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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
van Helden, J. (1995). Analyse fonctionnelle du complexe génique achaete-scute chez Drosophila melanogaster (Unpublished doctoral dissertation).
Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/212582/1/e9717dbf-021e-48c9-a4c0-48c5653df921.txt
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Service de Neurobiologie
Département de Biologie Moléculaire Faculté des Sciences
Université Libre de Bruxelles
Analyse fonctionnelle
du complexe génique aehaete-scute
chez Drosophila melanogaster
s iii
Thèse présentée en vue de
l*obtention du grade scientifique de
Docteur en Sciences Agronomiques
Promoteur de thèse : Alain Ghysen
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
FACULTE DES SCIENCES.
ni, JL J c:
L'épreuve publique pour l'obtention du grade Scientifique de Docteur en Sciences Agronomiques de Monsieur Jacques VAN HELDEN, aura lieu le :
VENDREDI 20 OCTOBRE 1995 à 16.30 HEURES
en la salle Jean Brachet, Campus Rhode-St-Genèse 67 Rue des Chevaux à 1640 - Rhode-St-Genède
Monsieur VAN HELDEN présentera et défendra publiquement une dissertation originale intitulée ;
"Analyse fonctionnelle du complexe génique achaete-scute chez Drozophila melanogaster";
et une thèse annexe intiitulée :
"Une adaptation de la méthode logique généralisée permettra la modélisation des réseaux génétiques impliqués dans la morphogenèse'';
DEFENSE PRIVEE : LUNDI 25 SEPTEMBRE 1995 A 16.30 HEURES Rhode-St-Genèse
Directeur de thèse: M. Alain GHYSEN
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Service de Neurobiologie
Département de Biologie Moléculaire Faculté des Sciences
Université Libre de Bruxelles
Analyse fonctionnelle
du complexe génique acliaete-sciite chez Drosophïla meÊanogaster
ii
Thèse présentée en vue de
(‘obtention du grade scientifique de
Docteur en Sciences Agronomiques
Promoteur de thèse ; Alain Ghysen
Avant d’entamer cet ouvrage, j’aimerais saluer lespersojines qui y ont contribué.
Alain tout d’abord, irremplaçable chercheur et etiseignant.Je ne conruiis personne qui allie à un point aussiparoxystkjiie la curiosité, l’intrayisigeance, l’ouverture au débat et à la remise en question, le goût d’apprendre et de partager son savoir. Sa façon d’être entier en tout, même dans ses légendaires sautes d’humeur, le rendrait totalement insupportable s’il n’y mêlait une botine dose d’humour.
je dois beaucoup à Christine également, qui illustre pour moi la rigueur scientifique. Elle a le chic pour vous confronter à tout moment à la réalité, vous faire tomber de votre sphère
d’élucubrations en vous rappelant une expérience qui ne va justement pas du tout avec votre belle théorie.
J’ai rencontré dans notre laboratoire une ambiance stimulante et une esprit d’équipe et d’entraide que j’ai énormément appréciés.
Merci à toutes les mouches passées, présentes et à veyiir.
Plusieurspersonties ont lu, relu, critkjiié, corrigé ce texte.
Leurs remarques m’ont été précieuses: Alavi, Christine, Fratiçoise, Denis, Eugénie, Michel et Annick.
I am debtful to Akiko and Kazuya who teached me to dissect pupaes, and know better tban atiyone hoiv to stain any tissue with
any antibody.
Merci à Gogo, quia lancé l’impression de la figure 1.14.
Je tiens à exjmmer ma gratitude à l’indispensable Nathalie. Je n’ai pas compris par quel secret elle s’arrange pour que tout se trouve toujours au bon endroit exactement au moment où en a besoin.
C’est une qualité que partagent également Marie-Jeayme et Riri, qui arriveyu à maiyitenir à flot wi secrétariat dayys la tempête des fms de thèse, dates limites de rapports IRSIA-FRIA, et autres
grayids momeyits.
Merci aussi à IDommique et Joseph qui partageyit yios cornées avec tayitde boyme humeur.
Je suis très recoymaissayit eyivers Jeayi Vayi Daele, toujours patient et dispoyiible, qui m’a appris à coyicevoir et réaliser les
circuits électroyikjues. I.e chercheur égaré sait qu’ils trouvera chez lui LOI petit bout de chocolat salvateur.
Durayit les quelques ayoïées que j’ai passées au DEM, j’ai rencoyytré quelques ceyitaiyies de persoyyyies.J’en ai apprécié beauoiip, certames soyit deveymes mes amis, je garderai de moyi passage im riche souveyiir.
Merci à Aymick, pour tout.
Caminante, son tus hiiellas el camino, y nada mâs;
camùiante, no bay camino, se hace camino al andar.
Al amlar se hace camino, y al volver la uista atrâs se ve la senda que nunca se ha de volver a pisar.
Caminante, no bay camnio, sino este las en la mar.
