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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Haumont, E. (1987). Modification post-transcriptionnelle IN VITRO d'acides ribonucléiques. Application à l'étude de la maturation de tRNAs IN VIVO (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/213473/1/ec63da9c-3df2-447e-8872-0142ca43f3ae.txt
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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DES SCIENCES
SERVICE DE CHIMIE BIOLOGIQUE
MODIFICATION POST-TRANSCRIPTIONNELLE IN VITRO
D'ACIDES RIBONUCLEIQUES
APPLICATION A L'ETUDE DE LA MATURATION DE tRNAsIN VIVO.
MEMOIRE PRESENTE EN VUE DE
L'OBTENTION DU GRADE LEGAL DE DOCTEUR EN SCIENCES CHIMiaUES
ETIENNE HAUMONT Université Libre de Bruxe Les
JUIN 1987
FACULTE DES SCIENCES
L’épreuve publique pour l'obtention du grade légal de Docteur en Sciences de Monsieur HAUMDNT, Etienne. Licencié en Sciences, pour le groupe des sciences chimiques, aura lieu le :
JEUDI 18 JUIN 1987 A 16.00 HEURES
dans le Grand Auditoire des Bâtiments de l'Université Libre de Bruxelles, 67 Rue des Chevaux, 1640 Rhode-St-Genèse.
Monsieur HAUMONT présentera et défendra publiquement une dissertation originale intitulée :
"Modification post-transcriptionnelle in vitro d'acides ribonucléiques.
Application à l’étude de la maturation de tRNAs in vivo."
et une thèse annexe intitulée :
"Le gène du petit RNA nucléaire U6 de Xénopus tropicalis est transcrit par un complexe comprenant une RNA polymérase ayant la même sensibilité à 1'o<-amanitine que la RNA polymérase III et des facteurs de transcription utilisés également par la RNA polymérase II".
DEFENSE PRIVEE : Vendredi 12 Juin 1987 à 14.00 heures
à Rhode-St-Genèse.
une grande variété de nucléosides modifiés. Ces modifications sont toutes post- transcriptionnelles et s'opèrent à partir des quatre bases fondamentales A, C, U ou G lors du processus de maturation des tRNAs.
Plus de 80 nucléosides modifiés ont été caractérisés dans tous les tRNAs séquences Jusqu'à présent ; certains sont le résultat de simples méthylations, d'autres ont une structure moléculaire beaucoup plus complexe. Les nucléosides hypermodifiés se trouvent toujours dans la région de Vanttcodon des tRNAs.
Une des difficultés majeures dans l'étude de la biosynthèse de ces nucléosides modifiés provient principalement de la difficulté d'obtenir des tRNAs qui en sont dépourvus.
Nous avons contourné ce problème en combinant diverses procédures enzymatiques nous permettant de remplacer un ou plusieurs nucléosides dans la boucle de l'anticodon de différents tRNAs de levure ; principalement les tRNA-Asp et tRNA-Arg. Grâce à cette technique de restructuration du tRNA, nous avons préparé de nombreux variants de tRNAs ayant une séquence de boucle d'anticodon altérée. Ces tRNAs ont été microinjectés dans le cytoplasme d'oocyte de Xénope. De cette manière, nous avons obtenu des renseignements sur la spécificité des enzymes catalysant la biosynthèse des nucléosides modifiés Q, glycosyl Q et I (situés en première position de l'anticodon) et lA et lA (située en position 3' adjacente à l'anticodon). ô ô
Les résultats indiquent que ces enzymes de modification sont sélectives et reconnais
sent non seulement des nucléosides spécifiques dans la boucle de l'anticodon mais
aussi d'autres paramètres de structure de la molécule de tRNA, comme une boucle
d'anticodon à sept nucléotides et l'espèce de tRNA.
FACULTE DES SCIENCES
SERVICE DE CHIMIE BIOLOGIQUE
MODIFICATION POST-TRANSCRIPTIONNELLE IN VITRO
D'ACIDES RIBONUCLEIQUES
APPLICATION A L'ETUDE DE LA MATURATION DE tRNAsIN VIVO.
MEMOIRE PRESENTE EN VUE DE
L'OBTENTION DU GRADE LEGAL DE DOCTEUR EN SCIENCES CHIMIQUES
ETIENNE HAUMONT
JUIN 1987
Je remercie Henri Grosjean qui m'a accueilli dans son laboratoire et qui a relu, avec attention, mon travail.
Un grand merci à Philippe Carbon, Michel Fournier, Suzy de Henau, Krikor Nicoghosian, Louis Drogmans et Luc de Vries pour leur collaboration.
Que Gérard Keith et les membres du laboratoire du professeur
Dirheimer de l'IBMC de Strasbourg trouvent ici l'expression de ma
gratitude.
A. L'ARN de transfert dans la synthèse protéique 2
1. Structure de VARN de transfert 2
2. Interaction tRNA-synthétase 6
3. Interaction tRNA - ARN messager 8
4. Autres interactions 10
B. Présence de nucléosides modifiés dans les tRNAs 14 1. Nucléosides modifiés situés en positim. 3' adjacente à l'anticodon 17
(position 37)
2. Nucléosides modifiés situés en première position de l'anticodon 23 (position 34)
3. Nucléosides modifiés situés dans la région de l'anticodon 27 (positions autres que 34 et 37)
4. Nucléosides modifiés situés en dehors de la région de l'anticodon 28
CONCLUSIONS 30
C. Transcription et maturation des gènes de tRNAs chez les eucaryotes 32 D. Biosynthèse des nucléosides modifiés et spécificité des enzymes de
modification 41
1. Généralités 41
2. Particularité de la formation de la queuosine, de l'inosine et de
la pseudouridine dans les tRNAs 44
m. CADRE ET BUT DU TRAVAIL 49
1. Généralités 49
2. Approche expérimentale 50
n. MATERIEL ET METHODES 52
1. Enzymes utilisées 52
2. Conditions d'utilisation des différentes enzymes 55
3. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide 57
4. Séparatim. et identification des nucléotides 59
5. Microinjection des oocytes 60
6. Restructuration des tRNAs 62
7. Maturation des tRNAs dans les oocytes 65
IV. RESULTATS ET DISCUSSION 67
1. Publications 1 et 2 67
2. Publications 3, 4 et 5 : Etude de la formation enzymatique de queuosine et de glycosyl-queuosine dans des tRNAs de levure microinjectés dans
des oocytes de Xenopus laevis 101
3. Publication 6 et résultats non publiés : Etude de la formation enzyma
tique de l'inosine en position 34 des tRNA-Arg et tRNA-Asp de levure ;
étude de l'effet de la séquence de l'anticodon 139
CONCLUSIONS GENERALES 161
Bibliographie
La fonction principale du tRNA est la traduction de VARN messager en protéine au niveau du ribosome. Le tRNA y joue un rôle central en étant le lien indispensable entre la séquence en bases de triplets de nucléotides, appelés codons, d'un ARN messager et la séquence correspondante en acide aminés d'une chaîne polypeptique (protéine).
