur sont associées telles que la schizophrénie.

Cela a fait naitre pour les hormones peptidiques un regain d'intérêt considérable qui motive, aujourd'hui encore, le travail de nombreuses équipes de chercheurs tant dans les universités que dans les firmes pharmaceutiques qui commencent à entrevoir des applications thérapeutiques possibles pour certains peptides ou encore pour les molécules capables de moduler leur métabolisme.

I.l.l, La gastrine;

Bien que la gastrine ait été découverte en 1905 (2), son existence a longtemps été contestée. Les extraits tissulaires contenaient également de l'histamine, qui, comme la gastrine, stimule la sécrétion d'acide par l'estomac.

La démonstration définitive de l'existence de la gastrine a été fournie par Gregory et Tracy (3), en 1964, avec la purification, au départ de muqueuse antrale de porc, et la détermination de la séquence de deux heptadécapeptides, la G-17 sulfatée et la G-17 non sulfatée.

Ces deux formes de gastrine, découvertes initialement, ne diffèrent que par la présence ou non d'un groupe sulfate estérifiant le groupement phénolique d'une tyrosine située en sixième position à partir de leur extrémité G-terminale (FIG.

1) . Les deux peptides comportent un acide pyroglutamique à leur extrémité N-

terrainale et ont leur carbonyle terminal amidé. Une autre caractéristique

D'autres formes de gastrlne n'ont cependant pas tardé à être mises en évidence et la diversité des formes moléculaires existantes se comprend aisément lorsque l'on examine la séquence déduite du DNA complémentaire au RNA messager codant pour la préprogastrine (4, 5 et 6). Elle comporte, en effet, plusieurs des sites de clivage pour les enzymes impliquées dans la maturation du précurseur. Les multiples foirmes de gastrlne représentent différents stades de maturation. Elles sont, cependant, toutes biologiquement actives.

Structure de la préprogastrine;

La préprogastrine humaine est un polypeptide de 101 acides aminés (FIG.

2). La séquence de la G-17, que l'on trouve en position 76 à 92, contient la séquence nécessaire à l'activité biologique du peptide. Elle est suivie par un tripeptide, Gly-Arg-Arg, qui caractérise les sites d'amidation reconnus par une enzyme impliquée dans la maturation du peptide. Cette enzyme clive le précurseur à hauteur de la glycine, cette dernière étant le donneur de la fonction -NHj qui reste sur le carbonyle de la phénylalanine en position 92. Un hexapeptide prolonge le précurseur en une extension C-terminale de la position 96 à la position 101.

A l'extrémité N-terminale de la préprogastrine on distingue le peptide signal

(position 1 à 21). La séquence intermédiaire entre le peptide signal et la G-

17 comporte plusieurs paires de résidus basiques constituant des sites de clivage

pour les enzymes de type trypsine chargées de la maturation du précurseur en

fragments plus courts. Le clivage d'un ou de plusieurs de ces sites, après

élimination du peptide signal, génère deux peptides contenant la séquence

nécessaire à l'activité biologique, la G-17 et un autre peptide comportant 17

acides aminés supplémentaires sur son extrémité N-terminale, la G-34.

16

1 10

Met Gin Arg Leu Cys Val Tyr Val Leu Ile Ptie Ala Leu Ala Leu Ala Ala Phe Ser

20 30

Glu Ala Ser Trp Ly» Pro Arg Ser Gin Gin Pro Asp Ala Pro Leu Gly Thr Gly Ala

40 50

Asn Arg Asp Leu Glu Leu Pro Trp Leu Glu Gin Gin Gly Pro Ala Ser His His

Arg Arg

60 70

Gin Leu Gly Pro Gin Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys Lys

80 90

Gin Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe Gly I--- G 17---

lArg Arg

100 Ser Ala Glu Asp Glu Asn

Figure 2: Séquence en acides aminés (haut) et représentation schématique de la prépro-gastrlne (bas) déduites sur base de la séquence du cDNA codant pour la gastrlne. Adapté de fioel et al. (6).

Les fragments complémentaires de ces derniers (le fragment cryptique A, le

fragment N-terminal G-34 et le fragment cryptique B) sont, bien entendu, générés

simultanément. Une forme moléculaire plus longue englobant les séquences du

fragment cryptique A et de la G-34 pourrait également exister. Cependant son

existence en dehors de la cellule n'a pu être confirmée jusqu'à présent par

aucune méthode biochimique.

prévisible sur base de la séquence primaire du précurseur. Il n'en reste pas moins que la G-14, le tétradécapeptide C>terminal de la G-17, a été mise en évidence dans la circulation par des méthodes chromatographiques.

En résumé, la gastrine existe sous trois formes moléculaires biologiquement actives de longueurs différentes mais qui comportent toutes la même extrémité C>terminale. Ces trois peptides contiennent, en position six depuis l'extrémité C-terminale, une tyrosine dont le groupement phénolique peut être libre ou estérifié par un groupement sulfate. Des formes plus courtes, comme la G*6 ou la G-4 ont également été décrites.

1.1.1.2. Le gène de la gastrine:

Le gène codant pour la gastrine humaine est constitué d'environ 4000 paires de bases (pb) et est organisé en 3 exons et 2 introns (7).

Le premier intron est situé dans la région 5' non traduite. L'autre intron s'insère dans la séquence codant pour le précurseur et partage cette dernière entre l'exon 2 et l'exon 3 (FIG. 3). L'exon 1 code pour l'extrémité 5' non traduite.

Il est intéressant de noter que la séquence codant pour le précurseur de la gastrine n'est pas partagée aléatoirement entre les exons 2 et 3. La région active est séparée du restant de la molécule: la séquence qui contient l'activité biologique (la G-17) est concentrée au sein de l'exon 3, l'exon 2 ne code que pour l'extrémité N-terminale du précurseur.