Antonio Macbado
T able des matières
1. I ntroduction : le développement du système nerveux
PÉRIPHÉRIQUE DE LA DROSOPHILE ... 1
1.1. Analyse du développement de la macrochète dorsocentrale postérieure... 2
1.2. But du travail... 21
2. E quivalence fonctionnelle des gènes du complexe achaete - SCUTE POUR LA SPÉCIFICATION DU TRAJET AXONAL...22
2.1. La spécificité individuelle des macrochètes... 22
2.2. Résultats... 23
2.3. Discussion : le complexe achaete-scute et la spécification des macrochètes...28
3. P hénotypes d ' induction d ' organes sensoriels par la lignée HSSC... 31
3.1. Introduction...31
3.2. Résultats... 32
3.3. Discussion : induction d'organes sensoriels par HSSC...34
4. T entative de mise au point d ' une méthode de mesure de L'ACTIVATION TRANSCRIPTIONNELLE DANS LES CELLULES VIVANTES... 38
4.1. Introduction...38
4.2. Système d'imagerie microscopique... 41
4.3. Marquage de la b-galactosidase dans des disques imaginaux en culture... 43
4.4. Marquage de la b-galactosidase dans des cellules dissociées... 44
4.5. Discussion : mesure de l'activation transcriptionnelle dans les cellules vivantes...49
5. D ynamique d ' interaction des gènes proneuraux ... 51
5.1. Définition des conditions expérimentales... 51
5.2. Résultats : la trans-activation d'achaete par seule... 52
5.3. Discussion : interactions génétiques et cellulaires... 55
6. L e rôle d 'EMC DANS LE POSITIONNEMENT PRÉCIS DE LA PSA... 64
7. C ouplage de l ' amplification proneurale et de l ' inhibition MUTUELLE : UN MODÈLE...65
8. D iscussion : un scénario évolutif pour le complexe achaete - scute ... 71
9. A nnexes ... 74
9.1. Analyse génétique du complexe achaete-scute pour chaque macrochète considérée individuellement, et pour les microchètes prises dans leur ensemble...74
9.2. Système d'imagerie microscopique...80
9.3. Publications et abstracts... 90
10. M atériel et méthodes ...91
10.1. Stocks de drosophiles...91
10.2. Thermoinduction de la lignée HSSC...91
10.3. Traçage des axones à la peroxydase...91
10.4. Test fonctiormel de connectivité neuronale... 92
10.5. Montage des ailes... 92
10.6. Marquages vitaux dans les disques imaginaux/cellules dissociées... 92
10.7. Marquage de disques imaginaux et cellules dissociées fixés... 94
11. B ibliographie ... 98
L iste des abréviations
MOI lignée enhancer trap rapportant l'activité de neuralized
ac achaete
ose asense
ATT après traitement thermique
b-HLH domaine protéique basic Flelix-Loop-Helix bca branche commissurale antérieure
bcm branche commissurale majeure
bcmt branche commissurale métathoracique bcp branche commissurale postérieure bla branche longitudinale antérieure bip branche longitudinale postérieure CAS complexe achaete-scute
CMOS cellule-mère d'organe sensoriel
Dl Delta
FDG fluorescéine-di-galactose FP formation de la pupe HSSC heat-shock scute l'sc léthal of scute
N Notch
SC scute
SNC système nerveux central Macrochètes
a, pDC antérieure, postérieure dorsocentrale
a, pNP antérieure, postérieure notopleurale
a, pPA antérieure, postérieure postalaire
a, pSA antérieure, postérieure supraalaire
a, pSC antérieure, postérieure scutellaire
PS présuturale
Résumé
Le complexe achaete-scute comporte quatre gènes homologues {achaete, scute, asense et léthal of scute), qui jouent un rôle essentiel dans la formation du système nerveux. Ces gènes sont exprimés durant le développement embryonnaire et larvaire, dans des groupes de 6 à 30 cellules précisément localisés. De chaque groupe émerge une cellule à expression renforcée, qui devient précurseur neural. La singularisation du précurseur au sein du groupe repose sur un mécanisme d'inhibition mutuelle entre les cellules du groupe. Les précurseurs neuraux sont de deux types: les neuroblastes engendrent les neurones du système nerveux central, et les cellules-mères d'organe sensoriel (CMOS) génèrent les organes sensoriels constituant le système nerveux périphérique. Les mutations du complexe achaete-scute provoquent une diminution du nombre de précurseurs neuraux, et par conséquent du nombre de neurones centraux ou d'organes sensoriels. On a donc attribué à ces gènes le nom de proneuraux, et on appelle les groupes de cellules où ils s'expriment groupes proneuraux.
Chaque gène proneural intervient dans la détermination d'un sous-ensemble des précurseurs. En particulier, les soies mécanosensorielles qui couvrent le dos de la mouche adulte dépendent de deux gènes: achaete et scute. Le pattern de ces soies est reproductible: plus ou moins 200 petites soies (microchètes) régulièrement espacées recouvrent la majorité de la surface dorsale du thorax, et 22 grandes soies (macrochètes) occupent des positions précisément définies. Chacune de ces soies est innervée par un neurone bipolaire, dont l'axone rejoint le système nerveux central et s'y ramifie. L'axone de chaque macrochète suit au sein du système nerveux central un trajet déterminé (la projection centrale), dépendant de la position de l'organe à la surface du corps. On peut ainsi distinguer les projections centrales des macrochètes antérieures vs postérieures, ou centrales vs latérales. Une autre distinction entre les macrochètes individuelles est leur dépendance vis-à-vis d'achaete (pour les macrochètes centrales) ou de scute (pour les macrochètes latérales). Nous avons testé si la spécification du trajet axonal des macrochètes était liée à leur dépendance vis-à- vis de l'un ou l'autre des gènes proneuraux. Pour ce faire, nous avons comparé les projections centrales de différents mutants du complexe achaete-scute. Nous avons notamment étudié la projection de soies dorsocentrales (dépendant normalement d'achaete) formées en surexprimant scute chez des mouches mutantes pour achaete.
Les projections de ces soies sont normales en dépit de l'absence d'achaete. En aucun
cas, nous n'avons pu détecter de modification du trajet axonal liée à une déficience
d'un gène du complexe (nous avons testé des déficiences d'achaete, scute, et asense
respectivement): quand une soie est formée en une position donnée, elle établit sa
Jacques van Helden 5 Septembre 1995 Résumé
projection suivant le trajet approprié, indépendamment du gène proneural qui l'a formée. La spécificité axonale ne dépend donc pas des gènes proneuraux.