Outre ce rôle primordial, ces molécules interviennent dans d'autres processus cellu
laires (Clark, 1980).
La synthèse des protéines est maintenant un processus assez bien connu qui comprend trois étapes : l'initiation, l'élongation et la terminaison.
Bien que les différentes étapes de cette synthèse soient "gouvernées" par le ribosome, la précision de la traduction de VARN messager en protéine repose sur l'estérification correcte du tRNA par l'acide aminé lui correspondant et sur la reconnaissance, sans faute, au niveau du ribosome, entre l'anticodon du tRNA chargé et le codon de VARN messager.
Le taux d'erreur, lors de la synthèse des protéines, est faible et varie suivant le tRNA considéré (Kurland et Ehrenberg, 1984). Les erreurs d'incorporation d'acides aminés sont estimées être, en moyenne, de l'ordre de 10 ^ par codon (Loftfield et Vanderjagt, '1972).
La structure du tRNA doit contenir toutes les informations nécessaires pour ses interactions spécifiques avec les composants (protéines et ARNs ribosomiques) de l'appareil de traduction.
Une des caractéristiques des tRNAs est de contenir un grand nombre de bases modifiées (et même hypermodifiées) qui apparaissent progressivement au cours du processus d'élaboration de molécules fonctiormelles (maturation).
Nous nous sommes proposés d'étudier l'importance de la structure du tRNA dans son interaction avec une catégorie d'enzymes appelées enzymes de modification, cataly
sant la formation des bases modifiées.
Avant d'entrer dans le vif du sujet, nous allons rappeler brièvement : - la structure particulière de la molécule de tRNA ;
- ses interactions spécifiques avec les "autres acteurs" de la synthèse protéique ; - la nature, la localisation et les rôles, parfois multiples, des bases modifiées chez
les procaryotes et les eucaryotes ;
- la transcription des gènes de tRNAs chez les eucaryotes.
Nous aborderons ensuite la biosynthèse des nucléosides modifiés ainsi que la spécifité
des enzymes catalysant ces modifications.
A. L’ARN DE TRANSFERT DANS LA SYNTHESE PROTEIQUE
1. Structure de VARN de transfert
Tous les tRNAs sont constitués d'une seule chôme polynucléotidique de longueur variable qui comprend en générale, selon l'espèce de tRNA, de 74 à 94 nucléotides.
R existe toutefois certaines exceptions comme le tRNA-Lys de mitochondrie de foie de rat qui ne comprend que 57 nucléotides (Randerath et colL, 1981) ou le tRNA-Ser de mitochondrie humaine qui en comprend seulement 63 (de Bruijn et coll., 1980).
Si l'on tient compte des appariements intermoléculaires entre hases (liens hydro
gènes) de type Watson-Crick, on peut représenter les molécules de tRNAs sous forme de feuille de trèfle constituant ainsi la structure secondaire voir figure 1, page 3). Cette structure caractéristique a été proposée par Holley et coll. en 1965, qui établirent pour la première fois la séquence d'un tRNACle tRNA-Ala de E. coli).
Depuis lors, plus de 600 séquences de tRNAs provenant de divers organismes ont été déterminées ; toutes s'accordent avec ce modèle structurel (voir dans Sprinzl et coll., 1985).
La structure secondaire peut être divisée en plusieurs régions : les régions appariées appelées tiges ou bras et les régions non appariées appelées boucles (voir figure 1 ,page 3).
A l'exclusion de certains tRNAs mitochondriaux, tous les tRNAs comprennent quatre régions appariées :
1) La tige acceptrice comprenant l'extrémité 5' phosphate et le triplet CCA placé à l'extrémité 3' ; l'acide aminé se fixe sur l'adénosine terminale. Tous les tRNAs-His ont une nucléotide supplémentaire en 5' qui peut parfois s'apparier avec le nucléotide situé juste avant la queue CCA formant ainsi une tige acceptrice contenant 8 paires de bases au lieu de 7.
2) la tige dihydrouridine qui comprend de 3 à 4 paires de bases.
3) la tige de l'anticodon qui comprend toujours 5 paires de bases, parfois différentes des paires Watson-Crick classiques ;
4) la tige VfC qui comprend, comme celle de l'anticodon, 5 paires de hases.
La plupart des tRNAs comprennent également 4 boucles contenant un nombre
variable de nucléotides non appariées :
Tige et boucle Dihydrouridine
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Tige acceptrice
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Boucle variable Tige et
boucle anticodon
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Figure 1 Structure secondaire en feuille de trèfle de TARN de transfert La numérotation des nucléotides se réfère à ceux de TARN de transfert phénylalanine de levure
. Les nucléotides entourés d'un trait épais sont communs
â tous les ARN de transfert
1) la boucle dihydrouridine qid comprend de 7 à 11 nucléotides ;
2) la boucle de Vanticodon qui comprend 7 bases non appariées ; elle contient Vanticodon qui reconnaît le codon du RNA messager ;
3) la boucle TfC est toujours constituée de 7 bases non appariées contenant la séquence particulière TfC (sauf notamment dans les tRNAs méthionine initiateurs d'eucaryotes ou l'on trouve la séquence A UC).
