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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Devaux, S. (2007). Recherche de facteurs impliqués dans le contrôle de l'expression des gènes d'antigènes de surface chez Trypanosoma brucei (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des Sciences – Sciences biologiques, Bruxelles.

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DBM 00B73

Université Libre de Bruxelles

Faculté des Sciences Directeur de thèse : Etienne Pays

Laboratoire de Parasitologie Moléculaire Promoteur : Luc Vanhamme

Recherche de facteurs impliqués dans le contrôle de l’expression des gènes d’antigènes de surface chez

Trypanosoma brucei

ULB - IBMM

BIBLIOTHEQUE

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade académique de Docteur en Sciences

Sara Devaux

Décembre 2006

Faculté des Sciences

Laboratoire de Parasitologie Moléculaire Promoteur : Luc Vanhamme

Recherche de facteurs impliqués dans le contrôle de l’expression des gènes d’antigènes de snrface chez

Trypanosoma brucei

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade académique de Docteur en Sciences

Remerciements

Avez-vous vu not’ Labo, on dirait qu’ils sont normaux Et bien, soyez-en certain, les trypas sont peu communs Laissez-moi ici décrire, ceux qui souvent m’ont fait rire.

M’ont soutenus et supportés, au cours de ces cinq années.

Etienne c’est lui le chef ; chez qui lorsqu’on se confesse On découvre la passion ; et les voies de la raison.

Luc en boss attentiormé ; a su maintes fois m’éveiller C’est vrai qu’ son café est corsé ; et ses conseils bien avisés.

Laurence, elle, m’a tout appris ; à ses côtés j’ai grandi Et mes questions existentielles ; elle y répond à merveille Ce travail est un peu le sien ; elle me permit de le mener à bien.

Il y a Pat toujours présente ; pour m’écouter longuement m’épandre Et avec nous rigoler, de nos délires insensés

C’est vrai qu’c’est la cousine de son cousin ; ça crée des liens c’est certain.

Madame Annette dans ses tiroirs ; du labo conserve les belles histoires Où chacun est intégré ; c’est la reine de l’hospitalité.

Pierrick se trouve tous les matins ; à son bench, pleins d’entrain Et le midi on a bien ri, son humour nous a nourrit.

David avec son microscope ; est un peu l’œil du cyclope Il parle de biologie ; comme d’un voyage plein de magie.

Poupon, tout le monde s’en fou ; c’est ce qu’il croit et c’est fou Et il a l’cœur sur la main ; lorsqu’on sait le prendre bien.

Didier on ne peu plus l’arrêter ; lorsqu’il commence à parler

Mais parfois c’est très marrant ; voire même plutôt intéressant.

Nathalie est efficace ; c’est vrai aussi qu’elle est loquace Mais son travail minutieux ; me fit gagner un temps précieux.

Eliza avec nos pipettes ; fait des jolies pirouettes Et améliore le quotidien ; grâce à son rire et son entrain.

Wally est sûrement le plus gentil ; de tous les gars de ce pays Avec lui qu’est-ce que j’ai ri, que de projets inaboutis Souvent il fut mon modèle ; son travail m’a donné des ailes.

Céline vient juste d’arriver ; mais elle s’est vite intégrée, J’espère qu’elle trouvera comme moi ; de la joie chez les trypas.

Il reste maint’nant les doctorants ; sur qui vraiment à tous moments.

J’ai pu compter pour m’aider ; nos excursions vont me manquer.

Cécile a su mieux que personne ; partager ce projet énorme Rire, pleurer, imaginer ; construire les bases d’une amitié Cette thèse m’a permis au moins ça ; c’est le plus important pour moi.

Ben le super motivé ; m’impressionne c’est obligé Par l’ardeur de sa réflexion ; et sa détermination.

Gégé est une petite fée ; pour tous très attentionnée Son enthousiasme spontané ; donne l’énergie d’avancer.

Anaïs c’est un délice ; dit ce qu’elle pense avec malice

A ce régime, elle vaincra ; les trypas et leurs traeas.

Gilles et son humour tranquille; est entré dans le jeu de quilles Il est toujours prêt à aider ; e’est presque un vrai chevalier.

Puis il y a ceux qui sont partis, à qui aussi je dis merci ;

Sans rimes c’est trop compliqué, c’est pas pour ça qu’ils n’ont pas comptés, José, Pourri, Joyce et Rachel ; Hubert, Xong et puis Daniel.

Et puis quelques mémorants ; sans qui ce s’rait moins marrant J’pense à Julie et Noémie ; à Jérôme et à Virginie.

Il y a aussi les comics ; qui font de la protéomique

Jean-François combattant héroïque ; m’a dormé de très beaux pics Et Sylvain m’a bien aidé, à retrouver ces données.

Aux membres de mon jury aussi ; je tiens à dire grand merci Pour leurs conseils et leurs questions ; sur cette réalisation.

Pour leurs critiques avisées ; qui m’ont permis de l’améliorer.

Dans ce projet insensé, dans lequel je m’suis lancé, parfois j’ai un peu peiné, Car les trypanosomes, c’est pas toujours drôle ...

Mes amis qui l’ont compris, ont su maintes fois me soulager, m’écouter et m’entourer Et puis me faire oublier, et relativiser... Alors merci à Eglantine, Benja, Irène et Catheline, Anne, Vico et Dorothée, et toute cette bande de tarés, Pauline, Aude et puis Sophie(s), et tous ceux qu’ici

j’oublie.

Il reste enfin mes parents ; qui ont toujours été présents Pour soutenir mes projets ; on pourrait croire qu’ils sont parfaits.

Mes beaux parents eux aussi ; ont été de la partie

Ils ont traqués fautes d’orthographes ; dans mes moindres épigraphes.

Ces quelques remerciements ; sont certainement un peu gnangan

Dérisoires et incomplets ; en bref, loin d’être parfaits

Il sont néanmoins sincères ; vous me croirez je l’espère.

ADN : Acide DésoxyriboNucléique ADNr : ADN ribosomique

ApoL I : Apolipoprotein LI ARN : Acide RiboNucléique ARNdb : ARN double brin ARNi : interférence à ARN ARNm : ARN messager ARNr : ARN ribosomique ARNt : ARN de transfert ATP : Adénosine Triphosphate

BF : Forme sanguicole (Bloodstream Form) BrUMP : BromoUridine Monophosphate BrUTP : BromoUridine Triphosphate BrEth : Bromure d’Ethidium

CAK : CDK Activating Kinase CDK : Cyclin Dépendant kinase CBC : Cap Binding Complex CF : Cleavage factor

CPSF : Cleavage Polyadenylation Spécifie Factor CStF : Cleavage Stimulatory Factor

CTD Pol II : Carboxyterminal domain of RNA polymerase II C-term : Carboxyterminal

Ctrl : Contrôle

DFC : Dense Fibrillar Component Dox : Doxycycline

DSE ; Downstream Sequence Elément EP : désigne une forme de PROCYCLINE (E et P sont les lettres du code d’acides aminés) ES : Expression Site

ES body : Expression Site body

ESAG : Expression Site Associated Genes FC : Fibrillar Center

GC : Granular Component

GRESAG : Gene Related to ESAG

GPEET : désigne une forme de PROCYCLENE (GPEE et T sont les lettres du code d’acides aminés)

Kb : Kilobase kDa : Kilo Dalton KO : Knock-out

L. donovani : Leishmania donovemi L. major : Leishmania major NEUF : Négative Elongation Factor NER : Nucléotide Excision Repair NES : Nuclear Localisation Signal N-term : Aminoterminal

ORF : Open Reading Frame PABP : PAP binding Protein PAG : Procyclin Associated Gene PAP : Poly(A)Polymerase

Pb : Paires de bases

PCR : Polymerase Cbain Reaction PF : Forme procyclique (Procyclic Form) PIC : Prelnitiation Complex