Nous avons ensuite étudié les interactions entre les gènes proneuraux. Les gènes du complexe achaete-scute et scute codent pour des facteurs transcriptionnels. Leurs produits reconnaissent des séquences spécifiques d'ADN, s'y fixent et activent l'expression de régions codantes avoisinantes. On sait c\a'achaete et scute ont chacun la capacité d'activer leur propre expression, et de s'activer réciproquement. Cette capacité n'est cependant pas mise à profit dans toutes les cellules exprimant l'un ou l'autre gène : in vivo, l'activation réciproque semble limitée à la future CMOS, à l'exclusion des autres cellules du groupe proneural. Au moyen d'une lignée thermoinductible permettant d'exprimer scute transitoirement dans toutes les cellules, nous avons étudié la dynamique d'activation à'achaete par scute dans les disques imaginaux.
Cette étude montre d'une part que l'activation d'achaete par scute n'a pas lieu dans
toutes les cellules du disque imaginai : certaines régions sont réfractaires à
l'activation, vraisemblablement sous l'action de protéines inactivant le produit de
scute. D'autre part, on constate que l'activation d'achaete par scute n'est pas
intrinsèquement limitée aux cellules-mères : dans certaines régions du disque, toutes
les cellules expriment transitoirement achaete sous l'action de scute. Cette expression
n'est maintenue (et renforcée) que dans quelques cellules isolées, qui deviendront
vraisemblablement les CMOS. Un modèle est déduit de ces résultats, selon lequel
l'inhibition mutuelle agirait par inactivation posttraductionnelle des protéines
proneurales.
Figure 1.1
1. Introduction : le développement du système nerveux périphérique de la drosophile
Et si on prenait le temps de regarder une mouche ? Une mouche à vinaigre, par exemple, Drosophila melanogaster. Ce minuscule insecte qui passe le plus clair de son temps à voleter autour des fruits en décomposition pourrait mériter quelques moments d'attention (figure I.IA). On pourrait même la regarder d'un peu plus près, et nous attarder à lui compter les soies. Car elle est couverte de soies cette mouche, sur la tête, les pattes, l'abdomen, et le thorax. Sur le thorax (figure I.IB), on distingue deux types de soies : les petites (microchètes) sont régulièrement espacées, plus ou moins alignées en rangées antéro-postérieures; les grandes soies (macrochètes), occupent différentes positions sur le dos, sans logique apparente. Pourtant, en comparant plusieurs mouches, on réalise que la disposition des macrochètes est totalement reproductible : elles sont en nombre constant (11 de chaque côté du thorax) et occupent des positions précisément définies. Quoiqu'à première vue anecdotique, cet arrangement défini des soies de mouche nous confronte à l'une des principales questions de la biologie du développement : quels sont les mécanismes qui assurent, au cours de l'ontogenèse, la différenciation des cellules suivant une disposition (pattern) invariante pour une espèce donnée. Dans le cas des soies de drosophile, cette question a été abordée dans les années trente par les généticiens russes du groupe de Serebrovski, qui ont étudié les mutations provoquant une variation de leur pattern. Cette analyse génétique se poursuit encore actuellement, solidement épaulée depuis deux décennies par l'analyse moléculaire. Si l'on a avancé dans la compréhension des étapes et mécanismes régissant la formation du pattern, on est toujours loin d'en connaître tous les éléments.
Mais avant de vouloir comprendre comment un ensemble s'organise, il vaut peut- être la peine de se pencher sur un seul de ses éléments. Si on y regardait de tout près maintenant, pour nous focaliser sur une seule des macrochètes, celle du milieu du dos par exemple, qu'on appelle dorsocentrale postérieure (pDC, Figure I.IC).
Figure 1.1 : la mouche à vinaigre. A ; Drosophila melanogaster. vue d'ensemble. B : zoom sur le thorax. Les noms des macrochètes sont indiqués (pour le nom complet, voir la liste des
abréviations ci-dessus). Les trois noms entre parenthèses indiquent la position de macrochètes hors foyer. La région encadrée en blanc comprend la macrochète dorsocentrale postérieure (pDC) et quelques microchètes. C : gros plan sur la région dorsocentrale postérieure (encadré blanc en B). La flèche épaisse indique la soie de la pDC. La petite flèche indique son soquet.
Mettons-nous pour quelques instants dans la peau de cette soie. Qui est-elle ? Comment est-elle constituée ? Quel est son environnement direct ? Quelle est sa fonction ? Et surtout, quelle est l'histoire de sa vie ? Comment est-elle arrivée à se
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1
-Jacques van Helden 5 Septembre 1995 Développement du système nerveux
différencier au cours du développement de la mouche ? Et pourquoi est-elle localisée précisément au même endroit chez toutes les mouches ?
1.1. ANALYSE DU DÉVELOPPEMENT DE LA MACROCHÈTE DORSOCENTRALE POSTÉRIEURE
L'analyse d'une seule soie nous permettra d'aborder la plupart des thèmes intervenant dans la formation du pattern. On doit naturellement se demander si cette focalisation extrême n'est pas réductrice : en limitant trop notre champ de vision, ne risquons-nous pas de passer à côté des mécanismes mêmes qui nous intéressent ? Nous pensons au contraire éviter par cette approche le piège d'une généralisation abusive : comme nous le verrons, les macrochètes sont bien différentes les unes des autres, et notamment en ce qui concerne leur développement. Par ailleurs, l'analyse génétique a fourni pour l'ensemble des soies une masse impressionnante d'informations, dont le volume, outre son côté rébarbatif, risque de noyer les informations essentielles à la compréhension des mécanismes. En nous concentrant sur une seule soie, nous nous donnons une chance d'intégrer, pour celle-là seulement, mais au moins pour elle, toute l'information disponible.
L'hyperspécialisation de cette étude nous permettra peut-être d'approfondir notre analyse pour démêler l'écheveau d'un réseau régulatoire remarquablement complexe.
Nous nous proposons donc de réaliser une revue de la biologie et du développement de la macrochète dorsocentrale postérieure. A chaque étape, nous mentionnerons brièvement le cas d'autres soies (ou des organes homologues) pour souligner ce qui distingue ou rapproche la pDC de ses consoeurs.