4) une boucle variable qui contient un nombre différent de bases selon le tRNA considéré. Cette boucle est responsable des plus importantes différences en taüle des tRNAs puisqu'elle peut comporter de 3 à 21 nucléotides ; ceux-ci peuvent former jusqu'à 5 paires de base créant ainsi une nouvelle tige. Les tRNAs-Leu, tRNAs-Ser et certains tRNAs-Tyr ont toujours une grande boucle variable.
La structure tertiaire des tRNAs, déterminée par étude cristallograpihique (Kim, 1981) peut être schématisée sous la forme d'un L qui s'obtient en empilant en une longue hélice les tiges dihydrouridine et anticodon d'une part, les tiges acceptrices et TTC d'autre part. Dans cette structure, la plupart des bases sont orientées de manière à pouvoir s'empiler les unes sur les autres (stacking), rendant maximale l'interaction entre leurs faces hydrophobes. Une des extrémités du L comprend le site d'attachement de l'acide aminé et l'autre la boucle de l'anticodm. Ces deux extrémités, responsables des deux activités du tRNA, apparaissent très accessibles et se trouvent à environ 70 A l'une de l'autre (voir figure 2 p. 5).
Le maintien de la structure tridimensimnelle implique des interactions par liens hydrogènes, englobant parfois 3 bases au lieu de 2, qui n'apparaissent pas dans la structure secondaire conventionnelle en feuille de trèfle. Des interactions par empilement de bases entre différentes régions du tRNA sont également impli
quées. Les interactions "tertiaires" se produisent principalement entre les boucles dihydrouridine et TfC.
Bien que les séquences en bases des tRNAs aient dû être soumises à de nombreuses
mutations au cours de l'évolution, elles ont été conservées à un degré élevé. On
constate, en comparant les séquences des tRNAs, qu'à certaines positions les bases
sont invariables. Si l'on considère par exemple les séquences des tRNAs élongateurs
d'eucaryotes (Grosjean et coll., 1982), on trouve comme bases invariantes : G19,
U33, T54, Y55, C56. A d'autres positions (à 1 ou 2 exceptions près), on retrouve
presque toujours les mêmes bases : U8, A14, G18, G53, A58, C61. Certaines
positions sont toujours occupées, soit par une purine, soit par une pyrimidine : ce
sont les positions semi-invariantes 11, 24, 32, 37.
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Figure 2
A. Structure tertiaire hidimensiormelle du tRNA-Phe de levure (les lignes indiquent les interactions tertiaires)
B. Structure tridimensionnelle du tRNA-Phe de levure (Kim, 1979)
Beaucoup de hases invariantes ou semi-invariantes jouent un rôle dans le maintien de la structure tertiaire du tRNA. Ceci explique mieux dès lors leur conservation et suggère également que la forme de la structure tertiaire de tous les tRNAs doit être sensiblement la même. Cependant, certaines bases sont conservées à des positions nécessaires à la fonction du tRNA lors de la synthèse des protéines ; d'autres peuvent faire partie aussi du signal de reconnaissance pour la RNA polymérase lors de la transcription.
En particulier, la boucle et la tige de Vanticodon présentent des caractéristiques qui leur sont propres (Grosjean et coll., 1982). La comparaison de 260 tRNAs d’origines différentes montre que, à quelques exceptions près, les 3 nucléotides de Vanticodon sont situés au milieu d'une bouche de 7 nucléotides. Du côté 5' de Vanticodon (positions 32 et 33), on ne trouve que des pyrimidines ; la base en position 33 est une uracile dans tous les tRNAs élongateurs, la base en 32 est parfois modifiée (pseudouridine ou méthyl en OH 2' sur le ribose). La base en 3’ de Vanticodon est toujours une purine, souvent modifiée d'une façon caractéristique (base hypermodifiée). En position 38, on trouve souvent une adénosine non modifiée bien que des pyrimidines parfois modifiées ou une guanosine (rarement) soient aussi tolérées. La distribution des nucléotides dans la tige de Vanticodon est également caractéristique. On ne trouve jamais de A en position 40 excepté dans les tRNAs de mitochondries. La paire de base en position 29-41, au milieu de la tige de Vanticodon, est toujours une paire Watson-Crick complémentaire qui ne contient pas de base modifiée.
R est à remarquer que plus on séquence de tRNAs, plus on constate que des positions qui semblaient totalement invariantes ne le sont plus. Parfois ces exceptions sont propres à un tRNA, parfois elles se produisent dans des cellules particulières.
2. Interaction tRNA - Synthétase
La spécificité de la reconnaissance par une synthétase d'un tRNA lui correspondant est une donnée essentielle pour la précision de la synthèse protéique. De nombreux auteurs ont démontré l'importance de la conservation de différentes "régions" du tRNA (c-à-d l'extrémité 3' acceptrice, Vanticodon, le bras dihydouridine) afin que l'interaction tRNA - synthétase se forme correctement. R est à noter que, suivant l’espèce de tRNA, ces régions ont plus ou moins d'importance ; ceci est compréhen
sible si Von tient compte de la grande variabilité de structure des synthétases correspondant aux différents tRNAs. Ainsi, chez E.coli, leur poids moléculaire est compris entre 59 et 227 Kd et leur structure peut être du type o(,ot2,c<4 ou encore
ci2p2 (Schimmel et Sôll, 1979).
Des études génétiques ont montré l'importance du bras accepteur du tRNA pour une bonne reconnaissance de celui-ci par sa synthétase : une série de tRNAs-Tyr
+3 ^
suppresseurs (su ) mutés dans le bras accepteur sont misacylés par la glutamine (Smith et Celis, 1973).
Des études par modification chimique du tRNA initiateur de E.coli effectuées par Schulman (1979) ont montré que la mutation de l'une ou l'autre base dans le bras accepteur conduisait à l'inactivation totale du tRNA.
