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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Motte, S. (1996). Caractérisation de différentes classes de récepteurs de l'ATP dans les cellules endothéliales vasculaires (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/212322/1/ee0ec17b-dba7-4a7e-9e46-9eafa3376d33.txt
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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
Faculté de Médecine
Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Nucléaire
CARACTERISATION DE DIFFERENTES CLASSES DE RECEPTEURS DE L’ATP DANS LES CELLULES
ENDOTHELIALES VASCULAIRES.
Serge Motte
— CÂO
Mémoire présenté en vue de l’obtention du titre d’Agrégé de l’Enseignement Supérieur
Année académique 1995-1996
CUNIQUES UNIVERSITAIRES DE BRUXELLES
UNIVERSITE ÜB^
DE BRUXELLES HOPITAL ERASME
ROUTE DE LENNIK 808 - B-1070 BRUXELLES
SERVICE DE
PATHOLOGIE VASCULAIRE
Professeur Jean-Pierre Dereume Au Professeur J.P. DEGAUTE
Doyen de la Faculté de Médecine CP 610
SECRÉTARIAT: TÉL,: 02/555 43 95 - 555 36 37 HOSPITALISATION: TÉL: 02/555 35 35 - 555 35 20 CONSULTATIONS: TÉL: 02/555 42 76
FAX: 02/555 35 36 - 555 67 11 B/KNQUE : 004-2500344-85 CLINIQUE CHIRURGICALE
Réf. : \adm\int\sm.36c VAS
G j
Le 5 septembre 1997
RÉSIDENTS
Dr Jean-Christophe Cavenaile Dr Philippe Dehon DrThuc Le Minh CONSULTANTS Dr Gisèle Vincent Dr Thierry Elleboudt Dr Alfred Leclercq CHEF DE SERVICE Pr Jean-Pierre Dereume CHEF DE CLINIQUE ADJOINT Dr José Ferreira
Hôpital Erasme
CLINIQUE MÉDICALE CHEF DE CLINIQUE Pr Jean-Claude Wautrecht CHEF DE CUNIQUE ADJOINT Dr Serge Motte
RESIDENT Monsieur le Doyen,
Dr Chnstophe Giot '
CONSULTANT Dr Sophie Guyot
Concerne : consultation thèse de doctorat.
Par la présente, je vous confirme que j'autorise la consultation de mon travail de thèse intitulé "Caractérisation de différentes classes de récepteurs de l'ATP dans les cellules endothéliales vasculaires" .
Je vous prie d'agréer. Monsieur le Doyen, l'expression de mes
sentiments les meilleurs.
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DE MEDECINE
Epreuve publique pour l’obtention du titre légal d’agrégé de l’enseignement supérieur
Serge MOTTE
Docteur en Médecine, Chirurgie et Accouchements
défendra publiquement le mardi 25 février 1997 à 18 heures, une thèse d’agrégation intitulée :
«CARACTERISATION DE DIFFERENTES CLASSES DE RECEPTEURS DE L’ATP DANS LES CELLULES ENDOTHELIALES VASCULAIRES»
M. MOTTE fera une leçon sur le sujet suivant :
«DIAGNOSTIC ET TRAITEMENT DE LA MALADIE VEINEUSE THROMBOEMBOLIQUE»
Auditoire Claude (local F2.204)
route de Lennik 808 - 1070 Bruxelles
Faculté de Médecine
Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Nucléaire
CARACTERISATION DE DIFFERENTES CLASSES DE RECEPTEURS DE UATP DANS LES CELLULES
ENDOTHELIALES VASCULAIRES.
Serge Motte
Promoteur:
Professeur J. M. Boeynaems.
Mémoire présenté en vue de l’obtention du titre d’Agrégé de l’Enseignement Supérieur
Année académique 1995-1996
Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance à Jean-Marie Boeynaems. J’ai été touché par la confiance qu’il m’a témoignée lorsqu’il m’a introduit dans “son groupe” à l’Institut de Recherche Interdisciplinaire. Tout en dirigeant et en structurant ce travail, il m’a communiqué son enthousiasme et le goût pour la recherche. Je le remercie chaleureusement pour sa disponibilité, ses encouragements et son soutien constant.
Je suis profondément reconnaissant à Jean-Pierre Dereume qui m’a donné les moyens de réaliser ces travaux. Par son ouverture d’esprit et sa générosité, il a contribué grandement au développement harmonieux de mes activités cliniques et de recherche. Sa confiance, ses encouragements et son enthousiasme ont été d’une aide considérable tout au long de ce travail.
Je remercie le Professeur Jacques Dumont pour m’avoir accueilli dans ses laboratoires ainsi que pour l’intérêt qu’il a porté à mes activités.
Je tiens à remercier Nicole Galand qui m’a initié aux techniques de cultures cellulaires.
Par la suite, son aide technique a largement contribué à la réalisation de ce travail.
Sabine Pirotton m’a aidé à acquérir les bases indispensables pour évoluer dans un laboratoire. Sa rigueur et ses discussions enrichissantes furent d’une grande aide pour la réalisation de nos projets. Je la remercie également pour ses conseils Judicieux lors de la rédaction de ce mémoire.
Je remercie Stéphane Swillens pour son aide précieuse dans le traitement mathématique de mes données, ainsi que Bernard Robaye pour ses conseils et ses encouragements.
Je remercie Didier Communi et Rodolphe Janssens qui m’ont guidé dans mes premiers pas en biologie moléculaire.
Je remercie tous mes collègues du service de Pathologie Vasculaire et particuliérement Jean-Claude Wautrecht pour m’avoir permis de disposer du temps nécessaire à la réalisation de ce travail.
Je remercie la Fondation Erasme qui m’a permis de réaliser une année de recherche à
temps plein à l’Institut de Recherche Interdisciplinaire.
