Disponible à / Available at permalink :

Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Steinert, M. (1953). Contribution à l'étude du métabolisme de l'acide ribonucléique dans le développement embryonnaire (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/215829/1/e8098b71-a016-44f8-94a8-efcaab2c2d61.txt

(English version below)

Cette thèse de doctorat a été numérisée par l’Université libre de Bruxelles. L’auteur qui s’opposerait à sa mise en ligne dans DI-fusion est invité à prendre contact avec l’Université (di-fusion@ulb.ac.be).

Dans le cas où une version électronique native de la thèse existe, l’Université ne peut garantir que la présente version numérisée soit identique à la version électronique native, ni qu’elle soit la version officielle définitive de la thèse.

DI-fusion, le Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles, recueille la production scientifique de l’Université, mise à disposition en libre accès autant que possible. Les œuvres accessibles dans DI-fusion sont protégées par la législation belge relative aux droits d'auteur et aux droits voisins. Toute personne peut, sans avoir à demander l’autorisation de l’auteur ou de l’ayant-droit, à des fins d’usage privé ou à des fins d’illustration de l’enseignement ou de recherche scientifique, dans la mesure justifiée par le but non lucratif poursuivi, lire, télécharger ou reproduire sur papier ou sur tout autre support, les articles ou des fragments d’autres œuvres, disponibles dans DI-fusion, pour autant que :

Le nom des auteurs, le titre et la référence bibliographique complète soient cités; L’identifiant unique attribué aux métadonnées dans DI-fusion (permalink) soit indiqué; Le contenu ne soit pas modifié.

L’œuvre ne peut être stockée dans une autre base de données dans le but d’y donner accès ; l’identifiant unique (permalink) indiqué ci-dessus doit toujours être utilisé pour donner accès à l’œuvre. Toute autre utilisation non mentionnée ci-dessus nécessite l’autorisation de l’auteur de l’œuvre ou de l’ayant droit.

--- English Version ---

This Ph.D. thesis has been digitized by Université libre de Bruxelles. The author who would disagree on its online availability in DI-fusion is invited to contact the University (di-fusion@ulb.ac.be).

If a native electronic version of the thesis exists, the University can guarantee neither that the present digitized version is identical to the native electronic version, nor that it is the definitive official version of the thesis.

DI-fusion is the Institutional Repository of Université libre de Bruxelles; it collects the research output of the University, available on open access as much as possible. The works included in DI-fusion are protected by the Belgian legislation relating to authors’ rights and neighbouring rights. Any user may, without prior permission from the authors or copyright owners, for private usage or for educational or scientific research purposes, to the extent justified by the non-profit activity, read, download or reproduce on paper or on any other media, the articles or fragments of other works, available in DI-fusion, provided:

The authors, title and full bibliographic details are credited in any copy;

The unique identifier (permalink) for the original metadata page in DI-fusion is indicated; The content is not changed in any way.

It is not permitted to store the work in another database in order to provide access to it; the unique identifier (permalink) indicated above must always be used to provide access to the work. Any other use not mentioned above requires the authors’ or copyright owners’ permission.

morphologie animale de l’Université libre de Bruxel­ les, sous la direction de M. le Professeur J. Brachet.

Contrîtutîon à Pétude du métabolisme

de Tacide rîbonucléique

dans le développement embryonnaire

M. STEINERT

pL

CET OUVRAGE ETANT

PAS

THBSS AITKEXS

Au poljraorxdilsao ûm fXa^ttXlés puzmsltee âu ^exuru txypaxicMiozai

eorresponâent dos âiffftrenoM laportantss de leur aétabollama

DANS LE DOMAINE PUBLIC,

NE PEUT ETRE COMMUNIQUE

QU»AVEC L’ AUTORISATION

DE L*AUTEUR.

)OOOOOOOOOOOOOOOQ OOOOO OOQ

P P P P P P P P P P O P

Monsieur le Professeur J, Brachet nous a enseigné l'embryologie chimique et c'est sous sa direction que nous avons effectué ce travail ; qu'il trouve ici l'expression de notre sincère grati- tude et d'un profond attachement.

Nous tenons à exprimer notre reconnaissance envers Monsieur le

K /

Professeur P. Brien , qui depuis qu'il assiste à nos premiers travaux de naturaliste n'a pas cessé de nous faire partager sa passion ét son enthousiasme pour la Zoologie.

Nous remercions très sincèrement Monsieur le Professeur R. Jeener et Monsieur H, Chantrenne dont les conseils et les critiques Judicieuses nous ont toujours été très précieux.

TABLE DES MATIERES

b

II. Description des techniques employées 1° Dosage de 1 ’ ARN

3“ Analyse des bases puriques libres et des nucléotides acidosolubles

III. Résultats expérimentaux

première partie. Etude des oeufs et embryons no rm aux.

1) Synthèse de 1'ARN dans les oeufs de batraciens 25 2) " " " " l'oeuf de truite 29 3) Dosages de l'ARN dans des explantats de batra­

ciens 31

4) Etude des bases puriques et des nucléotides

libres dans l'embryon de batracien 33

A. introduction 33

B. Isolement et identification des bases li­

bres 35

C. étude de dérivés puriques au cours du dé­ veloppement embryonnaire de R. fusca 36

D. conclusion 38

5) Dérivés puriques acidosolubles dans les oeufs

de truite et d'astérie 39

6) Etude de l'action directe de bases puriques

sur le développement des oeufs de batraciens 41 deuxième partie. Etude des embryons de batraciens

dont le développement est altéré par certains agents spécifiques 48 1) Le choc thermique des oeufs de batraciens

et ses effets 49

2) Métabolisme de l'ARN chez les oeufs traités

au DNP 55

3) Synthèse de l'ARN chez les hybrides létaux 60 IV, Discussion du rôle des oxypurines libres dans la

synthèse de l'ARN 62

8

17

Ij'embryologie chimique est une science récente, surtout si on

la limite à la connaissance des phénomènes chimiques qui accompagnent la morphogénèse. Les progrès dans ce domaine ont, en effet, été né­ cessairement liés au développem<='nt de techniques suffisamment sensibles et précises pour qu'on puisse aborder les problèmes de l'ontogénèse : il a fallu attendre les perfectionnements considérables que l'école de Copenhague ( Linderstr6m-Lantj. Holter. Zeuthen. ...), ainsi que Caspers- son. ont apporté aux méthodes cyto- et histochimiques pour voir l'embryo­ logie chimique prendre l'essor que nous lui connaissons à l'heure ac­ tuelle.

ex-2.

pose déjà, sous la forme d'hypothèses, l'essentiel de nos connaissances actuelles.

L'étude de la chimie embryologique doit être abordée dans un tout autre esprit que celle de la chimie physiologique : à aucun moment, le chercheur ne peut perdre de vue que son matériel est en continuelle ■ évolution. Un muscle reste morphologiquement identique à lui-même après chaque contraction, mais la gastrulation, par exemple, entraîne une trans­ formation complète de l'oeuf. Chaque réaction chimique dont l'oeuf est le siège aura des .répercussions multiples sur les réactions ultérieures.

Parmi les sciences biologiques, l'embryologie chimique est l'une des plus fondamentales, puisqu'elle s'attache à l'étude de cet aspect le plus tangible de la vie : cètte propriété d'une matière hautement or­ ganisée de s'accroître selon des lois, des règles qui lui sont propres. C'est l'étude de la vie créatrice des fontes et des fonctions, selon la définition d'Albert Brachet (25), c'est-à-dire de toute l'ontogénèse. Boveri (24) a bien mis l'accent sur cet intérêt particulier de l'embryo­ logie, lorsqu'il écrivait que la larve réalise un instrument de mesures par lequel on peut déterminer les caractéristiques des premières cellu­ les embryonnaires.

C'est dans le cadre de ce problème fondMiental de l'ontogénèse que nous nous sommes efforcés d'intégrer les résultats de nos propres expériences.

- Les acides nucléiques en embryologie. • Evolution des idées.

précise des nucléoprotéides dans les chromosomes des noyaux en cinèse ajoutait encore un autre attrait au problème : ces substances pourraient être, en effet, le substrat matériel des caractères héréditaires, c'est- à-dire la substance constitutive des gènes.

Dans le domaine de 1'embryologie, les premiers dosages d'acides nucléiques remontent à 1910, lorsque Masing montra, par des mesures du phosphore nucléique et de l'azote punique que, chez l'oeuf d'oursin, la quantité totale d'acide nucléique ne change pas au cours du développe­ ment embryonnaire. Cette constatation, qui a été vérifiée vingt ans plus tard par Shackell (181), J. et D. Needham (155) et Brachet (27), n'a pas manqué d'attirer l'attention : en effet, Godlewski (91) et Loeb (130) avaient démontré que le volume nucléaire total de l'oeuf d'oursin s'accroît considérablement depuis la fécondation jusqu'à l'é­ closion et on pouvait se demander pour quelles raisons le phosphore nucléique et l'azote purique ne présentent pas le même accroissement. La contradiction devint plus profonde encore lorsque Brachet (38) montra que la teneur en désoxypentose de l'oeuf d'oursin augmente au cours du développement et que la réaction de Peulgen, toujours localisée dans les noyaux s'intensifie aussi progressivement. L'absence totale de réaction de Peulgen dans le cytoplasme ( Brachet (38), Schmidt (176)) semblait exclure l'hypothèse d'une réserve extranucléaire d'acide dés­ oxyribonucléique, qui aurait été incorporée progressivement aux noyaux.