Crothers et coll. (1972) ont introduit l'hypothèse que la quatrième base en partant de l'extrémité 3' terminale du tRNA serait un important discriminant pour l'interaction entre tRNA et synthétase. L'hypothèse a été testée in vitro par Uemura et coll. (1982) sur le tRNA initiateur de E.coli. Dans ce cas, elle n’est pas vérifiée : l'aminoacylation du tRNA ne dépend pas d'une manière critique de la nature du nucléotide "discriminant".
n existe, de plus, deux cas connus (les tRNAs cytoplasmiques de levure correspon
dant h la lysine et à l'arginine) où dans une famille de tRNA isoaccepteurs, on trouve des bases différentes à la position discriminante (voir dans Sprinzl et coll., 1985).
Ces exemples montrent donc qu'un changement du nucléotide discriminant n'abolit pas nécessairement l'aminoacylatiœ. du tRNA par la synthétase correspondante.
D'autres régions du tRNA, comme celle de l'anticodon, sont impliquées dans la bonne reconnaissance entre le tRNA et sa synthétase. Schulman et coll. (1983) ont montré qu'une simple substitution de base en première position de l'anticodon du tRNA- fmet de E.coli empêchait la synthétase de reconnaître le tRNA. Leurs résultats impliquent donc l'existence d'une interaction entre la méthionine-tRNA synthétase et la base en première position de l'anticodon durant l'aminoacylation du tRNA- fmet. Dans un même ordre d'idée, le changement des bases U35 et A36 en A35 et U36 conduit à la conversion du tRNA méthionine initiateur en accepteur de la glutamine (Schulman et Pelka, 1985). Bare et Uhlenbeck (1985) ont également montré que le tRNA-Tyr de levure (anticodon GfA) modifié pour avoir un anticodon GAA spécifique pour le codon UUC de la phénylalanine, était misacylé par la phénylalanine tRNA synthétase de levure, in vitro, à un taux dix fois plus grand que le tRNA-Tyr non modifié.
Dans le cas des tRNA-Ser et tRNA-Leu, l'implication de l'anticodon semble moins
évidente puisqu'il y a 5 isoaccepteurs correspondant à chacun des 2 acides aminés
et ces cinq tRNAs sont reconnus par la même synthétase.
D'autres exemples indiquent que la reconnaissance entre tRNA et synthétase implique la présence d'une structure correcte du tRNA. Ainsi l'insertion d'une guanine supplémentaire dans la boucle de l'anticodon du tRNA-Pro (anticodon UGG) de C élégans conduit à l'inactivation du tRNA (Corho et coll., 1982).
Pour ce même tRNA, la mutation de G45 G46 (situés dans la boucle variable) en A45 A46, entraîne la perte de la capacité d'être aminoacylé. Les bases en positions 45 et 46 sont engagées dans des interactions tertiaires avec les nucléotides en positions 10 et 22 respectivement. Si l'une seulement de ces interactions est éliminée par mutation, le tRNA reste aminoacylable, si par contre les deux interactions sont éliminées, le changement de structure pour le tRNA est tel que celui-ci n'est plus reconnu efficacement par sa synthétase.
Les points précis de contacts du tRNA avec sa synthétase varieraient suivant le cas considéré (Butorin et coll., 1982). Cramer et coll. (1979) soutiennent que la reconnaissance entre le tRNA et sa synthétase comprend différentes étapes englobant des changements de conformation séquentiels entre les deux molécules, celles-ci s'imbriquant en différents endroits. Une étape critique pourrait également être un attachement temporaire par liaison covalente entre un site de la synthétase et l'uracüe invariante en position 8 des tRNAs (Starzyk et coll., 1985).
La structure du tRNA est donc primordiale dans ce phénomène de reconnaissance entre un tRNA et une protéine. R semble qu'il n'y ait pas de mécanisme unique de reconnaissance qui puisse être appliqué à tous les tRNAs ; les sites de reconnais
sance se trouvant en différents endroits du tRNA, selon l'espèce.
Ces quelques exemples, parmi de nombreux autres, tendent à montrer que la reconnaissance et l'interaction entre tRNA et synthétase impliquent non seulement une séquence correcte du tRNA en nucléotides mais également une structure conforme. L'importance de l'un ou l'autre de ces paramètres prend des proportions différentes suivant le tRNA et la synthétase considérés.
Les multiples études sur la spécificité des synthétases n'ont pas encore permis de dégager les paramètres de structure du tRNA essentiels à la reconnaissance entre l'acide nucléique et ces protéines.
3. Interaction tRNA-ARN messager
La traduction correcte du message génétique ne repose pas uniquement sur une interaction correcte entre tRNA et synthétase mais également sur une reconnais
sance exacte entre le codon et l'ARN messager et l'anticodon du tRNA.
On sait qu'il existe 61 codons correspondant à 20 acides aminés (dégénérescence du code génétique). On a constaté qu'un tRNA peut s'apparier avec des codons différents.
Pour l'expliquer, Crick (1966) a introduit l'hypothèse du "wooble" : la première base de l'anticodon du tRNA (position 34) peut interagir, par liens hydrogènes, avec la troisième base du codon par des appariements non usuels (différents de paires A-U ou G-C). U en première position de l'anticodon peut interagir avec G en troisième position du codon ; G peut reconnaître U ; I (inosine) pourrait reconnaître U, A et C.
Cette hypothèse exclut les paires UU, UC, CU et toutes les autres paires qui ne formeraient pas au moins deux liens hydrogènes (C-C ; CA ; I~G; GA ; G-G). Le modèle est basé sur des considérations structurales et également sur des expérien
ces de fixation in vitro de tRNA sur un complexe ribosome-codon.