I. INTRODUCTION p. 1
1. LES CELLULES ENDOTHELIALES : ROLE-CLE EN PATHOLOGIE
CARDIO-VASCULAIRE. p. 1
A. Modulation des réactions hémostatiques et thrombogénes. p. 1
1. Propriétés antithrombotiques. p. 2
2. Propriétés prothrombotiques. p. 3
B. Contrôle du tonus vasculaire. p. 4
C. Contrôle de la diapédèse des leucocytes. p. 4
D. Contrôle de la prolifération des cellules musculaires lisses. p. 6
2. ROLE PHYSIOLOGIQUE DE L’ATP EXTRACELLULAIRE DANS
LE SYSTEME CARDIOVASCULAIRE. p. 7
A. Sources de nucléotides extracellulaires dans les vaisseaux sanguins. p. 7 1. Perméabilisation sélective de la membrane plasmique. p. 8 2. Exocytose de grains ou vésicules sécrétoires. p. 9 B. Dégradation des nucléotides: rôle régulateur des ectonucléotidases. p. 9
C. Récepteurs P
2. p. 10
1. Introduction. p. 10
2. Classification moléculaire. p. 11
D. Actions physiologiques des nucléotides sur les cellules endothéliales. p. 14 E. Mécanismes de transduction des récepteurs P
2de l’endothélium
vasculaire. p. 15
1. Introduction. p. 15
2. Rôle des protéines G dans l’activation de la phospholipase C. p. 16
3. Les isoenzymes de la phospholipase C. p. 17
4. Métabolisme des inositol phosphates dans les cellules
endothéliales stimulées par les nucléotides. p. 17 5. Rôle du signal calcium dans le contrôle de l'action physiologique
des nucléotides sur l’endothélium. p. 18
F. Relation entre l’effet du flux sanguin, l’action des nucléotides et des
ectonucléotidases. p. 19
II. OBJECTIFS p .21
III. METHODES. p. 23
A. Mise en culture des cellules endothéliales d’aorte bovine. p. 23
B. Dosage des inositol phosphates. p. 23
C. Etude de la forme d’ATP interagissant avec les récepteurs P
2. p. 24 1. Effets des cations divalents sur l’accumulation des inositol
phosphates induite par l’ATP. p. 24
2. Calcul de la concentration d’ATP^'. p. 25
D. Etude de la liaison de radioligands sur celluies endothéliales
bovines intactes et sur fractions particulaires. p. 26 1. Préparation d’une fraction particulaire de cellules endothéliales
d’aorte bovine. p. 26
2. Expérience de liaison de radioligands sur fractions particulaires. p. 26 3. Mesure de la dégradation des radioligands dans les préparations
de fractions particulaires. p. 26
4. Liaison sur cellules endothéliales d’aorte bovine. p. 27
5. Analyse des caractéristiques de liaison. p. 27
IV. RESULTATS. p. 28
CHAPITRE 1: COEXPRESSION DES RECEPTEURS P jy ET Pzu DANS LES
CELLULES ENDOTHELIALES D’AORTE BOVINE. p. 28
CHAPITRE 2: LES RECEPTEURS P zy ET Pau SONT PREFERENTIELLEMENT
ACTIVES PAR DES NUCLEOTIDES NON COMPLEXES AUX CATIONS DIVALENTS. p. 29
CHAPITRE 3: CARACTERISATION DIRECTE DES RECEPTEURS PaPAR
LIAISON DE RADIOLIGANDS. p. 30
V. DISCUSSION. p.31
CHAPITRE 1 : COEXPRESSION DES RECEPTEURS PaY ET Pau- P- 31
CHAPITRE 2: LE LIGAND DES RECEPTEURS PaY ET Pau EST L’ATP“' OU
UNE FORME D’ATP NON COMPLEXE AUX CATIONS DIVALENTS. p. 36
LIAISON DE RADIOLIGANDS. p. 38
VI. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES. p.40
VII. BIBLIOGRAPHIE. p. 41
VIN. ANNEXE. p. 50
1
I. INTRODUCTION.
1. LES CELLULES ENDOTHELIALES: ROLE-CLE EN PATHOLOGIE CARDIOVASCULAIRE.
L’endothélium forme une monocouche de cellules polygonales aplaties, étroitement jointives, qui recouvrent entièrement l’intérieur de tous les vaisseaux sanguins. Ces cellules assurent de nombreuses fonctions. Situées à l'interface entre le sang et les tissus, elles contrôlent le transfert de substances du compartiment sanguin vers les espaces extracellulaires. Elles modulent également les fonctions biologiques des cellules sanguines et des cellules musculaires lisses sous-jacentes. L’éventail des principales fonctions de l’endothélium comporte:
- la modulation des réactions hémostatiques et thrombogènes.
- la constitution d’une barrière sélective, contrôlant le transport dans la paroi vasculaire d’éléments nutritifs, de substances vasoactives ou encore de lipoprotéines.
- la synthèse et la sécrétion de substances conjonctives (collagène, élastine) et de cytoadhésines (facteur de Von Willebrand, fibronectine) qui favorisent leur propre adhésion au sous-endothélium.
- la synthèse et la sécrétion de facteurs de croissance et de cytokines qui agissent sur les éléments figurés du sang et sur les cellules musculaires lisses.
- la modulation de l’adhésion et de la diapédèse des leucocytes.
- le contrôle du tonus vasculaire par la production de vasodilatateurs et de vasoconstricteurs agissant sur les cellules musculaires lisses sous-jacentes.
- le métabolisme de substances vasoactives (tels que l’angiotensine, la bradykinine, la sérotonine, la noradrénaline) ou encore de lipides (oxydation des lipoprotéines de faible densité).
Parmi ces nombreuses fonctions, la régulation du tonus vasculaire et de la balance hémostatique ainsi que le contrôle de la diapédèse des leucocytes et de la prolifération des cellules musculaires lisses jouent un rôle essentiel en pathologie cardiovasculaire, tout particulièrement dans l’athérogénèse et ses complications cliniques. Une vue plus détaillée de ces fonctions essentielles est décrite ci-dessous.
A. Modulation des réactions hémostatiques et thrombogènes
L’une des fonctions physiologiques essentielles de l’endothélium est d’assurer une
protection contre la thrombose. Par ailleurs, l’endothélium contribue à l’activation de
Modulation des réactions hémostatiques et thromboqènes
Principaux facteurs
antithrombotiques prothrombotiques
Réactions plaquettaires - Prostacycline (PGI 2 ) - Monoxyde d’azote (NO) - Ectonucléotidases
- Facteur de Von Willebrand - Collagène
Coagulation sanguine - Thrombomoduline - Glycosaminoglycans
sulfatés
- Inhibiteur de la voie extrinsèque
- Facteur tissulaire
Fibrinolyse - Activateur tissulaire du plasminogène (t-PA)
- Inhibiteur de l’activateur
tissulaire du plasminogène
(PAI -1)
2
l’hémostase normale en cas de lésion de la paroi vasculaire. Enfin, dans certaines circonstances, les cellules endothéliales peuvent perdre leurs propriétés antithrombotiques et acquérir des propriérés prothrombotiques. La modulation des réactions hémostatiques et thrombogénes s’effectue via des mécanismes multiples interférant avec l’agrégation plaquettaire, la coagulation sanguine, et le système fibrinolytique (tableau I ).
1. Propriétés antithrombotiaues.
L’endothélium contribue à la protection contre la thrombose de plusieurs façons:
- En réponse à différents stimulis, les cellules endothéliales synthétisent et libèrent deux puissants anti-agrégants plaquettaires dont l’action est locale: la prostacycline (PGI 2 ) et le monoxyde d’azote (NO). La PGI 2 est une prostaglandine synthétisée d’une part, à partir d’acide arachidonique libéré des phospholipides membranaires par la phospholipase A 2 (Vane et coll., 1987), d’autre part, à partir d’endoperoxydes libérés par les plaquettes lors de leur activation et capturés par les cellules endothéliales (Marcus et coll., 1980; Schafer et coll., 1984). La PGI 2 inhibe l’activation plaquettaire via une interaction avec son récepteur localisé à la surface des plaquettes et qui est couplé positivement à l'adénylate cyclase (Moncada et Vane, 1979). Par ailleurs, le NO qui est l’un des principaux médiateurs de la relaxation endothélium-dépendante (voir ci-dessous), inhibe l'activation plaquettaire via une augmentation du taux de GMP cyclique (Marcus et Safier, 1993). Comme la PGI 2 et le NO agissent via deux voies biochimiques distinctes, leurs effets inhibiteurs sur les réactions plaquettaires sont synergiques (Radomski et coll., 1987). Cette synergie inhibitrice puissante représente probablement un mécanisme physiologique important qui tend à limiter l’activation plaquettaire à l’endroit où une lésion de la paroi vasculaire s’est produite (Marcus et Safier, 1993). Enfin, les ectonucléotidases de la surface endothéliale endoluminale contribuent également à limiter l’agrégation plaquettaire: ces enzymes dégradent rapidement l’ADP extracellulaire, limitant ainsi l’amplification de l’activation plaquettaire induite par ce nucléotide (voir ci-dessous) (Marcus et coll., 1991).