La pDC est un organe mécanosensoriel
La pDC est un organe mécanosensoriel, sensible aux stimulations tactiles. Pour s'en convaincre, il suffit de faire bouger la soie d'avant en arrière, au moyen d'une pincette. Après quelques allers-retours de la soie, la mouche se frotte vigoureusement le dos, à l'endroit stimulé, au moyen de la patte postérieure (Vandervorst & Ghysen, 1980). Notre macrochète est donc le premier maillon d'une chaîne réflexe.
Cette expérience demande évidemment une certaine complaisance de la part de la mouche, qui n'a pas pour habitude de se laisser chatouiller par le premier venu.
L'astuce consiste à décapiter préalablement l'animal, ce qui l'empêche de s'enfuir, sans pour autant entraver sa réponse à l'agitation de la soie. La réponse de la mouche décapitée indique en outre qu'aucun des neurones nécessaires à ce réflexe ne passe par le cerveau. Les connexions impliquées se limitent au ganglion thoracico- abdominal.
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-Jacques van Helden 5 Septembre 1995 Développement du système nerveux
Variations sur la fonction
Les macrochètes et microchètes thoraciques suscitent toutes le même type de réponse au stimulus tactile. Il existe toutefois une spécificité positionnelle de la réponse : les soies les plus antérieures provoquent une réaction de la patte prothoracique (antérieure) au lieu de la métathoracique (postérieure).
Les soies de la drosophile ne sont pas toutes mécanosensorielles : il existe des soies chémosensorielles situées notamment sur les pièces buccales, les pattes, la marge de l'aile. Ces soies assurent la perception de substances volatiles (odorat) ou en solution (goût).
La pDC est constituée de 4 cellules assurant 4 fonctions différentes
Jusqu'ici, nous n'avons vu de la macrochète que sa structure apparente (figure I.IC) : un processus trichoïde allongé, légèrement conique et pointu (la soie sensu stricto), logé dans un anneau chitineux (le soquet), lui-même entouré de la cuticule épidermique. Sous cette cuticule, quatre cellules participent à la constitution de l'organe sensoriel : la cellule trichogène secrète le processus trichoïde. La cellule tormogène, entourant la trichogène, produit le soquet. La troisième cellule est un neurone bipolaire. Elle comporte un dendrite imique, qui s'étend jusqu'à la base de la soie, et un axone qui rejoint le système nerveux central thoracique. La quatrième cellule entoure le dendrite, ce qui lui a valu le nom de cellule-enveloppe.
Figure 1.2 : structure d'une soie mécanosensorielle.
Variations sur la structure
La plupart des organes sensoriels de la drosophile sont, comme la pDC, constitués d'un petit nombre de cellules distinctes, mais le nombre précis et l'organisation de ces cellules présentent des variantes :
• Les soies chémosensorielles sont innervées par plusieurs neurones (2 à 5). Les dendrites s'étendent à l'intérieur de la soie au lieu de s'arrêter à sa base. Le
processus trichoïde est ouvert à son extrémité, permettant aux molécules externes d'entrer en contact avec les dendrites sensoriels.
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-Jacques van Helden 5 Septembre 1995 Développement du système nerveux
• Dans le cas des sensilles campaniformes, le processus externe présente tme forme de dôme. Ces organes perçoivent des variations de tension à la surface du corps. Ils sont particulièrement nombreux à la base des haltères et des ailes.
• Outre ces organes sensoriels externes, il existe des organes sensoriels internes (organes chordotonaux, neurones multidendritiques), assurant la proprioception.
Les quatre cellules de la pDC descendent d'une cellule-mère par un lignage défini
Les quatre cellules constituant la pDC descendent directement d'un précurseur, la cellule-mère (Figure 1.3). Les rôles des cellules-filles sont définis au fil des deux divisions : la première division donne naissance à deux précurseurs secondaires. Au cours de la deuxième division, un précurseur secondaire engendre la cellule trichogène et la tormogène, l'autre le neurone et la cellule-enveloppe.
cellule-mère d'organe sensoriel
pila
_L
cellule tormogène
----1 O
cellule trichogène
O
pllb
rL O O
cellule thécogène
B
cellule-mèred'organe sensoriel
O
plia
_L_
cellule cellule tormogène trichogène
r
pllb
cellule thécogène
r
O O _L n
O j_
neurone neurone
Figure 1.3 : lignage des organes sensoriels. A : soie mécanosensorielle. B : soie chémosensorielle.
Variations sur le lignage
Les sensilles campaniformes et les soies chémosensorielles proviennent également d'un cellule-mère d'organe sensoriel (CMOS). Le lignage varie toutefois en fonction du type d'organe : chez les soies polyinnervées, après la division des précurseurs secondaires, l'une des cellules-filles continue à se diviser pour former 2 à 5 neurones (figure 1.3B).
L'axone de la pDC suit un trajet défini dans le système nerveux central Il est possible de marquer spécifiquement l'axone d'une seule soie sensorielle. Pour ce faire, on arrache la soie et on dépose une goutte de peroxydase à la base ainsi découverte. Le dendrite est occasionnellement abîmé, et laisse pénétrer la peroxydase. Celle-ci est alors transportée vers le corps cellulaire puis tout au long de l'axone. On applique alors un protocole de coloration de la peroxydase, qui révèle le trajet de l'axone.
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-Figure 1.4
Jacques van Helden 5 Septembre 1995 Développement du système nerveux
On peut ainsi suivre le trajet de l'axone de la pDC. Cet axone rejoint ceux des autres soies pour former un nerf qui atteint le système nerveux central. Dans le système nerveux central, l'axone descend vers un plan ventral, dans lequel il se ramifie. La figure 1.4C montre la projection centrale (l'ensemble des ramifications) de la pDC.