I.I.I.3. La localisation tissulaire de la gastrine;

Bien que la muqueuse duodénale soit très riche en gastrine, le tissu

18

Figure 3: Organisation du gène codant pour la gastrlne chez l'homme. Adapté de Ito et al. (8).

qui en contient le plus est la muqueuse antrale (3500 pmol.g’^).

Les formes moléculaires extraites sont étudiées par chromatographie couplée à des dosages radioimmunologiques utilisant des anticorps spécifiques de certaines régions de la gastrine.

Il a ainsi été montré que la G-17 constitue 95 % de l'immunoréactivité de type C-terminale dans les extraits d'antre de porc. La G-34 apparait comme une forme minoritaire, l'essentiel de ce peptide étant converti en G-17 avant sa sécrétion

(9).

Bien que l'on ait décrit la présence d'immunoréactivité de type

gastrine dans certaines zones du cerveau (10, 11, 12), celle-ci semble due à la

présence de cholécystokinine qui, du fait de sa parenté structurale avec la

gastrine, est également reconnue par beaucoup d'antiséra anti-gastrine (12). On

ne peut cependant pas nier que la gastrine soit un neuropeptide car sa présence

a été démontrée sans équivoque dans l'hypophyse de porc (13) et dans le nerf

vague abdominal chez le chat, chez le chien et chez l'homme (14, 15).

cellulaire qui produit la gastrlne. Ces cellules, à l'aspect caractéristique de cellules endocrines, présentent de nombreuses microvillosités qui se projettent vers la lumière glandulaire où elles perçoivent les modifications du contenu gastrique. La gastrlne est stockée dans des granules sécrétoires denses qui s'accumulent vers le pôle basal des cellules G d'où le peptide est déversé par exocytose dans la circulation sanguine.

I.I.I.4. Les activités biologiques de la gastrlne;

La stimulation de la sécrétion acide de l’estomac:

La plus connue des activités biologiques de la gastrlne est la stimulation de la sécrétion d'acide par la muqueuse gastrique en réponse à l'arrivée du bol alimentaire. Chez l'homme, toutes les propriétés nécessaires à cette fonction sont contenues dans le tétrapeptide C-terminal amidé de la gastrlne, 14-17 G-17, (16). Ce dernier est cependant un stimulateur moins puissant que la G-17 elle-même. La G-17 et la G-34 apparaissent strictement équivalentes pour ce qui est de la stimulation de la sécrétion acide. De même, les formes sulfatées et non sulfatées ont un pouvoir stimulant Identique.

La déamldatlon de l'extrémité C-terminale conduit non seulement à l'abolition complète de l'activité biologique mais produit un peptide qui antagonise les effets de la gastrlne.

Les fragments N-terminaux de la G-17 ou de la G-34 n'exercent aucune

action sur la sécrétion d'acide par l'estomac (17, 18) et sont généralement

considérés comme dépourvus de toute activité biologique.

20 La gastrlne n'est pas le seul protagoniste Impliqué dans les mécanismes de contrôle de la sécrétion acide par l'estomac. Des Interactions complexes existent entre trois constituants: la gastrlne, l'acétylcholine et 1'histamine

(19).

La stimulation de la motilité antrale:

A des doses supramaxlmales pour la stimulation de la sécrétion acide, la gastrlne stimule également la motilité antrale (20).

Son effet sur les muscles circulaires semble direct, celui sur les muscles longitudinaux semble produit par l'intermédiare de la sécrétion d'acétylcholine par le plexus myentérlque (21).

L'effet trophique sur la mumteuse eastriaue:

La gastrlne joue un rôle Important sur la croissance de la muqueuse gastrique, surtout dans les réglons où a lieu la sécrétion d'acide (22).

L'administration de gastrlne à des rats stimule la synthèse de DNA, de RNA et de protéines dans les cellules de la muqueuse gastrique, de même qu'elle augmente le nombre de cellules pariétales. Des récepteurs spécifiques pour la gastrlne ont d'ailleurs été mis en évidence à la surface de ces dernières.

1.1.2. La cholécvstokinine;

La cholécystoklnlne a été découverte en 1928 par Ivy et Oldberg (23).

Ils ont, en effet, observé la présence d'un facteur humoral, dans des extraits d'intestin grêle de chat et de chien, qui provoquait la contraction de la vésicule biliaire.

Sur base de ces observations, ils attribuèrent le nom "cholécystoklnlne" à cette

hormone dont ils ignoraient la nature chimique.

une substance hormonale, dans des extraits d'intestin de porc, qui, injectée par voie intraveineuse, stimulait la sécrétion des enzymes pancréatiques. Dans une démarche similaire à celle d'Ivy et Oldberg, ils nommèrent cette hormone

"pancréozymine" (24).

La nature chimique de la cholécystoklnlne (CCK) et de la pancréozymine (PZ) fut découverte simultanément par Mutt et Joirpès qui lors de la purification de la CCK virent que l'activité de type PZ était co-purifiée (25). Déterminant la structure du composé, ils montrèrent que les activités CCK et PZ sont dues à un seul et même facteur de nature peptidique dont ils déterminèrent la séquence.

I.1.2.1. Les formes moléculalrea de la CCK;

Le facteur purifié par Mutt et Jorpes contenait en réalité un mélange de deux peptides, l'un de 33 acides aminés (CCK-33) l'autre de 39 acides aminés (CCK-39). La CCK-39 est constituée des 33 acides aminés de la CCK-33 (FIG. 4) flanqués d’une extension N-terminale de 6 acides aminés.