Depuis lors, différents exemples ont montré l'existence d'appariements exclus par l'hypothèse du wobble. Ainsi dans le cas des tRNAs mitochondriaux de levure, un seul tRNA ayant une uridine-34 non modifiée peut décoder une famille homogène de codons XYA, XYU, XYG, XYC (Sibler, 1984). Munz et coll. (1981) ont montré que in vivo chez S. Pombe, le tRNA-Ser (anticodon IGA) ne reconnaît que les codons UCU et UCC, c'est-à-dire que I ne s'apparie bien qu'avec U et C. Le codon UCA n'est efficacement décodé que par un tRNA-Ser mineur ayant l'anticodon U^GA (U^ est une uridine modifiée). Ceci va également à l'encontre du principe de décodage "two out of three" proposé par Lagerkvist (1978, 1981) et basé sur des expériences de synthèse de protéines in vitro. Cette méthode de décodage implique que dans une famille de codons qui diffèrent seulement en troisième position et codent pour le même acide aminé la spécificité du décodage est basée sur l’interaction correcte de l'anticodm du tRNA avec les deux premières bases du codon, en ne tenant pas compte de la nature de l'interaction avec la base en position 34. Ce modèle s'appliquerait essentiellement aux codons dans lesquels les deux premières bases sont des G ou des C (en effet, les interactions G-C sont plus stables que les interactions A-U). Même, dans ce cas, cette hypothèse a été infirmée. Ainsi Murgola et Pagel (1980) ont montré que chez E.coü pour décoder la famille de codons GGX spécifiant la glycine, plusieurs tRNAs sont indispensables.
Comme on le voit, il est difficile de définir des règles univoques de décodage sur la
base "d'appariements" autorisés ou non entre les bases du codon de l'ARN messager
celles de l'anticodon du tRNA.
La spécificité de la reconnaissance des codons du messager par les tRNA est également influencée par la présence de nucléotides modifiés (voire hypermodifiés) qui, selon les tRNAs, font partie de l'anticodon et/ou sont directement adjacents à celui-ci (voir le chapitre sur les bases modifiées).
A l'heure actuelle, il semble établi que l'efficacité de décodage d'un tRNA ne dépend pas uniquement de son anticodon. Ainsi, par exemple, tous les tRNAs suppresseurs de codons ambre ont le même anticodon CUA ; ils montrent cependant une grande variabilité dans leur capacité d'insérer un acide aminé en réponse au codon U AG. Ceci a été démontré récemment par Yarus et coll. (1986). Rs ont transplanté réciproquement la séquence de la tige de l'anticodon de différents tRNAs suppresseurs de codons ambre par des techniques de recombinaisons de DNA. Leurs résultats indiquent que l'efficacité de translation d'un tRNA est également une propriété de la structure de la tige de l'anticodon.
Les tRNAs suppresseurs les plus efficaces sont ceux dont la séquence en bases ressemble le plus à celle trouvée dans les tRNAs suppresseurs naturels. Pour expliquer cette relation entre la structure et la fonction du tRNA, Yarus a, en 1982, introduit Vidée "d'anticodon élargi". Son argumentation repose sur deux idées principales : premièrement, "l'anticodon fonctionnel" fait partie d'une structure plus large : "l'anticodon élargi" ; deuxièmement, cet anticodon élargi est organisé pour être en harmonie avec un nucléotide qu'il appelle cardinal (c'est le nucléotide en position 36). Quand nucléotide cardinal et anticodon élargi sont en concordance, le tRNA se comporte d'une manière efficace et précise lors de la traduction. Cette théorie permet d'expliquer pourquoi certaines catégories de tRNAs donnent "par mutation" des suppresseurs de codons de terminaison efficaces et d'autres pas. Les tRNAs suppresseurs dans lesquels le nucléotide cardinal et l’anticodon étendu ne sont pas en harmonie sont de faibles suppresseurs.
4. Autres interactions
D'autres interactions entre tRNA et composants de la machinerie de traduction génétique interviennent également pour maintenir la fidélité de la traduction.
Les interactions du tRNA avec le ribosome ont une grande importance principa
lement celles avec les protéines ribosomales (Cantor, 1979). Une altération de
celles-ci peut conduire à une absence de reconnaissance entre le tRNA et le
ribosome. Nomum et coll. (1970) ont montré l'importance des protéines ribosomales
S8, SIO ou S14 pour la fixation du tRNA sur le ribosome ;
l'absence de l’une de ces protéines élimine l’interaction du tRNA avec le ribosome.
De même, la protéine SU participe directement à la sélection du tRNA correct : en l’absence de SU, des erreurs d'incorporation d’acides aminés (l’incorporation d’isoleucine, de tyrosine et de sérine dans un système in vitro programmé avec du polyU, codant normalement pour la phénylalanine) sont multipliées par un facteur 6,5.
La précision de la sélection des tRNAs au niveau du ribosome dépend également de l’état de la protéine S12. L’altération de cette protéine confère la résistance à la streptomycine et rend les ribosomes plus précis in vivo et in vitro. Une des conséquences de cette résistance à la streptomycine est également que certains tRNAs suppresseurs de non sens et de faux sens sont moins efficaces (Gorini, 1974).
Yarus et coll. (1980) ont montré par des manipulations génétiques que l’efficacité d’un tRNA au niveau d’un ribosome résistant à la streptomycine était déterminée plus par la boucle et la tige de l’anticodon que par le reste de la molécule.
Lors du cycle d’élongation de la synthèse protéique, l’aminoacyl-tRNA "entre" dans le ribosome sous la forme d’un complexe ternaire incluant le facteur d’élongation EF-Tu et du GTP. La formation de ce complexe est nécessaire pour une fixation spécifique du tRNA au site accepteur du ribosome. Le facteur d’élongation n'a bien sûr pas de spécificité poir l’espèce de-tRNA, excepté pour le tRNA initiateur pour lequel son affinité est très réduite lorsque le tRNA est formylé (Hansen et coll., 1986). Les tRNAs initiateurs possèdent d’ailleurs des caractéristiques de structure qui leur sont propres comme la présence de trois paires de bases G-C consécutives dans le bras de l’anticodon. Lorsque, par mutations dirigées, on remplace l’une après l’autre ces trois paires de bases G-C par celles trouvées dans le tRNA élongateur correspondant, on constate une décroissance progressive de l’activité du tRNA muté dans l’initiation de la synthèse protéique. L’effet des mutations se fait ressentir au niveau du site peptidyl du ribosome (Seong et Rajbhandary, 1987).
Par des méthodes chimiques, Bertram et Wagner (1982) ont montré que les
nucléotides protégés par le facteur d’élongation EF-Tu sont ceux qui sont invariants
ou semi-invariants. On peut dès lors penser que ces nucléotides forment des
structures "locales" communes h tous les tRNAs élongateurs reconnus par le
facteur d’élongation. Ceci pourrait expliquer pourquoi ces nucléotides se retrouvent
à ces positions dans tous les tRNAs et ont été conservés au cours de l’évolution.
différents constituants de la machinerie de synthèse protéique est primordiale pour un fonctionnement efficace de cette dernière.