4.

On essaya évidemment d'étendre cette hj^pothèse de la conversion à d'autres espèces. Elle se vérifia chez la plupart des invertébrés marins étudiés, qu'il s'agisse d'échinodermes, de vers ou de crustacés

(Needham et Needham 154), de l'aplysie ou du crabe Maja (Brachet 26). ,En ce qui concerne les batraciens, les dosages de phosphore nucléique

(Plimmer et Kaya 168), de purines (Graff et Barth 93 ; Vendrely 211), de pentoses et de désoxypentoses (Van der Ghinst 209 ; Brachet 38) étaient aussi en accord avec l'hypothèse de conversion. Par contre les oeufs de poissons, qui montrent un accroissement du phosphore nu­ cléique et du pentose des les premiers stades étudiés (Brachet 28 ; Van der Ghinst 210 ; P-osenheim et al. 174), semblent ne pas obéir à la même loi : enfin l'oeuf de poule s'en écarte totalement (Plimmer et Scott 169 ; Mendel et Leavenworth 142 ; Calver.y 03). Nous revien­ drons à ce problème dans les conclusions de ce mémoire.

Mais l'intérêt principal de l'étude des acides nucléiques pro­ vient évidemment de leur rôle probable dans les phénomènes qui sont

à la base même de la morphogénèse. Voyons comment les idées ont évo­ lué à ce point de vue.

En combinant l'utilisation des colorants basiques à celle de la ribonucléase, Brachet (31) a pu étudier d'une façon très précise la répartition de l'acide ribonucléique au cours de l'ovogénèse et de l'ontogénèse de différentes espèces animales. Toutes ses observations ont montré tant Croîs l'oocyte que dans l'oeuf fécondé, les pério­ des de croissance ou de différenciation intenses sont caractérisées par une teneur élevée en acide ribonucléique. Celui-ci est d'abord

constitu-tifs, dans la morphogénèse devint encore plus évident à la suite d’é­ tudes pharmacologiques : Brachet (db,45) fit observer que le benzimi- nazol, l'acide barbiturique et 1'acriflaviné, qui agissent tous trois sur le métabolisme de l'acide ribonucléique, bloquent aussi le dévelop­ pement des embryons.

Ces expériences ne permettent toutefois pas encore d'expliquer le rôle biologique des acides nucléiques : quels intermédiaires peut- il y avoir entre une substance chimique, encore mal connuq et la com­ plexité des phénomènes d’induction ? Par quels mécanismes l'acide nu­ cléique agit-il dans l'ontogénèse ?

Ce sont les hypothèses de Caspersson (65-68) et de Brachet (30,33) qui ont placé définitivement les acides nucléiques au tout premier plan en embryologie chimique : ils leur ont attribué, en effet, un rôle Important dans la synthèse des protéines (voir aussi Chantren­ ne 69), L'acide ribonucléique attira vite l'attention à cet égard : on le trouve en abondance dans le cytoplasme et le nucléole de toutes les cellules où se fait une synthèse active de protéines,

La croissance, au sens le plus large du terme, étant l'une des caractéristiques fondamentales du développement embryonnaire, l'acide ribonucléique, agent de synthèses protéiques, devait acquérir un inté­ rêt considérable.

6.

de ces granules dans la morphogénèse ne peut guère faire de doute.

Grâce à la découverte des granules riches en acide ribonucléi- que, la question des gènes cytoplasmiques s'est trouvée posée sur des bases concrètes (Brachet 46,46) et, de l'idée de synthèses de protéi­ nes spécifiques, on a pu passer tout naturellement à celle de la spé­ cificité des acides nucléiques (Mazia 141 ; Charëaff et al. 71,218 : Gulland et al. 99 ; Thomas 204-206). Cette notion de spécificité des acides nucléiques, introduite par les expériences d» Avery (4) et ses collaborateurs, dans le cas de l'acide désoxyribonucléique, a ouvert à l'embryologiste des perspectives encore plus étendues (on sait que ces auteurs sont parvenus à obtenir des mutations dirigées chez les pneu­ mocoques, en faisant agir sur ceux-ci un acide désoxyribonucléique hau­ tement purifié et spécifique) : on peut dès lors imaginer la différen­ tiation en fonction de la spécificité de structure d'une entité chimi­ que : l'acide nucléique. Cette idée a d'ailleurs déjà été invoquée pour expliquer la "chordalisation" de certaines ébauches dans l'em­ bryon de batracien traité par l'urée (Pautrez 89).

cet esprit par Brachet : nous avons cherché à les compléter par de

nouvelles observations quantitatives. Ce sera là l'objet de la tfôisiè- me partie de ce mémoire.

l.

4

ij E 3 C a I P î I 0 N

TECHNIOUES EMPLOYEES

I I

1* - Dosages de l'acide ribonucléique (ARN).

Aperçu de l'évolution des méthodes de dosage.

Sans parler ici des premières techniques utilisées pour l'étude quantitative des acides nucléiques, nous noterons qu'elles exigeaient une quantité considérable de matériel brut ; leur champ d'application, surtout en ce qui concerne l'embryologie chimique, en subissait néces­ sairement d'étroites limitations.

Au moment où nous avons commencé le présent travail, les mé­ thodes généralement utilisées étaient basées sur des réactions colorées des pentoses ou du phosphore, effectuées sur des extraits à l'acide trichloracétique des tissus. Ces extraits contiennent les deux types d'acides nucléiques sous une forme fortement dégradée (Schneider 178- 179). Après une extraction alcaline du tissu à 37°C, on peut séparer les deux types d'acides nucléiques par simple acidification de l'ex­ trait ; l'acide désoxyribonucléique (ADN), moins dépolymérisé, préci­ pite, tandis que l'acide ribonucléique (ARN) reste en solution (Schmidt

et Thannhauser 177). Ces propriétés ont été adaptées depuis à l'étude de quantités beaucoup plus faibles, de l'ordre de quelques milligrammes de tissus frais (Steele. Sfortunato et Ottolenëhi 196 ; Dackermann et Patterson 79 ; Davidson. Leslie et Waymouth 82).

Peul-gen ( Ris et Mirsky 173 ; L1son et Pasteels 126-129 ; Pollister et Ris 170). Ces dernières techniques permettent une localisation pré­ cise des acides nucléiques dans les coupes examinées et elles sont d'une sensibilité exceptionnelle. Mais elles ne peuvent, au point de vue strictement quantitatif, être considérées que comme des approxi­ mations assez grossières; leur emploi exige de nombreuses précau­ tions et une critique très sévère lors de l'interprétation des ré­ sultats obtenus.

Etude de la technique d'extraction à l'acide perchlorique,

(Application de la méthode d'Ogur et Sosen au matériel embryologique).

Nous avons vu qu'on doit à Caspersson (66) un ingénieux procédé de dosage semi-quantitatif des acides nucléiques, basé sur l'une des propriétés ph5'siques de ces substances ; leur pouvoir d'ab­ sorber de la lumière dans l'ultra-violet. L'ensemble des purines et des pyrimidines des acides nucléiques confère,en effet, à ceux-ci un spectre très caractéristique (fig. 1) ; ce spectre présente un maxi­

mum d'absorption vers 26Q m/x et un minimum vers 235 m/x ; la position et l'intensité de ce dernier est fonction du de­ gré de pureté de l'échantillon examiné.

Ce n'est que récemment qu'une méthode de dosage sure et quantitative des acides nu­ cléiques, basée sur l'absorp­ tion dans la bande de 260 m/x ,

].'aci-10

de trichloracétique. D'autre part, l'acide perchlorique est un ex­ cellent agent de précipitation des protéines (Graucr, Mandl, Strauss et Neuberg 95). Le princip'^ de la méthode d'Ogur et ilosen est fort simple : l'acide ribonucléique est siO'ultanément hydrolysé et extrait par de l'acide perchlorigue froid; l'acide désoxyribonucléique peut être extrait à son tour par de l'acide perchlorique chauffé à cent degrés. Les divers extraits sont analysés au spectrophotomètre : 1' intensité de l'absorption à 260 m/z donne immédiatement la concentra­ tion en acide nucléique de l'extrait étudié. L'avantage de cette mé­ thode réside surtout dans son extrême sensibilité, dans sa grande sim­ plicité et dans le fait qu'elle permet de mesurer directement une valeur correspondant à une constante physique des substances à doser, ce qui constitue un important critère de sécurité. Nous nous sommes efforcés d'adapter cette méthode l'étude du matériel embryologique.