PM : Poids moléculaire Pol I : ARN polymérase I Pol II : ARN polymérase II Pol III : ARN polymérase III

pTEF : positive Transcription Elongation Factor RHS : Recombination Hot Spot protein

RNP : RiboNucléoProtein SL RNA : Spliced Leader RNA SnoRNA : Small NucleOlar RNA SnRNA : Small Nuclear RNA

SnRNP : Small Nuclear Ribonucleoproteins SRA : Sérum Résistance Associated Gene S. cerevisae : Saccharomyces cerevisae T. brucei : Trypanosoma brucei

T. cruzi: Trypanosoma cruzi

TAF : TBP associated factor

TAP : Tandem Afinity Purification

TBP : TATA Binding Protein

UBF : Upstream Binding Factor

Table des matières

1 Introduction _____________________________________________ 1

1.1 Le trypanosome : présentation du modèle d'étude--- 1

1.1.1 Le trypanosome, kinetoplastidé responsable de la maladie du sommeil---1

1.1.2 Intérêt du modèle trypanosome--- 1

1.1.3 Le trypanosome et son cycle de vie--- 2

1.1.4 Mécanismes utilisés par le trypanosome pour échapper au système immunitaire de son hôte mammifère--- 4

1.1.4.1 L'immunodépression et l’activation polyclonale des lymphocj4es--- 4

1.1.4.2 La résistance au sérum humain--- 4

1.1.4.3 La variation antigénique--- 5

1.1.5 Les gènes codant pour les antigènes de surface--- 7

1.2 La transcription chez les eucaryotes---7

1.2.1 Les étapes de la transcription et la régulation de l'expression des gènes : généralités--- 7

1.2.2 Les différentes ARN polymérases--- 8

1.2.2.1 Leurs fonctions---8

1.2.2.2 Leur composition--- 9

1.2.3 Les facteurs de transcription--- 9

1.2.3.1 L'initiation et la libération du promoteur--- 9

1.2.3.2 Passage de la phase d'initiation à la phase d'élongation : rôle de la phosphorylation---10

1.2.3.3 L'élongation et la terminaison--- 12

1.2.3.4 La maturation des transcrits---12

1.2.4 Le nucléole--- 14

1.3 La transcription chez les trypanosomes--- 14

1.3.1 Particularités transcriptionnelles des trypanosomatidés--- 14

1.3.1.1 Organisation génomique et transcription polycistronique---15

1.3.1.2 L'épissage en trans--- 15

1.3.1.3 La régulation post-transcriptioimelle--- 15

1.3.2 Les ARN polymérases du trypanosome--- 17

1.3.2.1 Leurs fonctions--- 17

1.3.2.2 Leur composition---17

1.3.3 Les étapes de la transcription et les facteurs associés--- 19

1.3.3.1 L'initiation et la libération du promoteur--- 19

1.3.3.2 Passage de la phase d'initiation à la phase d'élongation : rôle de la phosphorylation--- 20

1.3.3.3 L'élongation et la terminaison---21

1.3.3.4 La maturation des transcrits---21

1.3.4 Le nucléole des trypanosomes--- 22

1.4 Contrôle des gènes codant pour les antigènes de surface chez le trypanosome —22 1.4.1 Les gènes de PROCYCLINE et de VSG sont transcrits par une ARN polymérase de type I — 23 1.4.1.1 Sensibilité à l’Q!-amanitine--- 23

1.4.1.2 Promoteurs interchangeables--- 23

1.4.1.3 Existence d’un compartiment nucléaire distinct--- 23

1.4.1.4 Invalidation de la sous-unité majeure--- 24

1.4.2 Les gènes de PROCYCLINE et de VSG sont transcrits à partir d'unités polycistroniques-24 1.4.2.1 Enviroimement génomique et gènes associés aux VSG--- 24

1.4.2.2 Environnement génomique des gènes codant pour la PROCYCLINE--- 25

1.4.3 PROCYCLINE et VSG : transcription constitutive---26

1.4.4 Transcription constitutive et expression monoallélique du VSG--- 26

1.4.4.1 Régulation par extinction télomérique--- 27

1.4.4.2 Régulation de l'élongation transcriptionnelle--- 28

1.4.5 L’expression de la PROCYCLINE et du VSG est mutuellement exclusive--- 29

1.4.5.1 Les niveaux de régulation--- 29

1.4.5.2 L’inhibition de la transcription Pol II et la perte du contrôle de l'expression spécifique de stade--- 30

1.4.5.3 L'hypothèse d'un facteur commun---31

1.4.6 Liens entre élongation transcriptionnelle et maturation des transcrits : de la Pol I à la Pol II. Hypothèse de travail--- 31

1.4.7 TFIIH, lien entre la machinerie Pol I et la machinerie Pol II du parasite ?---32

2. Objectifs --- 33

3. Résultats --- 34

3.1 Les techniques utilisées--- 34

3.2 Conventions de langage---35

3.3 Invalidation du facteur de transcription TFIIH chez Trypanosoma brucei et effet sur la transcription--- 35

3.3.1 Pourquoi TFIIH ?---35

3.3.2 Identincation d'un complexe TFIIH au sein du trypanosome--- 36

3.3.2.1 Identification des différentes sous-unités dans les banques de données--- 36

3.3.2.2 Expression de ces sous-unités au cours du cycle de différenciation du parasite--- 36

3.3.2.3 Purification du complexe via étiquetage des sous-unités TbXPD et Tbp44--- 37

3.3.2.4 Recherche d'une kinase CDK7--- 39

3.3.3 Invalidation de différentes sous-unités par ARNi et effet sur la transcription--- 39

3.3.3.1 Constructions--- 39

3.3.3.2 Effet de l’ARNi sur la croissance---40

3.3.3.3 Effet de l’ARNi de TbTFIIH sur la transcription Pol I, II et III---40

3.4 Caractérisation de TARN polymérase II de Trypanosoma brucei brucei ---41

3.4.1 Invalidation d’un gène codant pour une sous-unité Pol H et effet sur la transcription des gènes "standard"--- 41

3.4.1.1 Identification de TbRPB9--- 41

3.4.1.2 Construction des vecteurs d'invalidation du gène TbRPB9--- 42

3.4.1.3 Effet de l'ARNi de TbRPB9 sur la croissance des parasites---42

3.4.1.4 Effet de l'ARNi de TbRPB9 sur la transcription---42

3.4.2 Purification du complexe ARN Polymerase H--- 43

3.4.2.1 Construction et expression--- 43

3.4.2.2 Résultat de la Purification--- 44

3.4.2.3 Comparaison avec le complexe Pol I, identification de deux isoformes RPB5 et de deux isoformes RPB6---45

3.5 Les deux isoformes des sous-unités RPB5 et RPB6 sont associées à une polymérase spécifique.--- 46

3.5.1 Identification de chaque isoforme dans les banques de données et comparaison de séquences 46 3.5.2 Purification par affinité des complexes interagissant avec chaque isoforme---47

3.5.2.1 Constructions, expression et localisation subcellulaire--- 47

3.5.2.2 Résultat de la purification--- 47

3.5.3 Invalidation par ARNi de chaque isoforme RPB5---48

3.5.3.1 Constructions--- 48

3.5.2.1 Induction de l'ARNi et phénotype de croissance--- 48

3.5.2.2 Tentative de Knock-out de la sous-unité TbRPB5z---49

3.5.2.3 Effet de l'ARNi sur la transcription Pol II.--- 50

3.5.2.4 Effet de l'ARNi sur la transcription Pol III---51

3.5.2.5 Effet de l'ARNi sur la transcription Poli---51

3.5.2.6 Effet de l'ARNi TBRPB5z sur la structure du nucléole--- 52

3.6 Régulations transcriptionnelles des gènes "atypiques"---54

3.6.1 Transcription des SL RNA---55

3.6.1.1 L'invalidation de gènes impliqués dans la transcription Pol II modifie la maturation du SL RNA —55 3.6.1.2 L'invalidation de gènes impliqués dans la synthèse des ARNm (transcrits par la Pol II) n'inhibe pas systématiquement la transcription du SL RNA--- 55

