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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Vertongen, F. (1984). Activités des enzymes puriques et pyrimidiques dans le diagnostic et le pronostic des leucémies lymphoïdes et des lymphomes (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.

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Laboratoire de Chimie Médicale Hôpital Universitaire Saint-Pierre Prof M. FRANCKSON

ACTIVITES DES ENZYMES PURIQUES ET PYRIMIDIQUES DANS LE DIAGNDSTIC ET LE PRDNDSTIC DES

LEUCEMIES LYMPHOÏDES ET DES LYMPHOMES

F. VERTONGEN

Thèse présentée en vue de l’obtention du titre

d'agrégé de l’enseignement supérieur

Laboratoire de Chimie Médicale Hôpital Universitaire Saint-Pierre Prof. M, FRANCKSON

ACTIVITES DES ENZYMES PUDIQUES ET PYRIMIDIQUES DANS LE DIAGNDSTIC ET LE PRDNDSTIC DES

LEUCEMIES lymphoïdes ET DES LYMPHOMES

F. VERTONGEN

Thèse présentée en vue de l’obtention du titre d’agrégé de l’enseignement supérieur

1984

CHAPITRE 1

INTRODUCTION.

1. AVANT-PROPOS.

Le diagnostic différentiel des leucémies ne s'est longtemps fondé que sur leurs signes cliniques et leurs caractéristiques morphologiques établies sur frottis de sang ou de moelle (MO).

L'évolution, variable au sein du groupe de ces mala­

dies, n'a cessé d'inciter à la recherche de nouvelles méthodes plus spécifiques d'identification de la cel­

lule leucémique. La nécessité d'un diagnostic fiable s'est encore accentuée lors de l'introduction des drogues antimitotiques. Citons l'exemple de la crise blastique de la leucémie myéloïde chronique (LMC) dans laquelle la nature myéloïde ou lymphoïde des blastes présents conditionne le pronostic et le traitement.

La mise au point de nouvelles méthodes relevant de dis­

ciplines aussi diverses que l'immunologie, l'enzymolo- gie, la génétique a abouti ces dix dernières années à des progrès importants dans la caractérisation des lymphocytes leucémiques et normaux.

Une telle approche multidisciplinaire permet de déga­

ger deux grands concepts.

1°) L'homogénéité des cellules lymphocytaires normales n'est qu'apparente. Elles sont constituées de cellules fonctionnellement, phénotypiquement et enzymologiquement différentes. Chaque lignée (T,

B, nulle) se subdivise en sous-populations : les

lymphocytes T périphériques par exemple sont cons­

titués de cellules à caractère "helper"* ou "sup- pressor" dans l'activation des lymphocytes B.

Les caractéristiques d'un lymphocyte appartenant à une lignée définie sont en outre susceptibles de se modifier au cours du processus de maturation cellulaire.

2°) Dans presque tous les cas de leucémie, le phénoty­

pe pris au sens large de la cellule cancéreuse est identique à celui d'une cellule normale apparte­

nant à la même lignée et au même stade de différen­

ciation. La cellule leucémique n'est donc pas anormale en soi. Aucun marqueur tumoral "stricto sensu" n'a pu être mis en évidence. Les leucémies apparaissent comme l'expression de la prolifération d'un clone cellulaire, issu d'une cellule cible dont l'équivalent normal peut être défini. Cette cellule cible est arrêtée dans sa maturation, mais non dans sa prolifération. L'origine de la leucé­

mie réside probablement dans le dérèglement du syn­

chronisme des processus normalement couplés de ma­

turation et de prolifération cellulaires.

2. TECHNIQUES D'IDENTIFICATION DES LYMPHOCYTES NORMAUX ET LEUCEMIQUES.

Nous passerons brièvement en revue les techniques les plus utilisées.

* Pour les termes "helper" ou "suppressor" nous avons con­

servé la terminologie anglaise plus usitée que la ter­

minologie française.

2.1 Morphologie.

L'étude de la morphologie cellulaire en micros­

copie optique (OM) ou photonique (EM) reste un outil de base dans le diagnostic des leucémies. Elle permet de distinguer les cellules mûres des cellules immatu­

res. Elle autorise rarement la distinction de sous- groupes au sein d'une même classe cellulaire : la pos­

sibilité de distinguer des sous-groupes tels que les

"T^" et les "T^" reste en effet une exception (Grossi et coll., 1978).

Les critères de différenciation morphologique sont ba­

sés sur la taille, la forme, l'aspect de la surface cellulaire, le rapport nucléocytoplasmique, l'importan­

ce des organelles cellulaires et l'aspect de la chroma­

tine .

2.2 Les marqueurs immunologiques.

La détection de molécules membranaires et cyto­

plasmiques spécifiques permet de définir le phénotype immunologique d'une cellule lymphocytaire normale ou cancéreuse.

Ces molécules sont des déterminants antigéniques ou des sites de liaison pour des composants immunologi­

ques (immunoglobulines, complément...) ou encore pour des érythrocytes d'autres espèces. Leur mise en évi­

dence se réalise, soit par technique d'immunofluores­

cence, soit par visualisation de rosettes formées en présence de globules rouges adéquats.

De plus en plus, les anticorps utilisés pour la détec­

tion des antigènes membranaires sont de type monoclonal.

La technique révolutionnaire de "l'hybridome", mise au point par Kôhler et Milstein (1975) a permis la syn­

thèse de ce type d'anticorps sur une grande échelle.

2.2.1 Marqueurs^ spécifiques de^ rymphqcytes B.

A partir d'un certain stade de maturation, les lymphocytes B se caractérisent par la synthèse d'im­

munoglobulines (Ig) localisées soit dans le cytoplas­

me (IgC), soit à la surface (IgS), soit aux deux en­

droits simultanément.

Cinq à dix pour cent de lymphocytes B périphériques et certains lymphocytes B peu différenciés forment des rosettes en présence d'érythrocytes de souris (RS)

(Stathopoulos et Elliot, 1 974).

Les lymphocytes B sont spécifiquement infectés par le virus d'Epstein - Barr (EB7) pour lequel ils possèdent un récepteur proche du récepteur pour la fraction C3 du complément (Yefenov et coll., 1976).

Ils réagissent avec une série d'anticorps monoclonaux (Mackenzie et Zola, 1983). Nous ne nous attacherons qu'au seul anticorps dirigé contre l'antigène CALL

(coramon ALL antigen). Cet anticorps identifie non seulement certains blastes leucémiques mais également une faible proportion des lymphocytes B présents dans la MO normale (Janossy et coll., 1 97 9).

2.2.2 ^arq^eur^ ^écif^ques_ de^ ^nphocyte^ T.

Les lymphocytes T possèdent un récepteur spé­

cifique pour les érythrocytes de moutons (RM) mis en évidence par le test des rosettes (Uybran et coll., 1 972) .

Différents anticorps monoclonaux, dirigés contre des antigènes membranaires T, sont utilisés en routine;

les plus courants sont ceux répertoriés sous le sigle

OKT (OKT^, OKT^

, etc...) (Kung et coll., 1979 - Rein-

herz et coll., 1980). Les principaux caractères des

antigènes contre lesquels ils sont dirigés sont re­

pris dans la table l-I.

2.2.3 Marqueurs co^un^ ^mphocy^e^

Des récepteurs pour les fragments Fc des IgG sont présents sur des lymphocytes T ("T^"), B et nuis

(Yang et coll., 1978). Dans la lignée T, les "T^" re­

coupent largement mais pas entièrement les lymphocytes T à fonction "suppressive" (Moretta et coll., 1977).

Des récepteurs pour les fragments Fc des IgM sont dé­

tectables sur des cellules T ("T^") ayant une fonction

"helper" dans l'activation des lymphocytes B.

Ces derniers ont également des récepteurs pour le fragment Fc des IgM; leur avidité est faible.