Avec le développement des techniques chromatographiques modernes, combinées aux dosages radioimmunologiques, d'autres formes moléculaires de CCK ont été mises en évidence.

Toutes les formes biologiquement actives contiennent la même extrémité C-terminale amidée qui est essentielle pour l'activité biologique du peptide.

Elles contiennent également une tyrosine (sulfatée ou non sulfatée) en septième

position à partir de l'extrémité C-terminale. Elles diffèrent en cela de la

gastrine où ce résidu se trouve en sixième position. De plus, si la gastrine est

équipotente sous ses deux formes, la CCK non sulfatée est beaucoup moins active

que son homologue sulfatée (26).

22

Extrémité Extrémité

N-terminale C-termlnale

CCK-33

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Lys-Ala-Pro-Ser-Gly-Arg-Val-Ser-Met-Ile-Lys-Asn-Leu-Gln-Ser-Leu-Asp-

18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Pro-Ser-Hls-Arg-Ile-Ser-Asp-Arg-Asp-'jEÿr-Met-eiy-Trp-Hét-Asp’-Fhe’NHj

1 'R

CCK-8 fou CCK f26-33"). octaoentlde C-terminal de la CCK-33') 26

Asp-

27 28 29 30 31 32 33 - Me

« îïp -Asy Phe •< NH

R iiii “ iii liilii

Figure 4; Séquences en acides aminés des principales formes de CCK chez l'homme. La figure fait apparaître les ressemblances structurales avec la gastrlne.

En plus de la CCK-33 et de la CCK-39, une forme à 58 acides aminés, la CCK-58, a été isolée (27) ainsi que plusieurs formes plus courtes comme la CCK- 8 (28), la CCK-22 (29).

La structure complète du précurseur de la CCK a été déterminée chez le rat (30) et chez le cochon (31). Les grandes formes de CCK apparaissent ainsi comme étant des précurseurs des formes plus petites (FIG. 5).

La prépro-CCK est un polypeptide de 115 acides aminés qui est identique tant dans le cerveau que dans le tube digestif. A son extrémité N-terminale, le peptide signal est constitué par les 20 premiers acides aminés. La séquence de la pro-CCK s'étend de Gln*^ à Phe*°® et est immédiatement suivie du site d'amidation constitué par le tripeptide Gly-Arg-Arg lui-même suivi d'une extension C-terminale de 9 acides aminés.

Contrairement à la pro-gastrine, les sites destinés à la maturation de

la pro-CCK ne sont pas constitués par des paires d'acides aminés basiques. Le

I ProCCK ->

Peptide slgnal->| |cCK-58 -> |cCK-39 ->

-...Ala^° - Gln*^... Arg^® - Ala‘®... Arg®^ - Tyr®®...-,

I I I I I

<- CCK-8| <- CCK-I2I <- CCK-33I ;

«

,...Asp®®-Arg®®... Ile®*-Arg®^... Lys^^-Arg^®...

I I I t

! |<- Site d'amidation ->|Extension C-terminale

I I

; ->

I

'... Phe^°® - Gly^®^ - Ar g^°® - Ar g^°®... COOH^ ^®

Figure 5: Représentation schématique de la prépro-CCK faisant apparaître les principaux sites de maturation du précurseur.

Adapté d'après Deschenes et al.(32).

clivage de la pro-CCK a lieu sur le versant C-terminal d'une arginine unique.

Chez le rat, on note, entre autres, les sites de maturation constitués par les résidus Arg^®, Arg®*, Arg^®, Arg®^ et Arg®® qui donnent successivement naissance à la CCK-58, à la CCK-39, à la CCK-33, à la CCK-12 et à la CCK-8. Ces peptides sont, de plus, sensibles à la dégradation par des endo- et des exopeptidases ne nécessitant pas la présence de résidus basiques. Ces peptidases seraient donc responsables de la production de formes comme la CCK-25, la CCK-18 ou la CCK-7 dont l'existence a été démontrée par microséquence de peptides purifiés par chromatographie d'extraits tissulaires (33).

I.I.2.2. Le gène de la CCK;

Comme le gène de la gastrine, celui de la CCK est également organisé

en 3 exons et 2 introns (34). La région de la prohormone la plus conservée parmi

les différentes espèces, la CCK-33, qui, par ailleurs, contient la séquence

nécessaire à l'activité biologique, est codée par l'exon 3. Cet exon code

24 également pour le site d'amidation. L'exon 2 code pour le peptide signal ainsi que pour l'extrémité N-terminale de la prohormone. L'exon 1, enfin, code pour l'extrémité 5' non traduite.

L'arrangement spatial du gène de la CCK est donc très semblable à celui de la gastrine. Cette observation, de même que la parenté structurale existant entre les deux peptides, suggère qu'ils pourraient dériver d'une molécule ancestrale unique dont le gène se serait dupliqué au cours de l'évolution. Etant donné que le gène de la CCK est situé sur le chromosome 3 et celui de la gastrine sur le chromosome 17 (35), la duplication du gène ancestral aurait été suivie d'une translocation d'un, voire même des deux gènes à moins que le chromosome ancestral ne se soit dupliqué en entier.

1.1.2.3. La localisation tiasulaire de la CCK;

En périphérie, la CCK a été mise en évidence dans divers tissus, dans la circulation sanguine et certains neurones. Elle est présente dans diverses régions du cerveau. Les formes moléculaires rencontrées varient non seulement selon leur localisation mais également selon les espèces.

La cholécystokinine est la plus abondante dans les muqueuses intestinale et duodénale (150 à 250 pmol.g"^) où elle est produite par les cellules endocrines (36). Le peptide se présente sous forme.de CCK-8, de CCK- 33 ou de CCK-39, ces trois formes étant représentées dans des quantités équivalentes (37).