3.6.2 L’invalidation de gènes impliqués dans la transcription Pol II perturbe la régulation des gènes codant pour les antigènes de surface---56

3.6.2.1 L'invalidation des gènes impliqués dans la transcription Pol II perturbe le contrôle mutuellement

exclusif des gènes codant pour les antigènes de surface---56

Table des matières

4. Discussions et perspectives --- 59

4.1 Mise en évidence du facteur de transcription TFIIH chez T. brucei ---60

4.1.1 Plusieurs sous-unités du complexe TFIIH sont présentes chez le parasite et interagissent entre elles---60

4.1.2 La question de savoir si un CAK existe chez le trypanosome reste posée--- 60

4.1.3 Le complexe TFIIH de Trypanosoma brucei est impliqué dans la transcription Pol II---- 62

4.1.4 Le complexe TFIIH de Trypanosoma brucei est impliqué dans la transcription Pol I--- 62

4.2 Caractérisation de TARN polymérase II de T. brucei --- 63

4.2.1 TbRPB9 est indispensable à la survie du parasite--- 63

4.2.2 La composition de la Pol II est similaire à celle des autres eucaryotes--- 64

4.2.3 La Pol II de Trypanosoma Arwce/contient deux formes de la sous-unité TbRPBl---64

4.2.4 En dehors des sous-unités spécifiques du complexe, d'autres protéines ont été identifiées--- 65

4.2.5 Les sous-unité RPB5 et RPB6 sont dupliquées chez le parasite et chaque isoforme est associée une polymérase particulière--- 66

4.3 Etude de la fonction de chacune des deux isoformes RPB5--- 66

4.3.1 Chaque isoforme est indispensable à la survie du parasite--- 66

4.3.2 Chaque isoforme a une fonction spécifique--- 67

4.3.3 La présence des sous-unités Pol I est nécessaire pour maintenir la structure du nucléole chez T.

4.3.4 Création de deux isoformes pour les sous-unités RPB5 et RPB6 et particularités transcriptionnelles de T. brucei--- 68

4.3.4.1 La sous-unité TbRPB5 semble jouer un rôle particulier au niveau de la transcription des gènes "atypiques"---68

4.3.4.2 La création de deux isoformes des sous-unités RPB5 et RPB6 pourrait être liée à la capacité, pour les trypanosomatidés, d'utiliser une Pol I pour transcrire des ARNm--- 68

4.3.4 Investigation de la fonction des insertions présentes dans les variants 5z et 6z--- 70

4.4 Régulation des gènes "atypiques"--- 72

4.4.1 Transcription des gènes de SL RNA---72

4.4.1.1 L'inhibition de la transcription Pol II perturbe la maturation du SL RNA--- 72

4.4.1.2 La Pol II qui transcrit les gènes de SL RNA semble être différente de celle qui transcrit les autres gènes Pol II--- 73

4.4.2 Transcription des gènes

et

au stade procyclique--- 73

4.4.2.1 A propos du couplage entre la machinerie de maturation et la machinerie de transcription--- 73

4.4.2.2 La Pol I qui transcrit les gènes d'antigènes de surface du parasite semble être de nature différente de celle qui transcrit les gènes d'ADNr--- 74

4.4.2.3 L'inhibition de la transcription Pol II perturbe l'expression spécifique de stade des gènes codant pour les antigènes de surface--- 75

4.4.2.4 Le facteur labile qui régulerait l'expression de la PROCYCLINE agirait au niveau de la stabilisation des messagers--- 76

4.4.2.5 Le facteur labile qui régulerait l'expression d'ESAG7 agirait au niveau de la transcription---76

4.4.2.6 Les variations spécifiques de stade observées lors de l'inhibition de la Pol II pourraient avoir une signification biologique--- 77

4.5 Les techniques utilisées, leurs avantages et leurs limites--- 78

5. Conclusions --- 81

6. Matériels et méthodes --- 83

6.1 Constructions--- 83

6.1.1 Constructions pour l’expression des protéines étiquetées par le TAP tag---83

6.1.1.1 Expression inductible---83

6.1.1.2 Expression constitutive--- 83

6.1.2 Constructions pour l’ARNi---84

6.1.3 Constructions pour l’invalidation de TbRPB5z par recombinaison---85

6.2 Culture cellulaire--- 85

6.2.1 Culture en conditions standard---85

6.2.2 Transfections et sélections--- 86

6.2.3 Induction--- 87

6.2.3.1 Induction de l’ARNi--- 87

6.2.3.2 Induction des protéines étiquetées par le TAP tag--- 87

6.3 Analyse des complexes protéiques---87

6.3.1 Purification TAP tag--- 87

6.3.2 Microséquençage--- 88

6.3.3 Test d’activité kinase--- 88

6.4 Production des anticorps anti-Tbp44, anti-TbXPD et anti-TbXPB--- 89

6.5 Analyse de l’effet de PARNi sur la transcription--- 89

6.5.1 Extraction d’ARN--- 89

6.5.2 Analyse de la quantité d’ARN au sein des cellules invalidées--- 89

6.5.3 Analyse de la variation du taux de transcription--- 90

6.5.3.1 Marquages métaboliques visualisés par Dot blot--- 90

6.5.3.2 “Run-on” in situ visualisés par immunofluorescence--- 91

6.5.3.3 “Run-on”--- 91

6.5.3.4 Analyse des ARNr par incorporation in vivo-"Pulse et chase labeling"---92

6.6 Immunofluorescence---92

6.6.1 Localisation des protéines étiquetées---92

6.6.2 Localisation de l’anticorps nucléolaire L1C6---92

6.7 Microscopie électronique--- 93

7. Références --- 94

1. Introduction

1 Introduction

1.1 Le trypanosome : présentation du modèle d'étude

1.1.1 Le trypanosome, kinetoplastidé responsable de la maladie du sommeil

Le trypanosome est un protozoaire flagellé de la famille des kinétoplastidés. Les membres de cette famille sont caractérisés par la possession d’un ou deux flagelles qui émergent d’une cavité, flagelles à la base desquels on trouve une structure particulière appelée kinétoplaste et constituée d’ADN mitochondrial.

Les kinétoplastidés contiennent plusieurs espèces dont la plupart sont des parasites. Parmi ceux-ci, les trypanosomatidés, qui ne possèdent qu’un seul flagelle, comprennent des parasites de toutes les classes de vertébrés. Ils sont transmis à leurs hôtes vertébrés par des insectes hématophages et parfois par des sangsues. Certains trypanosomatidés infectent l'homme. Parmis ceux-ci on trouve Leishmania major (L major), agent responsable de leishmanioses viscérales et cutanées, Trypanosoma cruzi (T. cruzi) qui provoque la maladie de Chagas et enfin Trypanosoma brucei (T.

brucei) qui sévit en Afrique. L’espèce Trypanosoma brucei contient 3 sous-espèces qui sont morphologiquement indiscernables. Trypanosoma brucei brucei est responsable de la Nagana chez le bétail tandis que Trypanosoma brucei rhodesiense et Trypanosoma brucei gambiense sont les agents de la maladie du sommeil chez l’homme. Le parasite est transmis d’hôtes en hôtes par l’intermédiaire de la Glossine (mouche tsé-tsé).

Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, 60 millions de personnes dans 37 pays de l’Afrique sub-saharieime sont menacées par cette maladie et le nombre de personnes infectées est compris entre 300.000 et 500.000. De plus, les sous-espèces Trypanosoma brucei brucei et Trypanosoma brucei congolense créent de gros dégâts chez les bovins qui sont le plus gros stock de nourriture en Afrique centrale et rend inutilisable 10 millions de km^ de terrain de pâture, soit 17 % du continent africain. Ce parasite a donc de réels effets dévastateurs sur la vie et l’économie africaine, ce qui pousse les scientifiques à l’étudier plus en détail pour pouvoir mieux le contrer.