Les lymphocytes B et les monocytes possèdent des gly­

coprotéines membranaires dont la synthèse est codée par les gènes du locus HLA-DR (Chess et coll., 1976) Par homologie avec les lymphocytes murins, ces glyco­

protéines sont dénommées "la-like". Cet antigène n'est présent dans la lignée T, que sur des lymphocy­

tes activés (Evans et coll., 1 978).

Des récepteurs pour les fractions C3b et C3d du com­

plément sont présents à la surface des lymphocytes B mûrs et d'une faible proportion de lymphocytes T ou nuis (Mac Dermott et coll., 1 975 - Earrett, S, 1 978).

2.3 Les enzymes.

Les enzymes impliqués dans le métabolisme des purines et des pyrimidines seront évoqués plus loin.

Plusieurs autres enzymes mis en évidence par méthode cytochimique ou biochimique sont des marqueurs lym­

phocytaires potentiels.

68.000 95 95 95 90 Lymphocytes B - RS'*’

^3 19.000 5 10 90 95 Spécifique des

lymphocytes T

62.000 20 - 30 95 85 60 Macrophages

■^8 33.000 lO - 20 95 30 30 Cell. sinus

splénique

■^6 4 9.000 20 - 30 95 5-10 1 Cell. Langerhans

- 95 90 5-10 20

Précurseurs myéloïdes Tdt^

B moelle osseuse

T 11 55.000 80 95 95 95

50 à 80 % des lymphocytes

"Killer"

Table l-I ; Pourcentage des cellules thymiques et sanguines présentant des antigènes

membranaires de la série T. (D'après Janossy et Prentice, 1982) .

La présence ou l'absence d'un enzyme, sa localisation intracellulaire et le profil des isoenzymes, sont des facteurs utiles d'identification.

Citons un exemple de chacun de ces facteurs.

1°) La désoxynucléotidyl transférase terminale (Tdt) est une ADN polymérase nucléaire utilisée comme marqueur des cellules lymphocytaires très immatu­

res (Janossy et coll., 1 97 9).

2°) L'a- naphtyl acétate estérase, présente dans les lymphocytes T et B affecte une disposition carac­

téristique dans les (Grossi et coll., 1 978).

L'isoenzyme monocytaire est inhibé par le NaF.

(Ranki et coll., 1 978).

3°) L'activité totale de la lacticodéshydrogenase et l'importance relative de ses isoenzymes varient au cours de la maturation lymphocytaire T (Plum et coll. , 1 978) .

2.4 Sensibilité aux drogues et aux mitogènes.

Certaines molécules exercent un effet spécifi­

que sur différents types lymphocytaires.

Les glucocorticoïdes exercent in vitro un effet inhi­

biteur de la fonction des T "suppressor" (Gupta et Good, 1 977) .

Différentes lectines telles la phytohémagglutinine (PHA) et la concanavalline A induisent in vitro la blastogénèse des lymphocytes T (Geha et Merler, 1974), l'EBV celle des lymphocytes B (Kischner et coll.,

1 97 9) et le pokeweed mitogen celles des deux lignées

(Geha et Merler, 1974).

Cependant, l'utilisation de ces drogues, dans le but d'identifier un type cellulaire donné s'avère délica­

te puisque leur effet peut varier au cours du cycle cellulaire.

2.5 Etude du caryotype et du génome.

Certaines anomalies chromosomiques sont asso­

ciées à un type bien défini de leucémie. L'exemple du chromosome de Philadelphie est bien connu.

Les travaux de Korsmeyer et coll. (1981) ont montré d'autre part que la synthèse des Ig lymphocytaires né­

cessite un réarrangement spatial du génome qui s'opè­

re évidemment avant toute synthèse de chaînes lour­

des ou légères. La détection de ce réarrangement dans un lymphocyte permet de lui assigner de manière fiable une origine B.

D'autres techniques d'identification sont en­

core utilisées; elles tiennent compte des propriétés physiques, des réponses en culture...

3. ONTOGENESE LYMPHOCYTAIRE.

Utilisées simultanément, les techniques préci­

tées permettent de définir les caractéristiques d'un lymphocyte appartenant à un stade défini de l'ontoge­

nèse. Nous définirons brièvement les étapes de matu­

ration des deux lignées lymphocytaires.

Les lymphocytes T et B sont probablement issus d'une même cellule souche pluripotentielle (Abramson et coll., 1977); celle-ci se différencie en lymphocytes T et B au sein des organes inducteurs (moelle osseu­

se et thymus).

3.1 Différenciation des lymphocytes B.

Les étapes de la différenciation au sein de la lignée B sont reprises dans la fig. 1-1 (Vogler, 1 982) .

La cellule souche se diviserait en cellules pré-B

parmi lesquelles on reconnaît deux groupes : celui des cellules pré-pré-B de grande taille, à noyau indenté, se divisant activement et celui des cellules pré-B, plus petites, entrant plus rarement en mitose. Les réarrangements du génome, déjà décelables dans le pre­

mier groupe, précèdent l'apparition séquentielle de chaînes y, K, \ dans le cytoplasme (Korsmeyer et coll., 1981) .

Le lymphocyte B immature est le premier à porter des Ig membranaires de type y ou yô,

ou X ; il acquiert le récepteur pour les érythrocytes de souris (RS).

Les récepteurs pour la fraction C3 du complément et le fragment Fc des Ig sont acquis par le lymphocyte B intermédiaire.

Le lymphocyte B mûr perd généralement le récepteur RS mais acquiert la possibilité de synthétiser d'autres

types d'IgS.

3.2 Différenciation des lymphocytes T.

Les prothymocytes, issus de la cellule souche, migrent dans le thymus où ils se différencient en donnant naissance à de grands blastes (thymocytes immatures). (Fig. 1-2) Ils possèdent une activité Tdt, les antigènes T^, et le récepteur pour les RM.

Les thymocytes corticaux représentent le stade sui­

vant de maturation; ils acquièrent les antigènes

Thymocyte immature

Thymocyte cortical

Thymocyte médullaire

Fig. 1-2. Etapes de la différenciation des lymphocytes T.

Les détails sont donnés dans le paragraphe 3.2.

(D'après Janossy et Prentice. 1982)

membranaires , Tg (Tg"^) , Tg ('^ 5 '*') •

Les thymocytes médullaires qui perdent l'antigène T, se subdivisent en deux lignées cellulaires, T. ou Tg , qui se perpétuent dans les lymphocytes T mûrs pé­

riphériques .

L'activité Tdt est perdue au stade des thymocytes mé­

dullaires .

4. ENZYMES DU METABOLISME DES PURINES.

4 .1 Purines et fonction lymphocytaire.

En 1972, Giblett et coll. rapportent les cas de deux enfants atteints d'immunodéficience congéni­

tale sévère (SCID) et présentant une déficience con­

comitante en un enzyme du métabolisme des purines, l'adénosine désaminase (ADA).

L'altération profonde de la fonction lymphocytaire, particulièrement T, était manifeste dès la naissance.

C'était la première fois qu'un déficit enzymatique entraînant une anomalie du système immunitaire était décrite.

Une relation causale entre déficit enzymatique et im­

munodéficience était tellement étrangère à l'esprit des chercheurs à cette époque que la première hypo­

thèse émise en rapportait l'origine à une délétion de l'ADN affectant à la fois les gènes, présumés voisins, assurant la synthèse de l'ADA et associés à la réponse immunitaire (Ir). La description de nouveaux cas, la présence d'activités enzymatiques résiduelles chez certains d'entre eux, la localisation des gènes Ir et ADA sur des chromosomes différents (Creagan et coll.,

1973) ont rendu cette hypothèse caduque.