En ce qui concerne les formes circulantes de CCK, on trouve essentiellement la CCK-33 et la CCK-8. Les autres formes semblent également exister mais dans de plus faibles proportions.

Dans les neurones entériques la CCK-8 est la forme majeure et elle est

présente à des concentrations de l'ordre de 5 à 10 pmol.g"^.

l'hippocampe, l'amygdala, le striatum et l'hypothalamus (12). Dans le cortex la concentration en CCK peut atteindre jusqu'à 600 pmol.g"^. Dans le cerveau la forme majeure de la CCK est la CCK-8. Même si des formes plus grandes sont également observées, la CCK-8 représente plus de 95 % de l'immunoréactivité de type CCK C-terminale (37).

La CCK est également produite dans le nerf vague où des expériences de ligature ont montré qu'elle est synthétisée dans son extrémité crânienne et est transportée axonalement vers la périphérie (15).

I.1.2.4. Les activités biologiques de la CCK;

Du fait de sa double localisation dans des cellules endocriniennes et dans des neurones, la CCK a un double rôle d'hormone et de neurotransmetteur ou de neuromodulateur.

Son rôle hormonal est, aujourd'hui, clairement établi dans la stimulation de la contraction de la vésicule biliaire et la sécrétion des enzymes pancréatiques.

A des doses supramaximales pour la stimulation de la sécrétion pancréatique, la CCK inhibe la vidange gastrique (38) et stimule, par ailleurs, la motilité intestinale (39).

La CCK est également impliquée dans le contrôle du comportement

alimentaire notamment en participant aux mécanismes de la satiété.

26 1.1.3. Le métabolisme des hormones

Que ce soit pour les hormones peptidiques ou pour les neuropeptides, l'existence d'un système efficace d'Inactivation du messager est nécessaire pour une transmission normale du message.

Dans le cas des neurotransmetteurs classiques la durée du signal engendré est très courte et cela s'explique par l'existence d'un mécanisme d'inactivation rapide basé sur la recapture et/ou la dégradation enzymatique du messager en produits biologiquement Inactifs.

En ce qui concerne les hormones peptidiques et les neuropeptides aucun mécanisme de recapture n'a été mis en évidence jusqu'à ce jour. L'inactivation semble donc essentiellement assurée par dégradation enzymatique.

La gastrine et la cholécystokinine sont libérées dans le sang veineux suite à la prise de nourriture. Passant à travers la veine porte, elles traversent le foie, le coeur et les poumons avant de pénétrer dans le sang artériel qui les transporte enfin vers leurs tissus cibles respectifs. Ces peptides parcourent ainsi un trajet au long duquel ils sont susceptibles de rencontrer diverses enzymes protéolytiques capables de les inactiver. Les peptidases sont présentes à proximité du lieu d'action du messager ou dans les divers organes que traverse le flux sanguin.

La grande majorité des peptidases impliquées dans l'inactivation des messagers peptidiques sont des enzymes membranaires orientées vers le milieu extracellulaire. Dans le système nerveux, ces enzymes sont généralement associées aux membranes synaptiques. Ailleurs, bien que très largement distribuées, elles sont abondantes dans les bordures en brosse (p.ex.: dans les reins, les intestins, le placenta).

Les peptidases sont classées, selon leur mode d'action, en deux

catégories principales: les exopeptidases et les endopeptidases. Les premières

un acide aminé à la fois. Selon qu’elles attaquent l'extrémité C-terminale ou l'extrémité N-terminale du peptide, elles sont nommées carboxypeptidase ou aminopeptidase respectivement. Les endopeptidases, comme leur nom l'indique, clivent les peptides à l'intérieur de la chaîne peptidique.

Les hormones peptidiques participent étroitement au contrôle de nombreuses fonctions vitales et sont de ce fait souvent.impliquées dans diverses pathologies. Une perspective thérapeutique, consisterait à rétablir la fonction normale soit par un apport de peptides exogènes, soit par modification du catabolisme des peptides endogènes au moyen notamment d'inhibiteurs des protéases.

Cette démarche fort séduisante nécessite cependant l'identification préalable des peptidases impliquées dans le métabolisme du messager intéressant de même qu'une caractérisation précise des voles par lesquelles ce dernier est dégradé. On peut dès lors envisager le développement rationnel d'inhibiteurs des peptidases concernées de même que la synthèse de peptides modifiés offrant une résistance accrue à la dégradation.

Dans ce contexte, nous nous sommes Intéressés aux enzymes impliquées dans la dégradation de la CCK-8.

Un travail préliminaire de notre laboratoire avait montré qu'entre autres enzymes, une endopeptidase présente dans des membranes synaptiques de cerveau de rat est Impliquée dans la dégradation de la CCK-8 (40) . Cette endopeptidase présentait des similitudes frappantes avec une endopeptidase neutre très abondante dans le rein; 1'endopeptidase 24.11 ou EC 3.4.24.11.

O

28

i,Z. t^endopeptldase 24.lt:

Endopeptidase neutre (EC 3.4.24.11), enképhallnase, antigène de la leucémie lymphoblastique aigûe commune (CALLA), ce sont là trois noms différents pour désigner une seule et même enzyme. Ils sont le fruit de découvertes et redécouvertes successives.

L'enzyme a été observée pour la première fois, en 1968, dans les membranes de la bordure en brosse du rein de lapin (41) comme une activité protéolytique, de type endopeptidase neutre, capable d'hydrolyser la chaîne B de l'insuline.