Dans ces contacts, la flexibilité de la molécule de tRNA est aussi importante. Des mesures de susceptibilité des nucléotides du tRNA à différentes nucléases indi
quent que celui-ci adopte une conformation différente selon qu'il se trouve au site P ou au site A du ribosome ; la structure du tRNA serait plus ouverte lorsqu'il se trouve au site A (Jorgensen et coll., 1985).
De même, la fluorescence de la base Y située en 3' de Vanticodon du tRNA-Fhe est affectée par la présence, ou l'absence, du messager sur le ribosome, ce qui indiquerait un changement de structure (par rapport à la base hypermodifiée) de la boucle de Vanticodon (Cantor, 1979).
Harvey et Mc Cammon (1981) ont réalisé une étude théorique des différentes conformations possibles du tRNA-Phe en tenant compte de la flexibilité des liaisons de chaque atome de la molécule. R ressort de leur travail que le tRNA est flexible d'une manière surprenante, pouvant se tordre avec des angles aussi grands que 30° pour un coût énergétique de quelques kilocalories par mole. Ces énergies sont comparables à celles contenues dans quelques moles de liens hydrogènes, une quantité d'énergie qui peut être apportée par des interactions avec un solvant ou avec des macromolécules, ceux-ci modulant alors la structure du tRNA et sa flexibilité.
Le travail de Beresten et coll. (1983) illustre bien cette idée : lors de l'interaction du tRNA-Trp de bœuf avec sa synthétase, il y a changement mutuel de structure des deux molécules, le résultat pour le tRNA étant une susceptibilité plus grande du bras de Vanticodon et du bras accepteur à l'hydrolyse par l'endonucléase de venin de cobra spécifique des RNAs double brin.
X X
X
Dans ce chapitre, nous avons voulu montrer par quelques exemples l'implication de la structure du tRNA tout au long du processus de la synthèse protéique.
Le lecteur qui désirerait en savoir plus, peut se reporter à l'ouvrage suivant : "Transfer RNA, Structure Properties and Récognition" (1979) - partie I et R, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
Le lecteur plus intéressé par la précision dans la synthèse protéique peut se référer à
Buckingham et Grosjean (1985) ou encore à Kurland et Ehrenberg (1984).
Une des caractéristiques des tRNAs est de contenir une grande variété de nucléosides modifiés dérivés des quatre nucléosides parents A, C, U et G normalement trouvés dans les ARN s (voir figure 3, page 14),
Toutes les modifications sont post-transcriptionnelles et se produisent après la synthèse du tRNA, durant le processus de maturation.
On trouve également des nucléosides modifiés dans les ARNs messagers, les ARNs ribosomiques, les petits ARNs nucléaires et même dans le DNA, mais jamais dans une proportion aussi grande que dans les tRNAs. Par exemple, le tRNA-Trb de foie de bœuf compte 15 nucléotides modifiés sur un total de 75 nucléotides (Fournier et coll., 1978). Les nucléotides modifiés des tRNAs montrent une grande variété de structure.
On en a isolé et caractérisé à ce jour plus d'une soixantaine (Bjôrk, 1984 ; Bjork et coll., 1987).
Certaines modifications sont de simples méthylations sur la base ou sur l'hydroxyle en 2' du ribose, ou encore des thiolations, mais il existe aussi un certain nombre de nucléosides dits "hypermodifiés" comme Y et Q, qui sont modifiés de façon beaucoup plus complexe. Les modifications des pyrimidines (C et U) sont en général moins élaborées que celles des purines (A et G). La formation de presque toutes les bases modifiées nécessite la présence de molécules donneuses (S-adenosylméthionine, thré
onine, isopenténylpyrosphospihate, etc).
Certaines nucléosides modifiés commet , T ou D sont présents dans les tRNAs de la plupart des organismes. Certains ne le sont que chez les procaryotes, d'autres uniquement chez les eucaryotes (voir figure 4, page 13). Il est à noter que le nombre et l'importance des modifications augmentent avec la hiérarchie phylogénétique des tRNAs (Cedergren et coll., 1981).
On trouve en moyenne 7,9 bases modifiées par tRNA chez E. Coli, 11 bases modifiées par tRNA pour la drosophile et 12,3 bases modifiées par tRNA de foie de rat (Mc Closkey, 1986).
In prokaryotic tRNAs only
în eukaryotic tRNAs only
s-C m^C
s"U m’C
o’U mcnv'U
mo’U Tm
cmo’U m’G
mamVU miG
cmam’U i‘A
cmamVU m'I
mcmo’U Wye and
m^A m‘A ms^i^A
dérivatives
Figure 4
Psaudouridina ( Oihydrouridina (0 Of nu)
fliboihymidma (T) 3>(3*Amino*3>
carboxypropyl) uridina (acp^UI
3-Mathyicytidlna
Im’C) S-Ma(hyicytidina
(m'C)
Ribott Ribost
5'Methoiyundine
(mo'‘U)
Urtdln*5»
oiyacetic acid (V)
NHCOCH,
Rlboat
t
/y«-Ac«tyicytldina lw*C)
Riboif Ribos«
S-|M«tho*ycart>onyÉ* 4-Thloufldio* (s*U) meihyi) undine
(mcm»U)
0
5-Methyi-2-ihlo* Riboie
uricin«(fn»a^U) Iftotine(l)
Ribott 2-Thiocytldin« (s^C)
HN-CH
Ribo«a
A^*'Methyiadanoaln«
(m«A)
O
Ribo««
t'Meinylinoaina
{m’D
NH
RibOM l'Methylaidanosina (m A)
0
CMj-COOCH,
Riboaa
O
I Ribosa
NM-CH,
^(Maihoiycarbonyï* 6-Ma(hylaniino«
matnyi)<2-intouMdina mainyU2 ihtouridina CH
I 0 CHOH Il H I hn-C-n-C-COOH
Ribota
N.{N^{9-0 ’O’Ribty
Iuranoayi0urin*4-yi) carbamoyl]thraonina (l‘A)
O CHOH Il H I m,CN-C-N-C-COOH
> ■ - U
Ô:>
w*(/v.(9-0 -o-flibo- furanotyipurlo-^-yl) /V-maihyicarbamoyl) inreonlna (m(<A)
Riboat Riboia
N«>tiopantanyi* 2-Mathyithio<A/«>
«danosina (i*A) isooantanyiadanosina
l
NHCOOCH.