1.1.2 Intérêt du modèle trypanosome

L'intérêt que l'on peut porter à l'étude du trypanosome est multiple : d'une part, la

compréhension des modes de fonctionnements du parasite permettront certainement de trouver un

moyen pour mieux le contrer et ainsi pour diminuer l'impact néfaste qu'ont la Nagana et la maladie du

sommeil sur le continent africain. D'autre part, le trypanosome est un eucaryote primitif. L'élucidation

Figure 1.1 : Cycle de vie de Trypanosoma brucei

Représentation des étapes importantes du cycle de vie de T. brucei. Deux formes parasitaires spécifiques de

la mouche (à gauche) et deux formes spécifiques du sang des mammifères (à droite) sont représentées. Les

flèches indiquent l'ordre dans lequel s'effectue le passage d'une forme à l'autre, et sont plus épaisses quand la

transition entre deux forme nécessite un changement d'hôte. Pour chaque forme, l'état de la cellule

(prolifératif ou quiescent), le lieu de vie (localisation), le mode de production d'énergie (génération d'ATP),

et les protéines exposées à la surfece (protéines de surface) sont indiqués. Notons que ce schéma ne

mentionne pas tous les intermédiaires existants.

de certains de ses fonctionnements permettra peut-être de mieux se rendre compte de l'évolution des mécanismes de biologie moléculaire. Enfin, le trypanosome possède toute une série de particularités biologiques. Certaines de celles-ci se sont révélées ensuite être présentes chez d'autres organismes.

Citons par exemple la variation antigénique, mécanisme d’échappement très répandu parmi les microorganismes pathogènes (Vanhamme et al. 2000a), la transcription polycistronique, typique des procaryotes (Blumenthal 2004), et le trans-épissage, mécanisme particulier de maturation des ARN associé à la transcription polycistronique. Ce dernier mécanisme implique le transfert d'une petite séquence d'ARN transcrite indépendamment, qui vient s'associer à l'extrémité 5' des ARNm.

L'épissage en trans a été découvert chez les trypanosomes mais il est aussi présent chez les trématodes, les nématodes, les euglénides et même chez certains cordés primitifs tels que Ciona intestinalis (Krause et al. 1987; Rajkovic et al. 1990; Tessier et al. 1991; Vandenberghe et al. 2001) ainsi que dans les chloroplastes et les mitochondries de cellules végétales (Bonen 1993).

1.1.3 Le trypanosome et son cycle de vie.

Le parasite se propage d’un mammifère à l’autre par l’intermédiaire de la mouche tsé-tsé (Vickerman 1985). Les étapes importantes du cycle sont les suivantes (figure 1.1). Dans l’intestin de la mouche le trypanosome est présent sous la forme procyclique. Il migre jusque dans les glandes salivaires de l’insecte où il se différencie en forme métacyclique. Lorsqu’ils sont inoculés dans le sang des mammifères lors d'un repas sanguin de la mouche, les parasites se différencient en forme sanguicole. Ils adoptent une morphologie longue et mince est appelée "long and siender". Le cycle se poursuit et la forme "long and siender" évolue vers une forme petite et trapue, dite "short and stumpy". A ce stade, les parasites qui seront ingurgités par l'insecte lors d'un nouveau repas sanguin continueront le cycle pour se différencier en forme procyclique.

Remarquons que lors de son cycle, le parasite alterne entre des phases de croissance, adaptées à l'infection, et des phases de quiescence, qui précèdent le passage d'un hôte à l'autre. En effet, la forme sanguicole "long and siender" est proliférative tandis que la forme "short and stumpy"

est bloquée en phase Go du cycle cellulaire (Matthews 2005). De même, chez l’insecte, la forme procyclique est proliférative tandis que'la forme métacyclique est quiescente. Cette alternance entre phase de croissance et phase de quiescence permet entre autre aux parasites de maintenir leurs hôtes en vie aussi longtemps que possible ce qui augmente leurs chances d’être transmis.

Lors de son cycle de vie, le trypanosome est donc confronté à des environnements

extrêmement différents (différence de température, modification des sources d'énergie, diversification

des systèmes de défense de l'hôte, ...) auxquels il s'adapte en modifiant de manière abmpte son

programme d'expression génique. Le parasite va donc s'adapter continuellement en modifiant sa

morphologie, son métabolisme, et ses protections contre l'environnement dans lequel il évolue.

Introduction

1- Cycle et adaptations métaboliques

Dans la mouche, la source d'énergie principale provient de l'oxydation phosphoiylative de la proline.

Les parasites du stade procyclique utilisent cette source d'énergie et leur mitochondrie est active. Dans le sang des mammifères, riche en nutriments, les mitochondries s'inactivent et les parasite utilisent uniquement la glycolyse comme générateur d'énergie. Les trypanosomes sanguicoles ont d'ailleurs développé une organelle dédié à cette fonction ; le glycosome.

2- Cycle et contrôle de l'expression génique

Chez la majorité des eucaryotes, le contrôle de l'expression génique s'effectue au niveau de la synthèse des transcrits. Chez le trypanosome au contraire, ce contrôle s'effectue essentiellement au niveau de la dégradation de transcrits déjà présents dans la cellule (Clayton 2002). Il est en effet plus rapide d'éliminer les transcrits, toujours présents, dont le parasite n'a plus besoin, que de synthétiser "de novo" tout un ensemble de transcrits lors du changement de milieu.

3- Cycle et manteaux protecteurs

Les insectes et les mammifères possèdent des systèmes de défense très différents contre les pathogènes. Les trypanosomes affrontent ces défenses par la possession d’un manteau protecteur spécifique à chaque stade de différenciation.

Au stade procyclique, les trypanosomes évoluent dans le tube digestif de l'insecte, environnement basique et riche en protéases. A ce stade, le manteau protecteur du parasite est constitué de PROCYCLINE. Ces protéines semblent protéger le parasite contre les enzymes digestives de l’insecte (Acosta-Serrano et al. 2001).

Dans le sang des mammifères, le parasite est confronté au système immunitaire de son hôte.

Le trypanosome se couvre alors d'un manteau constitué d'une protéine unique appelée VSG (Variant Surface Glycoprotein). Pour se protéger de la réponse immunitaire de l'hôte, le trypanosome remplacera ce manteau périodiquement par un mécanisme appelé variation antigénique. Cette protéine peut cependant jouer d'autres fonctions dans l'adaptation du parasite à son hôte. En effet, cette molécule a la double particularité d'être immunogène et d'être constamment recyclée. Sa liaison aux anticorps permet ainsi une internalisation et une dégradation rapide de ces derniers, ce qui augmente les défenses du parasite (Engstler et al. 2004b). De plus, le VSG pourrait jouer un rôle de récepteur pour certaines macromolécules comme cela a été suggéré pour le TNF-o: (Magez et al. 2001 ).

3

Figure 1.2 : La variation antigénique

Lorsqu’on injecte une population de trypanosomes dans un rongeur de laboratoire, ceux-ci s’y multiplient et un pic de parasitémie est observé après 3 à 8 jours. La population atteint alors sa densité maximale pour diminuer ensuite et être remplacée par une nouvelle population qui sera au sommet de sa courbe de croissance 7 jours plus tard. Cette modification de densité de population, associée à une variation des antigènes exposés permet au trypanosome d’assurer sa transmission puisque l’hôte pourra ainsi supporter les parasites plus longtemps sans que son système immunitaire n’arrive à les éliminer.

La figure représente les vagues de parasitémie, numérotées de 1 à 3, développées par

une succession de populations de trypanosomes dans la circulation sanguine, exprimant

chacune un VSG différent. Ces antigènes de surfaces sont recoimus par les anticorps

sanguins spécifiques (anti-VSGl, anti VSG2, ...).