Figure 1.4 : projection centrale de la pDC. A: localisation du système nerveux central de l'adulte. B: schéma du trajet des soies thoraciques, avec annotation des repères
morphologiques et des branches principales, bla : branche longitudinale antérieure; bip : branche longitudinale postérieure; bca, bcm, bcp, bcmt : branches commissurales antérieure, majeure, postérieure, métathoracique; Im ; ligne médiane (marquée par les pointillés); GPro, GMés, GMétAbd : ganglions prothoracique, mésothoracique, et métathoracico-abdominal.
NPro, NMés, NMét : neuromères prothoracique, mésothoracique, métathoracique. C:
projection centrale de la pDC. Cette image est un montage réalisé à partir de 4 photos prises à des plans focaux légèrement différents, afin de montrer l'ensemble de la projection. Il en sera de même pour toutes les images de projections centrales dans le chapitre qui suit.
Variations sur lu projection centrale
La projection centrale varie en fonction du type d'organe sensoriel. Par exemple, les axones de la patte suivent un trajet totalement différent selon qu'ils irmervent une soie chémo- ou mécanosensorielle (Nottebohm et al., 1992).
Parmi les organes de même type, le trajet dépend de la localisation de l'organe : les projections de soies mécanosensorielles de l'aile sont bien distinctes des projections de soies du thorax (Ghysen, 1978).
Outre ces différences entre trajets, il existe une spécificité "fine" qui différencie les projections des soies qui suivent un même trajet. Cette spécificité réside dans l'extension plus ou moins grande des différentes branches, qui varie en fonction de la localisation précise de l'organe sensoriel innervé (spécificité positionnelle de la projection). Elle a été décrite en détail pour les macrochètes du thorax (figure 1.5A, tirée de Ghysen, 1980).
La branche longitudinale postérieure (bip) est remarquablement plus développée dans les projections de soies postérieures (pSC) que de soies antérieures (aNP, pNP) (figure 1.5A, D). La branche longitudinale antérieure (bla) montre la tendance inverse : elle est plus développée pour les soies antérieures que pour les postérieures (figure 1.5A, C). Un autre trait distinctif est l'étendue de la branche commissurale majeure (bcm), plus développée dans les projections de soies centrales, où elle dépasse la ligne médiane et envoie un prolongement contralatéral (aDC), que dans le cas de soies latérales, où elle peut être absente (pNP), ou à peine ébauchée (aNP) (figure 1.5A, B). On retrouve donc au niveau central une représentation topologique de la disposition externe des organes.
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-Jacques van Helden 5 Septembre 1995 Développement du système nerveux
Figure 1.5 : projection centrale des soies thoraciques (Ghysen, 1980). A : dessins des projections individuelles des macrochètes du thorax (tiré de Ghysen, 1980). Le trajet est commun, mais l'extension relative des branches est caractéristique de chaque macrochète.
L'encadré indique la région correspondant à la figure 1.4C. B-D: schémas de la spécificité spatiale des projections de macrochètes. B: extension de la branche commissurale majeure. • : la bcm croise la ligne médiane et s'étend contralatéralement; o : la bcm est peu développée, et ne dépasse jamais la ligne médiane. C : extension de la branche longitudinale antérieure. • : la bla longe le neuromère prothoracique; o : ne le longe pas; points gris: bla de taille intermédiaire.
D : extension de la branche longitudinale postérieure. • : la bip s'étend jusqu'au ganglion métathoracique; o : la bip n'atteint pas le ganglion métathoracique.
Analyse génétique de la pDC
Si la formation de la pDC est sous contrôle génétique, on devrait pouvoir affecter son développement en mutant les gènes intervenant dans ce contrôle. On connaît des mutations de la région terminale du chromosome X qui empêchent la formation de certaines soies. Nous avons dessiné un schéma indiquant les phénotypes associés aux
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-Jacques van Helden 5 Septembre 1995 Développement du système nerveux
différentes délétions de cette région (carte phénotypique), afin de localiser les régions chromosomiques intervenant spécifiquement dans la formation de la pDC (figure 1.6). Les phénotypes sont tirés de Garcia-Bellido (1979), la localisation précise des délétions provient d'une part de l'analyse moléculaire réalisée par Campuzano et al. (1985), d'autre part de Lindsley & Zimm (1992).
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T8 4 proximal
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I I ~l
ac-sc-
Figure 1.6 : phénotypes de disparition de la pDC provoqués par des délétions dans la région distale du chromosome X. Les flèches horizontales (T6, T5, T4, T3, T8) indiquent les régions transcrites, y, ac, sc, l'sc, ase : gènes yellow, achaete, scute, léthal ofscute, et asense. Boîtes horizontales : étendue et phénotype des différentes délétions (le phénotype est représenté par la couleur). Boîte noire : la délétion entraîne une disparition de la pDC chez plus de 50% des mouches. Boîte grise : entre 10% et 50% de disparition. Boîte blanche : moins de 10% de disparition. Par convention, les gènes et mutations sont notés en italiques.
La délétion du gène achaete {ar sur la figure 1.6) entraîne une disparition de la pDC chez 90% des mouches (Garcia-Bellido, 1979; Gomez-Skarmeta étal., 1995). Par contre, cette macrochète n'est pas affectée par les délétions proximales (sr, sc^, ase').
Le gène achaete est donc nécessaire à la formation de la pDC. L'effet de la délétion de ce gène n'est toutefois pas total : 10% des pDC se développent. Comment expliquer la dispensabilité du gène pour ces cas-là ? Une délétion enlevant à la fois achaete et scute entraîne une disparition totale de la pDC. Ceci indique que le gène scute est responsable des 10% de pDC formées en l'absence d'achaete. En présence d'achaete, l'absence de scute n'a néanmoins aucun effet sur la pDC. La formation de la pDC dépend donc du gène achaete, mais le gène scute peut partiellement compenser la délétion de celui-ci.