I *
CHCOOCH,
NHCOOCH, CHCOOCH3 HCOOH
CH,
1
8asa "oaroiy Y"
loyW)
O CHOHI *
» L
MN-C-NH-CH CH,OH N C 0 N H - C - C H , 0 H
7
CH,OHRibosa N^{N‘\^9^^ -o-nibo*
furanoaylourln*6-yl) carDamoyijlhraonylj 2-amido-2‘bydroKy>
mathyiprooana>l. 3*
dio*’**
O H,C
I Ribosa l<Maihytguanosina (m'G)
ftaM ’‘Yr m
R s h: Û (quauosinaorOuo'*n Ribosa fl s |3 •□•mannoayi: manQ‘»J fl s ^-o-galactosyl: gaiQ'«>W'-Mathyiguanoaifta «».N*-Olmaibyl- 7-Mathylguanoalna
(m^G) guanoaina (m^Q) (m'G)
Figure 3 Représentation de quelques bases modifiées des tRNAs
Aspect fonctionnel et localisation des nucléosides modifiés Aspect foncUanml
La complexité structurelle de beaucoup de nucléosides modifiés, leur présence à des endroits spécifiques de la molécule, leur présence dans tous les tRNAs séquencés jusqu'à présent et provenant d'une grande variété d'organismes, suggèrent que ces nucléosides dit mineurs jouent un rôle non négligeable dans la fonction du tRNA.
n semble qu'aucun des nucléosides modifiés ne soit essentiel pour le maintien de la structure tertiaire du tRNA ; ils pourraient cependant servir à stabiliser la structure correcte de la molécule en prévenant des appariements de bases incorrects ainsi que l'avaient suggéré Kelmers et Zachau (1971).
La présence des modifications peut, selon le tRNA, accroître sa surface jusqu'à 20 % (Kim, 1979), suggérant qu'elles pourraient servir de signal de reconnaissance pour des protéines et/ou des acides nucléiques (Bjork, 1984).
Localisation
Si, à première vue, les nucléosides modifiés sont répartis dans toute la molécule de tRNA, ils sont cependant le plus souvent situés à des positions spécifiques de la structure en feuille de trèfle, selon le type de modification.
Les nucléosides modifiés les plus "simples" peuvent parfois se trouver à de nombreux endroits de la molécule. La pseudouridine ( ) peut occuper 20 positions différentes, la dihdrouridine (D) peut occuper 6 positions différentes dans la boucle du même nom. Le plus souvent cependant, les nucléosides modifiés, même simplement, se trouvent à des positions bien précises de la molécule (Dirheimer, 1984) (voir figure 6, page 16).
Les nucléosides "hypermodifiés" occupent toujours la première position de l'anticodon (position 34) ou la position 3' adjacente à celui-ci (position 37 ; le nucléoside modifié étant toujours dérivé d'une purine). R est à noter que la région anticodon (tige et boucle) est particulièrement riche en bases modifiées.
On peut classer les nucléosides modifiés en quatre groupes suivant leur position dans le tRNA :
1) Ceux situés directement en 3' de l'anticodon (position 37)
2) Ceux situés en première position de l'anticodon (positon 34 ou position "wobble")
Figure 5 Positions occupées per différents nucléosides modifiés
© ARCHAEBACTERIA 0
@-(11. m*I (50(52)(J5^
\
V, m'if, Um
0
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EU8ACTERIA a EUKARYOTES
m^U. m* Um
(5?
Figure 6
Gm mcm’U ^ mnm’s^U
Q mcm’s^U cmnm’s^U
goiQ s*U mo’u
manO Um cmo’U
cmnm’U mse mcmo*U
cmSU Cm oc<C
3) Ceux situés à un endroit de la boucle de Vanticodon différent de la position 34 ou 37
4) Ceux situés à un autre endroit de la molécule.
Dans les paragraphes qui suivent, nous allons montrer par quelques exemples le rôle plus particulier de certains nucléosides modifiés appartenant à ces différents groupes.
1 ) Nucléosides modifiés situés en position 3' adjacente à Vanticodon (position 37)
Le nucléoside en position 37 est toujours une purine ; elle peut être modifiée de nombreuses manières différentes.
R existe une corrélation entre la nature du nucléoside en position 37 et la nature de la première base du codon correspondant (Nishimura, 1979) (voir figure 7 , page
18).
Ainsi, la plupart des tRNAs qui reconnaissent un codon commençant par un U ô 2 s contiennent en position 37 un nucléoside modifié hydrophobe comme i A, ms i A, Y, tandis que la plupart des tRNAs qui reconnaissent un codon commençant par un A contiennent un nucléoside modifié hydrophile comme t®A ou ses dérivés mt°A,
ms t A.
Parfois, ces nucléosides ne sont pas modifiés comme dans certains tRNAs initia
teurs ou de phage T4 par exemple.
Par contre, il n'existe pas de corrélation semblable pour les tRNAs qui reconnais
sent des codons commençant par G ou C ; ces tRNAs sont soit non modifiés à cette position, soit contiennent un nucléoside simplement méthylé comme m^G, m^I, m^A, m^A.
Nishimura (1972) a suggéré que ces modifications favorisent l'appariement correct
entre codon et anticodon, en stabilisant la structure de la boucle de Vanticodon et
en renforçant l'interaction des paires A-U ou U-A entre la première position du
codon et la troisième position de Vanticodon. Gefter et Russel (1969) ont ainsi
montré que l'absence de la modification "ms i " sur Vadénosine en position 37 pour
un tRNA-Tyr (suppresseur de codon ambre U AG) réduit l'efficacité du tRNA
suppresseur à se fixer au ribosome en présence du codon approprié in vitro.