Introduction

1.1.4 Mécanismes utilisés par le trypanosome pour échapper au système immunitaire de son hôte mammifère

La survie des microorganismes pathogènes dépend fortement de leur capacité à envahir, coloniser et se multiplier au sein d’un organisme hôte, ce qui nécessite au moins deux compétences : d’une part, les parasites doivent maintenir leur hôte en vie aussi longtemps que possible afin d’augmenter leurs chances d’être transmis, d’autre part, ils doivent trouver des moyens d'échapper aux multiples défenses de cet hôte. En particulier, les trypanosomes sont confrontés au système immunitaire, flexible et adaptatif, des mammifères qu'ils envahissent. Pour éviter ce dernier, Trypanosoma brucei utilise trois stratégies essentielles :

1.1.4.1 L'immunodépression et l'activation polyclonale des lymphocytes

Ce mécanisme consiste pour le parasite à "modifier" la réponse immunitaire de son hôte à son profit. En effet, lorsqu’une souris est infectée par des parasites, on observe une inhibition de la prolifération des lymphocytes B et T ainsi qu’une accumulation massive de lymphocytes B non spécifiques. Il a été montré que in vitro, des facteurs, encore inconnus pour la plupart, favorisent la production d’interféron y (Daiji et al. 1992). Cette production d’interféron y inhibe notamment la prolifération de cellules T et l’élimination des parasites.

En outre, les trypanosomes sont capables d’inhiber la réponse inflammatoire toxique pour l’hôte, au profit d’une réponse non inflammatoire, moins toxique (Baetselier et al. 2001). Ce dernier mécanisme permet au trypanosome de maintenir son hôte en vie plus longtemps et donc d’augmenter ses chances d’être transmis.

1.1.4.2 La résistance au sérum humain

Les sous-espèces Trypanosoma brucei rhodesiense et Trypanosoma brucei gambiense sont pathogènes pour l’homme tandis que la sous-espèce Trypanosoma brucei brucei ne l’est pas. Cette différence s’explique par le fait que les deux premières sous-espèces sont capables de résister à l’immunité innée des Homo sapiens tandis que la dernière est tuée par le facteur lytique, l'ApoL-I (Vanhamme et al. 2003), contenu dans le sang humain. Dans le cas de Trypanosoma brucei rhodesiense, la résistance au facteur lytique est conférée par le gène SRA (Sérum Résistance Associated gene), spécifique de cette sous-espèce (Xong et al. 1998). Les mécanismes de résistance de Trypanosoma brucei gambiense ne sont pas encore connus.

4

pseudogènes de VSG ^i|> Séquences répétées de x pb

Ex^ ESAGx

Région télomérique qjf

1 Petits fragments de pseudogènes de VSG

x^O Séquences de 70 pb répétées x fois

Figure 1.3 : Environnement génomique associé aux gènes de VSG (Extrait de Hom 2005)

Les fragments d'ADN (représenté par une ligne grise) contenant les sites d'expression télomériques des VSG

(schéma du haut), et les répertoires de pseudogènes de VSG (schéma bu bas) sont présentés avec les différents

gènes (flèches noires et blanches) ou pseudogènes (flèches grises) qui les constituent. Les régions

Introduction

1.1.4.3 La variation antigénique

(Vanhamme et al. 2000a; Barry et al. 2003b; Borst 2003)

La variation antigénique est utilisée par de nombreux pathogènes confrontés à des environnements changeants. Parmis ceux-ci, citons par exemple les bactéries Salmonella, Borrelia ou Neisseria, le champignon Pneumocystis ou encore le protozoaire Plasmodium falciparum.

Le mécanisme de variation antigénique permet aux parasites de faire varier fréquemment les antigènes qu’ils exposent à leur surface en utilisant des mécanismes actifs et spécifiques (les changements ne résultent pas de mutations aléatoires).

Chez le trypanosome, le mécanisme de variation antigénique consiste à exposer à sa surface une protéine très immunogène appelée VSG. Cette protéine, fortement exprimée, sera ancrée à la membrane afin de former une barrière dense, sorte de "manteau protecteur". En effet, on dénombre environ 10 millions de molécules de VSG à la surface du trypanosome. Cette grande densité de protéine permet de rendre inaccessible à l'environnement extracellulaire les autres constituants de la membrane plasmique. Ce manteau ne sera constitué que d'un type de VSG à la fois mais ce VSG sera remplacé régulièrement (à une fréquence pouvant atteindre un changement toutes les 10^ cellules). Au moment où le système immunitaire de l’hôte, ayant reconnu la molécule antigénique, deviendra apte à éliminer la population de parasites qui la porte, seul l’individu qui aura "changé de manteau" sera sélectioiuié et pourra être initiateur, par expansion clonale, de la population suivante (figure 1 . 2 ).

Le mécanisme de variation antigénique nécessite donc la capacité :

1- d'exprimer un seul gène d'antigène à la fois parmi un répertoire très élevé.

En effet, le séquençage récent du génome de Trypanosoma brucei a mis en évidence la présence de 1700 gènes ou pseudogènes de VSG (Berriman et al. 2005). Ces gènes sont localisés essentiellement en position télomérique ou subtélomérique (Hom et al. 2005)(figure 1.3) :

- certains VSG sont localisés dans les unités polycistroniques, appelées sites d’expression (ES =expression Site). Le nombre de sites d'expression contenus dans le génome d’un trypanosome n’est pas arrêté mais on pense qu’il se situe entre 15 et 20 (Becker et al. 2004) et la comparaison de six d’entre eux a montré que leur structure générale était conservée (Berriman et al. 2002; Donelson 2003; Becker et al. 2004). Ces ES peuvent atteindre 50 à 60 kb, ils sont toujours télomériques, et flanqués de régions qui contierment des séquences de rétrotransposons INGI, RIME et de sites d'intégration des rétrotransposons appelés RHS (Retrotransposon Hot-spot Sequences). Le gène de VSG est toujours situé à l’extrémité du locus (Kooter et al. 1984; Kooter et al. 1987; Pays et al. 1989).

5

---

tUütP’

Site d'expression actif Site d'expression inactif répertoire de VSG

VSG A

VSG B

VSG pseudogène

Figure 1.4 : Mécanismes permettant de générer de la diversité au niveau du site d’expression.

Représentation schématique de l'activation d'un gène par conversion génique (fig 1.4A) ou par

recombinaison réciproque (fig 1.4B). Ces processus permettent l'activation d'un gène précédemment

Introduction

- d’autres VSG sont localisés hors d’un site d’expression mais dans un environnement télomérique. En effet, la majorité des télomères du parasite contiennent des gènes de VSG (Van der Ploeg et al. 1984). En particulier, les mini-chromosomes, appelés ainsi en raison de leur petite taille (entre 50 et 150 kb), sont considérés comme des répertoires de VSG. En effet, ces chromosomes, qui ne sont jamais transcrits, ne contieiment aucun autre gène que celui du

VSG (Ersfeld et al. 1999).

- d’autres enfin sont localisés dans un environnement subtelomérique mais en sens opposé par rapport aux télomères, dans des régions qui contiennent entre 5 et 150 gènes disposés en série. La majorité de ceux-ci sont des pseudogènes ou des fragments de gènes puisque seulement 4 % codent pour des VSG fonctionnels. Ces gènes sont séparés par des séquences de rétrotransposons INGI, RIME et des séquences RHS (Bringaud et al. 2002).

Seuls les VSG situés dans les sites d’expression sont susceptibles d’être exprimés. Pour permettre le mécanisme de variation antigénique, un seul site d’expression peut être actif à la fois. Ainsi, un seul gène de VSG parmi les 1700 présents dans le génome sera traduit en protéine au sein d’une population. On parle d’expression monoallélique du VSG. Les gènes de VSG situés hors d'un site d'expression sont silencieux et dépourvus de promoteurs. Ils constituent cependant un répertoire énorme, sorte de "garde robe" dans laquelle le parasite peut puiser afin de "changer de manteau".