Préparation du matériel destiné à l'extraction par l'acide perchlorique.

Avant d'extraire l'acide ribonucléique par l'acide per- chlorigue, il est indispensable d'éliminer complètement les dérivés

La technique que nous avons finalement adoptée est la sui­ vante ; les oeufs sont ^ixés à l'alcool h 94 % , puis extraits deux fois à l'acide trichloracétique à 10 % à 0°C ; apres trois lavages, à 0°C, par de l'alcool à 94 % , ils sont extraits deux •^ois à l'éther sulfurique et enfin séchés sous vide.

On peut supprimer tout risque de perte de matériel en ef­ fectuant ces diverses opérations sur des oeufs ou des embryons entiers

sans broyage préalable; chacune des extractions, par l'acide trichlor acétique, 1 ' a^.Ppoi et i'éther, dure 3 0 minutes et nécessite une lé­ gère agitation du liquide. Une durée totale de 1 heure pour l'extrac­ tion à l'acide trichloracétique ( 10 % îi 0°C) est suffisante pour éliminer toute la fraction acidosoluble (nucléotides et bases libres).

Hydrolyse et extraction de l'acide ribonucléique.

Deux techniques différentes d'hydrolyse de l'acide ribo- nucléique par l'acide perchlorique ont été proposées (Ogur et Rosen):

1°) par l'action d' HClO^ à 5 % à la température du la­ boratoire pendant 24 heures.

2°) par i'action d' HClO^ à 10 % à 1-2°C pendant 24 heures.

Nous décrirons et nous comparerons ci-dessous ces deux procédés qui sont, aux détails de température et de concentration près, rigoureusement semblables. Disons cependant tout de suite que l'agitation de la solution doit être suffisamment vigoureuse, pendant toute la durée de l'extraction, pour qu'on évite la formation d'un culot au fond du récipient. La forme de ce dernier a donc une certai­ ne importance : les fioles coniques du type Erlenmeyer ou les tubes

à fond plat s'avèrent particulièrement f'avorables.

Action de l'acide perchlorique sur les acides nucléiques purifiés.

12

acide ribonucléique de la levure (Schwarz) et de l'acide thymonucléi- que hautement polymérisé de thjnnus de veau, préparé selon la méthode de Mjrsky et Pollister. (144-145).

Des solutions de condentration connue en acide ribonucléi- que sont mélangées avec un volume égal d'acide perchlorique à 20 % ou 10 % , selon que l'hydrolyse est faite à 0° ou à la température du' laboratoire. Après 20 heures, les tubes sont centrifugés et les liquides surnageants sont analysés par spectrophotométrie et par chro­ matographie sur papier. Dans les deux cas, l'hydrolyse est complète

et le faible culot déposé par la centrifugation n'est qu'un résidu de nature protéique.

L'hydrolyse de l'acide ribonucléique à la température du laboratoire (20°) donne des mononucléotides, de l'adénine et de la guanine libres. Les deux bases libres interviennent pour 16 % dans l'extinction totale à 260 m^u de 1 'hydrolysat, Quant à l'acide déso­ xyribonucléique, il est partiellement hydrolysé lorsqu'on le traite par l'acide perchlorique a 5 % à la température du laboratoire; 1' hydrolysat ne contient dans ce cas que de l'adénine et de la guanine. L'extinction totale due à ces bases correspond à 50 % de l'extinction à 260 m/i de l'acide nucléique utilisé : on détache donc, de cette manière, la plus grande partie de l'adénine et de la guanine de l'a­

cide désoxyribonucléique. L'hydrolyse à 0 ° par l'acide perchlori­ que à 10 % est beaucoup plus douce : 10 % seulement de 1'extinction totale à 260 m/j, de l'acide désoxyribonucléique se retrouvent en so­ lution, sous la forme d'adénine et de guanine.

Action de l’acide perchlorique sur des tissus d'origine animale.

De petites quantités de foie, d'oocytes ou d'oeufs de grenouille /quelques mgr.), préparées selon la technique qui vient d'être décrite, sont mises en suspension dans 1'acide perchlorique à 5 % et extraits à la température du laboratoire pendant 24 heures. Après centrifugation, les spectres des extraits sont établis au spectrophotomètre (Beckman) ( fig. 2). La comparaison avec i.e spectre de l'acide ribonucléique de la levure purifié et hydrolysé dans les mêmes conditions, laisse peu de doute quant à l'efficacité du procé­

dé :■ il s'agit bien d'un spectre d'acide nucléique à peine altéré

Spectres d'absorption de l'acide ribonucléique et d'un extrait perchlori­ que d'oocytes de grenouille.

X X X X

par quelques impuretés, qui provoquent une augmentation modérée de l'extinction aux faibles longueurs d'ondes.

Il est important de rappeler ici les effets de l'hydrolyse et, en particulier, ceux de l'hydrolyse acide, sur le spectre d'absorption des acides nucléiques. Une étude étendue de ces phénomènes a été faite par Tsuboï ( 208 ), qui a observé une augmenta­ tion de l'extinction au maximum et un déplacement de ce maximum vers 265 m/x dans le cas de l'acide désoxyribonucléique. Nous avons retrou­ vé ces faits après l'hydrolyse des acides nucléiques par l'acide per_ chlorique (voir aussi R. Thomas 206). liors d'une étude quantitative, il est donc indispensable de comparer l'extinction à 260 m/x de l'ex­

14.

L'extraction de l'acide ribonucléi<lue des embryons des batraciens peut se faire soit apres broyasse, soit sur des embryons entiers, comme nous l'avons indiqué plus haut. Ce dernier procédé a l'avantage de la simplicité, car il ne nécessite pas de centrifugation de l'extrait avant les mesures d'extinction: chose importante, il permet d'obtenir une solution plus claire, ne présentant pas d'effet Tyndall, et par conséquent, un spectre p]us pur. Nous avons pu doser ainsi l'acide ribonucléique dans des expiantes isolés de gastrulas : chacun de ces petits fragments d'embryons était transféré, après le dosag=> de l'acide ribonucléique, au moyen d'une pipette et sans aucune perte, dans un ballon à minéraliser, en vue d'un dosage de l'azote total.

Etude chronatographique de l'extrait à l’acide perchlorique.

La chromatographie sur papier constitue une méthode par­ ticulièrement favorable pour ].'identification des produits de l'hy­ drolyse des acides nucléiques. Nous l'avons employée avantageusement pour analyser ].es extraits à l'acide perchlorique et pour vérifier si l'absorption à 260 m/i. de ces extraits est bien due exclusivement aux acides nucléiques. Nous avons employé la méthode de Hanes et__ Isherwood (101 ). qui utilisent un solvant constitué de propanoi, d' ammoniaque et d'eau, dans les proportions respectives de 6-3-1 par­ ties. Le chromatogramme, développ''^ et séché, est photographié par contact direct à la lumière d'une lampe à vapeur de mercure, avec in­ terposition d'un filtre Corning 7-54. Cette technique nous a permis d'obtenir, en partant d'extraits perchloriques variés (d'oeufs d'our-

► sin, d'oocytes et d'embryons de grenouille, d'embryons d'axolotl),

des chromatogrammes identiques à ceux que .donne un hydrolysat, réali­ sé dans les mêmes conditions, d'acide ribonucléique purifié (SchwarzJ.

i Ces extraits perchloriques de cellules embryonnaires contiennent

donc des mononucléotides, ainsi que de )'adénine et de la guanine li­ bres, à l'exclusion de toute autre substance absorbant à 260 m/u. .

Etude quantitative de l'extraction à l'acide perchlorique.

Lorsqu'on soumet des oeufs de batracien à deux extractions successives de 84 heures par l'acide perchlorique à 5 % (20°C), on constate que l'extinction à 260 m/i du second extrait ne représente plus que 4-4,5 % de celle du premier; on pf’ut donc considérer l'hy­ drolyse de l'acide ribonucléique comme complète après .4-4 heures. A O^C , l'extraction par de l'acide perchlorique à 10 % donne des ré­

sultats identiques. Si une plus grande précision s'avérait nécessai­ re, on pourrait envisager de faire une extraction de plus longue du­ rée, tout en renouvelant l'acide perchlorique.

Des expériences analogues faites sur du foie de grenouil­ le n'ont cependant pas été aussi favorables: l'hydrolyse totale de l'acide ribonucléique, dans le cas de cet organe, est plus lente et exige deux traitements de 84 heures.