La seconde découverte de l'endopeptidase 24.11 a eu lieu dans le cadre des recherches sur les enképhalines : des peptides naturels découverts dans le système nerveux central, capables de se fixer sur les mêmes récepteurs que la morphine et d'y produire un effet analgésique. En 1978, une enzyme capable d'hydrolyser spécifiquement les enképhalines est mise en évidence (42). Dans l'enthousiasme consécutif à cette découverte, un nom trivial directement inspiré par son rôle dans la terminaison de l'activité biologique des enképhalines est proposé. L'enzyme est alors appelée "Enképhallnase".

Ces résultats provoquent un intérêt croissant pour l'enzyme. On ne

tarde d'ailleurs pas à montrer qu'il s'agit d'une enzyme ubiquitaire présente

également en dehors du sytème nerveux central (43, 44, 45, 46, 47, 48, 49). De

nombreuses équipes, dont la nôtre, se rendent compte que 1'enképhallnase, comme

1'endopeptidase neutre du rein, hydrolyse les messagers peptidiques comme la

substance P (50, 51), la cholécystokinine (Publication n®l, voir chapitre

Résultats), la gastrine (Publication n°3, voir chapitre Résultats), le facteur

atrial natriurétique (52), et d'autres (53, 54, 55); elle est sensible aux mêmes

inhibiteurs. L'identité des deux enzymes est rapidement proposée (56, 57, 58).

l'endopeptidase 24.11 vient démontrer définitivement que la séquence primaire de l'enképhalinase de cerveau et celle de l'endopeptidase 24.11 de rein sont identiques (59, 60, 61).

Le nom "enképhalinase" convient certainement pour l'enzyme dans les zones définies du cerveau où sa colocallsation avec les enképhalines lui confère cette fonction précise.

Il est cependant évident que ce nom, trop restrictif, n'est compatible ni avec la large distribution tissulaire de l'endopeptidase neutre, ni avec la grande diversité des substrats qu'elle est capable d'hydrolyser, ni donc avec ses multiples fonctions potentielles.

C'est pourquoi, l'enzjrme est plus généralement appelée endopeptidase 24.11 ou de manière plus précise endopeptidase neutre EC 3.4.24.11.

Jusqu'en 1989, rien ne rapprochait l'endopeptidase 24.11 de l'antigène de la leucémie lymphoblastique aigûe commune (ou CALLA ou encore CDIO) et les travaux sur le CALLÂ connaissaient un développement totalement indépendant.

Le CALLA, découvert par Melvyn Greaves en 1975 (62), est un antigène de surface important dans le diagnostic d'une forme de leucémie lymphoblastique aigûe (63). Cet antigène, peu représenté à la surface des lymphocytes B matures, est abondamment exprimé de manière transitoire dans le processus normal de différenciation des cellules de la moelle. Chez les patients leucémiques, ces processus sont perturbés et dans de nombreux cas l'expression du CALLA persiste à la surface des lymphocytes B tumoraux.

Le cDNA codant pour le CALLA a été cloné et séquencé. La séquence

primaire du CALLA fait apparaître qu'il s'agit d'une protéine membranaire

intégrale de type II (64). La comparaison de cette séquence avec d'autres déjà

recensées démontre la parfaite homologie de séquence entre le CALLA et

l'endopeptidase 24.11 (65, 66).

30

1.2.1. La structure primaire de l’endopeotldase 24.11:

Les stratégies utilisées par les différentes équipes qui ont découvert la séquence de l'endopeptldase 24.11 sont très semblables. Elles aillent les techniques classiques de purification et de séquençage des protéines à la puissance de la technologie de l'ADN recombinant (59, 60, 61).

L’endopeptidase 24,11 est une protéine membranaire intégrale de type 11:

La séquence de l'endopeptidase 24.11 comporte 750 acides aminés (742 selon certains auteurs) et est caractéristique d'une protéine membranaire intégrale de type II (59, 60, 61, 64, 65). On y rencontre un unique segment hydrophobe (24 acides aminés) qui joue le double rôle de segment transmembranalre d'ancrage et de peptide signal (pas de peptide signal cllvable).

Le domaine intra-cytoplasmique de l'enzyme comporte l'extrémité N- terminale. Il est constitué de 25 acides aminés dont 8 résidus fortement chargés qui jouent le rôle de séquence "stop transfert".

La séquence codant pour les domaines cytoplasmique et transmembranalre de l'endopeptidase 24.11 présente une homologie avec celle de la pro-sucrase- isomaltase, une glycosidase rénale membranaire de la bordure en brosse (67).

Le domaine extracellulaire (les 700 acides aminés C-terminaux) constitue l'essentiel de la séquence et contient le site actif.

Le domaine extracellulaire contient un exemplaire de la séquence consensus de cinq acides aminés, His-Glu-Ile-Thr-His, qui est typique du domaine de liaison du Zn dans les métalloprotéases utilisant ce métal comme cofacteur (68, 69).

La présence de cette séquence consensus dans le domaine extracellulaire confirme

les données recueillies, en 1974 déjà, par Kenny et ses collaborateurs montrant

que l'endopeptidase neutre de rein de lapin contient du Zn à raison

Le rôle du domaine cytoplasmique de 1'endopeptidase 24.11 reste à déterminer. Il est cependant certain qu'il n'est pas nécessaire pour l'activité enzymatique de la protéine. Une endopeptidase 24.11 soluble a, en effet, été construite par fusion du cDNA codant pour le peptide signal de la pro- oplomélanocortine avec le cDNA codant pour l'ectodomaine de 1'endopeptidase 24.11. Cette enzyme tronquée, exprimée dans des cellules rénales en culture, est sécrétée dans le milieu sous une forme qui conserve l'entièreté de l'activité enzymatique de 1'endopeptidase 24.11 membranaire (71).

La spécificité de Vendopeptidase 24.11 et la structure de son site actif:

La spécificité de l'enzyme a été étudiée au moyen de nombreux substrats tant naturels que synthétiques.