2 - de remplacer rapidement le gène exprimé par un autre membre de la famille.

Pour ce faire, le trypanosome utilise deux processus distincts. Le premier, appelé activation in situ, consiste à inactiver le site d'expression utlisé tout en activant un des sites d'expression préalablement silencieux, et ce, sans réarrangement de l'ADN. Le second processus consiste à insérer un gène silencieux au niveau du site d'expression actif La recombinaison réciproque et la conversion génique sont les deux mécanismes qui permettent ce processus (figure 1.4). La recombinaison réciproque permet la conservation des deux copies du gène tandis que la conversion génique entraîne la disparition totale ou partielle d’une séquence ciblée. Ces deux mécanismes sont dirigés par le phénomène de recombinaison homologue, lui-même permis par la présence de séquences homologues au sein des ES et plus particulièrement dans les régions entourant le gène de VSG.

3- de faire évoluer le répertoire de VSG afin que le parasite puisse renouveler constamment ses antigènes de surface.

Les mécanismes qui permettent la diversification infinie du VSG exprimé sont liés aux processus qui permettent l'intégration d'un gène silencieux au niveau du site d'expression. En effet, les gènes de VSG constituent une famille et codent tous pour des protéines de structure similaire. Ils présentent donc des homologies de séquence entre eux. La recombinaison peut ainsi s’effectuer entre deux gènes entiers (présents par exemple dans deux sites d’expression différents (figures 1.4, panneaux a) mais aussi

6

Poil ARN ribosomique

Pol II

ARN messagers Petits ARN nucléaires

dont les U-SnRNA

Pol III

ARN de transfert ARN 5S

Petit ARN nucléaire U6

Tableau 1 : Rôle des différentes ARN polymérases chez les eucaryotes

Les différentes ARN polymérases (Pol I, Pol II, Pol III) sont indiquées ainsi que les ARN qu’elles

transcrivent.

Introduction

entre deux parties de gènes (figure 1.4A, panneau b). On assiste ainsi à des recombinaisons intragéniques entre des gènes fonctionnels (situés par exemple au sein du site d’expression) et des pseudogènes. Ce processus conduit à la création de chimères constituées de fragments provenant de différents donneurs et donc à l’évolution constante du répertoire de VSG.

1.1.5 Les gènes codant pour les antigènes de surface

A chaque stade de son cycle de vie, le trypanosome se couvre d'un "manteau protecteur"

constitué d'antigènes de surface différents: la PROCYCLINE au stade procyclique et le VSG au stade sanguicole. Ces antigènes ne sont jamais exprimés en même temps et chacun est spécifique d'un stade particulier. On parle du contrôle spécifique de stade des gènes codant pour les antigènes de surface du parasite. La question qui est à la base de ce travail consiste à comprendre comment s'effectue la régulation de l'expression spécifique de stade des antigènes de surface, l'objectif étant de trouver des facteurs impliqués dans ce contrôle.

La compréhension du contrôle de l'expression des gènes nécessite de s'intéresser aux mécanismes de transcription. Nous nous intéresserons donc dans un premier temps à ces mécanismes, en insistant sur ce qui différencie le parasite des autres eucaryotes. Nous reviendrons ensuite sur les hypothèses et les connaissances concernant la régulation de la transcription du VSG et de la PROCYCLINE.

1.2 La transcription chez les eucaryotes

La transcription, qui a pour objet la génération d'ARN à partir de l'ADN, est un processus complexe et hautement régulé chez les eucaryotes. Ce processus est réalisé par l'intermédiaire d'une enzyme appelée ARN polymérase, enzyme qui s'associe à différents facteurs appelés facteurs de transcription.

Dans ce chapitre, nous commencerons par décrire brièvement les différentes étapes de la transcription et les divers modes de régulation de l'expression des gènes. Nous nous intéresserons ensuite aux constituants de la machinerie de transcription au cours de ces différentes étapes.

1.2.1 Les étapes de la transcription et la régulation de l'expression des gènes : généralités

Le processus de transcription s'effectue en plusieurs étapes connues sous le nom de "cycle de transcription". Ce cycle comprend l'initiation, la libération du promoteur, l'élongation et la terminaison. Lors de l'initiation, la machinerie de transcription est recrutée au niveau des promoteurs.

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Bactéries Archébactéries Eucaryotes

Figure 1.5 ; Structure des ARN polymérases chez les eucaryotes

A : Rqjrésentation schématique de la structure du 'core' de l’enzyme chez les bactéries, les archébactéries et les eucaryotes respectivement (extrait de Cramer et al, 2002). Les sous-unités homologues sont représentées par des ellipses de couleurs identiques et identifiées en fonction d'une nomenclature conventionnelle.

B : Représentation tridimensionnelle de la structure que forment les 12 sous-unités de la Pol II ehez les

eucaryotes (extrait de Cramer et al, 2004). Une représentation schématique des 12 sous-unités est montrée en

parallèle avec les mêmes couleurs. Les canaux d'entrée de l'ADN et de sortie de l'ARN sont mis en évidence

par une flèche noire. Une ligne noire pointillée représente les acides nucléiques eontenus dans un sillon

positivement chargé (appelé "main ehannel"), formé par les deux sous-unités majeures (représentées en beige

et en gris). Le "wall", extrémité de RPB2, qui ferme l'extrémité du "main ehannel", ainsi que le "elamp", formé

Introduction

séquences d'ADN non transcrites, qui précèdent la majorité des gènes. La transcription débute et les premiers nucléotides sont assemblés. La machinerie de transcription doit ensuite quitter le promoteur et se "déplacer" le long du brin d'ADN. C'est la phase d'élongation. A la fin du gène, la machinerie de transcription libère l'ARN néo-synthétisé, c'est la terminaison. Cette machinerie est ensuite recyclée pour pouvoir initier un nouveau cycle. Au cours de sa synthèse, l'ARN est modifié par des processus d'épissage, d'ajout de coiffe et de polyadénylation. On parle de la maturation des ARN.

L'ARN polymérase ne peut effectuer à elle seule les différentes étapes du cycle de transcription. Elle s'associe donc au cours de ce cycle à des facteurs généraux de transcription, des facteurs d'élongation, des facteurs de maturation et des facteurs de terminaison. En outre, la régulation des gènes nécessite la présence de facteurs supplémentaires connus sous le nom de régulateurs transcriptionnels. Ces régulateurs peuvent favoriser la transcription d'un gène spécifique, on parle d'activateurs, ou au contraire inhiber cette transcription, on parle de répresseurs.

Chez la majorité des eucaryotes la régulation de l'expression des gènes s'effectue essentiellement pendant les étapes d'initiation. La régulation s'effectue donc en favorisant ou en empêchant le recrutement de la machinerie de transcription au niveau du promoteur. On parle de régulations transcriptionnelles. Cependant, le contrôle de l'expression d'un gène peut s'effectuer plus tardivement. En effet, chaque étape du cycle de transcription est potentiellement sujette à des régulations. Les régulations peuvent aussi s'effectuer après la synthèse de l'ARN proprement dite, c'est à dire aux étapes de maturation, de stabilisation et d'export des transcrits et aux étapes de traduction.

On parle de régulations post-transcriptionnelles.

1.2.2 Les différentes ARN polymérases (Cramer 2004b; Cramer 2004a; Trinh et al. 2006)

1.2.2.1 Leurs fonctions

Différents types d'ARN sont nécessaires au bon fonctionnement de la cellule. Certains de ceux-ci sont destinés à être traduits en protéines, ce sont les ARN messagers (ARNm). D'autres ont une fonction structurelle ou enzymatique. Il s'agit des ARN ribosomiques (ARNr) et des ARN de transferts (ARNt) qui sont impliqués dans la synthèse des protéines ainsi que des petits ARN nucléaires (SnRNA= small nuclear RNA) et nucléolaires (SnoRNA = small nucleolar RNA) qui jouent un rôle important dans la maturation des ARN.