La description d'une immunodéficience congénitale spé­

cifiquement T associée au déficit d'un autre enzyme purique (purine nucléoside phosphorylase, PNP) (Giblett et coll., 1975) et la démonstration d'enzymes mutants dans les deux syndromes (Hirschhorn et coll., 1976) ont définitivement mis en évidence le rôle des enzymes du métabolisme des purines dans le développement de l'im­

munocompétence .

La découverte d'une association entre immunodéficience primaire et déficience en ecto 5'-nucléotidase (5'N) a encore renforcé cette conception (Johnson et coll., 1977).

4.2 Métabolisme cellulaire des purines.

Les nucléosides puriques monophosphorylés cel­

lulaires résultent, soit de l'hydrolyse des acides nu­

cléiques, soit d'une synthèse de novo. (Fig. 1-3).

Leur catabolisme comporte une déphosphorylation cata­

lysée par la 5'N (Q)* endocellulaire suivie ulté­

rieurement d'une phosphorolyse des nucléosides générés catalysée par la PNP ( Q) ) : bases puriques et riboses correspondants en résultent.

Deux voies sont alors possibles : les bases puriques sont, soit engagées dans une voie de dégradation dont le produit final est l'acide urique, soit recyclées dans le "salvage pathway" (@) vers l'acide inosi- nique (IMP), source potentielle d'acides adénylique (AMP) et guanylique (GMP). Cette voie de récupéra­

tion des bases puriques générées in situ ou d'origine extracellulaire est importante puisque 30 % de 1'IMP endocellulaire en provient. Le fonctionnement adé­

quat de la voie catabolique est cependant requis, faute de quoi, une accumulation de métabolites poten­

* Les chiffres entre parenthèses renvoient aux numéros des

voies métaboliques dans la fig. 1 - 3 .

tiellement toxiques est susceptible de se produire.

Le catabolisme de l'AMP et du désoxy-AMP (dAMP) est plus complexe.

L'AMP est le substrat de la 5'N (Q) et de l'AMP dé- saminase (© ) qui catalysent sa dégradation en adé- nosine (Ado) et en IMP respectivement. Lomax et coll.,

(1975) ont montré que la voie de désamination ( ©) est prépondérante dans les cellules. Elle constitue une véritable voie de contournement de l'ADA dans la production d'inosine.

L'Ado formée est le substrat potentiel de trois enzy­

mes ; l'ADA (©), l'adénosine kinase (AK) (©) et la S-adénosylhomocystéine hydrolase (AdoScyH) ( (s) ) . Son devenir est conditionné par sa concentration in­

tracellulaire et par les affinités des 3 enzymes dont les Km sont respectivement de 25 yM (Agarwal et coll., 1975), 1,8 yM (Schneble et coll., 1967) et 10 à 20 yM

(Kredich et Martin, 1977). Aux concentrations physio­

logiques (0,4 à 0,6 yM - Fox et coll., 1974), l'Ado est préférentiellement rephosphorylée en AMP. Cette donnée est valable pour l'Ado provenant du catabolisme cellulaire et pour l'Ado pénétrant dans la cellule à partir du milieu extracellulaire.

La faible affinité de l'AMP désaminase pour le dAMP oriente ce substrat vers la voie de déphosphorylation.

La désoxyadénosine (dAdo) formée est, soit rephospho­

rylée via l'AK ((^) ou la désoxycytidine kinase (dCtK) ( © ), soit désaminée en désoxyinosine, via l'ADA (©). Aux concentrations intracellulaires physiologiques, le Km de ce dernier enzyme étant net­

tement inférieur à ceux des deux autres, la dAdo est

préférentiellement désaminée (Agarwal et coll., 1975 -

Ives et Durham, 1970).

Acides nucléiques

Acides nucléiques

©5' n

(2) ADA (3) PNP

(4) "’Salvage pathway*

(HPGRT )

(g) dCt K

(7) AMP déjaminase (8) Ado ScyH

Fig. 1-3. Métabolisme cellulaire des purines : les voies

métaboliques sont explicitées dans le paragraphe 4 . 2 .

La fonction physiologique de l'ADA dans la cellule porte donc plus sur le catabolisme de la dAdo que sur celui de l'Ado. Ce rôle a été démontré in vivo chez les patients atteints de SCID et déficients en ADA (SCID-ADA ) chez qui l'on observe une accumula­

tion de dAdo dans le sang et son excrétion accrue dans les urines (Cohen et coll., 1978). Il a également été démontré in vitro sur des lignées lymphocytaires nor­

males mais dont l'ADA était inhibée par la désoxyco- formycine (dCof) : l'accumulation de dAdo entraîne une diminution de la croissance cellulaire (Hakala et

Taylor, 1959).

L'effet toxique de la dAdo n'est cependant pas direct : l'augmentation de sa concentration intracellulaire en­

traîne sa phosphorylation en dATP, inhibiteur de la ribonucléotide réductase (RR), enzyme contrôlant la synthèse de l'ADN (Cohen et coll., 1978). La toxici­

té d'un excès de dATP a été mise en évidence sur des souches murines de cellules T lymphosarcomateuses

mutantes et non mutantes (Ullman et coll., 1978 - i960).

Ces auteurs ont en effet montré que la présence de dAdo et d'un inhibiteur de l'ADA n'empêchait la crois­

sance des cellules que dans les souches capables de phosphoryler la dAdo en dATP ou dont la RR était sen­

sible à l'effet allostérique du dATP.

Il est toutefois peu probable que l'inhibition de la synthèse de l'ADN soit le seul facteur responsable de l'immunodéficience des patients SCID-ADA~. Deux mé­

canismes adjuvants ont en effet été évoqués : un trou­

ble du métabolisme de l'AMP cyclique (Polmar et coll.,

1979) et l'inhibition de l'enzyme S-adénosylthomocys-

téine hydrolase (AdoScyH) (Hershfield, 1979).

L'inosine, la guanosine et leurs correspondants dêsoxy- sont les quatre substrats naturels de la PNP.

De ceux-ci, seule la désoxyguanosine peut être re- phosphorylêe directement en dGMP via la dCtK.

La guanosine et la désoxyguanosine s'accumulent dans le plasma et les urines des patients déficients en PNP (PNP ). L'effet de ces métabolites est encore mal connu en raison de la difficulté d'obtenir un nom­

bre suffisant de lymphocytes de ces patients et de disposer d'un inhibiteur spécifique de la PNP. Les résultats obtenus avec des souches lymphoblastoîdes mutantes suggèrent des mécanismes de toxicité compa­

rables à ceux observés dans les cas de SCID-ADA : accumulation de dGTP et inhibition de la RR (Ullman et coll. , 1979).

Contrairement aux autres bases puriques, l'a­

dénine ne peut être obtenue dans la cellule à partir d'adénosine via la PNP (Kim et coll., 1968); elle est un sous-produit de la synthèse des polyamines aliphatiques (Pegg et Williams-Ashman, 1969). (Fig.

1-4). Cette synthèse requiert en effet un groupe­

ment aminopropyl, fourni par la S-adénosylméthionine (SAM) décarboxylée. La méthylthioadénosine (MTA) ré­

siduelle est dégradée en adénine et 5-méthylthioribo- se - 1 - phosphate par phosporolyse catalysée par la méthylthioadénosine phosphorylase (MTA-P).

Comme les autres bases puriques, l'adénine peut être recyclée dans un "salvage pathway", via l'adénine phosphoribosyl transférase (APRT) (Siramonds et coll., 1976). Il a été démontré sur lymphoblastes en cultu­

re que cette voie participe pour plus de 80 pour cent à la synthèse d'AMP dans la cellule (Katamani et

Carson, 1981).

Ornithine

Amino-

MTA

^C02

V

Putrescine

V

Spermidine

Spermine

5-Méthylthioribose-1.Po4 + Adénine

(î) Ornithine de^carboxylase (2) Spermidine synthétase (3) Spermine synthétase

(4) Methylthioadénosine phosphorylase

Fig. 1-4. Synthèse des polyamines et génération intracel­

lulaire d'adénine : les voies métaboliques sont

explicitées dans le paragraphe 4-2.

4.3 Caractéristiques du métabolisme des purines dans les lymphocytes.

Bien que l'ADA et la PNP soient des enzymes ubiquitaires, leur déficience congénitale n'altère profondément que le système lymphocytaire. Une des causes de cette spécificité réside dans la richesse particulièrement marquée des lymphocytes en désoxynu- cléosides kinases (Carson et coll., 1979).

Il existe de plus une différence de sensibili­

té à la déficience en ADA, entre les lymphocytes T et B.

Alors que la fonction T est profondément altérée chez les patients, la fonction B est mieux conservée. A concentrations égales en dAdo dans le milieu de cul­

ture et en présence d'un inhibiteur de l'ADA, des lymphocytes humains T croissent nettement moins vite que les lymphocytes B (Hishhorn et coll., 1979).

La capacité de concentration du dATP pour les lympho­

cytes T relève de deux facteurs : leur potentiel de phosphorylation des désoxynucléosides est supérieur à celui des lymphocytes B et leur activité nucléotidasi- que est moins importante (Carson et coll., 1979).

Une même sensibilité différentielle existe pour la déficience en PNP. Chez les patients, seule la fonc­

tion lymphocytaire T est atteinte; dans la mesure où la fonction B est normale, un résidu de fonction T

"helper" doit subsister. La résistance à l'effet to­

xique du dGTP des T "helper" par rapport aux T "sup-

pressor" a été démontrée in vitro (Gelfand et coll.,

1979) mais les mécanismes qui y conduisent restent

obscurs.

Les lymphocytes ont une 5'-nucléotidase mem­

branaire (ecto-5'N, définie comme 5'N dans la suite du texte). Les cellules parenchymateuses hépatiques et les cellules de l'endothélium vasculaire possèdent un enzyme membranaire similaire alors que les mono­

cytes, les neutrophiles et les érythrocytes en sont dépourvus (Webster et coll., 1978 - Vertongen et coll.,

1984a). Le centre actif de l'enzyme serait orienté vers le milieu extracellulaire. Le rôle physiologi­

que de cet enzyme reste mal défini : il pourrait in­

tervenir dans la génération au départ d'ADP, d'adé- nosine inhibitrice de 1'aggrégation plaquettaire et permettrait aux lymphocytes d'accéder aux foyers in­

flammatoires, au travers de vaisseaux partiellement oblitérés par des thrombi (Smith et coll., 1981). Sa participation à la dégradation des nucléotides endo- cellulaires n'est cependant pas exclue. Des échanges entre les 5'N endo- et ectocellulaires ont été démon­

trés chez le rat (Stanley et coll., 1980).

Les 5'N ectocellulaire et intracytoplasmiques se dif­

férencient par leur pH optimal d'activité et par leur affinité pour les substrats de la série désoxy-

(Carson et coll., 1981).

5. ENZYMES DU METABOLISME DES PYRIMIDINES.

Aucune déficience enzymatique associée à un syndrome d'immunodéficience n'a été décrite.

La voie anabolique permet la synthèse des désoxynu-

cléotides pyrimidiques indispensables à la formation

de l'ADN. L'importance de ces nucléotides dans les

processus de prolifération néoplasique est évidemment

cruciale. Aussi, l'inhibition de leur synthèse par

des drogues antimêtaboliques est-elle largement uti­

lisée dans le traitement de nombreux cancers.

La synthèse des nucléotides procède de deux voies mé­

taboliques (fig. 1-5). La synthèse de novo (Q) comporte en premier lieu la formation d'acide uridy- lique (UMP), à partir duquel peuvent être générés d'une part le cytidine triphosphate (CTP) via l'acti­

vité de trois enzymes dont la CTP-synthétase (CTP-S) (( 4 )) et d'autre part l'acide thymidylique (dTMP) via le dUMP et la catalyse de la désoxythymidylique syn- thétase (dTMP-S) ( ©). Les désoxynucléotides sont formés à partir des nucléosides di- ou tri-phosphory- lés. La seconde voie est une voie de recyclage

("salvage pathway" des pyrimidines). L'uridine et la désoxythymidine provenant du milieu extracellulaire ou de la déphosphorylation des nucléotides peuvent être recyclées vers 1'UMP et le dTMP via les kinases correspondantes (UK ( 9 ) et dThK © ) .

L'importance de la récupération dépend de la modula­

tion cellulaire des voies de recyclage et de dégrada­

tion de ces nucléosides. Il existe en effet une al­

ternative au devenir de ces derniers : ils peuvent également être engagés dans une voie catabolique. La phosphorolyse, catalysée par l'uridine- (UP) (©) et la désoxythymidine- (dThP) phosphorylases ( ©) abou­

tit à la libération des bases respectives; celles-ci sont à leur tour engagées dans une série de réactions enzymatiques séquentielles dont les produits finaux sont la 3-alanine pour l'uracil et l'acide 3-aminoi- sobutyrique ( AIE) pour la désoxythymidine et de 1'anhydride carbonique.

L'UP catalyse également la phosphorolyse de la déso-

xyuridine (dU).

(T) Synthèse denovo

@ UMP kinase (D U D P kinase (4) CTP synthétase

Uridine phosphorylase

© dTMP synthétase

@ d Thymidine phosphorylase

® d Thymidine kinase

© Uridine kinase

Fig. 1-5. Métabolisme cellulaire des pyrimidines : les voies

métaboliques sont explicitées dans le paragraphe 5.

L'acide désoxycytidylique (dCMP) peut également être

obtenu par phosphorylation directe de la désoxycyti-

dine, via la dCtK;

CHAPITRE 2

PHENOTYPES IMMUNOLOGIQUES ET ACTIVITES ENZYMATIQUES DES CELLULES LEUCEMIQUES.

ETAT DE LA QUESTION ET BUT DU TRAVAIL.

1. ETAT DE LA QUESTION.

1.1 Marqueurs immunologiques.

Au moment où ce travail a débuté, l'utilisation des marqueurs immunologiques avait permis de détermi­

ner les équivalents phénotypiques normaux de la plu­

part des leucémies lymphoïdes. Ces données sont con­

signées schématiquement dans la table 2-1 (a et b).

Elles reflètent les travaux de Greaves (1979), Greaves et coll. (1981), Seligmann et coll. (1981) et Foon et coll. (1982).

Ce schéma appelle plusieurs commentaires.

1°) Commentaires généraux.

Toutes les leucémies lymphoïdes n'entrent pas

dans ce cadre : le phénotype immunologique de certains

patients est inclassable; le passage d'une classe à

l'autre peut se produire au cours du temps et il peut

exister un certain recouvrement entre les différents

phénotypes.

Cellules normales Celliole Cellules pré-B B irrmature B intenitédiaire B mür souche pré-pré-B pré-B

Cellules leucé- LLA UA ccnmunes liA-B

C-B HCL-B

miques nulles pré-pré-B pré-B LPL-B

Table 2 - la : équivalents phénotypiques leucémiques des cellules normales pour la lignée B.

Moelle Thymus Sang

4 --- k

Cellules normales Cellule souche

T immature T cortical T médullaire T mûr

Cellules leucé­

miques 7 IiLA-pré-T LLA-T liA-T

LLC-T LPL-T Sézary

Table 2 - i: b : équivalents phénotypiques leucémiques des cellules normales pour la lignée T.

HCL : leucémie à tricholeucocytes. LPL : leucémie prolymphocytaire.

U1

2°) Commentaires relatifs à la lignée B.

Les LLA nulles sont définies par exclusion.

Aucun marqueur spécifique n'est jusqu'à présent attri­

buable à cette classe. La réactivité avec des anticorps monoclonaux spécifiques de la lignée B, l'étude du géno­

me, l'acquisition de l'antigène CALL, par des blastes initialement "nuis" au cours d'une rechute sont autant d'arguments qui permettent de classer une partie au moins des LLA nulles dans la lignée B.

Le terme de "leucémies prolymphocytaires" (LPL-B) est mal choisi : les cellules de ce type sont de fait plus différenciées que celles des LLC-B (Catovsky, D, 1977) . Les tricholeucocytes (HCL-B) partagent certains carac­

tères avec les monocytes (Catovsky, D, 1977) mais leur phénotype est essentiellement celui d'une cellule B mûre.

3°) Commentaires relatifs à la lignée T.

A l'intérieur des LLA-T, existent différentes sous-classes.

Les LLC sont de type T "helper" ou T "suppressor", alors que les LLP et les syndromes de Sézary sont gé­

néralement de type T "helper".

1.2 Enzymes du métabolisme des purines.

1.2.1 ADA - PNP - 5'N.

Une revue de la littérature a paru à ce sujet en 1980b (Blatt et coll.). Les données recueillies peu­

vent être résumées de la manière suivante (table 2-1).

1°) Parmi les cellules normales, les activités de l'ADA

et de la PNP sont prédominantes dans les cellules T celles de la 5'N dans les cellules B. Dans la li­

gnée T, l'activité del'ADA diminue avec la matu­

ration cellulaire, alors que celle de la PNP évo­

lue en sens inverse.

2°) Dans les cellules leucémiques, les activités enzyma tiques reflètent le degré de différenciation et le lignage de la cellule leucémique.

L'activité de l'ADA est la plus élevée dans les LLA de type T; elle est élevée dans les LLA communes;

elle est plus faible dans les cellules leucémiques plus différenciées.

Peu de données existent sur la PNP : l'activité est faible dans les LLA-T, plus élevée dans LLC-T.

Le fait le plus marquant pour la 5'N est sa diminu­

tion importante dans les LLC-B.

1.2.2 Méthylthi^oad£nos_ine £hos£horylase J_MTA 2 ^Pj_.

Toohey (1978) est le premier à attirer l'atten­

tion sur la déficience en MTA-P de certaines souches de cellules hématopoïétiques murines en culture.

Katamani et coll. (1981) démontrent le même phénomène sur des cultures de cellules leucémiques humaines.

Toutefois, aucune étude n'avait été entreprise sur des cellules leucémiques prélevées directement chez des patients.

1.3 Enzymes du métabolisme des pyrimidines.

La distribution différentielle entre cellules B et T des désoxynucléosides kinases a déjà été évo­

quée dans l'introduction.

La réponse variable du traitement par la désoxythymidi-

ne (dTh) en fonction du type de leucémie laissait

Type cellulaire. 5 'N ADA PNP

Normales

Lymphocytes T ++ ++ à +++ ++

Lymphocytes B ++ â +++ ++ + à ++

Mononucléées sang ++ ++ ++

Thymocytes + ++++ +

LLA

T + ++++ +

LLA communes ++ ++ à +++ ++

B ^- + ^-

LLC-B 0 à +++ +

+H—h + à ++

Table 2-II : Activités des enzymes puriques dans les

lymphocytes normaux et tumoraux. (D'après Blatt et

coll., 1980).

supposer que la régulation des voies anaboliques et ca­

taboliques de ce métabolite diffère selon le phénotype leucémique. Fox et coll., (1979) ont démontré que des lymphoblastes humains T, nuis ou pré-B mis en culture étaient extrêmement sensibles à la dTh ajoutée au mi­

lieu; la toxicité de cette molécule était inversément proportionnelle à l'activité de la dThP très abaissée dans les cellules testées. Une autre équipe avait déjà rapporté l'abaissement de la dThP dans certaines leucémies (Gallo et Perry, 1968) .

Nous n'avons relevé dans la littérature aucune donnée spécifique concernant la dThK et la dCtK dans les leucémies aiguës de la lignée lymphocytaire.

2. BUTS DU TRAVAIL.

Les buts de notre travail étaient de tenter de répondre à quatre questions précises concernant les enzymes puriques et pyrimidiques dans les cellules lymphocytaires de patients atteints de leucémie lym­

phoïde aiguë, chronique ou de lymphome.

1. LES ACTIVITES ENZYMATIQUES MESUREES SONT-ELLES UTILISABLES COMME "MARQUEURS" DE LA CELLULE TUMORALE ?

Dans ce domaine, nous voulions tenter de définir un phénotype enzymatique d'une cellule leucémique donnée,comparable au "phénotype immunologique" déter­

miné à l'aide de plusieurs paramètres. Nous avons donc mesuré simultanément les activités de plusieurs enzymes, défini leurs rapports et recherché la rela­

tion éventuelle existant entre elles au sein de chacun

des groupes de leucémies et de lymphomes.

Les critères retenus dans le choix des enzymes étu­

diés ont été basés, soit sur leur importance dans la différenciation et la prolifération lymphocytaire

(ADA - PNP - 5'N), soit sur leur rôle direct ou indi­

rect dans la duplication de l'ADN (MTA-P, pyrimidine- phosphorylases et kinases).

Nous avons voulu établir : la spécificité et le pouvoir discriminant d'une modification d'activité dans les divers types de cellules leucémiques; la re­

lation existant éventuellement entre une évolution clinique défavorable et une modification plus pronon­

cée d'activité enzymatique; ou, à l'inverse, entre une rémission clinique et une normalisation d'activité.

C'est-à-dire, tenter de déterminer la valeur des mesu­

res d'activités enzymatiques comme paramètres diagnos­

tiques et/ou pronostiques dans la surveillance des pa­

tients leucémiques.

2. L'INTEGRATION DES ACTIVITES DE PLUSIEURS ENZYMES PARTICIPANT A UNE PEME VOIE METABOLIQUE PERMET-ELLE DE COMPRENDRE LES MECANISMES D'ACTION DE CERTAINES DROGUES ?

Si tel était le cas, l'analyse des voies métabo­

liques pourrait suggérer de nouvelles recherches d'in­

terférence médicamenteuse dans le métabolisme de la cellule leucémique.

3. LES MODIFICATIONS D'ACTIVITES ENZYMATIQUES MISES EN EVIDENCE SUR DES LYSATS CELLULAIRES REFLETENT-ELLES DES MODIFICATIONS DANS L'UTILISATION DES SUBSTRATS CORRESPONDANTS^ DETECTABLES PAR DES EXPERIENCES D'INCUBATION DES MEMES CELLULES INTACTES ?

Ce problème général doit en effet être posé pour

pouvoir inférer d'étude sur le contenu cellulaire des déductions quant au comportement de la cellule in vivo et notamment quant à la sollicitation préférentielle de l'une ou l'autre voie métabolique dans la cellule leucémique.

4. LES MESURES D’ACTIVITES ENZYMATIQUES PEUVENT-ELLES CONTRIBUER A LA COMPREHENSION DE LA PATHOGENIE DES LEUCEMIES ?

Nous voulions notamment préciser si les activi­

tés enzymatiques des différentes cellules leucémiques correspondaient à celles observées dans leurs équiva­

lents non tiimoraux, et si tel n'était pas le cas, dé­

terminer si la discordance observée pouvait être le

reflet d'un mécanisme d'induction oncogénique.

CHAPITRE 3

METHODOLOGIE.

1. RECOLTE DES CELLULES.

1.1 Récolte des cellules mononuclêées du sang périphé­

rique et des ganglions.

Le sang est prélevé sur Dextran 200.000 (Povite) hépariné. Les érythrocytes sédimentent; le plasma

contenant les leucocytes et les plaquettes est régu­

lièrement prélevé. Après centrifugation à faible vi­

tesse les cellules mononucléées sont isolées sur gra­

dient de Ficoll (B;z5yum, 1968) puis lavées deux fois en solution de Hanks et une troisième fois en NaCl 154 mM.

La viabilité cellulaire contrôlée par la méthode d'ex­

clusion au Bleu Trypan (Phillips, 1973) est d'au moins 90 %. La contamination granulocytaire est inférieure à 2 %; la contamination par les érythrocytes est nulle.

Les cellules sont conservées à - 20° C telles quelles ou dans un milieu protecteur qui est fonction de leur utilisation ultérieure.

Pour les ganglions, une suspension cellulaire est réalisée en les écrasant à travers un fin tamis métallique (400 mailles par cm ) et en les rinçant au 2

RPMI 1640. Les cellules mononucléées sont ensuite isolées sur gradient de Ficoll en suivant une procé­

dure identique à celle décrite pour les cellules san­

guines .

Dans certains cas, et notamment lors de la re­

cherche des marqueurs immunologiques, le sang est pré­

levé sur calparine; le "buffy coat" est déposé sur Ficoll. Les cellules mononucléées sont lavées deux fois en milieu RPMI 1640 (Gibco).

1.2 Globules rouges.

Les globules rouges sont obtenus à partir du prélèvement utilisé pour les cellules mononucléées; ils sont lavés trois fois avec du NaCl 154 mM; la propor­

tion des granulocytes contaminants est négligeable.

Ils sont conservés à - 20° C dans un milieu variant se­

lon les dosages à effectuer.

2. LYSAT CELLULAIRE.

2.1 Cellules mononucléées.

Les cellules sont congelées et décongelées trois fois en mélange acétone-carboglace. Elles sont ensuite broyées au moyen d'un homogénéiseur muni d'un piston en téflon (vitesse maximale pendant 2 min).

Pendant cette opération, les cellules sont maintenues dans un bain de glace fondante.

Ce lysat est utilisé lors de différents dosages enzy­

matiques tel quel ou après centrifugation. Les for­

ces et durées de centrifugation dépendent de l'enzyme mesuré.

2.2 Globules rouges.

L'hémolyse est réalisée en solution hypotonique

et/ou par congélation - décongélation.

3. ACTIVITES ENZYMATIQUES.

3.1 Expression des résultats.

Les activités enzymatiques sont exprimées en activité spécifique par mg de protéines pour les cel­

lules mononucléées, par mg d'hémoglobine (Hb) pour les érythrocytes. L'alternative était d'exprimer l'activité en fonction du nombre de cellules. Dans la littérature, les deux modes d'expression sont uti­

lisés. Aucune des deux méthodes n'est entièrement satisfaisante, tant le volume que le contenu en pro­

téines des cellules pouvant varier par rapport à la normale chez des patients leucémiques et parfois ané­

miques. Notre choix a été essentiellement guidé par la fiabilité plus grande du dosage protéique par rap­

port au comptage cellulaire.

Les protéines sont dosées par la méthode de Lowry et coll. (1951) en utilisant comme standard de l'albumine de boeuf (Fraction V, Armour Company). Le dosage de l'hémoglobine est réalisé par la méthode de conversion en cyanmethhémoglobine en solution de

Drabkin (Merckotest); des solutions commerciales de cyanmethémoglobine sont utilisées comme standards

(Merck).

Tous les réactifs utilisés sont p.a.; les enzymes et substrats sont fournis par les firmes Boehringer et Sigma, les substances radioactives par le Radiochemi- cal Center (Amersham).

Le calcul de la précision intra-essai sur les

paramètres enzymatiques a été établi par deux méthodes

selon les cas ; soit en effectuant au cours d'un même

essai le dosage répété d'un échantillon avec calcul de

la moyenne et du coefficient de variation (CV); soit en effectuant des essais en duplicata et en calculant l'erreur standard proprotionnée sur les paires (S )

a dont le coefficient de variation vaut CV = S / /„

a' /2 (Bondy et coll., 1957).

Le terme sensibilité utilisé ci-après est pris dans l'acception de la plus petite activité significative­

ment détectable.

3.2 Adénosine dêsaminase (ADA).

3.2.1 Traitement_des_lysat£.

Le lysat des cellules mononucléées est centrifugé à 4° C, pendant 10 min à 1100 g. L'analyse est réalisée sur le surnageant.

Les érythrocytes sont hémolysés en tampon phos­

phate Na-K 10 mM, pH 7,5. La concentration en Hb est ajustée aux environs de 1 g par dl.

3.2.2 Activité_enz;^at_ique_^

L'activité de l'ADA est mesurée selon la métho­

de de Hopkinson et coll. (1969). La méthode est basée sur la mesure à 293 rim de la formation d'acide urique à partir d'adénosine au cours de réactions enzymati­

ques séquentielles.

Le milieu réactionnel est constitué de 2,5 ml de tampon phosphate Na-K 50 mM, pH 7,5, 1,3 yM en adénosi­

ne et contenant les enzymes auxiliaires (0,1 U de xan- tine oxydase (XO), 0,5 U de PNP). Après 10 min d'in­

cubation à 37° C, la réaction enzymatique est déclen­

chée par l'extrait enzymatique (0,05 ml contenant 100

à 200 yg de protéines ou 500 à 1000 yg d'hémoglobine);

elle est suivie à 293 ym dans un spectrophotomëtre en­

registreur Beckman 25 thermostatisé à 37° C. Un blanc de réactif est réalisé simultanément. Les résultats sont exprimés en ymoles d'acide urique formées par heure et par mg de protéines ou d'hémoglobine.

3.2.3 Caractéristiques_du do^ag;e^

- Sur cellules mononucléées.

Reproductibilité interessai : CV = 6,4 % (n =- 10);

précision intra-essai : CV = 5,7 % (n = 10); sensi­

bilité : 100 ymoles/h/mg protéines; linéarité : 100 à 2500 ymoles/h/mg protéines.

- Sur érythrocytes.

Reproductibilité interessai : CV = 5,4 % (n = 15);

précision intra-essai : CV = 4,3 % (n = 15); sensi­

bilité ; 30 ymoles/h/mg Hb; linéarité : 30 à 500 ymoles/h/mg Hb.

3.3 Purine nucléoside phosphorylase (PNP).

3.3.1 Traitement_des_lysat^.

Il est identique à celui réalisé par l'ADA, pour les deux types cellulaires.

3.3.2 Activité_enzymat_ique_^

L'activité est mesurée selon la méthode de Kalckar (1947). Comme pour l'ADA, la génération d'a­

cide urique est suivie à 293 ym et à 37° C. Une par­

tie aliquote (0,020 ml) contenant 20 à 50 yg de proté­

ines ou 100 à 250 g d'hémoglobine est ajoutée â 2,3 ml de tampon phosphate Na-K 50 itiM, pH 7,5 contenant 0,06 U de XO. Après 10 min d'incubation la réaction est déclenchée par adjonction de substrat (0,1 ml d'une solution d'inosine 9 mM). Un blanc exempt de substrat est simultanément réalisé. Le mode d'expres­

sion des résultats est identique à celui de l'ADA.

3.3.3 Caracterîsti 2 ues_du do^a£e_^

- Sur cellules mononucléées.

Reproductibilité interessai : CV = 4,6 % (n = 10);

précision intra-essai : 3,9 % (n = 10); sensibilité ; 1500 nmoles/h/mg protéines; linéarité ; 1500 à 20.000 nmoles/h/mg protéines.

- Sur érythrocytes.

Reproductibilité interessai : CV = 2,7 % (n = 15);

précision intra-essai ; 2,2 % (n = 9); sensibilité : 1000 umoles/h/mg Hb; linéarité ; 1000 à 4000 nmoles/

h/mg Hb.

3.4 5'-Nucléotidase (5'N).

3.4.1 Tr ai tement_des_ly^sat£.

Le lysat cellulaire est utilisé tel quel.