Comparai son avec d'autres méthodes,

Dans un même extrait perchlorique d'oeufs de batracien, nous avons successivement mesuré l'extinction à 260 mpL et dosé le phosphore par la méthode de Berenblum et Chain (14). Nous avons trou­ vé une extinction par mole de phosphore, E(pj , égale à 9.083 , ce qui correspond à la valeur Ejpj généralement attribuée A l'acide ribonucléique hydrolysée ( Tsuboï 207-208). Toutefois, la libération de phosphore à partir des phosphoprotéines du vitellus aurait pu cons­ tituer une cause d'erreur possible lors du dosage du P nucléique; pour nous mettre à l'abri d'un tel écueil, nous avons déterminé l'Ejpj d'un extrait à l'acide perchlorique de plaquettes vitellines purifiées. L'isolement deuces plaquettes vitellines a été réalisé par centrifu­ gations fractionnées en partant d'oeufs de grenouille ( Pani.lel 162 ) La teneur en phosphore et l'extinction à 260 mpt d'un tel extrait per_ chlorique sont très faibles; elles donnent une valeur normale ^^(p) de 10.300. Le spectre de cet extrait est caractéristique d'une solu­ tion de nucléotides et il présente un maximum net à 260 m/u. On peut donc affirmer que le phosphore présent dans un extrait perchlorique d'embryons provient bien de l'acide ribonucléique et que les phos­ phoprotéines restent intactes lors de l'extraction.

spectropho-16.

tométrie à 260 mfjL d'une part et la réaction à l'orcinol de l'autre, fait apparaître de légères divergences. Elles sont peut-être dues à une composition en bases différente entre l'acide nucléique de la levure, utilisé comme étalon, et les acides ribonucléiques des oeufs de batraciens. Il n'y a d'ailleurs pas de doute que le dosage par l'orcinol est plus délicat que les autres et que des erreurs peuvent être causées par la teneur élevée en sucres des enveloppes de l'oeuf.

Comparons maintenant la sensibilité de la méthode de dosage de l'acide ribonucléique à l'orcinol et celle de la technique que nous avons décrite. La sensibilité est fonction de la densité op­ tique de la solution examinée, quelle que soit la longueur d'onde où se font les mesures. Les deux méthodes ont été appliquées à un même échantillon d'acide ribonucléique (Schwartz) et nous avons cons­

taté que pour obtenir une même densité optique de 0,5 , il fallait mettre en oeuvre 500 y d'acide ribonucléique par 5 ml pour la réac­ tion à l'orcinol, et seulement 90 y par 5 ml pour le dosage dans l'ultra-violet. Cette dernière méthode est donc plus de 5 fois plus sensible que la technique à l'orcinol.

Action de l'acide perchlorique sur les protéines des oeufs de gre- noui lie,

Comme nous avons été amené dans certains cas à rapporter la quantité de l'acide ribonucléique dosé au poids de l'azote total, il importait de rechercher si l'extraction à l'acide perchlorique n'entraîne pas une perte d'azote trop importante. Des oocytes de

grenouille ont été traités d'abord par de l’acide perchlorique à 5 % pendant 20 heures à la température de 20’ C, ensuite pendant cinq minutes à 100° C par de l'acide perchlorique à 5 ■». Les dosages d'azote ont donné (méthode de Harkham) :

dans le premier extrait dans le second extrait dans 1<. nésidu

On constate donc que la teneur en azote total du matériel étu­ dié reste pratiquement inchangée après l'extraction des acides nucléi­ ques par l'acide perchlorique.

2° - Analyse des bases puriques libres et des nucléotides acidosolu-bles.

Principe : Combinaison des mesures de l'extinction d'un extrait, au maximum d'absorption des bases puriques (250 m^i. - 260 m/i), et de l'analyse chromatographique quantitative de cet extrait.

I. - Analyse de l'extrait total par spectrophotométrle.

Nous avons adapté à l'étude des composés puriques acidoso- lubles la méthode de dosage par mesure de l'absorption dans l'ultra­ violet déjà utilisée pour les acides nucléiques. Le matériel à ex­ traire est broyé dans un homogénéiseur de Potter et Ëlveh.iem dans 5 ml d'acide perchlorique à 1 %. Cette concentration en acide per- chlorique s'est révélée suffisante pour extraire quantitativement les bases libres et les mononucléotides, tout en laissant les acides nucléiques intacts. Après dix minutes, l'extrait est centrifugé et le culot est remis en suspension dans 4 ml d'acide perchlorique pen­ dant dix minutes encore, avant d'être centrifugé une seconde fois. Les deux liquides surnageants sont réunis et le volume est amené à

18.

phase aqueuse en comparant l'extrait avec un blanc. Les extraits sont alors analysés au spectrophotomètre Beckman sans neutralisation préalable. L'extinction au maximum (250 m/j.) de ces solutions varie

Fië. 3. A : Spectre d'absorption d'un extrait perchlorique d'oeufs de grenouille. C : Spectre du mê­ me extrait traité au chloroforme. B ; A - C.

de 0,150 à 1,0. Nous avons généralement utilisé 20 oeufs de grenouil­ le par dosage, mais une adaptation de cette technique à une échelle beaucoup plus petite serait parfaitement réalisable.

II. - Application de la chromatographie sur papier à l'étude des ba­ ses puriques et de leurs dérivés dans les oeufs de batraciens et d'échinodermes.

La faible quantité de matériel embryologique disponible pour les analyses pose des conditions sévères à l'expérimentateur. Celui- ci doit faire appel aux techniques les plus sensibles, les plus exac­ tes et les plus sûres : l'échelle des mesures est, en effet, celle du gamma (y) et la moindre variation, qualitative ou quantitative, dans la composition d'un embryon ou dans sa structure, peut revêtir une importance capitale pour la compréhension de sa morphogénèse.

ont été adaptées à l'échelle microchimique par Graff et Maculla (94), ainsi que par Vendrely (211).

Le procédé d'identification des purlnes et des composés pu­ niques le plus remarquable, est sans doute celui qui a été décrit par Kalckar (113) ; extrêmement sensible et spécifique, il exige mal­ heureusement la préparation préalable de divers enzymes purifiés et il n'est pas d'un usage facile quand l'analyse porte sur un mélange de plusieurs constituants.

La chromatographie sur papier, qui est actuellement bien au point et universellement utilisée pour les analyses les plus di­ verses, nous offre un instrument de travail beaucoup plus efficace : en effet, le repérage sur le papier des purines ou de leurs dérivés se fait très aisément par un simple examen à la lumière ultra-violet­ te. La séparation sur papier des bases puniques a fait l'objet d'ex­ cellents travaux auxquels nous avons fréquemment eu recours au cours de la présente étude. Citons surtout ceux de Vischer et C'hargaff

(214), Smith et Markham (186), Carter (64), Magasanik. Vischer. Do- niger. Bison et Chargaff (134), Marshak et Vogel (137-138).

Nous avons généralement utilisé des solvants alcalins, à base d'alcools supérieurs et d'ammoniaque. Le choix du papier ne s'est pas montré aussi délicat qu'on aurait pu s'y attendre ; les pa­ piers Whatman 1, 3 et 4 nous ont donné des séparations également bon­ nes. L'épaisseur plus grande du papier Wg nous l'a fait adopter de préférence aux autres, car il permet de concentrer une quantité de substance plus grande par unité de surface. La plupart de nos chro- matogrammes ont été obtenus par développement descendant à la tempé­ rature du laboratoire.

Etude des bases puriques libres et des composés acidosolubles, Préparât ion des extraits,

20.

ce d'une quantité importante de sels minéraux dans la solution à chromatographier cause des variations des valeurs Rf et une sépa­ ration moins bonne des constituants. Il est donc préférable de ne pas concentrer exagérément l'extrait. Les proportions indiquées ci- dessous nous ont donné satisfaction :

- Pour les oeufs de batraciens : broyer et extraire avec un volume d'acide perchlorique à 2 % égal à celui des oeufs. Extraire 10 à 15 min. à 0° C.

- Pour les oeufs de truite ou d'astérie : même procédé que ci-dessus ; ou bien : extraire avec un mélange à volumes égaux d'éthanol absolu et d'acide perchlorique à 2 %,

L'addition d'alcool éthylique à l'acide perchlorique per­ met parfois d'obtenir des extraits plus limpides. Souvent, lorsque

l'extrait reste trouble après centrifugation, il y a avantage à l'é­ mulsionner avec un volume égal de chloroforme, comme il l'a déjà été dit plus haut. Lorsque sa concentration n'est pas suffisante, l'ex­ trait peut-être évaporé sur un gel de silice dans un exsiccateur à vide. L'extrait n'est neutralisé qu'après avoir été déposé sur le papier, au moment où il est plongé dans l'atmosphère chargée d'ammo­ niaque de la cuve à chromatographier.

Etude des bases purique s des polynucléotides. Préparation de l 'hydrolysat (arbacia).