Contrairement aux procaryotes qui ne possèdent qu'une sorte d'ARN polymérase pour transcrire ces différents types d'ARN, les eucaryotes possèdent trois types d'ARN polymérase.

L'ARN polymérase I (Pol I) est dédiée à la transcription des ARN ribosomiques (ARNr), c'est-à-dire les ARN 18S, 5.8S et 28S. L'ARN polymérase II (Pol II) transcrit les ARNm ainsi que la majorité des SnRNA alors que l'ARN polymérase III (Pol III) synthétise les ARNt, l'ARNr 5 S ainsi que le transcrit

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chaque holoenzyme, sous-unités qui n'appartiennent pas à la structure de base du complexe.

Introduction

U 6 SnRNA (Tableau 1). Dans le cadre de ce travail, nous nous intéresserons particulièrement aux Pol I et II.

1.2.2.2 Leur composition

Chez la levure et l'homme, les ARN polymérases I, II et III sont des complexes protéiques constitués respectivement de 14, 12 et 17 sous-unités. La résolution tridimensionnelle de la Pol II a été réalisée chez la levure. La comparaison de la structure de cette polymérase avec celle des ARN polymérases bactériennes et archébactériennes (Cramer et al. 2000; Cramer et al. 2001) met en évidence que les cinq sous-unités qui forment le "core" de l'enzyme chez les bactéries ont des homologues chez les eucaryotes et que l'architecture de ce "core" est conservée entre les différents phylums (figure 1.5). En particulier, les éléments fonctionnels du site actif de l'enzyme partagent une structure identique' ce qui suggère que toutes les polymérases partagent un mécanisme commun (Cramer 2002). Le site actif est constitué par deux grandes sous-unités, spécifiques de chaque complexe. Il s’agit de RPAl et RPA2 pour la Pol I, RPBl et RPB2 pour la Pol II et de RPC 160 et RPC 128 pour la Pol III. Les autres sous-unités ont pour fonction de favoriser et de stabiliser les interactions entre les sous-unités catalytiques. Par ailleurs, certaines de ces sous-unités, situées à la périphérie du complexe sont capables d'interagir avec les facteurs de transcription spécifiques. Dix sous-unités, y compris les sous-unités majeures, sont fortement conservées entre les trois complexes et forment la structure de base de l'enzyme. Neuf de ees dix sous-unités ont des homologues chez les archébactéries, ce qui suggère que la structure de base des ARN polymérases fut conservée au cours de l’évolution (Langer et al. 1995). Cette structiu-e minimale est compétente pour la transcription quel que soit l'ADN patron (Dezelee et al. 1976). Cinq de ces sous-unités sont partagées par les trois complexes (figure 1.6, intersection). En particulier, les gènes RPB5 et RPB6 dont nous reparlerons plus tard, existent en une seule copie dans le génome de la majorité des eucaryotes et les protéines correspondantes sont des constituants des ARN polymérases I, Il et III. Des sous-unités spécifiques de chaque complexe, et moins conservées entre les différents eucaryotes, existent cependant (figure 1. 6 , sous-ensembles). Ces dernières sont nécessaires pour une transcription spécifique du promoteur (Edwards et al. 1991; Thuillier et al. 1995; Bmn et al. 1997; Peyroche et al. 2000).

1.2.3 Les facteurs de transcription

1.2.3.1 L'initiation et la libération du promoteur

Pour se lier à l'ADN, l'holoenzyme a besoin de l'aide des facteurs généraux de transcription.

Ces facteurs, associés à la polymérase, forment le complexe de préinitiation (PIC= Prelnitiation Complex).

' Notons que c’est surtout la stmcture qui est conservée plutôt que la séquence en acides aminés

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Elongation

Figure 1.7 ; Représentation de l’assemblage du complexe d’initiation de la Pol II des eucaryotes (inspiré de Martinez et al. 2002)

Les différents facteurs de transcription ainsi que TARN polymérase II sont représentés par des ellipses. Ces

facteurs s’associent à l’ADN (ligne noire) au niveau d’une séquence particulière d’ADN (boite blanche) située

proche du promoteur ( | ^ ). TFIID (constitué de TBP et de TAF) et TFIIB se lient au promoteur avant que

l'holoenzyme n'y soit recrutée. La Pol II ainsi que les sous-unités TFIIE, TFIIF et TFIIH viennent ensuite s'y

associer pour former le complexe de préinitiation (PIC). L’ouverture du promoteur nécessite de l’ATP. Elle

dépend de l’activité ATPase de TFIIH et est stimulée par TFIIE. Lors de l’initiation, le CTD Pol II est

phosphorylé par la kinase CDK7. Cette phopshorylation permet la libération du promoteur et la libération de

TFIIH, TFIIB et TFIIE. L’élongation s’effectue par la Pol II hyper-phosphorylée associée à TFIIF. Après la

Introduction

En ce qui concerne la Pol II, ces facteurs sont TFIID, TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF et TFIIH (Lee et al. 2000; Lemon et al. 2000; Hahn 2004; Boeger et al. 2005). Le recrutement de l'ARN polymérase au niveau du promoteur nécessite la présence de TFIID (constitué de TBP (TATA Binding Protein) et de TAF (TBP Associated Factors)), TFIIB, TFIIA et TFIIF (figure 1.7). L'initiation de la transcription requiert la dissociation de la double hélice d’ADN au niveau du promoteur permettant la formation d'une bulle simple brin. Ce processus, qui nécessite la présence d'ATP, fait appel aux facteurs de transcription TFIIE et TFIIH (Dvir et al. 1996; Holstege et al. 1996). Ce dernier facteur est constitué de dix sous-unités dont plusieurs ont des activités enzymatiques (Zurita et al. 2003). En particulier, les hélicases XPB, et dans une moindre mesure XPD, jouent un rôle important lors de l'initiation de la transcription (Dvir 2002). L’activité ATPase mais pas l’activité hélicase de XPB est nécessaire pour permettre l’ouverture de l’ADN (Lin et al. 2005). La transcription peut alors être initiée via l'addition des deux premiers nucléotides et la formation du premier lien phosphodiester.

L'ARN polymérase doit ensuite libérer le promoteur. Cette étape nécessite elle aussi de l'ATP et le facteur TFIIH y Joue une rôle particulièrement important (Dvir et al. 1997). Ce moment de "libération du promoteur" est critique pour la suite de la transcription (Sims et al. 2004). Durant cette étape, certains facteurs restent associés au promoteur, tandis que d'autres suivent le mouvement de la Pol H.

TFIIH est le facteur qui reste associé le plus longtemps à l'holoenzyme avant la phase d'élongation.

TFIIF se dissocie de l'holoenzyme peu de temps après l'initiation et se réassocie à l'ARN polymérase au moment de l'élongation (Dvir 2002).

Chez la levure et les mammifères, l’initiation de la transcription nécessite, en plus de facteurs généraux de transcription, la présence d’activateurs transcriptiormels. Ceux-ci interagissent avec le PIC et favorisent l’initiation via le médiateur, complexe protéique constitué de plus de 20 sous-unités.

Ce dernier complexe, qui est nécessaire pour la transcription de la grande majorité des gènes chez la levure, semble en outre favoriser l’assemblage du PIC. D peut cependant aussi avoir une action répressive (revues : Conaway et al. 2005 ; Malik et al ; 2005).

Le PIC de la Pol I est moins complexe que celui de la Pol II (Russell et al. 2005). Il est constitué au minimum de l’holoenzyme et d’un complexe appelé SLl, composé de TBP et de trois TAF (TAFl 110, TAFl 63, TAFl 48). L'holoenzyme est recrutée au niveau du promoteur via son association avec RRN3 (Moorefield et al. 2000; Miller et al. 2001). La présence de UBF (Upstream Binding Factor) est nécessaire, en plus de SLl, pour activer la transcription.