- Les cellules endothéliales accroissent l’efficacité des réactions plasmatiques anti
thrombotiques grâce à la présence à leur surface endoluminale d’une part, de
mucopolysaccharides (les glycosaminoglycans sulfatés) et, d’autre part, de
thrombomoduline. Les glycosaminoglycans sulfatés sont fixés sur des protéines
transmembranaires de la membrane plasmique endothéliale et inhibent la coagulation par un
mécanisme similaire à celui de l'héparine utilisée en thérapeutique, consistant à
l'accélération de la neutralisation de la thrombine par la formation d'un complexe ternaire
avec l'anti-thrombine III plasmatique (Mertens et coll.,1992). La thrombomoduline, quant à
elle, est une protéine membranaire qui lie la thrombine, bloquant son activité procoagulante et augmentant sa capacité d'activer la protéine C (Esmon, 1993). La protéine C activée intervient dans l'inactivation des facteurs de coagulation Va et Villa. Enfin, les cellules endothéliales pourraient synthétiser l'inhibiteur de la voie extrinsèque de la coagulation (TFPI). Ce facteur inhiberait à la surface endothéliale le complexe formé par le facteur tissulaire et le facteur Vlla (voir ci-dessous). Le rôle physiologique de cet inhibiteur n’est toutefois pas connu (Wu et Thiagarajan, 1996).
- Les cellules endothéliales constituent la source principale de l'activateur tissulaire du plasminogène (t-PA). De plus, elles expriment des sites de liaison pour cet activateur de la fibrinolyse ainsi que pour le plasminogène, ce qui d'une part accroît l'efficacité de la réaction d'activation du plasminogène par le t-PA et d'autre part, protège ces molécules de l'inactivation par l’inhibiteur principal du t-PA, le PAI-1, et I'a2-antiplasmine (Hajjar et coll., 1986, 1987; Hajjar et Nachman, 1988). Les cellules endothéliales en culture peuvent également synthétiser un second activateur du plasminogène, l’urokinase. La signification physiologique de ce dernier n’est toutefois pas clairement établie (Wu et Thiagarajan, 1996).
2. Propriétés prothrombotigues
- Les cellules endothéliales contribuent à l’activation de l’hémostase physiologique principalement par la synthèse et la sécrétion du facteur de Von Willebrand. Ce facteur est le co-facteur essentiel de l'adhésion des plaquettes au collagène et aux structures conjonctives du sous-endothélium en cas de lésion de la paroi vasculaire.
- Par ailleur, les cellules endothéliales en culture peuvent être transitoirement activées en
réponse à différents facteurs, essentiellement les médiateurs de l'inflammation tels que
l’endotoxine (LPS) (Crossman et coll., 1990), le TNF (Tumor Necrosis Factor) (Bevilacqua et
coll., 1986) et l’interleukine-1 (IL-1) (Bevilacqua et coll., 1984). Cette activation entraîne une
réduction de leurs propriétés anti-thrombotiques et fait apparaître des propriérés
procoagulantes. Les cellules activées réduisent l’expression de thrombomoduline et
expriment le facteur tissulaire. Ce facteur, traditionnellement appelé thromboplastine
tissulaire, est une glycoprotéine transmembranaire qui forme avec les phospholipides
membranaires adjacents, le Ca^* et le facteur Vlla un complexe enzymatique capable
d'activer les facteurs IX et X de la coagulation. Les cellules endothéliales activées inhibent
également la fibrinolyse via une réduction de leur sécrétion de t-PA et une augmentation de
leur sécrétion du principal inhibiteur du t-PA: le PAI-1.
4
B. Contrôle du tonus vasculaire
En 1980, Furchgott et Zawadzki ont démontré que la vasorelaxation d'anneaux d'aorte de lapin induite par l'acétylcholine nécessitait la présence de l'endothélium intact. Cette vasorelaxation endothélium-dépendante est médiée par un facteur relaxant appelé initialement EDRF et identité plus tard comme étant le monoxyde d'azote (NO) (Palmer et coll., 1987). Le NO, qui est synthétisé par une NO synthase constitutive à partir de la L- arginine (Palmer et coll., 1988), diffuse dans les cellules musculaires lisses sous-jacentes où il stimule la guanylate cyclase soluble, augmente le taux de GMPc et provoque ainsi la relaxation. Le tonus vasculaire artériel est influencé par une libération permanente de NO qui joue donc un rôle dans le contrôle de la pression artérielle et des flux sanguins régionaux (Rees et coll., 1989). De plus, la libération locale de NO par l'endothélium peut être transitoirement accrue en réponse à différents agonistes tels que les nucléotides, la bradykinine, la sérotonine et la thrombine. Outre le NO, d'autres médiateurs endothéliaux peuvent être impliqués dans le contrôle du tonus vasculaire. La PGI 2 contribue à la vasodilatation endothélium-dépendante dans certains vaisseaux via une stimulation de l'adénylate cyclase des cellules musculaires lisses (Vane et coll.,1987). L’existence d'un facteur hyperpolarisant libéré par l'endothélium a également été proposée. Ce facteur qui agirait via l'ouverture de canaux potassiques au niveau des cellules musculaires lisses (Taylor et Weston, 1988), semblerait être l’agent principal de la relaxation endothélium- dépendante dans certains vaisseaux, plus particuliérement les vaisseaux de petit diamètre (Garland et coll., 1995).
L'endothélium synthétise également un peptide, l'endothéline-1, qui excerce une action locale sur le tonus vasculaire (Yanagisawa et coll., 1988). Ce peptide exerce un effect vasoconstricteur puissant via l’activation d’un récepteur de type A exprimé par les cellules musculaires lisses. Dans certains lits vasculaires, les cellules endothéliales expriment un récepteur de l’endothéline de types B dont la stimulation autocrine provoque une vasodilatation principalement via la libération de NO (Masaki, 1995). Enfin, les cellules endothéliales expriment l’enzyme de conversion de l'angiotensine qui active l'angiotensine I en angiotensine II (Soffer, 1976).
C. Contrôle de la diapédèse des leucocytes.
Au repos, l’endothélium constitue une surface relativement inerte, peu adhésive pour les
éléments figurés du sang. La production continue de NO par les cellules endothéliales
saines constitue l’un des mécanismes qui contribuent à limiter l’adhésion des leucocytes. En effet, l’inhibition in vivo de cette production basale de NO augmente l’adhésion des leucocytes à l’endothélium (Kubes et coll.,1991). Lors de l’activation des cellules endothéliales par des agonistes tels que la thrombine ou les médiateurs de l’inflammation, le recrutement séquentiel des polynucléaires et des monocytes s'accroît considérablement en raison d'une meilleure efficacité de l'adhérence des leucocytes aux cellules endothéliales.
L'adhérence des leucocytes sur les cellules endothéliales et la diapédése comporte 3 étapes successives: l’attachement lâche et réversible (appelé le rolling), l’adhésion ferme puis la migration proprement dite des leucocytes entre les cellules endothéliales adjacentes (LuscinskasetGimbrone, 1996).
-1 Dans un premier temps, l’attachement lâche des leucocytes sur l’endothélium augmente par l'expression massive à la surface de l'endothélium de glycoprotéines transmembranaires, appelées les sélectines. La sélectine P, stockée dans des granules endothéliaux appelés les corps de Weibel-Palade, est transférée à la surface cellulaire dans les minutes suivant la stimulation par des médiateurs tels que la bradykinine ou l'histamine (Hattori et coll.,1989). La sélectine E, par contre, doit être néosynthétisée et n'apparaît à la surface des cellules endothéliales que quelques heures après l'activation de ces cellules par des médiateurs inflammatoires tels que le TNF ou l’IL-1 (Bevilacqua et coll.,1989). Ces deux sélectines jouent un rôle dans la première étape de l'adhésion à la fois des polynucléaires et des monocytes. Les leucocytes qui interagissent avec les sélectines sont en quelque sorte, freinés sur une courte distance, ce phénomène est appelé le rolling.