La délétion distale ac^ affecte la pDC dans une moindre mesure (entre 10 et 50% de disparition). Cette délétion couvre une région de transcription (T6) mais le gène correspondant, yellow, n'est pas impliqué dans le développement des macrochètes (Campuzano et al., 1985, Lindsley et Zimm, 1992). L'effet de la mutation ac^ sur la pDC est vraisemblablement dû à l'inactivation d'éléments de contrôle (enhancers) agissant en cis sur la transcription d'achaete.
Cette hypothèse est renforcée par l'étude des insertions (figure 1.7). On a isolé plusieurs insertions localisées dans la région terminale du chromosome X. La mutation ac^^ est due à une insertion de 7.3 kb, située entre la région transcrite d'achaete (T5) et le site de la délétion acL Le phénotype de cette insertion est similaire à celui de la délétion ac^ : la pDC manque dans 10% à 50% des cas. Or l'insertion ne touche pas la région transcrite T6. Par contre, elle éloigne la région transcrite d'achaete de la partie distale du chromosome. Le phénotype de disparition partielle de la pDC
y ac SC l'sc
T6 T5 T4 T3
4 4 4 4
i----1---1---1---1 I---
60 40 20
ac^
distal
• I-
kb 80
-
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-Jacques van Helden 5 Septembre 1995 Développement du système nerveux
pourrait provenir d'une diminution de l'efficacité d'éventuels sites de contrôle en cis, séparés de la région codante par l'insertion. D'autres insertions, plus proximales (sc^, sc^^, sc^), n'ont aucun effet sur la formation de la pDC.
Les mutations ac^ et semblent toutes deux agir sur un site qui contrôle l'expression d'achaete pour la formation de la pDC. Qu'en est-il de la combinaison des deux mutations ? Curieusement, une mouche portant à la fois les deux mutations (une sur chaque chromosome : ac^lac^^) montre le phénotype sauvage : la pDC est formée dans tous les cas. Il y a donc complémentation complète entre les allèles ac^ et Cette complémentation inattendue ne constitue pas un cas isolé chez la drosophile: on constate le même genre d'effet dans d'autres loci complexe. Nous ne pouvons y fournir d'interprétation moléculaire.
distal
• I-
kb 80
y ac T6 T5
^--- 1--- h H -♦
A 60
\ac3B
A
SC l'sc
T4 T3
4 H
-I---1---1---1---1---Y
40 20 A 0
SC J SCB>2\
t__ \sc^S O O
ase
T8 4 proximal
—I--- 1 I •
-20 -40
Figure 1.7 : phénotypes de disparition de la pDC provoqués par des insertions dans la région distale du chromosome X. Les flèches verticales indiquent le site des insertions. Les pastilles indiquent le phénotype. Pastille grisée : entre 10% et 50% de disparition de la pDC. Pastille blanche : moins de 10% de disparition.
La fonction du gène achaete requiert donc non seulement la région codante, mais aussi des régions latérales, contenant des sites de contrôle. Quelle est l'étendue de la région de contrôle nécessaire à la formation de la pDC ? L'étude des inversions chromosomiques nous permet d'apporter une première réponse à cette question.
abc de f g
■H---:—I--- 1--- 1--- 1--- :--- 1------
a e d c b
--- 1--- 1---1--- 1--- 1--- h
Figure 1.8 : schéma d'une inversion chromosomique. Les flèches verticales indiquent les positions des deux points de rupture. Le point de rupture gauche a pour effet de séparer physiquement les régions a et b. Si b contient une région codante, l'inversion empêchera l'action d'éventuels sites de contrôle localisés en a.
Ces inversions ont pour effet de séparer totalement les régions à gauche et à droite d'un point de rupture (figure 1.8). Quand l'un des deux points de rupture est localisé entre une région codante et son site de contrôle, il empêche l'action du site de contrôle.
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-Jacques van Helden 5 Septembre 1995 Développement du système nerveux
La figure 1.9 représente le phénotype de disparition de la pDC pour différentes inversions ayant un point de rupture dans la région terminale du chromosome X^.
Distalement à achaete, on constate que l'inversion n'a pas d'effet sur la formation de la pDC. La région distale à ne contient donc pas de sites de contrôle d'achaete nécessaires à la formation de la pDC. En combinant cette information à celle obtenue par l'étude des délétions (figure 1.6) et insertions (figure 1.7), nous pouvons localiser une région comprenant au moins un site de contrôle de la pDC entre les positions^ 67 et 63.7 (ac^^). Nous ne disposons pas de mutations permettant de localiser plus précisément cet élément distal de contrôle.
sc^ sc^
distal
--- 1—
kb 80
y ac
T6 T5
4 4 4--- 1—
SC
T4
4 4
---- 1--- 1-
sdL ScH ScS2
scl9il il i ase T8 4
---1- proximal
t
60 40
fi
20 0 -20 -40
1 y3P
1 sc8
1 ScL8
1 SC4 ScSl
3P 8 L8S1 4 H 9 S2 7 19
O ooo OO 00 O
Figure 1.9 : phénotype de disparition de la pDC suite à une inversion occasionnant un point de rupture dans la région distale du chromosome X. Les flèches verticales indiquent les positions des points de rupture. Les pastilles indiquent le phénotype. Pastille grisée : entre 10% et 50%
de disparition de la pDC. Pastille blanche : moins de 10% de disparition.
Proximalement à sc^, on ne détecte aucun effet des inversions sur la pDC. Le phénotype de l'inversion sc^ suggère l'existence d'un site de contrôle additionnel, proximal au point de rupture de cette inversion, et qui agit sur l'expression d'achaete.
L'absence de phénotype pour l'inversion sc^ et pour toutes les inversions proximales limite la localisation de ce site de contrôle hypothétique à la région comprise entre sc^
et sc^.