Bien que la chaîne B de l'insuline soit un substrat pour 1'endopeptidase 24.11, l'insuline, l'albumine ou la caséine ne le sont pas (72).

L'endopeptidase 24.11 agit donc sur des oligopeptides plutôt que sur des protéines.

Sur base des nombreuses études effectuées sur 1'endopeptidase 24.11 au moyen de substrats synthétiques, l'importance relative des acides aminés engagés dans la liaison peptidique à cliver (position Pj et P'j) et celle des résidus voisins (positions Pj et Pj en allant vers l'extrémité N-terminale et P'j et P'j en allant vers l'extrémité C-terminale) a été établie (FIG. 6) (73, 74, 75).

Bien que la nature de tous ces résidus puisse influencer les paramètres

cinétiques de la réaction d'hydrolyse, seule la présence d'un acide aminé

hydrophobe (p.ex.: Phe, Leu, Val, Tyr, Ile, Trp,...) non C-terminal (ou du moins

dont le carbonyle est amidé) en position P'j est une condition nécessaire pour

qu'un peptide soit un substrat potentiel pour 1'endopeptidase 24.11.

32

Figure 6: Représentation schématique du site actif de l'endopeptldase 24.11 et dénomination des positions occupées par les résidus de part et d'autre de la liaison peptidique qui est clivée.

Les informations disponibles sur la structure du site actif de 1'endopeptidase 24.11 ont souvent été obtenues par comparaison avec celui d'autres protéases à Zn de spécificité similaire telles que l'enzyme de conversion de l'angiotensine ou la thermolysine (74).

La thermolysine est une peptidase bactérienne dont la structure tridimentionnelle a été établie par cristallographie aux rayons X (76) et dont les acides aminés du site actif ont été localisés par cocristallisation de l'enzyme avec un inhibiteur spécifique (77). Cet inhibiteur, le phosphoramidon (FIG. 7 A), est une molécule naturelle produite par Streptomyces qui inhibe également

1'endopeptidase 24.11 (78).

Les séquences primaires de la thermolysine et de 1'endopeptidase 24.11

présentent peu d'homologie dans l'ensemble. Les acides aminés qui constituent

leurs sites actifs respectifs sont cependant fortement conservés. Un modèle pour

le site actif de l'endopeptldase 24.11 calqué sur celui de la thermolysine a été

Figure 7: Structure de quelques Inhibiteurs spécifiques de l'endopeptidase 24.11: le phosphoramidon (A), le thiorphan (B), le rétrothiorphan (C) et le kélatorphan (D).

établi (79) et a été vérifié par mutagénèse dirigée après expression de l'endopeptidase 24.11 recombinante dans des cellules rénales de mammifère en culture (80, 81).

L'atome de Zn est lié au site actif de l'endopeptidase 24.11 par

34 l'intermédiaire des chaines latérales de deux His (en position 583 et 587) et d'un Glu (en position 646). Il interagit, par ailleurs, avec l'atome d'oxygène d'une molécule d'HjO étroitement associée au site actif de l'enzyme par interaction avec la chaîne latérale d'un Glu (en position 584, les positions données à titre indicatif, se rapportent à la séquence de l'endopeptidase 24.11 déterminée par Devault et al. (80)).

Ce modèle de site actif a été exploité pour le développement rationnel d'inhibiteurs synthétiques de l'endopeptidase 24.11.

Ces inhibiteurs ont été développés en greffant un groupement susceptible de chélater l'atome de Zn sur des dipeptides contenant une phénylalanine (82, 83, 84, 85, 86). La chaîne latérale hydrophobe de cet acide aminé assure le positionnement du composé dans le site actif de l'enzyme dans une configuration favorable à l'interaction du groupement chélatant avec l'atome de Zn.

Le groupement thiol (-SH) est le groupement chélatant qui est à l'origine de la forte inhibition de l'endopeptidase 24.11 par le thiorphan et par le rétrothiorphan (FIG. 7 B et C) . Dans le kélatorphan, par contre, c'est un groupement hydroxamate qui complexe l'atome de Zn (FIG. 7 D) .

L'endopeptidase 24.11 est une glycoprotéine:

Le domaine extracellulaire de l'enzyme comporte plusieurs sites potentiels de N-glycosylation (Asn-X-Ser/Thr). Ces sites sont au nombre de 5

(chez le lapin) ou de 6 (chez l'homme et le rat).

L'absence de domaines riches en sérine ou en thréonine dans la séquence de l'endopeptidase 24.11 suggère que l'enzyme ne contient pas de sites potentiels de 0-glycosylation.

La présence de N-glycosylation a été démontrée par des moyens chimiques

(87) ou enzymatiques (70, 80). Des différences importantes sont notées dans le

L'endopeptldase est un polypeptide constitué d'environ 750 acides aminés pour lequel un poids moléculaire voisin de 85 kDa peut être calculé. Le poids moléculaire de l'enzyme natif varie, selon le tissu, entre 90 et 100 kDa.

L'enzyme de rein humain migre sur SDS-PAGE comme une protéine de 93 kDa de poids moléculaire (70) alors que l'enzyme exprimée à la surface de cellules leucémiques ou de mélanomes se comporte comme une protéine de 100 kDa de poids moléculaire (89). Cette hétérogénéité est essentiellement due aux différences dans les taux de glycosylation de la protéine. Les sucres constituent, en effet, de 15 à 20

% de son poids moléculaire.

L’endopeptldase 24.11 est fortement conservée chez les mammifères:

Les enzymes de cerveau de rat et de rein de lapin présentent respectivement 94 % et 93 % d'homologie avec l'enzyme humaine (59, 60).