1.2.3.2 Passage de la phase d'initiation à la phase d'élongation : rôle de la phosphorylation

Une fois que la polymérase a libéré le promoteur et synthétisé une molécule d'ARN de 23 nucléotides de long, la transcription passe d’un état instable à un état plus stable et la polymérase entre en phase d'élongation (Pal et al. 2003).

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Pour la Pol II, le passage de la phase d'initiation à la phase d'élongation est caractérisé par la phosphorylation du domaine carboxyterminal (CTD= Carboxy Terminal Domain) de la sous-unité majeure (Dahmus 1996). Ce domaine est constitué de répétitions en tandem de 7 acides aminés, riches en sérines (Y 1 S 2 P 3 T 4 S 5 P 6 S 7 ), qui dépassent de la structure minimale du complexe pour se positionner près du point de sortie de l'ARN (Cramer et al. 2001) (figure 1.5). Lors de l'initiation, le CTD de la Pol II est hypophosphorylé. La kinase CDK7/Kin28 qui appartient au facteur de transcription TFIIH phosphoryle la sérine 5 du CTD pendant l'initiation de la transcription (Coin et al. 1998). Cette phosphorylation est importante pour le recrutement des enzymes d’addition de la coiffe et pour la libération du promoteur (Rodriguez et al. 2000; Orphanides et al. 2002). Cette phopshorylation est en outre indispensable aux phosphorylations suivantes. Lorsque la polymérase a quitté le promoteur, la kinase CDK9/Ctkl qui appartient au complexe pTEF (positive Transcription Elongation Factor) (Price 2000) phosphoryle les sérines 2 et 5 du CTD et empêche l'action de facteurs négatifs d'élongation comme DSEF et NELF ( Négative ELongation Factor) (Wada et al. 1998; Yamaguchi et al. 1998). De plus la phosphorylation de la sérine 2 est impliquée dans le recrutement de la machinerie de maturation et de polyadénylation (Komamitsky et al. 2000; Cho et al. 2001; Skaar et al. 2002; Ahn et al. 2004). Une troisième kinase, appelée CDK8/SrblO phosphoryle le CTD Pol II avant que l'holoenzyme ne s'associe au complexe d'initiation. Cette phosphorylation empêche la polymérase d'entrer dans le cycle de transcription (Hengartner et al. 1998). Cependant, CDK 8 peut aussi avoir un effet positif sur la transcription en interagissant par exemple avec des activateurs (Vincent et al. 2001) ou en permettant la dissociation du complexe d'initiation (Liu et al. 2004). Ces trois kinases ont des homologues chez la levure et sont associées à des cyclines et jouent donc en plus un rôle important dans le contrôle du cycle cellulaire. La phosphatase FCPI est elle aussi impliquée dans le cycle de phosphorylation de la Pol El. Elle est nécessaire pour l’élongation et participe au recyclage de l’holoenzyme (Cho et al. 1999; Mandai et al. 2002). Ainsi, le cycle de phosphorylation/déphosphorylation a une importance particulière dans la régulation de l'expression des gènes chez les eucaryotes (Sims et al. 2004; Meinhart et al. 2005). En outre, la phosphorylation du CTD Pol II joue un rôle central dans le recrutement de protéines impliquées dans l'élongation, la maturation des ARNm et l'export des transcrits (Hirose et al. 2000; Orphanides et al. 2002; Proudfoot et al. 2002). De plus, les différents évènements impliqués dans la création des ARNm matures s'effectuent de façon cotranscriptionnelle et sont co-régulés.

Le rôle de la phosphorylation dans le contrôle de la transcription est moins étudié en ce qui concerne la Pol I. On sait que la phosphorylation de la sous-unité majeure est nécessaire chez la levure pour l'association de la polymérase au facteur de recmtement RRN3 (Fath et al. 2001). Cette sous-unité est aussi susceptible d'être phosphorylée chez les autres eucaryotes par CKII (Hannan et al.

1998; Saez-Vasquez et al. 2001), une kinase impliquée dans la régulation du cycle cellulaire et dans la

ARNr précurseur - 18S I—^

Figure 1.8 : Epissage des ARNr

Les ARN précurseurs qui contiennent les gènes 75 S, 5.8 Set 28 S sont maturés en trois transcrits chez les eucaryotes.

Figure 1.9 : Epissage des ARNm chez les eucaryotes (épissage en cis).

L'ARN pré-messager, constitué de séquences non codantes (représentées par une ligne noire et des lettres

indiquant les acides nucléiques importants) et de séquences codantes (représentées par des boites blanches) va être

clivé par le spliceosome au niveau des sites d'épissage. Les séquences codantes (cas de l'épissage en cis) seront

ensuites assemblés entre elles. Ce mécanisme s'effectue via deux réactions de transestérification qui permettent la

création d'une structure en Y.

prolifération cellulaire. La kinase CTKl et la phosphatase FCPI interviennent également dans les processus de transcription dépendant de la Pol I (Bouchoux et al. 2004; Fath et al. 2004).

1.2.3.3 L'élongation et la terminaison (Sims et al. 2004)

L'élongation de la transcription peut être empêchée par trois mécanismes distincts : les pauses, les arrêts et la terminaison. Les pauses et les arrêts sont induits par des séquences d'ADN spécifiques, des facteurs protéiques ou la structure des transcrits en voie de synthèse. Dans tous les cas, la polymérase s'arrête et les facteurs d'élongation permettent à l'holoenzyme de poursuivre la transcription.

Les pauses transcriptiormelles résultent d'un faible décalage entre l'extrémité 3'-OH des ARN et le site actif de l'enzyme. Ces pauses sont réversibles et on pense qu'il s'agit d'un mode de contrôle transcriptioimel. Les facteurs qui les contrecarrent sont nombreux et leurs modes d’actions multiples (Sims et al. 2004). Cependant, étant dormé qu’aucun d’entre eux n’a été identifié chez le trypanosome, nous avons décidé de ne pas les décrire dans cette introduction.

Les arrêts de la transcription sont caractérisés par une halte irréversible de l'holoenzyme au cours de laquelle la polymérase est incapable de reprendre son activité sans l'aide de facteurs externes.

L'action de ces facteurs consiste en un mécanisme de clivage de l'ARN, conservé au cours de l'évolution, et qui permet le réalignement de l'extrémité 3' de l'ARN avec le site actif de l'enzyme. Le facteur de transcription TFIIS joue un rôle important dans ce processus en induisant des changements stmcturaux au niveau de l'holoenzyme (Kettenberger et al. 2003). Ce facteur est conservé au cours de l'évolution (on retrouve des protéines homologues chez la bactérie) et est aussi impliqué dans l'élongation et le clivage dans la transcription réalisée par la Pol I (Schnapp et al. 1996). Le facteur de transcription TFIIH est lui aussi nécessaire à la Pol I pour générer de longs transcrits (Hoogstraten et al. 2002; Iben et al. 2002). Cependant, la génération de ces transcrits est indépendante d'une quelconque activité ATPase, hélicase ou kinase de ce facteur (Iben et al. 2002).

La terminaison est un processus qui permet à l'holoenzyme de libérer l'ARN transcrit. Dans le cas de la Pol II, celle-ci a lieu après la transcription d'une série de résidus T. Ce processus est couplé au clivage et à la polyadénylation de l'extrémité 3' de l'ARN pré-messager (Buratowski 2005).

1.2.3.4 La maturation des transcrits

La maturation des ARNr (Raska et al. 2004) est un processus complexe qui nécessite la

présence d’endo- et d’exo-nucléases, de pseudouridine synthase et de méthyltransférases ainsi que de

ribonucléoprotéines (RNP). Ces dernières sont constituées de petits ARN nucléolaires, les SnoRNA, et

de protéines associées. Un ARNr précurseur est synthétisé. Il contient des régions qui seront excisées

grâce aux ribonucléoprotéines, pour doimer naissance aux ARN 18S, 5.8S et 28S (figure 1.8).