Le matériel frais est fixé à l'alcool à 94 %, extrait deux fois à 0° par de l'acide trichloracétique à 7 % pendant lû min., la­ vé trois fois à 0° par de l'alcool à 94 % et enfin séché sous vide

après deux lavages à l'éther sulfurique. E;nviron 30-40 mgr de ce ma­ tériel sec sont hydrolysés pendant 1 heure au bain-marie à 100° C, dans 0,2 ml d' HClN . L'opération se fait avantageusement dans un petit tube scellé. L'hydrolysat ainsi obtenu ne doit pas être con­ centré avant son application sur le papier ; il n'est pas neutralisé, de façon à éviter toute perte de guanine, substance peu soluble en milieu neutre.

dans ce cas, à laisser les bases pyrimidiques sous la forme de nucléo­ tides, car elles se sépareront mieux des bases nuriques libres dans ces conditions. L'hydrolyse des nucléotides pyrimidiques nécessite un traitement beaucoup plus sévère, à l'acide perchlorique 12 N

(Marshak et Vogel 137 ).

Développement des chromatogrammes.

Deux mélanges à base d'alcools supérieurs nous ont donné satisfaction. Le premier est celui qu'ont décrit Hanes et Isherwood (101), propanol-NH^0H-H20 (6-3-1 parties). Il donne une excellente séparation de l'adénine, de l'hypoxanthine et de la guanine. La xan- thine ne peut cependant être séparée de la guanine qu'après un temps de développement très long, les valeurs rf de ces 2 constituants étant trop voisines. Ce solvant sépare parfaitement aussi les acides adénosine-5-phosphorique et adénosine-3-phosphorique.

Le second solvant est préparé en agitant vigoureusement de l'alcool isobutylique avec un mélange de 1 partie d'ammoniaque concen­ tré et 3 parties d'eau distillée. La phase alcoolique est séparée dans une ampoule à décanter. Ce solvant, contrairement au précédent, n'entraine pratiquement pas les nucléotides, mais il sépare bien la xanthine des autres bases. Le papier est, en tout cas, maintenu pen­ dant 1 heure au moins dans une atmosphère saturée des vapeurs du sol­ vant avant d'être mis en contact avec ce dernier. Il est retiré du solvant lorsque le front de la phase liquide s'est déplacé d'au moins 20 cm, c'est-à-dire après un développement d'environ 7 à 8 heures. Il est alors séché dans un courant d'air chaud.

Révélation des chromatogrammes.

22.

Analyse quantitative des constituants.

Los bases peuvent être aisément éluées du chromatogramme développé : il suffit pour cela de découper soigneusement les taches dans le papier, en même temps gue des morceaux de papier de même sur­ face pris comme témoins, puis de les mettre pendant quelques heures en suspension dans 5 ml de HCl N/10 . Les solutions sont ensuite analysées au spectrophotomètre Beckinan.

Détection des pentoses,

Nous avons parfois appliqué la technique de détection des sucres décrite par Partridge (163-164) à des chromatogrammes dévelop­ pés suivant la technique qui vient d'être indiquée. Le révélateur a la composition suivante : Aniline 0.93 gr ; Ac. phtalique 1,66 gr dans 100 ml d'eau saturée de butanol. Cette solution est vaporisée sur le chromatogramme et la réaction colorée se développe pendant 5 min. à 105° (four électrique). Les pentoses se caractérisent par une coloration rouge-brun intense, les désoxypentoses par une coloration j aune.

Détection du phosphore.

Elle se fait au moyen du réactif de Hanes et Isherwood (101) au molybdate. Le chromatogramme est imprégné de ce réactif à l'aide d'un vaporisateur et il est mis à incuber au four électrique pendant 7 min. à C5° C. Une modification utile de la technique de Hanes et Isherwood nous a été conseillée par De Deken (85) : elle consiste à remplacer la réduction à l'hydrogène sulfuré par une exposition de quelques minutes aux rayons ultra-violets émis par une lampe à vapeurs de mercure (Minera]-light, sans filtre) placée à 30 cm du papier. Nous avons obtenu par ce procédé d'excellents résultats.

Détection des acides aminés.

Méthode usuelle à la Ninhydrine.

Exe^m£le_s_d_|_analj/^e_rte_s_b^se.s_ou £omp^s£s_pur_i(iue£. Analyse d'un échantillon d'acide ribonucléique désaniné.

Environ 1 gramme d'acide ribonucléique est traité au nitrite de sodium par le procédé décrit par Bredereck et al. (58). Le produit obtenu est hydrolysé à l'acide chlorhydrique normal pendant une heure à 100° (bain-marie) et l'hydrolysat est chromatographié sans neutra­ lisation. Les figures 4 montrent les résultats de deux analyses dif­ férentes : on voit que le solvant propanol-NH^-H20 donne une excel­ lente séparation de l'hypoxanthine et de l'adénine ; la guanine et la xanthine ne forment qu'une seule tache, leurs valeurs Rf étant très voisines dans le cas de ce solvant. Avec le second solvant ( isobutanol-NH^-HgO), la séparation des quatre bases est parfaite : les nucléotides ne sont presque pas entrainés, ce qui aurait été gê­ nant dans le cas d'un dosage de l'acide adénosine-5-phosphorique dans un extrait d'embryons, par exemple.

•

#

•/;

f i >i.- .. ■ mJ

a < ■'■■■

pour les quatre bases :

Solvant Adénine Guanine Xanthine Hypoxanthine

prop anol/NHg 1.00 / /, 2. 20

isobutanol/NHg 1.00 1.12 2. 10 2. 34

(Valeurs calculées sur la base des coefficients d'extinction molécu­ laire suivants : adénine : 13.300 (260): guanine : 10.900 (245); hy­ poxanthine : 10.500 (245): xanthine : 11.000 (260). Kerr et al.

(116) : Stimson et Reuter (199) ; Kalckar (113)).

Cet exemple démontre bien les avantages considérables qu'of­ fre la méthode chromatographique pour l'étude des purines et des oxy- purines.

Séparai ion chromatographique des acides adényliques du muscle et de la levure (figure 5).

L'acide adénylique de la levure est facilement séparé de l'acide adénylique du muscle dans le solvant au propanol. Quant à l'acide adénosine triphosphorique, en raison de son instabilité au pH très alcalin du solvant employé, il se comporte comme l'acide

adénosine-5-phosphorique. Les taches correspondant à l'acide adéno- sine-5-phosphorique sont généralement assez allongées,- peut-être parce que les papiers n'ont pas été débarassés d'ions Cu par des lavages à l'acide chlorhydrique.

III

RESULTATS EXPERIMENTAUX

Première partie : Etude des oeufs et embryons normaux.

1° - Synthèse de l'acide ribonucléique dans les oeufs de batraciens.

Presque toute notre attention s'est portée sur l'évolution de l'acide ribonucléique au cours du développement, de la féconda­ tion à l'éclosion. Cependant quelques mesures ont été consacrées à l'étude 1) de la synthèse de l'acide ribonucléique au cours de 1'oo-

génèse de la grenouille rousse (^. fusca),

2) de l'évolution, après la ponte, de la teneur en acide ribonucléique de l'oeuf vierge.

Oogénèse. A partir d'ovaires de R, fusca, nous avons isolé les oo­ cytes en les classant en trois catégories d'après leur taille : pe­ tits oocytes de 0,1 à 0,3 mm de diamètre, oocytes moyens de 0,3 à 0,6 mm et enfin les oocytes mûrs de taille maxima (les volumes moyens des oocytes de ces 3 catégories sont, respectivement, de 0,013 ,

0,118 et 4,46 mm^). Les dosages de l'acide ribonucléique montrent que la croissance de l'oocyte est accompagnée d'une augmentation de sa teneur totale en acide ribonucléique.

oocyte

oocyte

Les oocytes de 0,1 - 0,3 mm contiennent 0,76 y ARN par

les oocytes de 0,3 - 0,6 mm contiennent 4,00 y ARN par

les oocytes mûrs contiennent 13,00 y ARN par oocyte.

cette relation et nous observons comme Brachet (3S) un appauvrisse­ ment relatif du cytoplasme en acide ribonucléique. C'est ce qui ex­

plique que les observations cytochimiques donnent l'illusion de voir la basophilie cytoplasmique diminuer au cours de l'oogénèse, pour disparaître presque entièrement dans les oocytes de taille maxima. Nous savons cependant que l'acide ribonucléique cytoplasmique de ces oocytes mûrs manifeste une basophilie intense lorsqu'il est concen­ tré en une zone unique par centrifugation de l'oocyte (Brachet 38). Il n'en reste pas moins vrai que la période où 1 a concentration en acide ribonucléique est la plus élevée précède celle de la synthèse des protéines.

Oeufs vierges. Des oeufs vierges de S. fusca, gardés dans du liqui­ de de Holtfreter, changent d'aspect après un ou deux jours. Le pig­ ment mélanique se répartit d'une façon anormale en marquant la sur­ face de l'oeuf de marbrures irrégulières. Brachet (54) a signalé que le pôle animal de ces oeufs vierges évoluant vers la cytolyse présente une basophilie intense. La question se posait donc de sa­ voir s'il s'agit là d'une simple concentration de granules riches en acide ribonucléique au pôle animal, ou s'il se produit réellement une synthèse de ce constituant. Nos dosages n'ont montré aucune aug­ mentation de la teneur totale en acide ribonucléique lors du vieil­

lissement des oeufs vierges : nous trouvons en effet, dans le cas des oeufs vierges d'Axolotl, une moyenne de 10 y d'ARN par oeuf au m.oment de la ponte, 10,1 y après 50 heures et 9,9 y après 98 heures.

Il ne se produit donc, chez les oeufs vierges, qu'une modification dans la répartition des granules, analogue/ à celle que produisent la centrifugation ou certains agents cytolysants, sans synthèse vraie.

Oeufs fécondés.

Nos observations ont porté sur diverses espèces : K. fusca, R. esculenta, l'axolotl (Av.b. Mexicanur.) et le pleurodèle (Triton ifalthii) .

27.

où tous les individus se développent à une vitesse égale, nous avons rapporté au stade du développement la quantité d'acide ribonucléique trouvée ; celui-ci a été déterminé au moyen des tables de Harrison

(v. Hamburger 100). La synchronisation a été effectuée a postériori, en obsôrvant la vitesse de développement de quelques embryons éle- véq spécialement à cet effe'^ dans des conditions identiques de tem­ pératures (chambre thermostatique à 15° C), Ce procédé permet de comparer plus exactement les résultats obtenus au cours d'expérien­ ces différentes.

Fig. 6. Synthèse de 1' ARN au cours du développement de l'embryon d'Axolotl.

Le tableau suivant montre l'évolution de la teneur en acide ribonuclëique pendant le développement d'autres espèces de batraciens

AHN par embryon

Stade R. fusca R. esculenta

i pleurodèle | ! Fécondation '• 14, 10 y 4, 40 7 6,0 7 Blastula : 1 15, 40 - -J. Gastrula] - 4, 20 6,0 Gastrula 15, 50 4, 30 7, 20 Neurula ' 16, 90 4, 70 8, 50

Bourg, caudal Id, 90 5, 70 9,60

;

d'aci-de ribonucléIque. Cette synthèse ne d'aci-devient importante qu'au cours de la neurulation : dans un cas, nous avons même observé une infle­ xion très brusque de la courbe d'accroissement de l'acide ribonucléi- que au moment où se fait la soudure des bourrelets médullaires (Axo­ lotl, fig. 6). C'est à ce même stade que commence l'élongation de l'embryon et la segrégation des principales ébauches. La synthèse de la phosphatase alcaline et l'accroissement des oxydations de

l'embryon suivent des courbes très semblables à celles que nous avons obtenues pour la synthèse de l'acide ribonucléique (LAvtrup 132 ; Krugelis 118, 119 : Boe11 22). Ces divers phénomènes sont probable­ ment liés les uns aux autres et ils correspondent peut-être à la néo­

formation de granules cytoplasmiques riches en acide ribonucléique et en enzymes (microsomes et mitochondries).

Comparons nos résultats avec ceux qui ont été obtenus aupa­ ravant par Graff et Barth (93), Brachet (39) et Vendrely (211). Graff et Barth ont étudié le rapport N purique/N total au cours du développement embryonnaire de Rana pipiens. Les résultats qu'ils ont obtenus sont très semblables à ceux que nous avons trouvés chez l'Axolotl. Un doute persiste cependant sur le point de savoir s'il y a ou non synthèse d'acide ribonucléique dès la fécondation. Les auteurs américains n'observent aucune synthèse de purines pendant la segmentation, tandis que nous avons observé parfois un léger ac­ croissement de la quantité d'acide ribonucléique, de l'oeuf fécondé à la gastrula. Selon ces mêmes auteurs, le rapport 100 x N purique/ N total serait, au moment de la fécondation, de 0,9. Nous avons trouvé pour l'oeuf fécondé de l'axolotl 11 y d'acide ribonucléique, soit environ 1,2 y d'azote purique (d'origine ribonucléique) pour 225 y d'azote total, ce qui donnerait un rapport de 0,53. Il n'est pas étonnant de trouver une différence de cet ordre de grandeur si l'on songe que le matériel utilisé provenait d'espèces différentes ; en outre, les auteurs américains ont dosé les purines totales, alors que nous n'avons suivi que l'acide ribonucléique.

La même remarque est valable pour les observations de Ven­ dre 1.y (221), bien que l'écart entre ses résultats et les nôtres soit plus important. En effet, cet auteur a trouvé 3,10 y d'azote pvirique total par oeuf de grenouille (R. fusco), alors que nous avons dosé

29.

environ 1,56 y d'azote purique provenant exclusivement de cet acide, ûuant à Brachet. il a trouvé dans la moitié dorsale de la gastrula 7,6 y d'acide ribonucléIque pour 100 y d'azote total, et 5,9 y dans

la moitié ventrale. Nous avons obtenu de notre coté pour l'ensemble de la gastrula 6 y d'acide ribonuclélque pour 100 y d'azote total. Comme la richesse en azote est la plus grande dans la moitié ventra­ le, on peut considérer que ces résultats concordent de façon satis­ faisante. Notons cependant que nous n'avons pas observé la chute de la teneur en acide ribonucléique que Brachet avait décrite chez l'em­ bryon de batracien en segmentation.

On voit, en tout cas,que les résultats fournis par la métho­ de que nous avons mise au point concordent de façon satisfaisante

avec ceux qui avaient été obtenus par d'autres chercheurs, qui avaient fait appel à des techniques entièrement différentes.

2° - Synthèse de l'acide ribonucléique dans l'oeuf de truite ( Salno irrideus ).

Technique.

Après fécondation artificielle, les oeufs d'une truite sont élevés sur une claie en verre, dans un courant d'eau continu. Pen­ dant 18 jours, quelques individus sont prélevés à intervales régu­ liers pour observer le stade du développement. Les dosages de l'aci­ de ribonucléique sont effectués sur les blastodisques ou sur les em­ bryons isolés de la masse vitelline. Cet isolement se fait avec de fines pinces d'horloger dans du liquide de Holtfreter dilué 10 fois ; elle n'offre aucune difficulté particulière grâce à la fluidité par­ faite du vitellus. La masse vitelline, qui est considérable, libè­ re une trop grande quantité d'impuretés dans l'extrait perchlorique pour permettre un dosage précis sur l'oeuf entier.

Résultats.

la segmentation ; plus nettement que chez les batraciens, on consta­ te que cette synthèse s’amorce à partir d'un stade bien précis du développement, correspondant au début de l'enveloppement du vitellus Pendant les 6 premiers Jours, l'accroissement de la quantité d'aci­ de ribonucléique du blastodisque n'est que de 0,6 y, tandis que, pen dant les 7 jours suivants., il atteint 7,7 y.

Fig. 7. Synthèse de 1'ARN dans l'embryon de truite

(Salmo irrideus ) .

Il est difficile de comparer ces chiffres avec les obser­ vations antérieures de Van der Ghinst (210), faites également sur des embryons détachés de la masse du deUtoplasme ; en effet, la mé­ thode que cet auteur a utilisée n'était pas assez sensible pour lui permettre de doser l'acide ribonucléique pendant les premiers jours du développement. Au 17® jour. Van der Ghinst trouve, par oeuf de truite, 9 "y de furfurol (soit environ 30 y d'ARN), 7 y d'acide dés­ oxyribonucléique et 5,6 y de phosphore nucléique total. La courbe que nous avons déterminée (fig. 7) nous donne, au même moment, 11 y d'acide ribonucléique par embryon. Les résultats de Van der Ghinst sont nettement plus élevés que les nôtres, tout en restant du même ordre de grandeur (il est probable que les dosages du furfurol ne correspondent pas uniquement à l'acide ribonucléique).

31.

3® - Dosages c^e l'acide ribonucléique dans des explantats de batra­ ciens.

Nous n'avons pas entrepris d'études systématiques sur la répartition de l'acide ribonucléique dans l'embryon de batraciens. Nous nous limiterons donc à l'exposé de quelques observations iso­ lées, faites sur la teneur en acide ribonucléique des régions ven­ trales et dorsales d'embryons, chez quelques espèces.

Les embryons sont découpés sur fond d'agar avec une anse de platine. La séparation des fragments se fait avec un maximum de soin, en veillant, par exemple, à bien éliminer toutes les cellules ento- dermiques qui adhéreraient à un explantat d'ectoderme ou à la lèvre dorsale du blastopore. Cinq à six explantats sont réunis pour cha­

que dosage. Les méthodes de dosage sont celles qui ont été exposées au début de cette étude ; les tissus sont broyés dans l'acide per- chlorique avant l'extraction de l'acide ribonucléique. Les estima­ tions d'azote total sont faites sur les résidus de l'extraction per- chlorique, en suivant les procédés courants (Microkjelclahl, selon Markham ).

Résultats,

a) Axo,lot^. Les teneurs en acide ribonucléique sont évaluées en y par milligramme d'azote total.

i

i

1 Blastulas 1

Moitié supérieure

1

i

Moitié inférieure i

Jeunes Gastrulas I ectod. présomptif + z, mar­ ginale ventr.

neurod. et chordomésod. pré­ somptifs + Z. marginale dor­ sale . 3 tout l'endoderme 150 y/mgr N ... ... 1 346 y/mgr N 28 y/mgr N

b) Di^co^g^o£se_. Les teneurs en acide ribonucléique sont exprimées en y par milligramme de poids sec total (PS).

i

î

Moitié supérieure 38 y/mgr PS Jeunes Gastrulas

Moitié inférieure 16,5 y/mgr PS

c ) Ple^ur_odèie.

r

Il est probable que ces chiffres sont un peu supérieurs à la réalité. Les extraits perchloriques d'embryons broyés ne sont en effet jamais parfaitement limpides, ce qui tend à forcer légère­ ment les mesures d'extinction. D'autre part, lorsqu'il s'agit d'aus­

si petites quantités de substance, des pertes ne peuvent guère être évitées au cours des lavages et des centrifugations successives.

Les dosages de l'azote tendent donc à donner des valeurs trop faibles.

morphogé-33.

nése. Nos données se rapprochent aussi de celles de KruéelIs (118, 119) et de Gregé et L^vtrup (96) sur les gradients biochimiques de la gastrula d'axolotl. Ces auteurs ont montré l'existence de gra­ dients animal-végétatif pour divers enzymes, notamment la phosphata­ se alcaline, la ;ô-glycérophosphatase et 1'alanylglycinepeptidase.

Il serait intéressant de comparer entre elles les pentes des divers gradients découverts dans la gastrula d'amphibien (enzy­ mes, Af-tN, consommation Og) en se référant à un même constituant (l'a­ zote total ou l'azote non-vitellin) et en standardisant les méthodes de dosage.

4° - Etude des bases puniques et des nucléotides libres dans l'em­ bryon de batracien.

A. Introduction.

La grande importance biologique que l'on tend à attribuer aux acides nucléiques nous a valu, au cours de ces dernières années, de nombreux travaux sur leur concentration et leur répartition pen­ dant le développement embryonnaire. Qu'ils aient été obtenus par dosage du phosphore, du pentose ou du désoxypentose, ou des bases, les résultats des divers auteurs concordent en général de façon sa­ tisfaisante et ils ont permis d'étayer d'intéressantes hypothèses. Par contre, les mononucléotides acidosolubles, comme 1'adénosine-5'- phosphate et ses dérivés polyphosphorés ont moins retenu l'attention des embryologistes. Après les travaux initiaux de Zielinski (220, 221) et Brachet (29) sur les composés phosphorés acidosolubles sont venues les observations beaucoup plus précises de Barth et Jaeger

(6-8), et de Kutsky (121).

L'étude des phosphagènes et de l'acide adénosine-triphos-

phorique dans les embryons ^.résente un intérêt particu­

lier en raison de l'ancienne hypothèse de Needham (153-157) sur la prépondérance d'une glycolyse sans phosphorylations chez l'embryon de poulet et de batracien. Par ailleurs, dans son traité "Bioche~

ses d'embryons, différant par le type de leur métabolisme nucléique :

1) Echinodernes, arthropodes, vers : l'AI^N sert de précurseur à l'ADN, 2) Amphibiens : transformation d'ARN en ADN et synthèse totale.

3) Poissons : L'ARN et l'ADN sont synthétisés à partir de réserves de purines et de pyrimidines.

4) Oiseaux, reptiles : synthèse totale.

Sans vouloir pour l'instant discuter la valeur de cette clas­ sification, remarquons qu'une transformation d'un type d'acide nucléi­ que en un autre, telle que Brachet la proposait dans le cas de l'our­ sin, suppose une dépolymérisation et une libération de nucléotides puniques et pyrimidiques. Peut-on déceler ces substances intermé­ diaires du métabolisme de l'acide désoxyribonucléique ?

D'autre part, on sait que d<^ récentes observations semblent confirmer une hypothèse émise par J. 3rachet (38), selon laquelle les phénomènes d'induction, chez les embryons de batraciens, seraient provoqués par une migration d'acide ribonucléique de l'inducteur vers l'épiblaste sus-jascent. Cette idée, déjà développée par l'auteur de 1'"Embryologie chimique" en 1944, a subi une évolution en raison des intéressantes comparaisons qui ont été faites entre l'induction organisatrice et une infection à virus (Dalcq 80 ; Needham 151 ; Bra- chet 44,48). A l'idée d'une diffusion de petites molécules de nu­ cléotides a fait place celle d'une migration de particules cytoplas­ miques, peut-être à travers de fines travées cytoplasmiques (Brachet 48). Cette nouvelle conception trouve un apnui dans les observations de Brachet et Huëon de Scoeux (44) montrant que l'interposition d'une membrane de cellophane entre l'organisateur et l'épiblaste arrête l'induction : elle a été discutée par son auteur à plusieurs reprises. Néanmoins, il importait de rechercher si le métabolisme de nucléoti­ des acidosolubles ne présenterait pas des particularités au moment de l'induction neurale. Enfin, nous avons vu plus haut que Graff et Barth (93) et Vendre!.y (211), on dosant les purines totales de l'oeuf de batraciens, ont trouvé des valeurs plus élevées que celles que nous avons obtenues pour les acides nucléiques ; ce désaccord apparent pourrait provenir de la présence de bases puniques acidosolubles.

35

métabolisme et le rôle des acides nucléiques dans l'oeuf en voie de développement que nous avons entrepris une étude systématique des composés puniques acidosolubles.

B. Isolement et identification des bases libres.

Nous avons étudié les extraits d'oeufs de trois espèces d'a­ noures {Discog lossus pictus, Rana fusca et R. esculent a) et de qua­ tre espèces d'urodèles [Amb, nexicanum. Triton palmatus, Tr, alpes-

tris et Ir. Walthii) .

Nous avons réuni dans la figure 8 les spectres d'absorption que donnent les extraits d'oeufs en segmentation provenant de six espèces différentes d'amphibiens. Une première constatation impor­ tante s'impose : aucun de ces spectres ne montre un maximum à 260 m//, comme on aurait pu s'y attendre si le composé purique prédominant

avait été de l'acide adénylique ou de l'acide adénosine triphospho- rique. Les maxima sont tous décalés vers 250 m/z. La ou les subs­ tances responsables de ce spectre sont précipitées par le cuivre (méthode de Vendrely) et on retrouve le même spectre après dissocia­ tion du complexe cuivrique.

Sur un chromatogramme réalisé à partir d'un extrait d'oeufs vierges de R. fusca, deux taches sont parfaitement séparées ( fig. 9). Les valeurs Rf des substances correspondant à ces taches sont iden­ tiques à celles de 1'hypoxanthine et de la guanine. Les spectres d'absorption (fig. 10) des solutions obtenues après élution de ces taches sont spécifiques de l'hypoxanthine et de la guanine à tous les pH. Le spectre de la guanine et ses variations en fonction du pH étant très caractéristiques, il ne reste aucun doute sur la présen­ ce de cette base, à l'état libre, dans l'extrait. L'identité de > la seconde substance décelée par chromatographie avec l'hypoxanthine a pu être définitivement établie par la méthode enzymatique de Kalckar (113) : la substance à identifier, isolée d'un chromatogramme, est mise en présence de xanthine-oxydase fraîchement préparée suivant le

procédé décrit par Bail (5) ; on observe que, après incubation avec l'enzyme, le maximum d'extinction à 250 mjj. disparaît complètement pour faire place au spectre caractéristique de l'acide urique (fi­

traciens (acide perchlorique 1

%).

Fig. 9« Chromatogramme d'un extrait Fjg, 10. Spectres d'absorption des d'oeufs vierges de Rana fusca. deux bases puniques séparées par T : chromatogr, témoin d*un hydrolysat chromatographie, à partir d'un ex-

d'ao, ribonucléique désaminé. trait d'oeufs vierges de Rana fusca, G + X : guanine + xanthine

Fig. 11. Spectres d'absorption de l'hypoxanthine isolée d'oeufs de gre­ nouille avant (A) et après (B) l'incu­ bation avec la Xanthine oxydase.

Fig. 12. Chromatogramme d'un extrait d'oeufs vierges de Triton Alpestris

(Mêmes signes que Fig. 9).

Bases libiies dans L*(Rrp de diverses espèces debatraciens. SlJldr _{miiTomoIr.fi'Df}libres A<*. ritH>iiudéit|U('- inirroniole

de l‘ <ruf

Hnna rêCffii Hta... monilH tl.9 HH 10.H 10-»

Bnnti fn<rn... J. EU>‘tni*a :i6,5 KH 1»,7

piclut J. 11,9 KH —

Amf>u9>onm me.ncannm.. MM>rul{i 2H.2 10-» :i».3 10*» / ntoH •« ttUfifi... . • •. iiionila n,<i KH 7,9 KH 1

Noue pouvons conclure de ces premières données que l'oeuf vierge de Rana fusca contient de l'hypoxanthine et de la guanine sous une forme libre ou, en tous cas, libérable à froid par un acide très dilué. La proportion des deux bases est d'environ deux molécu­ les d'hypoxanthine pour une molécule de guanine.

ser que les extraits d'oeufs d'autres espèces doivent contenir les mêmes bases puriques. L'analyse chromatographique de la fraction

acido-soluble d'oeufs vierges de Rana esculenta et de Triton alpes- tris révèle effectivement la présence de guanine, d'hypoxanthine, ain si que d'acide adénosine-5-phosphorique. L’oeuf d'axolotl ne semble pas renfermer de guanine, mais seulement de l'hypoxanthine et de l'a­ cide adénylique. Remarquons que l'oeuf vierge de la grenouille rous­ se paraît presque dépourvu d'acide adénosine-5-phosphorique ou de ses dérivés polyphosphorés ; seuls les chromatogrammes faits en par­ tant d'un extrait fortement concentré permettent de déceler une tra­ ce de ces substances.

On peut estimer, avec une assez bonne approximation, la quan tité absolue des purines libres par embryon, en prenant comme base une extinction moléculai-^e moyenne égale à 10^. On trouvera dans le tableau (fig. 13) les résultats calculés de la sorte pour diverses espèces d'amphibiens (les données sont exprimées en micromoles par oeuf). La teneur en acide ribonucléiq.ue des mêmes embryons, dosée sur un extrait à l'acide perchlorique 10 %, a pu, dans certains pas, être mise en parallèle. Quelle que soit l'espèce, l'oeuf contient toujours une quantité de purines libres de l'ordre de grandeur de celle des purines liées à l'acide ribonucléique : les dosages de purines totales ne peuvent donc en aucun cas convenir aux mesures des acides nucléiques et il n'est pas étonnant que Vendrely ait ob­ tenu, dans ces conditions, des résultats trop élevés.

C. Etude des dérivés puriques acidosolubles au cours du développe­ ment embryonnaire d? ?. fusca.

depuis 24 heures, ont été étudiés par la méthode qui a été décrite (combinaison du dosage spectrophotométrique dans l'ultra-violet avec

L'examen des spectres d'absorption (figure, l) laisse à

37.

la méthode chromatographique).

Considérons tout d'abord le spectre d'absorption de l'ex­ trait total à l'acide perchlorique h 1 % d'embryons à divers stades (figure 14). Depuis l'oeuf non fécondé jusqu'à un stade avancé de la neurulation, la forme de la courbe ne se modifie pas : elle présente un maximum unique et très accusé entre 245 et 250 mpi,. Dès la segmentation cependant, l'absorption de l'extrait diminue i d'intensité. A partir du stade du bourgeon caudal, alors que l'in­ tensité de l'extinction à 250 m/j. continue à diminuer considérable­ ment, l'extinction à 260 m/j. se stabilise, puis augmente même légère­ ment. On assiste vraisemblablement à une disparition progressive de l'hypoxanthine et de la guanine et à l'apparition d'au moins un nouveau constituant, dont le maximum d'extinction paraît correspon­ dre à celui de l'adénine.

Il ressort de l'analyse chromatographique que, jusqu'à un stade très avancé de la morphogénèse, l'espèce Jf, fusca ne contient, dans la fraction acidosoluble, que les deux bases libres hypoxanthi­ ne et guanine, dans un rapport moléculaire de 2 à 1. S'il existe de l'acide adénosine-5-phosphorique dans l'oeuf de la grenouille rousse avant le stade du bourgeon caudal, la quantité présente doit être trop faible pour qu'on puisse la mesurer par le procédé utili­ sé au cours de ce travail : elle ne peut excéder 0,005 micromole par embryon.

A partir du stade du bourgeon caudal, l'acide adénylique existe en quantité suffisante pour qu'on puisse l'isoler en une ta­ che bien nette sur la chromatogramme (figure 15-16). Nous n'avons jamais décelé d’autre dérivé purique acidosoluble que l'hypoxanthine, la guanine et l'acide adénosine-5-phosphorique, quel que soit l'age de l'embryon.

bryons de R. fusca à divers sta. des du développement, A, blastulaj B. neurulaj C, bourgeon caudal, D. éclosion*

Fjg. 15. Chromatogramme d'un extrait d'embryons de Rf /i*sca au stade du bourgeon caudal

(M'gmes signes que fig, 9).

38.

effeti observé chez R. esculenta, discoglossus pictus, tr, palnatus et Anb. nexicanun, que le spectre d'absorption de l'extrait à l'aci­ de perchlorique varie avec l'âge de l'embryon : au cours du dévelop­ pement, le maximum d'absorption diminue d'intensité et il se déplace de 250 m/j. vers 260 m/Lt, indiquant ainsi la perte progressive des oxy- purines et une synthèse d'acide adénylique.

D. Conclusions.

Constatons tout d'abord que nous n'avons pas décelé de li- bér^ation notable de nucléotides au moment de la gastrulation. Ce fait cadre bien avec nos dosages de l'acide ribonucléique, dont la teneur ne diminue à aucun moment du développement. L'acide adényli­ que que l'on trouve à ce stade chez certaines espèces est exclusive­ ment de l'acide adénosine-5-phosphorique, probablement étranger aux acides nucléiques. Si l'induction de la plaque médullaire s'accom­ pagne d'une migration d'acide ribonucléique, comme Brachet (1945) l'a suggéré, nos observations n'apportent aucun argument en faveur d'un passage de mononucléotides ; elles laissent, par contre, toute sa valeur à la dernière hypothèse de Brachet (1950) qui voit plu­ tôt dans ce phénomène d'induction une transmission de particules cyto­ plasmiques spécifiques, riches en acide ribonucléique.

D'autre part, l'absence de mononucléotides dans l'oeuf en segmentation n'apporte aucun appui à l'idée d'une conversion d'acide ribonucléique en acide désoxyribonucléique* ; on ne peut, en effet, imaginer une telle conversion sans qu'il y ait au moins une dégrada­ tion de l’acide ribonucléique en mononucléotides.

En ce qui concerne la teneur très faible en acide adényli­ que de l'oeuf de grenouille rousse, il faut attirer l'attention sur l'existence d'un désaccord important entre les résultats obtenus par Brachet (29) et Zjelinski (220-221), qui ont étudié le phosphore labile , et les nôtres : Nos observations cadrent mal avec la quan­ tité relativement grande de phosphore labile décelée par ces auteurs. Nous ne trouvons actuellement aucune explication satisfaisante de ce désaccord, à moins d'admettre l'existence, en quantité importante

adénosine triphosphorique ne peut cependant être considéré comme un argument en faveur de l'hypothèse d'une prédominance, dans l'oeuf de batracien, d'une glycolyse sans phosphorylations (Nowinski 157 ; Needham et al. 153).

La présence d'hypoxanthine et de guanine libres est proba­ blement générale dans les oeufs de tous les amphibiens. Ces bases disparaissent progressivement à partir de la fin de la segm.entation. Ce n'est qu'au stade du bourgeon caudal que commence la synthèse de ]'acide adénylique ; ce dernier préexiste dans les oeufs vierges de la plupart des espèces, à l'exception de la grenouille rousse qui n'en possède que des traces, comme on l'a vu.

L'étude d'un extrait de petits oocytes (diamètre maximum 0.5 mm) de S. fusca ne révèle pas la présence d'oxypurines libres ;

l'allure du spectre d'absorption, qui présente un maximum très accen­ tué à 260 m/jL, semble indiquer la présence d'une quantité importante d'acide adénosine triphosphorique à ce moment. Les bases libres

font donc leur apparition au cours du grand accroissement de l'oocyte, tandis que les nucléotides adényliques disparaissent.

Que signifie la présence d'hypoxanthine et de guanine libres dans les oeufs de batraciens ? On peut supposer qu'il ne s'agit là que de produits du catabolisme de l'oocyte, qui seraient lentement éliminés au cours du développement de l'embryon. Une autre hypothè­ se, que nous discuterons en détail à la fin de ce mémoire et qui réu­ nit un grand nombre d'arguments en sa faveur, consiste à voir dans ces purines des précurseurs des purines nucléiques, l'adénine et la guanine.

5° - Dérivés puriques acidosolubles dans les oeufs de truite et d'as­ térie ,