-2 Pendant la phase de rolling, des substances chimiotactiques sécrétées par l’endothélium
stimulent l'activation des pi- et P 2 -intégrines exprimées par les leucocytes. Ces intégrines
provoquent l’adhésion ferme des leucocytes en interagissant avec des protéines
d’adhérence exprimées par les cellules endothéliales. Ces molécules endothéliales
d’adhérence leucocytaires sont apparentées aux immunoglobulines: au moins trois protéines
distinctes sont impliquées: ICAM-1 (intercellular adhesion molécule) et ICAM-2 ainsi que
VCAM-1 (vascular cell adhesion molécule). ICAM-1 et -2 sont exprimées constitutivement à
la surface des cellules endothéliales: l’expression d’ICAM-1 (et pas d’ICAM-2) est
augmentée en réponse à des cytokines (Wertheimer et coll., 1992). L’expression de VCAM-
1 par l’endothélium normal est faible, mais elle est augmentée en réponse aux médiateurs
de l’inflammation (Osborn et coll.,1989).
6
-3 Enfin, la migration transendothéliale des leucocytes serait médiée par une autre molécule d’adhérence, PECÀM-1 (platelet/endothelial cell adhesion molécule 1), qui est exprimée constitutivement par les cellules endothéliales (Muller et coll.,1993).
Outre leur rôle dans l'inflammation aiguë, les mécanismes d’adhésion jouent également un rôle important dans l’athérogénèse. Ainsi, Cybulsky et Gimbrone (1991) ont montré qu’un régime athérogène induisait rapidement chez le lapin l’expression par l’endothélium de VCAM-1. Cette expression était particuliérement localisée aux endroits où s’accumulaient les lipides dans la paroi vasculaire. Il est bien admis actuellement que l’infiltration de monocytes sanguins constitue une étape-clé dans le développement de la plaque d’athérome (Ross, 1995).
D. Contrôle de la prolifération des cellules musculaires lisses
Dans le vaisseau sain, les cellules musculaires lisses de la média se multiplient très peu. En réponse à de multiples facteurs, principalement les facteurs de croissance et les cytokines, ces cellules migrent dans l’intima où elles prolifèrent et sécrètent des substances conjonctives. Il est actuellement bien établi que la migration des cellules musculaires lisses de la média vers l’intima, leur prolifération et l’accumulation de matrice extracellulaire qui y est associée jouent un rôle essentiel dans l’athérogénèse ainsi que dans l’hyperplasie intimale survenant après angioplastie ou implantation de greffons vasculaires (Ross, 1995).
Il semble que l’endothélium sain contribue à inhiber de façon continue la migration et la prolifération des cellules musculaires lisses. Garg et coll. (1989) ont rapporté que le NO inhibait la prolifération de ces cellules en culture. Les cellules endothéliales produisent également en culture des molécules d’héparan sulfate qui exercent un effet inhibiteur sur la prolifération des cellules musculaires lisses (Castellot et coll., 1981). Par contre, les cellules endothéliales activées par la thrombine ou des cytokines peuvent produire elles-même des facteurs de croissance et des cytokines tels que le PDGF (platelet-derived growth factor), le FGF (fibroblast growth factor), le TGFp (transforming growth factor p) et l’IL-1 qui exercent un effet stimulant paracrine sur les cellules musculaires lisses (Ross, 1995). Enfin, l’endothéline -1 sécrétée par l’endothélium peut également exercer un effet mitogène sur les cellules musculaires lisses (Komuro et coll., 1988; Nakaki et coll., 1989).
En conclusion, l’endothélium constitue habituellement une surface thromboprotectrice
et non adhésive pour les leucocytes. Il joue un double rôle fondamental dans le maintien de
l’intégrité des vaisseaux. D’une part, il module à court terme la balance hémostatique et le tonus vasculaire. D’autre part, il exerce à plus long terme un contrôle sur la structure même de la paroi vasculaire via la modulation de l’infiltration leucocytaire et le contrôle de la prolifération des cellules musculaires lisses. Du fait de ces multiples propriétés, le NO produit en permanence par les cellules endothéliales saines semble exercer un effet protecteur continu important contre le développement de lésions de la paroi vasculaire (Lloyd-Jones et Bloch, 1996). L’exposition chronique à divers stimuli tels que des cytokines, des agents métaboliques (lipides oxydés, homocystéine), toxiques ou mécaniques (perturbation du flux) conduit à une dysfonction de l’endothélium. Celle-ci se caractérise par une réduction de l’activité des molécules vasodilatatrices et protectrices contre la thrombose allant de pair avec un accroissement des propriétés prothrombotiques et de l’adhésivité.
Cette dysfonction endothéliale joue un rôle important dans l’athérogénèse et ses complications; elle prédispose en effet le vaisseau à la vasoconstriction, l’agrégation plaquettaire, la thrombose, l’infiltration leucocytaire et la prolifération des cellules musculaires lisses (Gibbon et Dzau, 1996).
2. ROLE PHYSIOLOGIQUE DE L*ATP EXTRACELLULAIRE DANS LE SYSTEME CARDIO-VASCULAIRE.
L'ATP est un composant intracellulaire qui joue un rôle fondamental dans le métabolisme énergétique des cellules ainsi que dans la régulation cellulaire (substrat des protéine- kinases, régulateur de certains canaux potassiques,...). Il est maintenant bien établi que l’ATP peut également exercer la fonction de médiateur intercellulaire. Les multiples actions de l’ATP extracellulaire sont médiées principalement par des récepteurs spécifiques appelés récepteurs P 2 dont l’expression est ubiquitaire. Dans le système cardio-vasculaire, les multiples sources de nucléotides extracellulaires et l’expression de multiples sous-types de récepteurs P 2 suggèrent que les nucléotides jouent un rôle physiologique important, tout particulièrement dans l’interaction entre la paroi vasculaire et les plaquettes.
A. Sources de nucléotides extracellulaires dans les vaisseaux sanguins.
La source la plus évidente d’ATP extracellulaire est l’ATP cytoplasmique (concentration de
l’ordre de 3 à 5 mM dans la plupart des cellules) qui peut être libéré en cas de lyse cellulaire.
8
Outre la lyse cellulaire, l'apparition d'ATP et d'ADP dans le milieu extracellulaire peut résulter de deux mécanismes: la perméabilisation sélective de la membrane plasmique et l'exocytose de grains sécrétoires.
1. Perméabilisation sélective de la membrane plasmique.
En 1979, Pearson et Gordon ont rapporté la libération d'ATP cytoplasmique par les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses en culture en réponse à la thrombine. Il faut souligner que la libération des nucléotides était observée sans perte significative de déshydrogénase lactique, ce qui suggère que l'intégrité cellulaire était préservée. Depuis ce travail, la libération d'ATP cytoplasmique par des cellules endothéliales en culture a été rapportée en réponse à différents agonistes tels que la bradykinine, l'acétylcholine, la sérotonine, la noradrénaline et l'ADP lui-même (Yang et coll., 1994; Shinozuka et coll., 1994). Ce mode de libération de l'ATP a également été décrit dans différents modèles animaux de vaisseaux intacts (Sedaa et coll., 1990; Shinozuka et coll., 1994). Sedaa et coll.