Plus de 700 acides aminés sur 750 sont communs aux trois espèces. La plupart des domaines importants de l'enzyme sont intégralement conservés. C'est le cas pour les sites de glycosylation (5 sur 6), pour la séquence stop transfert (constituée de 8 acides aminés), pour le domaine hydrophobe transmembranaire (constitué de 24 acides aminés) ainsi que pour deux fragments du domaine extracellulaire (constitués de 9 et 13 acides aminés) impliqués dans la fixation de l'atome de zinc (64).

Chez les trois espèces, l'enzyme possède la même capacité à former

des ponts disulfures, les 12 cystéines étant conservées. Quatre d'entr'elles sont

confinées dans un domaine extracellulaire restreint (32 acides aminés) proche

du point d'ancrage de la protéine dans la membrane. Un tel confinement de

cystéines est également observé pour la sucrase isomaltase (90) et la gamma-

glutamyltranspeptidase (91) deux enzymes membranaires des microvillosités

36 possédant la même orientation que l'endopeptldase 24.11.

Parmi les différences qui existent entre les enzymes des trois espèces, celles qui concernent l'alignement des trois séquences et les sites potentiels de glycosylation sont les plus importantes.

En effet, si la séquence de l'enzyme de rat s'aligne parfaitement sur celle de l'enzyme humaine, la séquence de l'enzyme de lapin comporte un acide aminé additionnel (61).

Comme nous l'avons signalé ci-dessus, l'enzyme humaine et l'enzyme de rat comportent 6 sites potentiels de N-glycosylation alors que l'enzyme de lapin n'en compte que 5. Parmi les 6 que comportent les deux premiers seuls 5 sont Identiques. Le site absent chez le lapin est également absent chez l'homme mais ce dernier compte un site additionnel qui lui est propre (61).

L'impact de ces différences sur les propriétés enzymatiques de 1'endopeptidase 24.11 parait, cependant, peu important.

L'enz3rme humaine et l'enzyme de rat sont, en effet, identiques sur base de nombreuses propriétés parmi lesquelles le pH optimum, la sensibilité aux inhibiteurs et les paramètres cinétiques pour l'hydrolyse de divers substrats (53, 92, 93, 94).

1.2.2. Le gène de l'endopeptldase 24.11;

Le gène de l'endopeptldase 24.11 a récemment été isolé d'une bibliothèque génomique de DNA placentaire humain. Le DNA, partiellement digéré par une enzyme de restriction (Sau3AI) et intégré dans un vecteur (EMBL3A), a été sondé au moyen de divers fragments de cDNA de CALLA (95).

Le gène de l'endopeptldase 24.11 qui s'étend sur plus de 80 kb

(kilobases) est organisé en 24 exons séparés par de multiples introns dont les

Les deux premiers exons codent pour les séquences 5' NTR (non traduites). Le troisième, contenant le codon d'initiation, code pour la séquence N-terminale de l'endopeptidase 24.11 qui englobe le domaine cytoplasmique et la séquence hydrophobe transmembranaire de la protéine. L'essentiel du domaine extracellulaire (600 acides aminés sur 700) est codé par une succession de 20 petits exons dont les tailles varient de 36 à 162 pb.

Le dernier exon, beaucoup plus long (3400 pb environ), code non seulement pour les 32 acides aminés C-terminaux de la protéine mais également pour l'entièreté de la région 3' NTR.

Trois types de cDNA d'endopeptidase 24.11 humaine ont été identifiés.

Ils diffèrent exclusivement par la séquence en amont du troisième exon. Leur existence découle de l'utilisation alternative de trois sites d'épissage donneurs présents au sein du premier exon associés à un même site accepteur présent dans le troisième exon. Deux des cONA humains sont apparentés au cDNA de cerveau de rat, le troisième est apparenté au cDNA de rein de lapin.

L'existence des sites d'épissage alternatifs, et par conséquence de mRNA épissés de manière différente, peut constituer un moyen de régulation de l'expression de l'enzyme en affectant la stabilité ou la vitesse de traduction du mRNA.

1.2.3. L'endopeptidase 24.11 est une enzyme ubicniitaire à large distribution tissulaire:

La localisation tissulaire de l'endopeptidase 24.11 a été étudiée par

différentes méthodes qui vont de la mesure de l'activité enzymatique sensible

au phosphoramidon, aux dosages radioimmunologiques, en passant par la liaison

d'inhibiteurs tritiés spécifiques et de haute affinité. Bien que dans l'ensemble

ces différentes méthodologies aboutissent à des conclusions très semblables,

38 certaines discordances sont quand même observées dans les données de la littérature. Ces dernières semblent cependant davantage liées à l'utilisation d'espèces différentes plutôt qu'à la méthodologie elle-même.

Tous les auteurs décrivent cependant l'endopeptidase 24.11 comme une enzyme ubiquitaire qui est présente tant en périphérie que dans le système nerveux central et qui possède une très large distribution tissulaire.

De plus, sa distribution au sein d'un même tissu est très souvent hétérogène et discrète plutôt qu'uniforme et diffuse.

1.2.3.1. En périphérie;

L'endopeptidase 24.11 est présente dans de nombreux tissus périphériques parmi lesquels les reins (97), le placenta (98),les ganglions lymphatiques (99), le tractus génital mâle (100), le tractus gastro-intestinal (96, 101, 102), les cartilages et la moelle osseuse, l'hypophyse antérieure (103), les poumons (104), les glandes salivaires, les glandes surrénales, le pancréas, la thyroïde (96) et les neutrophiles (93, 105).

Quel que soit le tissu, l'enzjrme, souvent associée à des structures épithéliales comme les bordures en brosse, est toujours détectée sous une forme membranaire orientée vers le milieu extracellulaire.