Toutes les mutations mentionnées ci-dessus sont récessives : leur phénotype ne s'exprime pas à Tétat hétérozygote. Une seule copie sauvage du gène achaete suffit donc à assurer pleinement la fonction. Il existe par ailleurs une série de mutations dominantes de la même région du chromosome X. Ces mutations provoquent un effet inverse à celui des mutations récessives : plusieurs macrochètes excédentaires apparaissent dans la région dorsocentrale. Des microchètes ectopiques se forment également sur Taile, ce qui a donné leur nom à ces mutations : Hairy-wing (Hw).
L'analyse moléculaire révèle que les mutations Hw provoquent un excès de fonction du gène achaete, par dérégulation de son contrôle (Campuzano et al., 1986, Balcells et al., 1988).
^ Le second point de rupture est généralement beaucoup plus proximal, et sort totalement de la région représentée dans la figure 1.8. On peut donc considérer que l'inversion sépare totalement les parties proximale et distale au point de rupture représenté.
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-Jacques van Helden 5 Septembre 1995 Développement du système nerveux
La mutation Hairy-wing indique que le gain de fonction d'achaete génère des soies excédentaires. L'étude des délétions nous avait montré que la perte de fonction d'achaete provoque la disparition de soies. La comparaison des effets de perte et de gain de fonction indique que le gène achaete est à la fois nécessaire et suffisant pour induire le développement de macrochètes dans la région de la pDC.
Variations sur la pDC : analyse génétique des autres soies thoraciques
L'analyse génétique de la pDC nous a permis d'attribuer au gène achaete la responsabilité de la formation de cette soie, et de localiser des régions chromosomiques intervenant en cis dans le contrôle transcriptionnel de ce gène. En outre, cette analyse a révélé l'existence du gène scute, pouvant partiellement complémenter l'absence d'achaete. Qu'en est-il pour les autres soies ? Dépendent-elles des mêmes gènes, et partagent-elles les mêmes régions de contrôle transcriptionnel que la pDC ?
Les macrochètes dépendent d'achaete. de scute. ou de la combinaison des deux gènes La figure 1.10 illustre le phénotype des délétions de 3 des gènes de la région : achaete, scute, et asense. Le quatrième gène, léthal of scute, n'a pas été envisagé car sa délétion provoque une létalité embryonnaire. Ce gène semble impliqué dans le développement du système nerveux central, et n'affecte pas le système périphérique (Garcia-Bellido & Santamaria, 1978).
Les quatre soies les plus antérieures (aNP, pNP, PS et aSA) du thorax ne sont affectées ni par la délétion d'achaete, ni par celle d'asense. Par contre elles disparaissent totalement quand la région codante du gène scute est délétée. Ces soies dépendent donc du transcrit T4 (scute). Il en est de même pour les soies postalaires (aPA, pPA).
Nous avons vu que la pDC dépend d'achaete. Les cas de la pSA et de l'aDC ne sont pas aussi clairs : la délétion d'achaete provoque plus de 50% de disparitions, la délétion de scute les affecte dans une moindre mesure. La formation de ces soies requiert donc des éléments appartenant à chacime des régions délétées.
^ Par convention, on définit toutes les positions en Kb. Le zéro correspond à un site de restriction choisi arbitrairement (Campuzano étal., 1985)
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Figure 1.10 : phénotype de disparition des macrochètes chez des mouches déficientes pour achaete (A), scute (B) , asense (C) et pour une déficience simultanée d'achaete et scute (D) (d'après Garcia-Bellido, 1979). Soies noires : disparition dans plus de 50% des cas. Grisées : entre 10% et 50% de disparition. En blanc : moins de 10% de disparition.
Les macrochètes scutellaires (aSC, pSC) dépendent partiellement d'asense. Les mouches déficientes à la fois pour achaete et scute sont totalement dépourvues de macrochètes. Le gène asense n'est donc pas suffisant pour générer des soies. Le phénotype de la délétion ase' peut refléter une dépendance partielle vis-à-vis du transcrit T8 {asense). Alternativement, ce phénotype pourrait être dû au fait que la délétion supprime des sites de contrôle proximaux, agissant sur T4 (scute) et/ou T5 (achaete).
Les macrochètes dépendent de régions de contrôle distinctes, éparpillées sur plus de 75 Kb dans la région terminale du chromosome X
Ceci nous amène à notre deuxième question : où sont localisés les sites de contrôle pour les autres macrochètes ? Comme pour la pDC, nous avons réalisé pour chaque macrochète une fiche rassemblant les données de l'analyse génétique (Garcia-Bellido, 1979). Ces fiches sont reprises en annexe 9.1. Cette étude nous montre que la formation des différentes macrochètes répond à des éléments de contrôle distincts.
Nous avons représenté dans la figure 1.11 la localisation des régions de contrôle déduite de notre analyse.
Pour la plupart des macrochètes, l'analyse génétique permet de localiser ime région
"sensible", comportant vraisemblablement des sites de contrôle spécifiques pour cette soie. Pour certaines soies (aDC, pDC, pSA), on observe des perturbations dans plusieurs régions. Ceci suggère l'existence de plusieurs sites de contrôle impliqués dans la formation de la même soie. Notons que la résolution de l'analyse est assez faible (5 à 20 Kb), car nous sommes limités par les mutations disponibles. L'analyse génétique de Garcia-Bellido (1979) traite ensemble l'aPA et la pPA, ainsi que l'aSC et la pSC. Ceci explique probablement l'imprécision de la localisation pour le couple aPA+pPA : les régions 1 et 2 correspondent vraisemblablement à l'une et l'autre soie (on constate en outre un effet partiel de la région 3).