(1990) ont notamment montré que l'ATP cytosolique libéré par les cellules endothéliales d'aorte thoracique de lapin représentait une fraction très importante (90%) de la totalité de l'ATP libéré par le vaisseau en réponse à une stimulation électrique transmurale ou à un agoniste al adrénergique, une petite partie (7%) provenait des cellules musculaires lisses et 3% seulement étaient d’origine neuronale. La force de cisaillement engendrée par le flux sanguin constitue également un facteur stimulant la libération de nucléotides. Bodin et coll.
(1991) ont démontré la libération d'ATP cytosolique par des cellules endothéliales fraîchement isolées d'aorte thoracique de lapin soumises à des perfusions à vitesses croissantes. Des résultats similaires ont été rapportés avec des modèles de vaisseaux intacts tels que les vaisseaux mésentériques ou pulmonaires de rat (Ralevic et coll., 1992;
Hassessian et coll., 1993) ainsi que les vaisseaux cérébraux de lapin (Domer et coll., 1993).
Enfin, l'hypoxie semble également être un stimulus induisant la libération d'ATP cytosolique.
La libération d'ATP en réponse à l’hypoxie a ainsi été rapportée dans différents modèles tels que le coeur intact perfusé de rat (Clemmens et Forrester, 1981; Vial et coll.,1987), les cardiomyocytes de rat (Forrester et Williams, 1977) et les érythrocytes humains en suspension (Forrester, 1990). Récemment, Bodin et Burnstock (1995) ont observé une synergie entre les effets de l’hypoxie et ceux de l’augmentation de la force de cisaillement sur la stimulation de la libération d’ATP par des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine fraîchement isolées.
Le mécanisme précis impliqué dans la perméabilisation sélective pour les nucléotides reste
spéculatif. La libération d'ATP cytoplasmique pourrait être médiée par des protéines
transmembranaires appartenant à la famille des canaux ioniques ABC (ATP binding
cassette) telles que la glycoprotéine P ou la protéine CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) impliquée dans la mucoviscidose (Abraham et coll., 1993; Reisin et coll., 1994). Toutefois l'implication de ces transporteurs reste controversée (Reddy et coll.,
1996, Li et coll., 1996).
2 . Exocytose de grains ou vésicules sécrétoires.
- Corps denses de plaquettes ;
Les nucléotides sont présents à concentration élevée dans les corps denses des plaquettes.
La somme des concentrations d'ATP et d'ADP est de l'ordre de 1 M. Après activation des plaquettes par la thrombine in vitro, on peut estimer que la concentration plasmatique d'ATP et d'ADP est de l'ordre de 20 pM (Gordon 1986 ). Il faut souligner que d'autres nucléotides sont également stockés dans les corps denses plaquettaires, notamment l'UTP.
- Vésicules sécrétoires des fibres nerveuses périvasculaires :
Su (1975) a rapporté, grâce à une technique de marquage à radénosine[^H], la première démonstration d'un efflux d'ATP[^H] après stimulation électrique des fibres nerveuses adrénergiques périvasculaires de l'aorte de lapin. Il est actuellement bien établi que l'ATP est co-libéré avec la noradrénaline par les fibres nerveuses adrénergiques périvasculaires (Westfall et coll., 1990). L'ATP peut également constituer le neuromédiateur principal libéré par des terminaisons nerveuses non adrénergiques, non cholinergiques (nerfs purinergiques) et peut être libéré par des fibres nerveuses sensitives (Burnstock, 1990).
En résumé, des quantités importantes de nucléotides peuvent être libérées localement en réponse à différents agonistes, en cas d'hypoxie et d'augmentation de la force de cisaillement ou encore lors de l'agrégation plaquettaire; les plaquettes et les cellules endothéliales elles-même constituent une source importante de nucléotides.
B. Dégradation des nucléotides : rôle régulateur des ectonucléotidases.
Les nucléotides libérés dans le milieu extracellulaire sont rapidement métabolisés par des ectonucléotidases présentes à la surface cellulaire. Dans les vaisseaux sanguins, les ectonucléotidases endothéliales jouent un rôle majeur en contribuant à limiter dans le temps l'activité des nucléotides. Ainsi, alors que la demi-vie de l'ATP dans le sang total ex vivo est de 5 minutes, elle n’est que de quelques secondes dans la microcirculation (Pearson, 1985).
L'ATP est séquentiellement dégradé en ADP, AMP et adénosine par une ATPase, une
ADPase et une 5'-nucléotidase. L'ectoATPase, qui est présente à la surface de nombreuses
TABLEAU 2
CLASSIFICATION PHARMACOLOGIQUE DES RECEPTEURS P 2
TYPE AGONISTES LOCALISATION(S) REPONSE TYPIQUE
PREFERENTIELS
PzY
2-MeSATP>ADP=ATP endothélium vasculaire, foie... libération de prostacycline et NO
P2X
APCPP>ATP>2-MeSATP muscle lisse contraction du muscle lisse
NCMQ.
BzATP>ATP>ADP macrophages, lymphocytes mort cellulaire
P2T
2-MeSADP>ADP (ATP=antagoniste)
plaquettes agrégation plaquettaire
P2U
UTP=ATP endothélium vasculaire,
épithélium respiratoire..
libération de prostacycline et NO, sécrétion de Cl"
2-MeSATP: 2-méthylthio-ATP APCPP: a,p-méthylène-ATP
BzATP ; 3’-0-(benzoyl)-benzoyl-ATP
2-MeSADP: 2-méthylthio-ADP
cellules, lie et hydrolyse le MgATP^', la forme d'ATP prédominante dans le milieu extracellulaire. Une ATP diphosphohydrolase a également été décrite. Cet enzyme dégrade directement l'ATP en AMP et serait exprimé notamment par les cellules endothéliales d'aorte et de coronaires de boeuf (Miura et coll., 1987; Côté et colL, 1991; Yagi et coll., 1991).
L'adénosine, qui constitue également un médiateur intercellulaire, est recaptée par les cellules et contribue à restaurer le pool des purines intracellulaires. Il faut souligner que l'ADP et, dans une moindre mesure, l'ATP sont des inhibiteurs de la 5’-nucléotidase (Gordon et coll., 1986, 1989; Meghji et coll., 1995). Cet effet inhibiteur, dont l'importance peut varier d'un tissu à l'autre, contribue à atténuer la production d'adénosine lors de la phase initiale de la libération d'ATP et d'ADP. Il est concevable que l’expression différentielle des ectonucléotidases d'un type cellulaire à un autre puisse affecter les concentrations locales des nucléotides et atténuer ainsi de façon différentielle l'amplitude et la durée d'action de chacun de ces nucléotides (Dubyak et El-Moatassim, 1993).
C. Récepteurs P?
1. Introduction.
En 1978, Burnstock, introduisit le concept selon lequel les actions de l'ATP et de l'ADP extracellulaires étaient médiées par des récepteurs spécifiques. Il baptisa ces récepteurs
" purinergiques P 2 " par opposition aux " purinergiques Pi " qui sont les récepteurs de
l'adénosine (Burnstock 1978). Ultérieurement, plusieurs sous-types de récepteurs p 2 ont été
identifiés essentiellement sur base de la puissance relative avec laquelle différents
nucléotides naturels et analogues de synthèse de l'ATP et de l'ADP produisent leurs effets
(tableau 2). Ainsi, en 1985, Burnstock et Kennedy proposèrent une première subdivision des
récepteurs P 2 en deux sous-classes P 2 X et P 2 Y sur base essentiellement de la sélectivité de
deux agonistes de synthèse: ra,p-méthylène-ATP qui est spécifique des récepteurs P 2 X et le
2-méthylthio-ATP (2-MeSATP), spécifique des récepteurs P 2 y - L’a,p-méthylène-ATP produit
une contraction directe du muscle lisse vasculaire tandis que le 2-MeSATP induit une
relaxation endothélium-dépendante. Peu après, deux sous-types supplémentaires furent
proposés: le P 2 Z et le P 2 T (Gordon, 1986). L'une des caractéristiques des récepteurs P 2 Z
proposée initialement était l'interaction préférentielle de ce sous-type avec l'ATP^". Les
récepteurs P 2 T exprimés par les plaquettes représentent un cas particulier car leur agoniste
naturel est l'ADP; l'ATP se comporte comme un antagoniste compétitif. Enfin, c'est en 1991
que O'Connor et coll. ont suggéré l'existence des récepteurs P 2 U, également appelés
11
récepteurs nucléotidiques, qui sont activés de manière équipotente par l'ATP et l'LITP.
Actuellement, cette classification pharmacologique apparaît trop simple pour accommoder toutes les données de la littérature. En fait, le développement récent de l'approche moléculaire a révélé que la famille des récepteurs Pz était bien plus riche que ce que l'on imaginait.
2. Classification moléculaire.
C'est en 1993 que les récepteurs P 2 Y et P 2 U ont été clonés à partir d'ADN complémentaire (ADNc), respectivement de cerveau de poulet (Webb, 1993) et d'une lignée hybride de neuroblastome-gliome de souris (Lustig, 1993). Actuellement, les ADNc des récepteurs P 2 Y humain (Ayyanathan et coll., 1996; Janssens, 1996; Schachter, 1996), de dinde (Fiitz et coll., 1994), de souris et de rat (Tokuyama et coll., 1995) ainsi que de boeuf (Henderson et coll. , 1995) sont clonés, ainsi que l'homologue humain (Parr et coll., 1994) et de rat (Gôdecke et coll., 1996, Rice et coll., 1995) du récepteur P 2 u- Ces récepteurs appartiennent tous à la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G. La structure de ces récepteurs comprend 7 zones hydrophobes transmembranaires reliées par des boucles hydrophiles intra- et extracellulaires. L’extrémité C-terminale est intracellulaire et comporte des sites de phosporylation pour les protéine kinases. Les récepteurs P 2 Y et P 2 U qui présentent entre eux 39% d'identité en acides aminés, ne présentent qu'une faible homologie avec les autres récepteurs heptahélicoïdaux. Ils constituent donc une sous- famille particulière. Il faut souligner que ces récepteurs ne contiennent pas le motif G(X 4 )GK (G=Glycine, X=n’importe quel acide aminé, K=Lysine), séquence consensus retrouvée dans de nombreuses protéines liant l'ATP.
Concernant les récepteurs P 2 X, deux premiers sous-types distincts ont été clonés simultanément en 1994, l'un à partir de canal déférent de rat (Valera et coll., 1994), l'autre à partir de cellules PC 12 de phéochromocytome de rat (Brake et coll., 1994). Exprimés dans des ovocytes de xénope, ces récepteurs se comportent comme des canaux cationiques non sélectifs. Leurs séquences sont caractérisées par l'existence de 2 zones hydrophobes transmembranaires séparées par une longue boucle extracellulaire riche en cystéines; les extrémités C- et N- terminales sont intra-cellulaires. La séquence de ces récepteurs contient, contrairement aux récepteurs P 2 Y et P 2 U, le motif apparenté à G(X 4 )GK dans la boucle extracellulaire.
A la suite du clonage des récepteurs P 2 Y. Pau et P 2 X, une réorganisation de la classification
sur base des séquences et des mécanismes de transduction a été proposée. Les récepteurs
possédant une activité intrinsèque de canal cationique sont appelés P2X tandis que les
récepteurs heptahélicoïdaux couplés aux protéines G sont appelés P2Y. Les récepteurs P 2 Y
CLASSIFICATION MOLECULAIRE DES RECEPTEURS ?2 P2Y : COUPLAGE AUX PROTEINES G
SOUS- TYPES
LOCALISATION(S) AGONISTE(S) PREFERENTIEL(S)
P 2 Yi (=P 2 y ) Cerveau (poulet, dinde) Endothélium (bœuf)
La plupart des tissus humains
(principalement prostate, ovaire, tube digestif)
2-MeSATP>ADP> ATP
P 2 Y 2 (=P 2 u ) Large distribution; muscle squelettique, épithélium des voies aériennes, placenta...
ATP=UTP
P2Ya Cerveau (poulet) UDP>ADP>ATP
P 2 Y 4 Placenta (humain) UTP
P2Ys Lymphocytes T activés (humain) ATP>ADP>2-MeSATP P2Ye Rate, placenta, thymus, leucocytes, muscle
lisse (humain)
UDP
P 2 Y 7 Coeur, muscle squelettique (humain) ATP>ADP=UDP
P2X: ACTIVITE INTRINSEQUE DE CANAL IONIQUE SOUS-
TYPES
LOCALISATION(S) AGONISTE(S) PREFERENTIEL(S)
P 2 Xi Vessie, canal déférent (rat, souris, humain) 2-MeSATP>ATP>APCPP>ADP P 2 X 2 Hypophyse, canal déférent,moelle épinière (rat) 2-MeSATP>ATP>APCPP P2Xa Fibres afférentes nociceptives (rat) ATP=2-MeSATP>ATPyS>ADP P 2 X 4 Large distribution; cerveau, glande surrénale,
épithélia, muscle lisse,...(rat, humain)
ATP>2-MeSATP>APCPP
P2Xs moelle épinière (rat) ATP>2-MeSATP>ADP
P2Xe cerveau, moelle épinière(rat) ATP>2-MeSATP>ADP P2Xy
(=P 2 Z)
cerveau, macrophage (rat) BzATP>ATP>2-MeSATP
2-MeSATP: 2-méthylthio-ATP; APCPP: a,P-méthylène-ATP;
BzATP: 3’-0-(benzoyl)-benzoyl-ATP
12
et P 2 U décrits dans la classification pharmacologique sont dès lors rebaptisés respectivement P 2 Yi et P 2 Y 2 (tableau 3). La numérotation P2Y
net P2X
nest actuellement attribuée selon l'ordre de publication des séquences.
Différentes stratégies de clonage par homologie ont permis le clonage d’autres sous-types de récepteurs P2X et P2Y qui n'avaient pas leur équivalent dans la classification pharmacologique. Actuellement, la famille de récepteurs P2Y compte 7 sous-types qui sont à différerents stades de caractérisation. Les récepteurs P2Ya (webb et coll., 1996a), P 2 Y 4 (Communi et coll., 1995a; Nguyen et coll., 1995) et P2Ye (Chang et coll., 1995; Commun! et coll. 1996) ont pour caractéristique d’interagir préférentiellement avec les nucléotides uridyliques. Il faut souligner que le clonage et l’expression fonctionnelle de ces sous-types apportent la première démonstration que les effets de l’UTP et de l’UDP peuvent être relayés par des récepteurs pyrimidinergiques spécifiques. La simple existence de ces récepteurs suggère que les nucléotides uridyliques jouent un rôle de médiateurs intercellulaires. Sur base d’une homologie de séquence, le récepteur orphelin 6H1 exprimé par les lymphocytes T activés par des mitogènes a été inclus dans la famille P2Y et appelé P2Ys (Webb et coll., 1996b). Cependant, à ce Jour sa caractérisation pharmacologique repose uniquement sur des données de liaisons de l’analogue [^®S]dATPaS. Le récepteur P2Y/, cloné à partir de cellules érythroleucémiques, est structurellement assez éloigné des autres sous-types P2Y (Akbar et coll., 1996).
Concernant la famille des récepteurs P2X, 7 sous-types distincts sont actuellement clonés et peuvent être regroupés de la façon suivante:
- les récepteurs P2Xi et P 2 X 3 , présentant une forte affinité pour l’ATP et dont l’activation entraîne une dépolarisation qui est brève en raison d’une désensibilisation rapide du récepteur.
- les récepteurs P 2 X 2 , P 2 X 4 , P2Xs, P2Xe, présentant une affinité pour l’ATP dix foix plus faible que les récepteurs P2Xi et P 2 X 3 , se désensibilisant lentement et dont la stimulation entraîne une dépolarisation lente.
- le récepteur P 2 X 7 , présentant les propriétés pharmacologiques du récepteur P 2 z: l’affinité pour l’ATP est faible (EC50 de l’ordre de 100 pM) et la stimulation prolongée par l’agoniste entraine une dépolarisation soutenue qui s’accompagne d’une augmentation de perméabilité non-sélective de la membrane plasmique conduisant à la lyse cellulaire.
La biologie moléculaire a donc permis d’identifier plusieurs sous-types de récepteurs P 2
donc l’existence n’était pas soupçonnée. Il faut souligner qu’en l’absence d’antagonistes
réellement spécifiques de ces différents sous-types, la caractérisation de ceux-ci sur base de l'ordre de puissance des agonistes présente différents problèmes propres à la nature même du ligand. Ces problèmes sont essentiellement:
- la libération de nucléotides endogènes par les cellules qui expriment les récepteurs P 2 .
- le métabolisme des nucléotides à la surface des cellules. Les analogues naturels ou de synthèse de l’ATP présentent une sensibilité différente à la dégradation par les ectonucléotidases. Ainsi, l’ap-méthylène-ATP a été considéré initialement comme l’agoniste sélectif des récepteurs P 2 X car cet analogue est plus puissant que l’ATP et le 2-MeS-ATP lorsqu’on mesure la contraction musculaire lisse sur préparation d’anneaux d’artère. Or, l’ap- méthylène-ATP est plus résistant à la dégradation par les ecto-ATPases que l’ATP et le 2- MeSATP (Gordon et coll., 1986). Lorsqu’on mesure les courants entrants induits par ces agonistes sur les cellules musculaires lisses isolées, dans des conditions où la dégradation des agonistes est limitée, l’ordre de puissance est inversé (2-MeSATP > ap-méthylène-ATP) (Evans et Kennedy, 1994). Outre la déphosphorylation des nucléotides, la phosphorylation de ceux-ci serait également possible à la surface des cellules. Récemment, Nicholas et coll (1996) ont démontré que les cellules 1321 NI, utilisées pour l'expression stable de différents récepteurs P2Y recombinants, expriment une nucléotide kinase qui catalyse la conversion des nucléotides diphosphates extracellulaires en nucléotides triphosphates. Ainsi, un effet apparent de l’UDP au niveau des récepteurs P 2 Y 4 serait dû à sa phosphorylation en UTP par cette kinase, qui utilise l’ATP libéré par les cellules.
Concernant la famille des récepteurs P2Y, l’expression stable dans les cellules 1321 NI des sous-types P2Yi, P 2 Y 2 , P 2 Y 4 , et P2Ye a permis récemment de préciser la pharmacologie de ces sous-types dans des conditions où le métabolisme des ligands est limité (Schachter et coll., 1996) et par l’utilisation de ligands purifiés par HPLC (Nicholas et coll., 1996). Il ressort notamment que le récepteur P 2 Yi est bien spécifique des nucléotides de l’adénine et que le récepteur P 2 Y 2 interagit sélectivement avec les nucléotides triphosphates ATP et UTP. La famille P2Y comporte donc:
- des récepteurs sélectifs pour les nucléotides di- ou triphosphates de l’adénine (P2
y=P2Y
i):
- des récepteurs communs aux nucléotides adényliques et uridyliques, mais interagissant préférentiellement avec les nucléotides triphosphates (P 2 u =P 2 Y 2 );
- des récepteurs pyrimidinergiques: les récepteurs P 2 Y 4 et P 2 Ye interagissant
préférentiellement avec l’UTP et l’UDP respectivement.
NERVE ADVENT.
MUSCLE
ENDOTH.
ADP
PLATELETS
&
FIGURE 1
CONTROLE DU TONUS VASCULAIRE PAR LES NUCLEOTIDES.
En réponse à l’ATP présent à la surface endoluminale, les cellules endothéliales
synthétisent et libèrent le NO, initialement appelé EDRF, qui induit la relaxation du muscle lisse
(-). Par ailleurs, l’ATP libéré comme cotransmetteur avec la noradrénaline (NA) par les
terminaisons nerveuses périvasculaires provoque la constriction (+) du muscle lisse. L’adénosine
(ADO) provenant de, la dégradation rapide de l’ATP par les ectonucléotidases induit une
vasodilatation via des récepteurs Pi (de type A 2 ) exprimés par les cellules musculaires lisses et
peut également agir au niveau des terminaisons nerveuses périvasculaires (via des récepteurs
de type Ai) pour inhiber la libération de transmetteurs. Figure empruntée à Burnstock, 1996.
D. Actions physiologiques des nucléotides sur les cellules endothéliales.
L'ATP et l'ADP exerœnt deux effets majeurs sur l'endothélium vasculaire: ils stimulent la libération de prostacycline (PGI 2 ) et de monoxyde d'azote (NO) (Boeynaems et Pearson, 1990). L'ordre de puissance des analogues de l'ATP suggérait initialement que la production de ces deux médiateurs était médiée exclusivement par un seul sous-type de récepteurs P 2 : les récepteurs P 2 Y (Martin, 1985; Needham, 1987). Les deux effets physiologiques principaux résultant de la production de PGI 2 et de NO sont d'une part, la modulation du tonus vasculaire, et d'autre part, l'inhibition de l'agrégation plaquettaire. Concernant l'effet sur le tonus vasculaire (figure 1 ), la réponse physiologique nette est la résultante de l'ensemble des effets exercés par l'ATP et son produit de dégradation, l'adénosine, sur les cellules endothéliales ainsi que sur les cellules musculaires lisses sous-jacentes via l'activation de multiples récepteurs et mécanismes de rétrocontrôle. La stimulation de l'endothélium entraîne une relaxation due, le plus souvent, au NO. L'ATP provenant des terminaisons nerveuses périvasculaires peut par ailleurs induire une vasoconstriction via la stimulation des récepteurs P 2 X des fibres musculaires lisses. L'importance relative de la relaxation ou de la constriction dans différents territoires vasculaires va donc dépendre essentiellement de la balance locale entre la production de NO par l'endothélium et la constriction des fibres musculaires lisses via les récepteurs P 2 X (Ralevic et Bunstock, 1991a). La balance se ferait en faveur de la constriction en cas de lésions de l'endothélium.
Dans cette situation, les plaquettes qui s'agrègent au contact du collagène mis à nu par la lésion de l'endothélium, libèrent des quantités importantes d'ATP et d'ADP, ainsi que d'UTP, qui peuvent agir directement sur les cellules musculaires lisses. En particulier, il est apparu récemment que les cellules musculaires lisses pouvaient exprimer, outre les récepteurs P 2 X.
des récepteurs de type P 2 U interagissant avec l'UTP et dont la stimulation entraîne également une constriction (Pacaud et coll., 1995; Miyagi et colL, 1996a).
Concernant l'agrégation plaquettaire (figure 2), l'ADP, libéré lorsque les plaquettes s'agrègent, stimule lui-même l'agrégation de plaquettes supplémentaires via les récepteurs P 2 T plaquettaires. L'importance de l'ADP et des récepteurs P 2 T dans la pathogénèse des thromboses artérielles vient d'être illustrée par la démonstration de l'action anti-thrombotique in vivo, chez l'animal, d'antagonistes sélectifs de ces récepteurs (Humphries et coll., 1995).
Par ailleurs, les nucléotides libérés stimulent la libération par les cellules endothéliales
voisines de PGI 2 et de NO qui vont inhiber l'agrégation. Ce mécanisme de rétrocontrôle
négatif tend donc à limitér l'agrégation plaquettaire et à localiser les thrombi au niveau des
lésions de l'endothélium (Boeynaems et Pearson, 1990; Marcus, 1993). L'action de l'ATP et
FIGURE 2
DUALITE DU ROLE DE L’ADP DANS L’AGREGATION PLAQUETTAIRE
De grandes quantités d’ATP et d’ADP sont libérées localement lors de l’agrégation
plaquettaire. L’ADP amplifie l’agrégation en interagissant avec des récepteurs plaquettaires
(P 2 t ). L’ADP ainsi que l’ATP agissent sur les cellules endothéliales et induisent la libération de 2
antiagrégants plaquettaires; la PGI 2 et le NO. Finalement, ces nucléotides sont dégradés par les
ectonucléotidases en adénosine qui peut inhiber l’agrégation plaquettaire via des récepteurs
exprimés par les plaquettes (A 2 ). Figure empruntée à Boeynaems et Pearson, 1990.
de l'ADP sur l'endothélium est vraisemblablement un des mécanismes impliqués dans l'augmentation de la biosynthése de PGI 2 qui a été rapportée chez les patients athéromateux présentant une activation plaquettaire accrue en cas d'artériopathie sévére des membres inférieurs (FitzGerald et coll.,1984 ), d'angor instable ou d'infarctus du myocarde (Fitzgerald etcoll.,1986).
En conclusion, diverses situations en pathologie vasculaire s’accompagnant de lésions des cellules endothéliales ou musculaires lisses (après angioplastie par exemple), d’hypoxie, d'augmentation de la force de cisaillement ou d’agrégation plaquettaire conduisent à une libération locale de nucléotides qui peuvent interagir avec de multiples récepteurs exprimés par les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses et les plaquettes. Les quantités importantes de nucléotides qui peuvent être libérées localement, ainsi que la démonstration de l'expression de multiples sous-types de récepteurs, suggèrent que les nucléotides jouent un rôle privilégié dans ces différents processus physiopathologiques. La réponse physiologique observée est la résultante d'actions sur de multiples sites impliquant des mécanismes de rétrocontrôle. Le rôle exact des nucléotides en physiopathologie vasculaire ne pourra dès lors être clairement élucidé que par la caractérisation précise des différents récepteurs impliqués.
E. Mécanismes de transduction des récepteurs P? de l'endothélium vasculaire.
1. Introduction.
De nombreux messagers intercellulaires agissent sur leur cellule c|b|e en se liant à des récepteurs spécifiques qui sont couplés à des systèmes effecteurs tels que des enzymes ou des canaux ioniques. La phospholipase C (PLC) constitue l’un de ces effecteurs impliqués dans la régulation de nombreux processus intracellulaires. La PLC activée catalyse l'hydrolyse de phospholipides membranaires, principalement le phosphatidylinositol bisphosphate (PIP 2 ). Cette activité enzymatique génère deux seconds messagers: l'inositol (1,4,5) trisphosphate (lns( 1 , 4 , 5 )P 3 ) et le diacylglycérol (DAG). Le DAG, qui reste dans la membrane plasmique, est l'activateur physiologique de la protéine kinase C (Nishizuka, 1992). L'lns( 1 , 4 , 5 )P 3 , qui diffuse dans le cytosol, induit la libération de Ca^'*’ intracellulaire à partir du réticulum endoplasmique via la liaison à son récepteur spécifique (Berridge, 1993).
L'accumulation des inositol phosphates en réponse à la stimulation par l'ATP a été
FIGURE 3
CYCLE D’ACTIVATION DES PROTEINES G.
A l’état inactif, la sous-unité a de l’hétérotrimère contient du GDP. L’activation du récepteur (R) stimule l’échange GDP/GTP. Il y a alors dissociation du récepteur, de la sous-unité a-GTP et du dimère Py. a-GTP et le dimère Py peuvent stimuler des effecteurs (E) différents.
L’hydrolyse du GTP lié à la sous-unité a met fin à son action. Figure empruntée à Clapham et
Neer, 1993.
démontrée dans plusieurs types de cellules endothéliales en culture : les cellules endothéliales d'aorte (Pirotton et coll., 1987) et d'artère pulmonaire bovine (Lustig et coll., 1992a), les cellules endothéliales microvasculaires de la surrénale de boeuf (Forsberg et coll., 1987), de cerveau de rat (Frelin et coll., 1993) et de myocarde de lapin (Mannix et coll., 1993).
2. Rôle des protéines G dans l'activation de la PLC.
Les protéines G forment une vaste famille de protéines membranaires qui assurent le couplage entre les récepteurs et différents systèmes effecteurs, notamment la PLC. Ces protéines sont des hétérotrimères composés d'une sous-unité a et d'un dimère Py indissociable. L'occupation du récepteur par l'agoniste catalyse l'échange GDP/GTP au niveau du site nucléotidique que contient là sous-unité a, provoquant la dissociation du récepteur, de la sous-unité a et du dimère Py (figure 3). Jusqu'il y a peu, on pensait que seule la sous-unité a était capable d'activer un ou plusieurs effecteurs. C’est pour cette raison que, conventionellement, les protéines G sont définies selon leur sous-unité a. Une vingtaine de sous-unités a distinctes ont été décrites et sur base de leurs séquences primaires en acides aminés, quatre classes peuvent être distinguées: Os, ai/o, aq et ai 2 (tableau 4). Cinq sous-unités p et 7 sous-unités y ont été décrites et peuvent former des hétérotrimères avec les différentes sous-unités a. La diversité des sous-unités a, p, et y offre donc de multiples possibilités de combinaisons. Récemment, il est apparu que les dimères Py avaient eux aussi la capacité d’interagir avec des effecteurs tels que certains isoenzymes de la PLC. Il apparait donc que la spécificité de l’intéraction protéine G/récepteur/effecteur n’est pas caractérisée uniquement par la sous-unité a, le dimère Py pouvant y contribué également (Qffermanns et Schuitz, 1994).
Actuellement, nous savons que les cellules endothéliales expriment des récepteurs de la
famille P2Y dont le clonage récent a démontré qu’ils appartenaient bien à la superfamille
des récepteurs couplés aux protéines G. Les protéines G exprimées dans les cellules
endothéliales n'ont été que partiellement identifiées. Récemment, l’utilisation d'anticorps
polyclonaux dirigés contre l'extrémité C-terminale des sous-unités a a permis de démontrer
la présence de sous-unités des familles ai et Oq dans les cellules endothéliales d’aorte
bovine (Liao et Homcy,1992, 1993; Gil-Longo et coll., 1993).
TABLEAU 4
DIVERSITE ET FONCTIONS DES SOUS-UNITES a DES PROTEINES G
FAMILLE SOUS-TYPES EFFECTEURS
«s
«sS, «sLAdénylate cyclase : t
Canaux Ca^* : t
«olf
?
oti/o n «il, «i2,ai3 Adénylate cyclase : 4^
Canaux K* : t
«Ol, «02 Canaux Ca^* : >1^
Canaux K* : t
Oti,at2
Phosphodiestérase du GMPc: t
«gus
?
«Z