Le rein est incontestablement l'organe le plus riche en endopeptidase 24.11 (97). Présente exclusivement dans le cortex rénal, l'enzyme est localisée en majorité sur la membrane apicale des cellules épithéliales des tubules contournés proximaux (106, 107) où elle représente environ 4 % des protéines membranaires. Elle est également détectée dans les glomérules où elle est concentrée dans une bande bien définie qui longe la membrane basale glomérulaire

(108).

plus abondante en endopeptidase 24.11 (109). La quantité d'enzyme varie fortement d'un ganglion à un autre mais elle y représente en moyenne 1 X des protéines.

L'enzyme est distribuée suivant un motif réticulé dans la medulla, le cortex et le paracortex mais elle est absente de la trabeculae, des sinus et des vaisseaux.

La localisation cellulaire de 1'endopeptidase 24.11 ganglionnaire a été déduite sur base des observations faites après mise en culture des cellules ganglionnaires. Dans ces conditions, la description des cellules qui expriment l'enzyme (5 à 25 % des cellules) coïncide avec celle des cellules réticulaires qui jouent un rôle important dans le maintien de la structure anatomique des ganglions (99).

D'autres tissus lymphoïdes, comme le tissu lymphatique lingual, le thymus ou la rate, contiennent également de 1'endopeptidase 24.11 mais à des taux cent fois plus faibles que dans les ganglions.

L'endopeptidase 24.11 est abondamment exprimée de manière transitoire à la surface des lymphocytes durant leur processus de différenciation à un moment où il y a réarrangement des gènes qui codent pour les Immunoglobulines et où ils acquièrent le phénotype B.

L'expression permanente de l'enzyme (aussi dénommée CALLA ou CDIO) à la surface des lymphocytes contribuait, jusqu'il y a peu, au diagnostic et à la classification de certaines leucémies lymphoblastiques (63). L'endopeptidase 24.11 était considérée comme absente de la surface des cellules lymphoïdes normales matures.

L'utilisation d'un inhibiteur spécifique de haute affinité comme ligand et un

dosage d'activité enzymatique très sensible a permis de révéler la présence

d'endopeptidase 24.11 sur les membranes des lymphocytes B et T matures. Le taux

d'enzyme y est très faible (environ 20 fois plus faible que celui des cellules

leucémiques) mais reste comparable à celui mesuré dans des membranes de cerveau

40 où l'enzyme exerce un rôle physiologique important (112).

L*endopeptidase 24.11 est abondamment présente dans le tractus génital mâle (100). Faible dans les homogénats de testicules, l'activité endopeptidase 24.11 est très élevée dans la fraction particulaire du liquide séminal et des homogénats de prostate ou d'épididyme. L'enzyme prostatique est localisée à la surface des cellules de l'épithélium luminal.

Les poumons contiennent également de 1'endopeptidase 24.11 (74).

Essentiellement présente dans les septa alvéolaires, l'enzyme est totalement absente de l'épithélium vasculaire (104). Les cellules pulmonaires exprimant 1'endopeptidase 24.11 sont notamment des fibroblastes.

La présence d'endopeptidase 24.11 dans ce type de cellules a été également montré dans la peau (111).

En ce qui concerne le tractus gastro-intestinal, l'estomac contient 1'endopeptidase 24.11 en quantité appréciable (101, 102) mais le maximum d'activité est mesuré dans le jéjunum et diminue progressivement à mesure que l'on progresse vers le colon où l'activité endopeptidase 24.11 est nulle (96).

L'enzyme intestinale est associée à la bordure en brosse des cellules épithéliales.

Dans le pancréas, l'enzyme est localisée dans les acini exocrines et sur les cellules épithéliales des canaux (96).

I.2.3»2. Dans le système nerveux central:

Les études les plus systématiques sur la localisation de 1'endopeptidase 24.11 ont été réalisées dans le système nerveux central.

L'endopeptidase 24.11 est distribuée d'une manière très hétérogène à travers

l'ensemble du système nerveux central.

Importantes dans le plexus choroïde, dans la substance noire, dans le striatum, dans le nucléus accumbens, dans les tubercules olfactifs et dans la substance gélatineuse de la moelle épinière. Elle est également présente en quantités modérées dans la matière grise périaqueductale, dans le noyau interpédonculalre et dans la couche moléculaire du cervelet (113).

Cette distribution de l'endopeptldase 24.11 présente une bonne corrélation avec les réglons du cerveau riches en récepteurs opioïdes et en enképhalines endogènes. Des zones dépourvues de récepteurs opiacés ou même d'enképhalines endogènes mais riches en endopeptidase 24.11 existent cependant (le plexus choroïde et la couche moléculaire du cervelet). D'autres neuropeptides, substrats potentiels pour l'enzyme, peuvent être mis en évidence dans ces zones suggérant donc que celle-ci est également impliquée dans d'autres mécanismes que le contrôle de la douleur.

Des observations contradictoires ont souvent été relatées dans la littérature en ce qui concerne la localisation cellulaire de l'endopeptldase 24.11. Il semble cependant que les travaux les plus récents et les plus cohérents plaident en faveur d'une localisation neuronale de l'enzyme plutôt qu'à la surface des cellules gliales (103, 114).

Ces résultats sont appuyés par le fait que les dégénérescences neuronales induites par l'injection d'acide kaïnique dans un lobe du cerveau sont toujours accompagnées par une forte baisse du taux d'endopeptidase 24.11. De plus, dans certaines maladies où une dégénérescence neuronale est observée (p.ex.: la maladie de Huntington), un taux réduit d'endopeptidase 24.11 est également

constaté.

II. MATERIEL ET METHODES: