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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Blasius, R. (2003). Interactions et photoréactions de complexes du ruthénium (II) à base du ligand HAT avec des acides nucléiques (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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D 03195

versité Libre de Bruxelles

Faculté des Sciences

Service de Chimie Organique et Photochimie

Interactions et photoréactions de complexes du Ruthénium (II) à base du ligand HAT avec des acides

nucléiques

Thèse présentée en vue de l'obtention du grade de Docteur en Sciences

Promoteurs de thèse : Pr. A. Kirsch-De Mesmaeker Pr. C. Moucheron

Romain Blasius

D03

Université Libre de Bruxelles

Faculté des Sciences

Service de Chimie Organique et Photochimie

Interactions et photoréactions de complexes du Ruthénium (II) à base du ligand HAT avec des acides

nucléiques

Thèse présentée en vue de l'obtention du grade de Docteur en Sciences

Promoteurs de thèse : Pr. A. Kirsch-De Mesmaeker Pr. C. Moucheron

Romain Blasius

Juillet 2003

The most important thing is not where you are, but where you are going to.

Goethe

Remerciements

Je voudrais tout cTaBord ex^mer ma gratitude atvç^ (professeurs Tanny %irscfi et Cécde Moucheron pour m’avoir accueilli dans Ceur Cahoratoire et de m’avoir donné Copportunité (Cejfectuer Ce présent travail Panny, ton esprit critique et tes encouragements tout au long de cette thèse auront été un support inestimahle pour moi Cécile, tu aurais sacrifié ta dernière minute de temps lihre pour une discussion scientifique ou une petite Blague. Ibn optimisme, de même que létemelle Bonne humeur qui te caractérise ont été une motivation quotidienne. Je vous remercie également toutes les deux, pour les opportunité^ de voyage à C étranger que vous m’avez offertes.

Je voudrais également remercier le (professeur Pascal (Dumy de m’avoir permis deffectuer un court séjour de recherche au sein de son laBoratoire à ÇrenoBk. Pn même temps, je voudrais exprimer ma gratitude envers Jean-Prançois Constant et Prie (Defrancq, pour leur aide et leurs conseils pendant et après ce séjour. Jean-

Prançois, je voudrais te remercier tout particulièrement pour ton aide lors de la fin de ce travail

I ivould also lihe to thanf Professer John %eüy for very interesting and helpful discussions. Hour advises were crucial for the elaBoration ofsome parts ofthis worf

Je tiens également à remercier le (Professeur Michel Luhmer et Pjta (D’Orazio pour leur aide en Michel ta rigueur scientifique et ta persévérance ont été un Bon exemple pour moi, mais le sourire et la gentillesse qui accompagnent tes qualités scientifiques sont encore plus impressionnants.

Je voudrais également remercier toutes les personnes avec lesquelles j’ai pu avoir des coÛaBorations : Jlélène qui ne m’aura pas seulement appris à faire des tartes flamBées, mais a également contriBué à CékBoration dune partie de ce travad; le (professeur Jlkin Van (Dorsseker; Matteo Cusumano et Maria Letizia (Di (pietro pour les études de viscosité; Prédéric Ppsu et le (professeur Pdwin De Pauw qui ont permis C étude des constantes d affinité par PSMS.

Mes remerciements s’adressent également auxmemBres de mon comité d accompagnement, Martine Prévost et Michel Çodefroid, pour les discussions que nous avons pu avoir au cours de ces années.

J’ai également une pensée très particulière pour pita £., Jûcole, Orner, PpBert et Juliana sans lesquels la vie

au P2 serait Beaucoup plus compliquée. Vous m’avez toujours reçu avec le sourire et vous avez réussi à

résoudre tous les petits proBlêmes quotidiens du P2.

‘Ensuite, je voudrais remercier tous mes amis du <P2, avec en -premier Cieu quatre personnes qui auront été pour moi Ca cCé du succès depuis Ce déBut de mes études à (Brwçellês. Olivier, tu t’es rapidement transformé de Binôme en ami (même si on peut te confondre avec un chat de temps en temps); je n’ouBCierai pas les nomBreuses Heures d’études que nous avons passées ensemBk, mais je préfère de Coin ms voyages communs, de même que Ces mmBreuses soirées autour d’un repas ou d’un petit verre. Julien: en qui j’ai trouvé un véritaBCe ami; ms discussions, ms soirées passées ensemBCe, de même que ton soutien et tes emouragements m’auront aidé et remonté Ce moraC tout au long de mes études ; j’espère que ceci ne soit pas des remerciements d’adieu. (Bemfi, ton arrivée un peu pCus tardive dans mtre petit groupe aura été Bénéfique pour mus ; je te remercie pour Ces Heures interminaBCes que mus avons passées ensemBCe avec Ces Bugs instrumentaioi du <P2 ; je te souHaite Bonne cHance pour Ce 360°. Ludo, cette fois-ci je ne te t’ouBOerai pas et je te promets qu’iCy

aura toujours une place pour toi sur mon campé.

‘Merci aussi à : Ered, ami de Fart et joyeiu(_fêtard, tu m’auras appris émrmément de cHoses qui se sont avouées utiles pour ce travaiC; j’espère que mus pourrons mus remontrer emore souvent dans divers musées du monde. (David, qui a été une aide inestimaBCe Cors de mon arrivée au <P2 et qui répond toujours présent qmndfai Besoin de lui; je te promets que Cors de ma procHaine visite à Madrid on ne se ratera pas. Jindré, qui n’a pas seulement Ce sourire après un tour du monde. IsaBeCCe %, qui m’a montré Ce cHemin des Bourses de fin de tHèse. Jirmud, qui à Cui seuC arrive à maintenir une Bonne amBiance au (F2 ; ne t’enfuis pas, ça va aCCer. (Benjamin, qui est toujours souriant, mais pas nécessairement aussi sériewç qu’iC voudrait Ce faire paraître. Etienne, en qui j’ai trouvé un faBideujçpartemire de discussions scientifiques ; tu aurais quand même pu venirpCus tôt. Jdriane, personne que Ce mot "accueillant" caractérise pafaitement. StepHan, pour qui seulement Ces cigares et Ce wHisHy ne se caCcuCent pas. Mco C-, qui est devenu un camarade de Bureau idéaC StépHanie, qui devrait être pro du surf dans 4 ans. LiH, ton départ aura Baissé un caCme inHaBitueC au (P2. CuroCe, qui a Fart de se mettre dam des sitmtiom inimagimBCes, mais qui en sort toujours avec Ce sourire. Manu, que mus enviom tous pour Ce soCeiC de Ca Sardaigne (tu vois, cette fois-ci je m me suis pas trompé) IsaBeCCe O., impressionnante de caCme et de gentillesse. Çiûés, ami du fromage accueillant. !Nico S., maître Limonceûo qui doit parfois montrer ses crocs pour cacHer sa gentillesse. %jistin, ne t’en fais pas, Ces L sont en voie de disparition. Jacques, toujours aussi impressionnant. Les 3 petits derniers : Jimaud Ç., continue comme ça ; MattHieu, qui ne perd jamais son caCme ; Mio, qui va sûrement en étonner emore pCus d’un Merci aussi à toutes Ces autres personnes qui ont séjourné au (P2 et contriBué à Ca Bonne amBiame de tous Ces jours.

Je voudrais aussi remercier Ce Professeur (Pierre SecH^ et Ce (Docteur Marc PauCy pour Ceur aide et pour Ca

confiame qu’iCs ont placée en moi

Je tiens également à remercier Ce ^Ministère de C%ducation JfationaCe du Lwçemôourg, les ‘Fondations (David et J^Cice F'an (Buuren, de CMeurs-François et FauC Fischen, les Legs TLfinnings et le Fond Jfational de la (R^chercfie pour le soutien financier pendant ma thèse, ainsi que le COST pour le financement dun séjour de recherche à Çrenohle.

Je ne remercierai jamais assez mes parents pour leur support sans limites. Merci fier dass dier mier cTChance heizou gin hudd. Ouni ierch wdr et net meiglech gewiecht. Merci aussi à Claudine, qui est toujours à Cécoute de son petit frère et prête pour me venir en aidé.

Fnfin, merci à Muriel dont les encouragements incessants et la patience parfois sans limites ont été dune

importance capitale pour moi Merci aussi pour ton aide pendant la période de stress de fin dé rédaction.

Table des matières

Résumé...1

Structure et abréviation des principaux ligands cités... 3

Liste des abréviations... 4

Chapitre I : Introduction... 5

I. L’ADN... 6

1.1. Structure de l'ADN... 6

1.2. Expression des gènes...9

1.3. Interaction de petites molécules avec l'ADN...9

1.4. Réaction de petites molécules avec l ADN... H 15. Les stratégies antisens et antigène... 12

II. Les complexes polypyridiniques du Ruthénium (II)...14

II. 1. Propriétés photophysiques... 14

11.2. Schéma photophysique...16

II. 3. Propriétés électrochimiques à l'état fondamental et à l'état excité...17

III. Les complexes polypyridiniques du Ruthénium (II) et l’ADN...18

///./. Les complexes à base des ligands TAP et HAT...19

111.2. Les complexes ancrés sur oligonucléotides...20

IV. But du travail...v... 22

Chapitre II : Synthèse et caractérisation____ _____ _____...--- -—... ... 24

I. Introduction... 24

/. 1. Stratégie de synthèse...25

II. Synthèse... 25

11.1. Synthèse du HAT(1,4,5,8,9,12-hexaazatriphénylène)... 25

11.2. Synthèse duphen’ (acide 5-amido-l,10-phénanthroline-glutarique)... 26

11.3. Synthèse du [Ru(phen)X

r et du [Ru(phen')X

/* (X = H

O, CT)... 26

11.4. Synthèse du [Ru(HAT)

phenf^ et du [Ru(HAT)

phen ’f*...27

III. Caractérisation des complexes par RMN du proton... 27

111.1. Caractérisation des complexes précurseurs monochélatés...27

111.2. Caractérisation des complexes trischélatés par résonance magnétique nucléaire du proton...29

rV. Caractérisation photophysique... 34

IV.1. Spectroscopie d’absorption...,... 34

IV.2. Spectroscopie d’émission...36

IV. 3. Durées de vie de luminescence...37

lV.3.a. Extinction de la luminescence par l’oxygène... 37

Table des matières

IV.4. Détermination des constantes cinétiques de désactivation... 40

V. Ancrage sur oligonucléotides... 40

VI. Conclusions...43

Chapitre III : Etude en présence de mono- et polynucléotides.— ... 44

I. Introduction... 44

LL Etude en présence de mononucléotides... 44

I. 2. Photophysique en présence de polynucléotides... 44

II. Etude en présence de mononucléotides... 46

III. Etudes en présence de polynucléotides...48

111.1. Titrages en émission...45

111.2. Méthode de calcul de la constante d’affinité...50

111.2. a. Le taux de recouvrement...52

111.2. b. Le modèle de McGhee et von Hipjjel...53

111.2. C. Détermination de la concentration en complexe lié...55

111.3. Détermination des constantes d'affimitépar spectroscopie d’émission...57

rv. Conclusions... 59

Chapitre IV : Etude de l’interaction du [Ru(HAT)

phen]^^ avec les acides nucléiques... 60

I. Introduction... 60

II. Résultats et discussion... 60

II. 1. Effet de sel sur l ’équilibre d’interaction... 60

II. La. Contributions thermodynamiques à l’interaction...63

II. 1 .b. Détermination des contributions thermodynamiques... 64

11.2. Quenching statique... 66

11.3. Dockinggraphique... 67

11.4. Viscosimétrie...68

11.5. Etude de constantes d’affinité par Spectrométrie de Masse Electrospray... 69

II. 5.a. Détermination des constantes d’affinité par spectrométrie de masse...72

III. Conclusions... 75

Chapitre V : Photoréaction du [Ru(HAT)

phen]^* avec la GMP...~...—...--- ...76

I. Introduction...76

IL Etude par spectroscopie d’absorption... 77

III. Photostabilité... 78

II. 2. Photoréactivité en présence de GMP...78

III. Etude par HPLC et ESMS... 80

III. I. Effet de la concentration en oxygène...87

III. 1 .a. Formation de guanines oxydées par l’oxygène singulet...89

III.I.b. Production de guanines oxydées au départ du complexe monoréduit... 90

III. Le. Production de guanines oxydées par GMP"’'... 91

III. 2. Formation de biadduits... 92

rv. Détermination de la structure du photoadduit... 95

V. Caractérisation photophysique du photoadduit...103

VI. Conclusions... 106

Chapitre VI : Photoréaction du [Ru(HAT)

pl*en]^^ avec des poly- et oligonucléotides...107

I. Introduction... 107

II. Etude par spectroscopie d’absorption... 107

III. Etude par gel d’électrophorèse... 109

rv. Conclusions... 117

Chapitre VII : Conclusions et perspectives--- ...—...—... ...118

Chapitre VIII : Partie expérimentale... 121

I. Techniques expérimentales...121

LI. Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN)... 121

1.2. Spectrométrie de masse électrospray (ESMS)... 121

1.3. Spectroscopie d’absorption... 122

1.4. Spectroscopie d’émission...122

I.4.a. Détermination des rendements quantiques de luminescence... 123

1.5. Mesures de durées de vie de luminescence... 124

16. Chromatographie liquide à haute performance (HPLC)...;...125

1.7. Mise en évidence de photoadduitspar spectroscopie d’absorption...125

18. Production de photoadduit à grande échelle...126

I. 9. Mise en évidence de photoadduits par gels d’électrophorèse...127

II. Produits et solvants... 128

II. I. Ligands et complexes...128

11.2. Mono-, oligo- et polynucléotides... 128

II. 3. Produits divers...128

II. 4. Solvants...129

III. Synthèse et purification des composés... 129

III. I. Synthèse des ligands...129

111.1. a. Synthèse de la 5-nitro-l,10-phénanthroline...129

111.1. b. Synthèse de la 5-amino-l,10-phénanthroline... 130

in.l.c. Synthèse de l’acide 5-amido-l,10-phénanthroline-glutarique (phen’)... 130

111.2. Synthèse des précurseurs métalliques et des complexes...131

111.2. a. Synthèse du [Ru(phen)X

]’''’ et du [Ru(phen’)X

]’'’' (X = H

O ou Cl")...131

111.2. b. Synthèse du [Ru(HAT)

phen]^’’ et du [Ru(HAT)

phen’]^’'... 131

III. 3. Purification des complexes finaux... 132

Chapitre IX : Références... 133

Table des matières

Résumé

Le développement de sondes moléeulaires de l’ADN capables de reconnaître des topologies particulières et de les corréler à son activité, constitue aujourd’hui un important domaine de recherche. D’autre part, un grand nombre de recherches vise le développement d’agents thérapeutiques capables de réagir au niveau des acides nucléiques.

Dans ce cadre, la recherche dans notre laboratoire est plus particulièrement focalisée sur l’étude de complexes polyazaaromatiques du Ruthénium (II) capables d’interagir et de phtetoréagir avec l’ADN. Ces propriétés pouvant être modulées en fonction des ligands chélatés au centre Ruthénium (II), nous nous sommes plus particulièrement intéressés à des complexes portant deux ligands HAT (HAT = 1,4,5,8,9,12-hexaazatriphénylène).

La première partie de notre travail a été consacrée à la synthèse, la purification et la caractérisation photophysique du [Ru(HAT)

phen]^^ et du [Ru(HAT)

phen’]^'^ (phen = 1,10- phénanthroline, phen’ = acide 5-amido-l,10-phénanthroline-glutarique). L’étude de ces complexes en présence de mononucléotides a révélé que leur luminescence est inhibée en présence de GMP, suite à un transfert d’électron photo-induit.

L’étude de l’interaction de ces complexes avec des oligonucléotides et des polynucléotides a été effectuée à l’aide de plusieurs techniques. Les résultats obtenus montrent que le [Ru(HAT)

phen’]^’^ interagit moins bien avec les acides nucléiques que le [Ru(HAT)

phen]^'^,

«eci étant dû à la charge négative portée par le ligand phen’ à pH 7. Les différentes techniques utilisées pour étudier l’interaction du [Ru(HAT)

phen]^^ avec les acides nucléiques indiquent toutes que ce complexe peut s’intercaler entre deux paires de bases de T ADN, géométrie d’interaction qui lui confère une affinité relativement élevée pour les polynucléotides.

Les études menées pour déterminer la eonstante d’affinité du [Ru(HAT)

phen]^^ pour différents oligonucléotides ou polynucléotides ont permis de comparer grossièrement deux techniques différentes, la spectroscopie d’émission et la spectrométrie de masse éleetrospray.

Enfin, la dernière partie de notre travail a consisté en l’étude de la formation de photoadduits,

d’abord entre le [Ru(HAT)

phen]^‘^ et la GMP, et, ensuite, entre le [Ru(HAT)

phen]^'^ et des

polynucléotides. Les résultats obtenus montrent que la formation de photoproduits entre le

[Ru(HAT)

phen]^"^ et la GMP dépend fortement de la concentration en oxygène dans la

solution et de la durée du temps d’illumination. Ainsi, nous avons pu montrer qu’il n’y avait pas seulement formation de "simples” photoadduits entre le [Ru(HAT)

phen]^"^ et la GMP, mais également de photoadduits oxydés et de biadduits. L’étude de la structure du photoadduit a ensuite été menée par résonance magnétique nucléaire.

La formation de photoadduits entre le [Ru(HAT)

phen]^^ et l’ADN a été étudiée par spectroscopie d’absorption ; elle ne révèle pas de dépendance vis-à-vis de la concentration en oxygène. Finalement, la formation de photoadduits entre le [Ru(HAT)

phen] et différents oligonucléotides à été mise en évidence par l’apparition de bandes retardées lors d’études par gel d’électrophorèse.

Résumé 2

Structure et abréviation des principaux ligands cités

1,4,5,8,Ç^l 2-hexaazatriphénylène 4,7-diphényl-1,10-phénanthroline

'=N N==/

phen

1

,

-phénanthroline

NHC0(CH2)3C00H

phen’

acide 5-amido-l,10-phénanthroline-glutarique

bpy

2

,

’-bipyridine

1,10-phénanthrolino[5,6-b] 1,4,5,8,9,12- dipyrido[3,2-a:2’,3’-c]phénazine

hexaazatriphénylène

Liste des abréviations

A ADN AMP ARN ATP C COSY DO DMSO dqf-COSY

Eox

Ered ESMS G GMP HPLC IR isc LC MC MLCT pb RMN SPC T TRIS UV T

adénine

acide désoxyribonucléique adénosine-5 ’-monophosphate acide ribonucléique

adénosine-5 ’-triphosphate cytosine

corrélation spectroscopy densité optique

diméthylsulfoxyde

double quantum filtrated corrélation spectroscopy potentiel d’oxydation

potentiel de réduction

spectrométrie de masse électrospray guanine

guanosine-5 ’ -monophosphate

chromatographie liquide haute performance infrarouge

intersystem Crossing

Ligand Centered Métal Centered

Métal to Ligand Charge Transfer

paire de bases nucléiques résonance magnétique nucléaire

Single Photon Counting

thymine

tris(hydroxyméthyl)-aminométhane ultraviolet

durée de vie

rendement quantique

Liste des abréviations 4

Intro(ûiction

Chapitre I : Introduction

La propriété la plus fondamentale de tout être vivant est probablement son aptitude à se reproduire. Tous les organismes vivants héritent de l’information génétique de leurs parents définissant leur structure et leur fonction. De même, toutes les cellules naissent de cellules préexistantes, de façon à ce que le matériel génétique soit répliqué et transmis des cellules parents aux cellules filles à chaque division cellulaire. Par conséquent, la découverte des mécanismes de transmission génétique et l’identification de l’ADN comme support génétique étaient d’une importance primordiale pour im bon nombre de recherches.

Même si les principes classiques de la génétique ont été découverts par Gregor Mendel en 1865, ce n’est qu’en 1944 qu’Oswald Avery, Colin MacLeod et Maclyn McCarty proposent pour la première fois TADN comme vecteur de l’information génétique^’l Au cours des décennies suivantes, l’intérêt porté à l’ADN n’a cessé de croître, menant ainsi régulièrement à de nouvelles découvertes. En 1991, "The Human Genome Project" a été lancé afin de fournir une carte complète de tous les gènes humains, objectif qui a été atteint en

^^’

Une bonne coimaissance de TADN et de la fonction des gènes est essentielle pour la compréhension du fonctîonfiement des cellules et du corps humain. En effet, TADN ne transmet pas seulement l’information génétique aux cellules filles, mais code aussi pour la synthèse des protéines et régule par ce biais l’activité des cellules. De ce fait, une erreur d’encodage au sein de TADN peut avoir des conséquences dramatiques pour une cellule, voire même pour un organisme tout entier. La connaissance sans cesse améliorée de TADN est également à la base de traitements de plus en plus efficaces contre des maladies comme, par exemple, le cancer.

Une anomalie fondamentale incriminée dans le développement d’un cancer est la prolifération continuelle et non régulée des cellules. Au lieu de répondre aux signaux qui gouvernent le fonctionnement normal de la cellule, les cellules cancéreuses grandissent et se divisent de façon non contrôlée, ehvahissant les tissus et les organes sains. Une des stratégies pour traiter un cancer vise donc à entraver cette division cellulaire non contrôlée. Un grand nombre de molécules, capables d’interagir ou de réagir avec TADN, ont ainsi trouvé une application dans le domaine médicafdu traitement de cancers^'*’’^^.

Les composés de métaux de transition occupent une place non négligeable dans ce domaine^*®’

Le cisplatine et ses dérivés, par exemple, sont parmi les molécules les plus efficaces

Chapitre I : Introduction 5

dans le traitement de patients souffrant de carcinomes testiculaires ou ovariens, de tumeurs à la vessie, la tête ou le cou^’°’ L’activité thérapeutique des composés du platine repose sur la formation d’adduits sur certaines bases de l’ADN, qui empêchent celui-ci de se répliquer

14-17]

Les recherches menées au sein de notre laboratoire visent le développement de complexes du Ruthénium (II) capables d’interagir et de photoréagir avec l’ADN. En effet, il a été montré que certains complexes polyazaaromatiques du Ruthénium (II) peuvent photoréagir et former un lien covalent avec l’ADN^**'^°\ pouvant ainsi mener à leur utilisation possible comme agents anti-tumoraux.

I. L’ADN

I.l. Structure de l’ADN

La structure primaire de l’acide désoxyribonucléique correspond à une chaîne de nucléotides,

chacun composé de trois sous-unités : une base, un sucre et un groupement phosphate. Les

groupements phosphates, chargés négativement, relient les sucres entre eux par des liens

phosphodiester. Les sucres, des désoxyriboses, forment avec ces groupes phosphates le

squelette de ce polyanion. Les bases de l’ADN, au nombre de quatre, sont portées par les

sucres et permettent l’association des deux chaînes, ce qui conduit à la formation de la

structure secondaire en forme de double hélice.

Figure 1.1 : Structure primaire de l’ADN.

C’est en 1953 que Watson et Crick ont proposé la structure secondaire la plus courante de l’ADN^^*\ l’ADN-B. Cette structure correspond à une double hélice droite où le squelette sucre-phosphate est à l’extérieur et les bases de l’ADN à l’intérieur. L’association des deux brins est assurée par des liens hydrogène entre les bases qui sont appariées à l’intérieur de l’hélice. La spécificité de l’appariement de ces deux brins est induite par la complémentarité des bases : guanine - cytosine (GsC) et adénine - thymine (A=T). La structure secondaire en forme de double hélice induit l’apparition de deux sillons : un sillon majeur large et profond et im sillon mineur étroit et profond. Le diamètre de cette double hélice est de 20 Â. Un tour d’hélice comporte 10,5 paires de bases qui sont séparées de 3,4 Â les unes des autres^^^^.

Figure 1.2 : Ponts hydrogène formés lors de l’appariement des paires de bases de l’ADN : adénine - thymine (A=T) et guanine - cytosine (G»C) ; dR représente la position d’attachement des groupements sucre-phosphate.

Chapitre I ; Introduction 7

ADN-A ADN-B ADN-Z

Figure 1.3 : Trois structures secondaires de l’ADN : ADN-A, ADN-B et ADN-Z.

Selon les conditions environnementales et la séquence, l’ADN peut adopter une grande variété de conformations^^^’. Les trois conformations majoritairement rencontrées sont les formes A, B et Z. Tandis que les formes A et B sont constituées d’une hélice droite, TADN-Z présente une hélicité gauche. L’ADN-A se différencie de l’ADN-B par la largeur et par la forme des sillons. Le sillon majeur de l’ADN-A est étroit et profond, tandis que le sillon mineur est large et peu profond. Outre l’hélicité gauche de l’ADN-Z, cette forme se différencie aussi des deux autres par l’orientation de la guanine vis-à-vis du lien glycosidique.

Contrairement aux autres bases de TADN, les guanosines présentes dans TADN de forme Z présentent une conformation syn. Cette conformation, stabilisée en présence de concentrations élevées en sel, est favorisée par une alternance des conformations syn et anti des guanines et des cytosines. Cette hélice en zig-zag se caractérise par un diamètre plus petit (18 Â), im sillon majeur aplati et im sillon mineur profond et étroit.

Figure 1.4 : Schématisation des positions anti et syn de la guanine.

1.2. Expression des gènes

Les gènes sont les parties de l’ADN qui codent pour la synthèse des protéines. A chaque division cellulaire, l’entièreté de l’ADN de la cellule est copié afin de transmettre toute l’information aux cellules filles. Cette réplication de l’ADN est rendue possible par des protéines, dont fait partie l’ADN polymérase. La synthèse des protéines par contre se déroule en deux étapes. Le gène codant pour la séquence de la protéine est tout d’abord transcrit en ARN messager. La protéine elle-même est issue de la traduction de cet ARN messager en une séquence d’acides aminés.

A B

Figure 1.5 : A : Schématisation de la réplication de l’ADN. B : Schématisation de la transcription de l’ADN et de la traduction de TARN messager.

1.3. Interaction de petites molécules avec l’ADN

L’activité biologique d’une cellule est basée, entre autre, sur la reconnaissance et l’interaction de protéines avec l’ADN. Dans le but d’interférer avec cette activité biologique, un grand nombre de molécules visent à empêcher ces interactions protéine-ADN.

L’ADN interagit de façon non covalente et réversible avec un grand nombre de substances, telles que des protéines, des oligonucléotides, des complexes métalliques ou des molécules organiques*'^’ L’association non covalente de l’ADN à d’autres molécules peut être stabilisée par différents types d’interactions intermoléculaires :

Chapitre 1 : introduction 9

les interactions électrostatiques, intervenant surtout lors de l’interaction de molécules chargées positivement avec le squelette polyanionique de l’ADN ; les interactions attractives de Van der Waals entre molécules non chargées, de type dipôle/dipôle, dipôle/dipôle induit, et les forces de dispersion de London, de type dipôle induit/dipôle induit ;

- les liens hydrogène, souvent établis entre les groupements donneurs ou accepteurs de ponts H de molécules contenant des hétéroatomes et les groupes donneurs ou accepteurs de ponts H des bases nucléiques ;

les interactions hydrophobes, impliquant la libération de molécules d’eau ou de contre-ions de l’ADN, entraînant ainsi une augmentation de l’entropie du système^^'*'.

Trois géométries d’association, stabilisées dans des proportions différentes par les types d’interactions décrits ci-dessus sont communément reportées dans la littérature. Toutefois, la plupart des molécules peuvent s’associer à l’ADN en adoptant plusieurs de ces géométries d’interaction^^^^.

adsorption

intercalation

interaction électrostatique

Figure 1.6 : Représentation des différentes géométries d’interaction de petites molécules avec l’ADN.

a) L'association à l'extérieur de la double hélice :

Cette association peu spécifique repose essentiellement sur des interactions électrostatiques.

Elle est observée pour des molécules cationiques, dont les complexes du Ruthénium (II).

b) L'adsorption dans les sillons de l'ADN :

Certaines molécules peuvent s’adsorber dans un des sillons de TADN. Alors que les

protéines’^^' et les oligonucléotides^^^'^”^ interagissent préférentiellement dans le sillon majeur

de l’ADN, certaines petites molécules se fixent dans le sillon mineur du polynucléotide. La nétropsine et la distamycine sont des exemples connus pour leur adsorption préférentielle dans le sillon mineur^^*’

c) L'intercalation entre deux paires de bases de l'ADN :

Cette géométrie, observée pour des molécules possédant un plan aromatique étendu capable de s’insérer entre deux paires de bases de l’ADN, a été proposée pour la première fois par Lerman^^^’ Ce type de géométrie d’association provoque une distorsion et un déroulement partiel de la double hélice d’ADN, ce qui affecte notamment sa viscosité^^^’ et peut être à l’origine d’effets biologiques importants^^^l L’exemple le plus connu d’intercalant est celui du bromure d’éthidium^^^’

Figure 1.7 : Exemples de molécules interagissant dans les sillons (a et b) et s’intercalant entre deux paires de bases de l’ADN (c).

1.4. Réaction de petites molécules avec l’ADN

L’activité anti-tumorale d’un certain nombre de petites molécules est basée sur la formation d’un lien covalent avec l’ADN. Un des exemples les plus connus est celui des dérivés du

Chapitre I : Introduction 11

cisplatine, couramment utilisés comme drogues anti-tumorales. Ces substances peuvent réagir dans le noir et se lier à deux guanines adjacentes de l’ADN, inhibant ainsi son expression et sa réplicatW“''’^'’l.

Le psoralène par contre ne réagit avec l’ADN que sous l’action de la lumière. Cette molécule, utilisée dans le traitement de certaines maladies dermatologiques, forme des photoadduits sur l’ADN sous l’action des ultraviolets, inhibant de cette façon la réplication et la transcription de celui-ci^*’

Cependant, ces substances ne présentent généralement que peu ou pas de sélectivité de réaction sur le polynucléotide. Il est dès lors impossible d’inhiber sélectivement l’expression d’un gène défectueux.

1.5. Les stratégies antisens et antigène

L’utilisation d’oligonucléotides synthétiques capables d’interagir avec des séquences spécifiques d’ADN ou d’AKN constitue une stratégie très prometteuse dans le traitement des cancers. Les interactions de ces oligonucléotides synthétiques avec les polynucléotides naturels reposent sur la formation de ponts hydrogène avec les acides nucléiques cibles. Une séquence bien déterminée de l’oligonucléotide permet de reconnaître un polynucléotide cible et de s’associer spécifiquement avec celui-ci.

StFBLtégie antisens Stratégie eoatigène

Figure 1.8 : Représentation schématique des stratégies antisens et antigène.

La stratégie antisens consiste en un blocage de l’expression génétique au niveau de la traduction de TARN messager. Cet effet résulte de la formation d’une double hélice entre l’oligonucléotide synthétique et l’ARN messager via la formation de ponts hydrogène de type Watson-Crick^''*’

Plusieurs facteurs entrent en jeu lors de l’inhibition de l’expression génétique par im oligonucléotide antisens^^'^'^l En effet, la formation de la double hélice empêche l’interaction des ribosomes avec l’ARN messager, ce qui inhibe la traduction de ce dernier en protéine. De plus, la formation du duplexe "ARN messager-oligonucléotide" est reconnue par des enzymes cellulaires, qui hydrolysent l’ARN messager.

En 1998, le Vitravene a été approuvé comme premier oligonucléotide antisens pour une utilisation thérapeutique^**^’Ce 21-mer, de séquence 5’-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG- 3’, possède un squelette phosphorothioate, ce qui lui confère une résistance contre la dégradation par les nucléases^**^^. Le Vitravene est utilisé comme agent anti-viral dans le traitement de patients atteints du SIDA. De nombreux autres oligonucléotides antisens sont aujourd’hui évalués en phase clinique pour une éventuelle utilisation contre les cancers et diverses maladies virales^****l

La stratégie antigène consiste en un blocage de l’expression génétique au niveau de la transcription. La formation d’une triple hélice entre l’oligonucléotide synthétique et une séquence spécifique d’un ADN double brin inhibe en effet la transcription de l’ADN en ARN messager. La formation d’une triple hélice implique des ponts hydrogène de type Hoogsteen^^’’ formés dans le grand sillon de la double hélice d’ADN.

TAT GGC

dR

H

Figure 1.9 : Représentation de deux exemples de liens hydrogène de type Hoogsteen ; dR représente l’attachement des groupements sucre-phosphate.

Chapitre I : Introduction 13

Le désavantage des stratégies antisens et antigène réside dans le fait que la formation de la double ou triple hélice est réversible. L’oligonucléotide synthétique peut donc se déshybrider de sa cible, ce qui annule l’effet d’inhibition de cette drogue sur l’expression génétique.

Il apparaît dès lors intéressant de combiner l’avantage de la sélectivité d’interaction des oligonucléotides avec la réactivité d’une autre drogue capable de former des liens covalents avec l’ADN.

IL Les complexes polypyridiniques du Ruthénium (II)

Dans le cadre de l’étude de complexes métalliques pouvant photoréagir avec l’ADN et mener ainsi à leur utilisation comme drogue anti-tumorale, la famille des complexes polypyridiniques du Ruthénium (II) figure certainement parmi une des plus prometteuses.

L’intérêt de ces composés vient en partie de la grande modularité de leurs propriétés photophysiques et photochimiques en fonction des ligands chélatés au centre métallique^'^’

53]_

II.l. Propriétés photophysiques

Les ions Ruthénium (II) peuvent être chélatés à trois ligands polypyridiniques bidentés, menant ainsi à la formation de complexes de coordinence six et de géométrie octaédrique. Le recouvrement des six orbitales vides d

sps du Ruthénium (II) avec les six orbitales sp

contenant les doublets non-liants des azotes des ligands est à la base de la liaison coordinative. La liaison est stabilisée par une composante rétrocoordinative, issue de la délocalisation partielle des électrons du métal dans le système :t* des ligands.

Les orbitales moléculaires formées lors de la complexation peuvent être décrites par une combinaison linéaire des orbitales atomiques du métal et des orbitales moléculaires des ligands. L’état fondamental de la configuration électronique résultante est (djt)^. La figure

1

.

.b. représente les états électroniques excités pouvant être atteints suite à l’absorption d’un

photon^^‘*l

E n

LC MC • MLCT-

GS

A

(jti)’ (jti*)' (djtn.)' (da„*)‘

(d:t„,)^ (jti*)’

(djin^r

(b) Figure I.IO : (a) Diagramme des niveaux d’énergie des principales orbitales moléculaires d’un complexe de type [Ru(bpy)

]^^. (b) Niveaux d’énergie de l’état fondamental et des états excités atteints suite aux différentes transitions électroniques.

Selon la nature des orbitales moléculaires impliquées, les transitions électroniques peuvent être classées selon trois types*^^^^.

- Les transitions centrées sur les ligands (LC : Ligand Centered) :

Jii*

Ces transitions observées dans TUV correspondent à la promotion d’un électron d’une orbitale liante Jtj centrée sur le ligand vers une orbitale Jii* également centrée sur le ligand.

Ces transitions, peu affectées par la complexation et donc similaires à celles du ligand libre, sont caractérisées par des coefficients d’absorption molaires très élevés (

= 10^ M'^ cm'*).

- Les transitions centrées sur le métal (MC : Métal Centered) : djt„ -* do„*

Ces transitions impliquent des orbitales centrées sur le métal et ont des probabilités de transition très faibles (

« 100 M'* cm'*). De ce fait, ces transitions apparaissant à des longueurs d’ondes inférieures à 400 nm, ne sont que très rarement observables.

- Les transitions de transfert de charge du métal vers un ligand (MLCT : Métal to Ligand Charge Transfer) : djtm —*■

*

Ces transitions correspondent au transfert d’un électron d’une orbitale djim centrée sur le métal vers une orbitale n;i* centrée sur un ligand. Les transitions MLCT peuvent être considérées comme un processus d’oxydo-réduction intramoléculaire, l’oxydation du métal étant accompagnée de la réduction du ligand. Ces transitions, observées dans le visible, présentent des coefficients d’absorption molaires assez intenses ( e ® 2 10'* M'* cm'*).

Chapitre I ; Introduction 15

II.2. Schéma photophysique

Le schéma photophysique établi pour le [Ru(bpy)

]^"^, présenté à la figure 1.11., est généralement admis pour la majorité des complexes polypyridiniques du Ruthénium

'MLCr

Figure I.l 1 : Schéma photophysique du [Rufbpyls]^^.

L’absorption de lumière dans le domaine des longueurs d’ondes du visible mène au peuplement d’un état 'MLCT. Cet état se désactive rapidement par "intersystem Crossing"

(ISC) vers un état excité de plus basse énergie, l’état ^MLCT. Cette conversion singulet- triplet, favorisée par la présence d’im atome lourd, se fait dans une échelle de temps de l’ordre de 300 femtosecondes^^^^ avec un rendement quantique unitaire^^^l Cet état peut ensuite se désactive^de plusieurs manières^^^^ :

- La désactivation radiative :

La désactivation radiative vers l’état fondamental par émission d’un photon est à l’origine de l’émission des complexes dans le domaine du visible.

- La désactivation non radiative :

Ce processus, correspondant à la dissipation d’énergie sous forme de chaleur au milieu

environnant, est généralement la voie de désactivation principale de l’état ^MLCT et contrôle

donc les durées de vie de l’état excité des complexes.

- Le passage à l'état excité ^MC :

L’état ^MC, peuplé thermiquement à partir de l’état ^MLCT, peut se désactiver non radiativement vers l’état fondamental. D’autre part, l’occupation d’une orbitale antiliante dom* par l’électron excité peut déstabiliser la liaison coordinative et conduire à la déchélation partielle du complexe^^®’

II.3. Propriétés électrochimiques à l’état fondamental et à l’état excité

A l’état fondamental, l’oxydation d’un complexe polypyridinique du Ruthénium (II) correspond à l’arrachement d’un électron d’une orbitale dn;m centrée sur le métal^^^l Le potentiel d’oxydation Ru(II)/Ru(III) dépend du caractère a-donneur ou :;r-accepteur des ligands complexés au centre métallique. Ainsi, un complexe constitué de ligands a-donneurs, dont les doublets non liants des azotes sont disponibles, voit son niveau dncm déstabilisé, ce qui facilite l’oxydation du complexe. La réduction d’un complexe correspond quant à elle à l’ajout d’un électron dans une orbitale antiliante Jii* d’im des ligands^^^l Dans ce cas, l’addition de l’électron est facilitée sur des ligands fortement jr-accepteurs.

A l’état excité, les propriétés oxydantes et réductrices des complexes sont exaltées^^^’Les potentiels d’oxydo-réduction correspondants peuvent être évalués à partir des potentiels à l’état fondamental et de l’énergie de la transition AEo-o.

Eox* = Eox -

AEo-0

Le passage de l’état fondamental à l’état excité peut donc activer des complexes vis-à-vis de réactions d’oxydo-réduction, alors qu’ils sont inertes à l’état fondamental. Le développement de molécules donnant lieu à des réactions d’oxydo-réduction photo-induites pourrait mener à leur utilisation comme agents thérapeutiques photoactivables.

Chapitre I : Introduction 17

III. Les complexes polypyridiniques du Ruthénium (II) et l’ADN

Les complexes polypyridiniques du Ruthénium (II) présentent certaines propriétés qui en font d’excellents candidats pour des études en présence d’ADN :

- une absorption intense dans le visible et une luminescence facilement détectable à température ambiante ;

- une population efficace de l’état excité ^MLCT de longue durée de vie ; cet état excité est très sensible à l’environnement et plus réactif pour des réactions d’oxydo-réduction que l’état fondamental ;

- une bonne stabilité thermique ;

- une grande diversité des ligands disponibles qui permet de moduler les propriétés du composé en fonction de l’application désirée ;

- une charge positive 2+ qui favorise leur interaction avec l’ADN.

L’interaction d’un complexe polypyridinique du Ruthénium (II) peut donner lieu aux mêmes géométries d’association avec l’ADN que celles présentées précédemment avec de petites molécules. Cette interaction avec l’ADN s’accompagne de modifications des propriétés spectroscopiques du complexe^^^"^^ et des propriétés physiques du polynucléotide^^^’ Ces modifications constituent des moyens d’étude de l’association "complexe-ADN", même s’il n’est pas toujours possible de déterminer la nature de cette association.

La géométrie d’interaction adoptée dépend néanmoins fortement des ligands chélatés au centre Ruthénium (II). Le [Ru(bpy)

]^'^, dont les propriétés ne sont que faiblement perturbées par l’ADN, interagit essentiellement à l’extérieur de la double hélice, avec le squelette polyphosphate^^^’ L’association du [Ru(tmp)

]^‘^ (tmp = tétraméthylphénanthroline) par exemple, a été localisée au niveau des sillons de l’ADN. L’encombrement stérique provenemt des groupements méthyles est à l’origine de la reconnaissance, par ce complexe, des sillons mineurs larges et peu profonds de l’ADN-A^’^’

D’autres complexes, portant un ligand aromatique plan étendu comme le dppz*^’*^’’^^ ou le

PHEHAT^^^’ sont capables de s’intercaler entre deux paires de bases de l’ADN et

présentent de ce fait une affinité très élevée pour les polynucléotides.

Association externe

|Ru(bpyhl'^

Cil,

.Absorption dans^

un sillon

tii, |Ru(TMP)]|’

lui rralation

|L . .S'IIMIAII

Figure 1.12 : Les différentes géométries d’interaction entre les complexes polypyridiniques du Ruthénium (II) et l’ADN.

III. 1. Les complexes à base des ligands TAP et HAT

Notre laboratoire a consacré une part importante de ses recherches à l’étude de complexes fortement oxydants à Tétat excité, comportant des ligands Jt-défîcients TAP (TAP = 1,4,5,8- tétraazaphénanthrène) et HAT (HAT = I,

,

,

,

,

-hexaa

atriphénylène).

TAP HAT

Figure 1.13 : Ligands TAP (TAP = 1,4,5,8-tétraazaphénanthrène) et HAT (HAT = 1,4,5,8,9,12- hexaazatriphénylène).

Certains complexes du Ruthénium (II), comportant au moins deux ligands TAP ou HAT, sont fortement oxydants à l’état excité, et dès lors capables d’induire un transfert d’électron au départ des guanines de l’acide nucléique^^®’ Ce transfert d’électron photo-induit peut

Chapitre I : Introduction 19

ensuite mener au clivage d’un brin d’ADN^^^’ ou à la formation d’un adduit sur le polynucléotide^^^’ Le photoadduit résulte d’ime réaction de couplage entre les espèces radicalaires issues du transfert d’électron photo-induit.

L’adduit du [Ru(TAP)

bpy]^^ sur l’ADN de thymus de veau a pu être isolé après digestion enzymatique du polynucléotide et sa structure a été déterminée (figure 1.14.) par La structure qui a été déterminée est équivalente à celle mise en évidence pour le [Ru(TAP)

] ayant photoréagi avec le mononucléotide GMP (guanosine-5’-monophosphate)^*^l

A B

Figure 1.14 : A ; Structure d’un des deux isomères de géométrie du photoadduit du [Ru(TAP)

bpy]^’^ sur la guanine, obtenu après digestion enzymatique de l’ADN. B : Structure du photoadduit du [Ru(TAP)

]^’^ sur la GMP, après hydrolyse acide = Ru^’^).

Les complexes photoréactifs que nous venons d’évoquer ne présentent cependant pas de spécificité pour une séquence d’ADN bien déterminée. Il est dès lors intéressant de combiner la photoréactivité d’un tel complexe avec la sélectivité d’interaction d’un oligonucléotide synthétique.

III.2. Les complexes ancrés sur oligonucléotides

Afin de combiner les avantages des complexes photoréactifs avec ceux des oligonucléotuies

synthétiques, il est possible d’ancrer chimiquement un complexe sur un

oligodésoxyribonucléotide. Cette stratégie nécessite la préparation d’un complexe

fonctionnalisé qui réagit avec une base modifiée présente dans l’oligonucléotide pour former

une entité appelée "conjugué oligonucléotide-complexe" ou plus simplement "conjugué". Un exemple étudié au sein de notre laboratoire est représenté à la figure 1.15.

3.5, A T T A T A T A A T

^ CG

NH—(CH2)j-T*A A T T A T A T A T A T A T A T A

5’ 3’

Figure 1.15 : Conjugué oligonucléotide-complexe en présence de sa séquence cible, étudié dans notre laboratoire

(®=Ru^^).

Le complexe choisi comporte un ligand fonctionnalisé par une chaîne aliphatique se terminant par un groupe Celui-ci, après activation, forme un lien amide avec le groupe NH

d’une thymine modifiée de l’oligonucléotide synthétique^*^’

La reconnaissance de la séquence cible se fait par hybridation de l’oligonucléotide sonde fonctionnalisé avec la séquence complémentaire. Cette reconnaissance moléculaire par appariement de bases A:T et G:C assure la sélectivité du composé pour une séquence de bases particulière. Le recours aux stratégies antisens ou antigène pourrait de cette façon permettre l’usage de ces complexes comme agents thérapeutiques.

Ainsi, le complexe utilisé lors de ces études, le [Ru(TAP)

(dip(CH

)

COOH)]^^, a été fixé à différentes séquences d’oligonucléotides et étudié en présence des séquences cibles correspondantes. Ces études ont montré que le complexe fixé sur l’oligonucléotide sonde peut former un photoadduit avec une guanine de l’oligonucléotide cible proche du site d’ancrage du complexe^*'^*^^ Il a aussi été clairement montré que la formation de ce photoadduit correspond à un "photocrosslinking" irréversible des deux brins d’oligonucléotides.

Il apparaît dès lors intéressant d’étendre ces études à d’autres complexes polypyridiniques du Ruthénium (II) afin d’améliorer le système présenté ci-dessus.

Chapitre I : Introduction 21

IV. But du travail

Notre travail s’insère dans le cadre du développement de complexes polyazaaromatiques du Ruthénium (II) capables de photoréagir avec les guanines de l’ADN. Dans ce domaine, l’attention s’est jusqu’ici portée sur l’étude des complexes à base du ligand TAP, bien que ceux-ci ne présentent qu’une faible affinité pour les polynucléotides. L’utilisation du ligand HAT, quant à elle, devrait conférer aux complexes une affinité plus élevée pour les acides nucléiques, tout en conservant une photoréactivité intéressante. De plus, l’utilisation du ligand phen, facilement dérivatisable, pourrait mener à un autre type de "linker" ancré sur oligonucléotide que celui étudié précédemment avec le dip.

(a) (b)

Figure 1.16 : Structures du [Ru(HAT)

phen]^’' (a) et du [Ru(HAT)

phen’]^'’ (b) (® = Ru^’^).

Notre travail est donc consacré à la synthèse et la purification des deux complexes cibles, [Ru(HAT)

phen]^’^ et [Ru(HAT)

phen’]^'^ (phen’ = acide 5-amido-l,10-phénanthroline- glutarique), et, dans un deuxième temps, à une étude approfondie de ceux-ci en milieu aqueux afin de comparer leurs propriétés spectroscopiques.

Par la suite, l’étude de l’interaction des deux complexes avee des polynucléotides et la

détermination des constantes d’affinité correspondant à ces associations ont été réalisées. Ceci

a permis un examen plus approfondi des géométries d’association du [Ru(HAT)

phen] avec

l’ADN.

De plus, une étude de la photoréactivité du [Ru(HAT)

phen]^'^ a été menée en présence de mono- et de polynucléotides, pour déterminer le type de photoadduit pouvant être formé.

L’étude de la structure de l’im de ces photoadduits a été réalisée par spectroscopie RMN.

En parallèle, les premiers tests d’ancrage du [Ru(HAT)

phen’]^’^ sur oligonucléotide ont été effectués dans le Laboratoire d’Etudes Dynamiques et Structurales de la Sélectivité du Professeur Pascal Dumy à Grenoble.

Chapitre I ; Introduction 23

Chapitre II : Synthèse et caractérisation

I. Introduction

Les recherches menées au sein de notre laboratoire ont montré, lors des dernières années, que des complexes du Ruthénium (II) portant au moins deux ligands fortement jr-déficients, tels que le TAP (1,4,5,8-tétraazaphénanthrène) ou le HAT ( 1,4,5,8,9,12-hexaazatriphénylène), peuvent former des photoadduits avec les guanines de TADN^’*’ Cependant, l’interaction, et de ce fait la photoréaction, du complexe de Ruthénium (II) avec l’ADN n’est pas spécifique d’une séquence de bases particulière. Dès lors, le photoadduit peut se former sur toutes les guanines d’un brin d’ADN. Dans le but de cibler une guanine bien précise, notre laboratoire a réalisé l’ancrage d’un complexe du Ruthénium (II) sur un oligonucléotide synthétique^*"*’ ce qui permet de diriger la photoréaction du complexe sur une guanine d’une séquence spécifique. Le [Ru(TAP)

(dip(CH

)

COOH)]^'^ a ainsi été fixé à différentes séquences d’oligonucléotides sondes et a été étudié en présence des séquences cibles correspondantes. Ces études ont montré que le complexe fixé sur l’oligonucléotide sonde peut former un photoadduit avec une guanine de l’oligonucléotide cible proche du site d’ancrage du complexe. Dans ce système, l’oligonucléotide synthétique est capable de s’hybrider à sa séquence complémentaire et de diriger ainsi la photoréaction du complexe sur une guanine de cette séquence cible.

Dans le but d’ancrer ultérieurement le [Ru(HAT)

phen’]^^ (phen’ = phenNHCO(CH

)

COOH) sur des oligonucléotides synthétiques, nous avons synthétisé ce complexe et en avons étudié la photophysique. Ce complexe a été choisi parce qu’il devrait répondre à trois critères importants pour ces études. Tout d’abord, le ligand plan étendu HAT devrait conférer au complexe une affinité nettement plus élevée pour les polynucléotides que celle observée pour le [Ru(TAP)

(dip(CH

)

COOH)]^^. Ensuite, ce ligand est également fortement ;jr-déficient, ce qui devrait permettre au complexe de photoréagir avec les guanines de l’ADN. Enfin, le ligand phen est facilement dérivatisable en phen’ pour un ancrage sur oligonucléotide.

En parallèle, nous avons synthétisé le [Ru(HAT)

phen]^‘^ afin de comparer le comportement photophysique de ces deux complexes, de même que leur comportement en présence de

Chapitre II : Synthèse et caractérisation 24

polynucléotides, et de mener une étude approfondie du type de photoréactions possibles avec le [Ru(HAT)

phen]^’^.

I.l. Stratégie de synthèse

La première étape de synthèse de complexes du type [Ru(L)

L’]^"^ consiste généralement en la complexation de deux ligands L sur le centre métallique. Cette méthode ne peut cependant pas être appliquée au [Ru(HAT)

phen]^^ ni au [Ru(HAT)

phen’]^’^. En effet, les deux ligands L identiques sont, dans les deux complexes visés, des ligands HAT. Comme ce ligand symétrique comporte non pas un, mais trois sites de chélation, cette première étape s’accompagnerait de la formation de polymères. Pour éviter celle-ci, nous avons choisi de commencer la synthèse par l’ajout d’un ligand phen (ou phen’) sur le centre métallique.

Lors de la deuxième étape de synthèse, l’ajout d’un excès de ligand HAT permettra de minimiser la formation d’oligomères de Ruthénium.

II. Synthèse

11.1. Synthèse du HAT ( 1,4,5,8,9,12-hexaazatriphénylène)

Le ligand HAT, fourni par le laboratoire, a été synthétisé selon le mode opératoire décrit dans la littérature^*^’

13.5-trichlorobenzène

1.4.5,8.9,12-hexaazatri phénylène (HAT)

Hexaami nobenzène

Figure II. 1 : Schéma de synthèse du ligand HAT.

II.2. Synthèse duphen’ (acide 5-amido-I,I0-phénanthroIine-gIutarique)

La synthèse de l’acide 5-amido-l,10-phénanthroIine-glutarique, appelé phen’, est réalisée selon le mode opératoire représenté à la figure

Figure II.2 : Schéma de synthèse du ligand phen’.

Pour la synthèse de la 5-nitro-l,10-phénanthroline, la 1,10-phénanthroline libre est mise en présence d’acide nitrique concentré et réagit par substitution électrophile aromatique sur la positon 5. Les autres positions de la 1,10-phénanthxoline sont désactivées pour cette réaction parce qu’elles appartiennent à des cycles pyridiniques jt-déficients. Le produit souhaité est obtenu avec un rendement de 81 %.

La réduction du groupement nitro par l’hydrate d’hydrazine en présence d’un catalyseur (Pd/C) fournit la 5-amino-1,10-phénanthroline avec un rendement de 78 %.

L’acide 5-amido-l,10-phénanthroline-glutarique est synthétisé avec un rendement de 56 % par condensation de la 5-amino-1,10-phénanthroline sur un acide activé, l’anhydride glutarique.

II.3. Synthèse du [Ru(phen)X

]^^ et du [Ru(phen’)X

]^^ (X = H

O, Cf)

La synthèse des précurseurs métalliques monochélatés a été réalisée selon le mode opératoire décrit par L. Jacquet^^^l Le ligand phen (ou phen’) est mis en présence de RuCls dans une solution HCl IN. Après une demi-heure d’agitation, il est laissé dans le noir pendant un mois.

Chapitre II : Synthèse et caractérisation 26

II.4. Synthèse du [Ru(HAT)

phen]^"^ et du [Ru(HAT)

phen’]^'^

Les composés obtenus après réaction avec le RuCh sont ajoutés à une suspension de HAT dans de Téau préalablement chauffée. Le milieu réactioimel est maintenu à reflux jusqu’à ce que le spectre d’absorption n’évolue plus. Les complexes obtenus sont ensuite purifiés sur une colorme échangeuse de cations Séphadex SP-C25.

Les complexes ainsi préparés ont été caractérisés par résonance magnétique nucléaire du proton.

III. Caractérisation des complexes par RMN du proton

111.1. Caractérisation des complexes précurseurs monochélatés

La caractérisation des complexes précurseurs monochélatés a été réalisée par RMN ’H et COSY L’attribution des différents pics aux protons de la phénanthroline a été réalisée par comparaison aux spectres RMN des ligands libres et d’autres complexes du Ruthénium (II) à base du ligand phen. Pour les complexes monochélatés, les protons des ligands subissent généralement un effet déblindant dû à la chélation du ligand au centre Ru .

Dans le spectre RMN du [Ru(phen)X

]^^ (X = H

O, Cf) (figure H.3.), on peut effectivement voir que les déplacements chimiques du ligand phen sont déplacés vers les champs faibles par rapport aux déplacements chimiques du ligand libre.

Figure 11.3 : Spectre RMN'H du [Ru(phen)X

]^’^ relevé à 300 MHz dans le DMSO-cL.

Attribution Ligand phen libre ô (ppm)^’’^

[Ru(phen)X4]

ô (ppm)

H2,9 9,13 9,28 et 9,26

H4,7 8,40 8,98 et 8,95

H s

7,92 8,29

H3,8 7,69 8,15 et 8,12

Tableau II. 1 : Effet déblindant de la complexation sur le déplacement chimique des protons du ligand phen.

L’attribution des protons aux différents signaux du spectre RMN du [Ru(phen’)X

]^^ n’a pas été aussi facile que celle du [Ru(phen)X

]^^. En effet, le spectre de corrélation COSY 'H-’H observé pour le [Ru(phen’)X

]^'^ indique que cette synthèse a mené à un mélange de produits.

Le lien amide contenu dans le ligand phen’ pouvant être hydrolysé en milieu acide, nous observons non seulement des signaux RMN dus aux protons du [Ru(phen’)X

]^'^, mais aussi des signaux qui pourraient correspondre au [Ru(phenNH

)X

]^^. Nous avons donc synthétisé le [Ru(phenNH

)X

]^'^ pour identifier clairement les déplacements chimiques des protons de cette molécule et les différencier des déplacements chimiques des protons du [Ru(phen’)X

]^^

Attribution Ligand phen’

libre ô (ppm)

[Ru(phen’)X4]^^

ô(ppm)

Ligand phenNH

libre ô (ppm)

[Ru(phenNH2)X4]^^

à (ppm)

NHCO 10,12 10,44 / /

H2,9 9,12 et 9,03 9,33 et 9,20 9,05 et 8,68 9,30 et 9,05 H4,7 8,61 et 8,44 9,11 et 9,08 8,67 et 8,04 8,86 et 8,80

H6 8,18 8,60 6,86 7,10

H

7,82 et 7,73 8,22 et 8,19 7,73 et 7,50 8,12 et 8,06

NH

/ / 6,12 6,28

CH,-COOH 2,58 2,65 / /

NHCO-CH

2,36 2,36 / /

CH2-CH?-CH2 1,91 1,91 / /

Tableau II.2 : Effet déblindant de la complexation sur le déplacement chimique des protons des ligands phen’ et phenNH

dans le DMSO-de.

La synthèse du [Ru(HAT)

phen’]^'^ a néanmoins été réalisée à partir de ce mélange de produits, vu la difficulté à séparer des complexes monochélatés de ce type.

Chapitre II : Synthèse et caractérisation 28

III.2. Caractérisation des complexes trischélatés par résonance magnétique nucléaire du proton

La figure II.4. présente le spectre RMN obtenu pour le [Ru(HAT)

phen]^'^ et le tableau II.3. en fournit l’interprétation. L’attribution des signaux aux différents protons du [Ru(HAT)

phen]^'^

a été réalisée par comparaison avec la littérature^^^’ et les données RMN ’H des ligands libres. Etant donné la symétrie d’ordre 2 du [Ru(HAT)

phen]^’^, les deux ligands HAT sont équivalents. L’attribution fournie pour le [Ru(HLAT)

phen]^'^ est en accord avec celle proposée précédemment dans la littérature^^’

Figure II.4 : Spectre RMN'H du [Ru(HAT)

phen]^’^ relevé à 600 MHz dans D

O.

Attribution Ligand libre ô(ppm)

Complexe ô(ppm)

Multiplicité J (Hz) Intensité relative

9,29 9,47 s* 4

H“7 9,29 9,20 d A t = 2,9

9,29 9,15 d J

= 2,9

H"4,7 8,40 8,81 dd 3^2,4 ~ =

9,29 8,70 dd J

= 2,9

H»3 9,29 8,49 d J

= 2,9

H" s

7,92 8,36 s

H"2.9 9,13 8,27 dd J

= J^8,9 = 5,3

H"3.8 7,69 7,80 dd J^'3,4 = J

= 8,3

Tableau II.3 : Déplacements chimiques, multiplicités, constantes de couplage et intensités relatives des protons du [Ru(HAT)

phen]^^ en solution dans D

O, à 600 MHz. H”* se réfère aux protons portés par un ligand HAT, H*’x se réfère aux protons portés par le ligand phen. * = isochronie accidentelle ; s = singulet ; d = doublet ; dd = doublet dédoublé.

Dans les complexes trischélatés, le proton adjacent au site de chélation est situé à l’aplomb d’un autre ligand et donc dans la zone de blindage d’un noyau aromatique. Cet effet, plus important que l’effet déblindant décrit ci-dessus, explique que ces protons soient plus blindés que ceux du ligand libre. On remarque en effet que les protons en position a d’un azote complexant sont blindés par rapport aux mêmes protons des ligands libres. Les protons en position P par rapport à l’azote complexant ne subissent quant à eux qu’un faible effet par rapport au ligand libre, qui peut être blindant ou déblindant selon les cas ; les deux effets opposés décrits ci-dessus s’annulent pratiquement pour ces protons. Les autres protons des cycles aromatiques résonnent à champ plus faible que ceux du ligand libre. Ce dernier phénomène est dû, comme nous l’avons déjà mentionné pour les complexes monochélatés, à l’effet déblindant lié à la chélation du ligand au centre Ru .

La caractérisation du [Ru(HAT)

phen]^’^ a également été réalisée par spectrométrie de masse électrospray (figure II.5.).

Chapitre II ; Synthèse et caractérisation 30