Nous n'avons pu mettre en évidence d'activité 5'N dans les membranes érythrocytaires; cette donnée confirme les résultats de Webster et coll., (1978).

3.4.2 Activité_enzymatj^que_^

L'activité enzymatique est dosée selon la métho­

de de Morré (1971). Une partie aliquote de lysat (0,1 ml) contenant 100 à 200 yg de protéines est ajou­

tée à 0,65 ml de tampon Tris-HCl pH 8,5, 55 mM Mgcl 2 et 11 mM AMP. Un blanc de réactifs et un blanc d'ex­

trait cellulaire sont réalisés simultanément. Après 120 min d'incubation à 37° C dans un bain, muni d'un système d'agitation douce, la réaction est arrêtée par adjonction d'acide trichloracétique (TCA) à 20 % (vo- liame à volume) . Le phosphore inorganique (Pi) libéré est mesuré selon la méthode de Fiske et Subbarow

(1925). Les activités sont exprimées en nmoles de Pi libérées par heure et par mg de protéines. Lorsque d'autres substrats sont utilisés, la méthodologie est identique.

3.4.3 Cara£t£r^stiques_du do£a£e_^

Reproductibilité interessai : CV = 4,2 % (n = 11) ; précision intra-essai : CV = 2,28 % (n = 31 pai­

res) ; sensibilité : 10 ymoles/h/mg protéines; linéari­

té : 10 à 750 ymoles/h/mg protéines.

3.5 Désoxythymidine phosphorylase (dThP).

3.5.1 Tr ai tement_de s_ly^sa t£.

Le lysat cellulaire est centrifugé à 100.000 g pendant 60 min (centrifugeur Beckman HR). Le surna­

geant est utilisé pour le dosage enzymatique.

3.5.2 Activité_enzymat_ique^

L'activité est dosée selon Schwarz (1978).

Nous avons modifié le pH du milieu réactionnel après

une étude préliminaire, nous ayant montré une optimi­

sation de la réaction à pH 6,5.

Le dosage est basé sur la mesure de la thymine produi­

te à partir de désoxythymidine, et dont le coefficient d'extinction molaire est 50 fois supérieur à celui de la désoxythymidine lorsque la mesure est faite à pH al­

calin et à 300 rim. Une partie aliquote (0,1 ml) conte­

nant entre 100 et 200 yg de protéines est ajoutée à 0,75 ml de tampon Tris-HCl 10 mM pH 6,5 et à 0,1 ml de tampon phosphate K 100 itiM pH 6,5. Après 10 min de

préincubation la réaction est déclenchée par adjonction de substrat (0,050 ml de désoxythymidine 0,1 M).

Après 60 min de déroulement dans le bain à agitation à 37° C la réaction est arrêtée par adjonction de NaOH 0,5 N (2 voliimes pour 1 volume) . Les absorbances de l'analyse, du blanc de réactif et du blanc d'extrait cellulaire sans substrat sont lues à 300 ym.

Les activités sont exprimées en ymoles de thymine li­

bérée par heure et par mg de protéines.

3.5.3 Caracteristi 2 ues_du dO£a 2 ;e_^

Reproductibilité interessai : CV =4,16 % (n = 9 paires); précision intra-essai : CV = 2,65 % (n = 19 paires); sensibilité : 0,050 ymoles/h/mg protéines;

linéarité : 0,050 à 2 ymoles/h/mg protéines.

3.6 Désoxyuridine phosphorylase (dUP).

3.6.1 Tr a i temen t_de s_ly^sa t^.

Il est identique à celui utilisé pour la mesure

de la dThP.

3.6.2 Activité_enzYinat^que_^

Le principe de dosage est identique à celui de la dThP, le substrat étant remplacé par la désoxyuri- dine, le produit de l'activité enzymatique étant l'uri- dine. Les conditions expérimentales sont celles du dosage de la dThP à l'exception du temps d'incubation

(120 min) et de la longueur d'onde de lecture (290 nm).

Les activités sont exprimées en ymoles de substrat li­

bérées par heure et par mg de protéines.

3.6.3 Caracteristi 3 ues_du do£a£e_^

Précision intra-essai ; CV = 0,9 % (n = 11);

sensibilité : 0,010 ymoles/h/mg protéines; linéarité : 0,010 à 2 ymoles/h/mg protéines.

3.7 Méthylthioadénosine phosphorylase (MTA-P).

3.7.1 Traitement_des_lysa t^.

Le surnageant obtenu après centrifugation pen­

dant 60 min à 100.000 g est utilisé pour le dosage.

3.7.2 Activité_enzymat_ique_^

L'activité enzymatique est dosée selon la méthode de Pegg et Williams-Ashman (1969) modifiée (Vertongen et coll., 1984b). La libération d'adénine à partir du substrat, la méthylthioadénosine (MTA), est suivie en la transformant en 2-8 dihydroxyadénine. Cette réac­

tion catalysée par la XO ajoutée en excès se déroule à 37° C et est lue à 305 ym.

Le lysat est préalablement incubé en présence d'une

quantité adéquate de désoxycoformycine (dCof) dans le

but d'inhiber l'ADA présente dans l'extrait cellulai­

re. Pour s'assurer du caractère complet de cette inhibition deux dosages préalables d'ADA doivent être réalisés. Le milieu réactionnel pour la mesure de la MTA-P est constitué de 2 ml de tampon phosphate Na-K

50 mM, pH 7,4 contenant 0,1 ml de lysat contenant de 30 à 100 yg de protéines.

La réaction est lue contre un blanc exempt de substrat.

Les résultats sont exprimés en nmoles d'adénine formées par heure et par mg de protéines.

3.7.3 Caractér^sti 2 ues_du do£a 2 ;e_^

Précision intra-essai : CV = 7,8 % (n = 6 pai­

res); sensibilité : 0,010 gmoles/h/mg protéines, li­

néarité : 0,010 à 150 nmoles/h/mg protéines.

3.8 Désoxythymidine kinase (dThK).

3.8.1 Traitement_des_lysat£.

Le lysat est préparé en tampon Tris-HCl 0,05 M pH 7,5, 2 mM dithiothréitol (DTT), 50 yM désoxythymidi­

ne, 10 % glycérol. Il est centrifugé à 1100 g pendant 10 min.

3.8.2 Activité^ en^ymati 3 ues_^

L'activité est dosée selon la méthode de Cheng (1978). Le dosage repose sur la conversion par l'en­

zyme du substrat marqué (dTh) en dTMP. La séparation

du substrat et du produit est réalisée en se basant

sur leurs caractéristiques différentes de rétention

sur DEAE cellulose : le nucléotide est retenu alors

que le nucléoside ne l'est pas. Un volume de 0,020 ml, contenant 40 à 150 yg de protéines est incubé à 37° C pendant 180 min avec 0,150 ml de milieu réac­

tionnel composé de Tris-HCl 100 itiM, pH 7,5 NaF 12,3 itiM, DTT 2 itiM, phosphocréatine 4,5 itiM, dTh 250 mM, Mgcl- 2,5 mM, ATP ou CTP 2,5 mM, albumine bovine 11

^ 14

g/dl et dTh2 C 10 yM (56 mCi/mmole). Cinquante yl du milieu d'incubation sont déposés sur un disque de DEAE cellulose (Whatman) qui est rapidement plongé dans de l'éthanol à 95°. Après quatre lavages, il est séché et introduit dans une fiole de comptage conte­

nant 15 ml de liquide scintillant (Instagel Packard).

Le comptage est effectué dans un compteur à scintilla­

tion Packard Tri-Carb 2450.

Les activités sont exprimées en ymoles de dTMP formées par heure et par mg de protéines.

3.8.3 Caracteristi 3 ues_du do£a£e_^

- Pour l'ATP comme donneur de phosphate.