Anticodon loops
nnt^
mrt^A t^A
m'G
V
ms^i^A i^A
m'G
m^A
’A
m® A
,m^A A
,Gly
C vc c m c c
• •
G G
jnRNA5'
—^ means stabilisation by stacking
Codons
B
Figure 7
Corrélation entre la séquence de Vanticodon et la modification trouvée en position
37(A) et en position 34(B)
Autrement dit, l'efficacité de ce tRNA suppresseur dans la terminaison de la synthèse des protéines est réduite. Une exigence similaire en la modification i A pour la suppression efficace in vivo par le tRNA-Tyr de levure (suppresseur de UGA) et par le tRNA-Ser de S. Pombe a été montrée (Latten et coll., 1978 ; Janner et coll., 1980). Ces études indiquent que la sous-modification de A37 n'a pas d'effet sur l'aminoacylation du tRNA mais qu'elle affecte une étape postérieure de la synthèse des protéines comme la fixation du tRNA au niveau du complexe ARN messager-ribosome.
Dans une étude sur la formation et la dissociatim de complexes entre tRNAs ayant des anticodons complémentaires, Grosjean et coll. (1976) ont examiné la relation entre la modification de la purine en 37 de différents tRNA-Phe (anticodon GAA ou GmAA) sur la stabilité du complexe avec un tRNA-Glu de E.coli (anticodon mam^s^UUC). Rs ont trouvé que le tRNA-Phe de E.coli (ms^i^A37) forme un complexe aussi stable avec le tRNA-Glu de E.coli, que le tRNA-Phe de levure (Y37). Les complexes entre tRNA-Phe de mycoplasme (m^G37) ou tRNA-Phe de levure (sans Y en 37) avec le même tRNA-Glu sont nettement moins stables. Ceci indique que l'hypermodification de la base adjacente en 3' de l'anticodon est correllée avec une augmentation de la stabilité de l'interaction anticodon- anticodon.
Si le rôle de stabilisation de l'hypermodification en 37 est évident, il ne semble p®e nécessaire pour le bon fonctionnement du tRNA dans la synthèse des protéines.
C'est ainsi que des souches mutantes de E. Coli ou de levures auxquelles il manque O fs fy
la modification ms i ou i dans les tRNAs, poussent presqu'aussi bien que les souches sauvages (Latten et coll., 1978 ; Janner et coll., 1980). R est possible cependant que dans certaines souches mutantes, la synthèse de certaines protéines soit affectée ou ne se fasse plus du tout. Une comparaison systématique des protéines synthétisées dans les différentes souches serait utile pour étayer cette hypothèse.
L'hypermodification joue également un rôle dans des mécanismes fins de régu
lation.
R existe une souche de E.coli appelée miaA (ou TrpX) qui ne possède pas la
modification ms i A (Einsenberg et coll., 1979). Dans ce mutant, l'opéron trypto-
phane est en partie déréprimé. La transcription de l'opéron Trp est régulée en deux
sites. Au site opérateur, l’initiation de la transcription est contrôlée par interaction
avec un complexe aporépresseur - L tryptophane.
L'opéron est aussi régulé par un mécanisme qui fonctionne en série avec le système opérateur-répresseur. Ce système contrôle l'expression en terminant la transcrip
tion à un site appelé atténuateur. Ce site se trouve dans une séquence "leader"
entre l'opérateur et le premier gène de structure pour la synthèse du tryptophane (Jackson et Yanofsky, 1973). Ce processus d'atténuation dépend du degré d'ami- noacylation du tRNA-Trp in vivo.
Einsenberg et coll. (1979) ont montré que la dérépression de l'opéron est due à l'incapacité du tRNA-Trp sous modifié à traduire efficacement deux codons tryptophane UGG qui se suivent. Ce ralentissement est équivalent à une diminution de la concentration de tRNA-Trp aminoacylé.
L'hypermodification est donc importante pour la traduction de codons situés dans un contexte particulier. Des codons Trp en tandem sont extrêmement rares, ce qui explique que la sous-modification du tRNA a peu d'effet sur la synthèse générale des protéines et que les souches mia A poussent pratiquement aussi bien que les
souches sauvages.
^ * ô 2 ô
On a montré que le degré de modification de A37 en i A ou ms i A variait avec les conditions de croissance de la cellule, ces différents degrés pourraient être une réponse de la cellule à ces conditions de croissance (Nishimura, 1972 ; Griffith et Humphreys, 1978).
Lorsque E.coli pousse sur un milieu où il y a une carence en ions fer, les tRNAs qui contiennent normalement ms i A sont sous-modifiés et ne contiennent plus que 2 3 i A. La bactérie acquiert en même temps une capacité plus grande à transporter les acides aminés aromatiques (Phe - Tyr - Trp) dans la cellule ; les tRNAs sous- modifiés fonctionnent donc comme un élément régulateur positif de la chaîne de transport des acides aminés aromatiques. Une explication de cette régulation est que, lorsque la bactérie pousse sur un milieu privé d'ions fer, elle synthétise et sécrète un chélateur de fer, Ventérochéline, enlevant le fer des protéines qui le fixent ou des complexes ferriques insolubles et le transportant à l'intérieur de la cellule. La synthèse de ce chélateur impose un déséquilibre dans la voie de biosynthèse des acides aminés aromatiques en consommant le "pool" d'acide chorismique (le précurseur de l'entérochéline et des acides aminés aromatiques).
Dès lors, en ayant une capacité plus grande à transporter des acides aminés aromatiques, la cellule peut vaincre ce déséquilibre (Buck et Griffiths, 1981, 1982).
Lors du passage de l'anaérobiose à l'aérobiose, ms i A37 chez Salmonella typhimu-
rium est modifié en ms io A37. Buck et Ames (1984) suggèrent que ces différents
états de modification Jouent un rôle dans le contrôle de la chaîne de transport des
électrons en conditions aérobique et anaérobique.
La fonction du nucléoside modifié t A est, semble-t-il, la même que celle de
9 Æ