Précision intra-essai : CV = 3,7 % (n = 35 paires);

sensibilité : 0,20 ymoles/h/mg protéines; linéarité 0,20 à 5 ymoles/h/mg protéines.

- Pour le CTP comme donneur de phosphate.

Précision intra-essai : CV = 1,93 % (n = 20 paires) sensibilité : 10 ymoles/h/mg protéines; linéarité : 0,10 à 2 ymoles/h/mg protéines.

3.9 Désoxycytidine kinase (dCtK).

3.9.1 Traitement_des_l^sat^.

Il est identique à celui réalisé pour la dThK.

3.9.2 Activité_enz^at_ique_^

Le principe de dosage est identique à celui du précédent enzyme. Le substrat est la désoxycytidine U C (480 mCi/mmole) et le donneur de phosphate est 14 l'ATP. Les résultats sont exprimés en moles de dCMP formées par heure et par mg de protéines. Nous avons pu démontrer pour l'enzyme extrait des cellules mononu- cléées humaines la même évolution bimodale de l'activi­

té en fonction de la concentration en substrat déjà si­

gnalée pour l'enzyme extrait des cellules thymiques de veau (Ives et Wang, 1978). Nous avons dès lors mesuré systématiquement les activités à deux concentrations de

-2 —1

dCt (7.10 et 1,5.10 mM) et nous avons calculé le rapport entre l'activité la plus élevée (dCtK 2 ) et la plus faible (dCtK^^) .

3.9.3 Caractéristi^ues_du do^a£e_^

- Pour la première concentration en substrat.

Précision intra-essai : CV = 4,3 % (n = 19 paires) ; sensibilité : 1,0 ymoles/h/mg protéines; linéarité : 1 à 9 ymoles/h/mg protéines.

- Pour la seconde concentration en substrat.

Précision intra-essai : CV = 3,3 % (n = 19 paires);

sensibilité : 1,5 ymoles/h/mg protéines; linéarité ; 1,5 à 10 ymoles/h/mg protéines.

4. INCORPORATION DE LA DESOXYTHYMIDINE ET DE LA DESOXY- CYTIDINE DANS L'ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE.

4.1 Préparation des cellules.

Après isolement sur gradient de Ficoll et lava-

ge, les cellules mononucléées sont maintenues en tam­

pon de Hanks contenant du glucose (5 mM). Un compta­

ge manuel, un test de viabilité au Bleu Trypan et un frottis coloré au May-Grünwald-Giemsa sont réalisés.

Ce dernier permet d'exclure les échantillons pour les­

quels la contamination monocytaire est supérieure à 5 %.

4.2 Incubation.

Dix millions de cellules sont mises en suspen­

sion dans 9,5 ml d'un milieu réactionnel composé d'un volume de Hanks glucosé (5 mît) concentré dix fois, deux volumes de plasma autologue, sept volumes d'eau bidistillée. La suspension cellulaire est incubée 60 min a 37 C en presence de 0,1 yCi par ml de dTh2 C 14

3 (56 mmoles/mCi) ou de 1 yCi par ml de dCth5 H (1 mmole/Ci).

4.3 Mesure de l'incorporation dans l'ADN.

La réaction est arrêtée par acidification du mi­

lieu en présence de TCA 20 % (1,2 ml pour 1 ml de mi­

lieu réactionnel). Après refroidissement pendant

10 min à 4° C le milieu est centrifugé 10 min à 1200 g.

Le surnageant est éliminé et le culot est lavé 2 fois avec du TCA 10 % et une fois avec 4 ml d'éthanol-éther

(1:1). Le culot est séché, hydrolysé dans 1 ml de NaOH 0,5 N et transvasé dans une fiole de comptage contenant 15 ml de milieu scintillant (Instagel Pa-

14 3 ckard). Le comptage de la radioactivité ( C ou H) est réalisé dans un compteur à scintillation Packard Tri-Carb 2450. Les résultats sont exprimés en dpm

g

par heure et par 10 cellules.

5. MARQUEURS IMf-lUNOLOGIQUES.

5.1 Méthodologie et expression des résultats.

Les déterminants antigéniques de la cellule sont mis en évidence par liaison avec une molécule identi­

fiable dans le système de détection utilisé (fluores­

cence ou formation de rosettes).

En immunofluorescence, cette molécule est un anticorps éventuellement de type monoclonal. La li­

aison antigène-anticorps se fait généralement dans une suspension cellulaire pour éviter la distorsion membranaire inévitable lors de l'étalement sur lame.

Deux procédés sont utilisés :

1°) l'immunofluorescence directe dans laquelle l'anti­

corps est directement couplé au fluorochrome;

2°) l'immunofluorescence indirecte (technique du sand­

wich) au cours de laquelle les cellules sont d'a­

bord incubées avec un premier anticorps non marqué dirigé contre les déterminants membranaires, puis lavées et incubées avec un second anticorps couplé au fluorochrome et dirigé contre le premier.

Dans les deux procédés, au moins 200 cellules lavées sont examinées au microscope à fluorescence

(Leitz). Le fluorochrome utilisé est 1'isothiocyanate de fluorescéine.

Le nombre de cellules positives est exprimé en pourcentage de cellules lymphocytaires totales. La na­

ture lymphocytaire de la cellule positive est confirmée

en microscopie par contraste de phase. Dans certains

cas (CALL, antigène la-like, IgC) l'intensité de la fluorescence est comparée à celle d'un témoin néga­

tif : la réponse est négative ou positive.

La formation des rosettes en présence des glo­

bules rouges adéquats est examinée en microscopie op­

tique. Les rosettes sont comptées dans une cellule de Thoma après coloration au Bleu de Toluidine.

Dans les rares cas où la population cellulaire de départ est hétérogène et l'identification lymphocytaire malai­

sée, la préparation est examinée sur frottis après colo­

ration au May-Grünwald-Giemsa.

5.2 Immunoglobulines de surface (IgS).

Les immunoglobulines de surface (IgS) sont mises en évidence par immunofluorescence directe (Pernis et coll., 1970). Les anticorps poly- et monovalents sont fournis par les firmes Dako et Kallestadt.

5.3 Immunoglobulines intracytoplasmiques (IgC).

La technique est similaire à celle utilisée pour les IgS mais les cellules sont préalablement fixées en solution éthanol-acétone-acide acétique.

5.4 Formation de rosettes en présence de globules rou­

ges de mouton (RM).

Le test de formation de rosettes en présence de

globules rouges de mouton prétraités à l'AET (bromure

de 2-aminoéthylisothiouronium) est pratiqué selon la

méthode de Jondal et coll. (1972) modifiée par Pelle-

grino et coll. (1975).

5.5 Formation de rosettes en présence de globules rou­

ges de souris (RS).

Ce test est réalisé selon la méthode de Gupta et coll. (1976) .

5.6 Utilisation des anticorps monoclonaux.

Nous avons utilisé les anticorps monoclonaux d'origine murine fournis par la firme Ortho (OKT^ - OKT^ - OKTg - OKT^

- OKT^^ - OKM^) et la méthode de détection en immunofluorescence indirecte selon Kung et coll. (1979). Les résultats sont généralement ex­

primés par rapport à un témoin négatif.

5.7 la-like.

L'anticorps est fourni par les firmes Cedarlane et Beckton-Dickinson; l'antigène est mis en évidence par immunofluorescence indirecte selon la technique préconisée par les fabricants.

5.8 Common acute lymphoblastic leukemia antigen (CALL).

La réactivité cellulaire est testée en immuno­

fluorescence indirecte à l'aide d'un anticorps fourni par la Croix Rouge Néerlandaise. Dans certains cas des anticorps monoclonaux anti-CALL sont utilisés (J5, ALj).

5.9 Nucléotidyl transférase terminale (Tdt).

La présence de l'enzyme est recherchée en immuno­

fluorescence indirecte à l'aide d'anticorps anti-Tdt