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pDC aDC pSA microchètes pNP aSA PS aPA+pPA aNP aSC+pSC
distal kb 80
y
T6 T5H 4
60
SC Vsc
T4 T3
4 4
40 20
ase
T84 proximal
-20 -40
E3
aDC, pDC
m
aNP, aPA
Figure 1.11 : localisation des régions de contrôle des différentes soies thoraciques. A : Localisation d'après l'analyse génétique (Garcia-Bellido, 1979). Les boîtes noires et grisées indiquent des régions chromosomiques contenant au moins un site de contrôle pour la soie concernée. La couleur indique la fréquence de disparition de la soie quand on inactive la région (noir : >50%; gris : >10%). Les régions en blanc ne contiennent pas de site important pour la soie considérée. Les points d'interrogation indiquent des régions dont le rôle est probable mais pas certain,
bp, bp, 8, l8, 4,si,
h, 9, S2, i9: localisation des points de rupture des inversions de la figure 1.9. B : Localisation d'après l'étude par gènes rapporteurs (Gomez-Skarmeta étal., 1995).
Nous avons repris dans la même figure (l.lOB) les résultats d'une analyse récente basée sur l'utilisation d'un gène rapporteur. Le principe de cette analyse est de découper l'ADN de la région chromosomique, et de combiner chaque fragment au gène lacZ, codant pour la |3-galactosidase bactérienne (le gène rapporteur). Si un fragment d'ADN comporte des sites activateurs de transcription, il déclenche dans certaines régions du disque l'expression du rapporteur (qu'on peut détecter par immunomarquage ou par son activité enzymatique). Il s'agit d'une dissection moléculaire de la région de contrôle d'un gène.
Cette dissection moléculaire a permis d'isoler des fragments activant l'expression dachaete et sente dans les régions du disque correspondant à 4 macrochètes : aDC, pDC, aNP et aPA (Gomez-Skarmeta et al, 1995). La localisation des fragments correspond à notre localisation génétique des régions de contrôle pour ces 4 macrochètes. Notons que l'analyse génétique et la dissection moléculaire nous fournissent des informations différentes. L'analyse moléculaire révèle des régions suffisantes pour activer l'expression du gène rapporteur (et donc vraisemblablement d'achaete ou sente) dans une région donnée du disque imaginai. Elle présente certaines limitations, notamment dues à l'analyse d'un fragment d'ADN hors de son contexte chromosomique (on utilise entre 1 et 5 Kb pour chaque construction, alors que l'ensemble de la région de contrôle d'aehaete couvre 100 Kb). En outre, la capacité
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-Jacques van Helden 5 Septembre 1995 Développement du système nerveux
d'un fragment isolé à activer le rapporteur ne prouve pas que c'est bien là sa fonction dans l'ensemble du complexe. L'analyse génétique nous indique quant à elle les régions nécessaires à la formation de chaque organe sensoriel. La combinaison des deux méthodes est donc essentielle à la fiabilité de la localisation.
Variations sur achaete : le complexe acbaete-scute
Nous avons vu que différentes régions de la partie terminale du chromosome X sont responsables de la formation de différents organes sensoriels. Le rôle de cette région ne se limite pas aux macrochètes thoraciques : les mutations de la région affectent l'ensemble des organes sensoriels externes de l'embryon et de l'adulte, ainsi que le système nerveux central (notamment le gène léthal of seule, dont les délétions provoquent une mortalité embryonnaire).
Cette région chromosomique a été appelée complexe achaete-scute (ASC). La qualification de "complexe" provient de l'impossibilité de diviser cette région en unités génétiques discrètes, du fait de la complémentation partielle des différents allèles. Cette complexité est vraisemblablement liée à l'interspersion des régions codantes et des sites de contrôle. Par exemple, les sites de contrôle de seule s'étendent à la fois en amont et en aval du transcrit T4 (seule), et certains sont situés proximalement au transcrit T3 (léthal of seule).
Le complexe aehaete-seute contient quatre gènes homologues, codant pour des régulateurs transcriptionnels
Quatre des transcrits du complexe aehaete-seute (T3, T4, T5, et T8) présentent une forte homologie, particulièrement concentrée en certaines régions. On retrouve dans chacune des protéines déduites un domaine Hélix-Loop-Helix flanqué d'une région basique (b-HLH). Le domaine HLH est connu pour permettre la formation de dimères entre protéines identiques (homodimères) ou apparentées (hétérodimères).
La région basique associée aux HLH confère aux dimères la capacité de se fixer à certaines séquences d'ADN spécifiques (les E-boxes), comme le montre la figure 1.12.
Dans le cas des gènes aehaete et seule, des expériences in vitro ont montré qu'ils forment des hétérodimères avec la protéine Daughterless. Ces dimères reconnaissent les E-boxes et s'y fixent (Van Doren et al, 1991). La liaison des hétérodimères aehaete- daughterless ou seute-daughterless active la transcription de gènes localisés à proximité du site de fixation (Van Doren et al, 1992). Les gènes aehaete et seule codent donc pour des régulateurs transcriptionnels.
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-Jacques van Helden 5 Septembre 1995 Développement du système nerveux
3' 5'
5' 3'
Figure 1.12 ; Les protéines à bHLH forment des dimères qui reconnaissent spécifiquement certaines séquences d'ADN (Ma étal., 1994).
Rôle du complexe achaete-scute dans le développement des organes sensoriels : la fonction proneurale
Nous avons vu que les gènes du complexe achaete-scute sont nécessaires et suffisants à la formation du système nerveux périphérique. Ils interviennent également dans le développement du système nerveux central, où leur expression détermine la formation de certains neuroblastes. En raison de cette fonction, on les a nommés gènes proneuraux (Ghysen & Dambly-Chaudière, 1989). Par extension, les groupes de cellules exprimant ces gènes sont appelés groupes proneuraux.
Homologie fonctionnelle des gènes du complexe achaete-scute
Les produits d'achaete et de scute ont chacun la capacité d'assumer la fonction proneurale. En surexprimant soit léthal of scute (l'sc) (Martin-Bermudo et al., 1995), soit asense (Brand et al, 1993; Dominguez & Campuzano, 1993), chez des mutants acsc-, on restaure une partie des organes sensoriels supprimés par la délétion.
L'homologie de séquence entre les quatre gènes du complexe s'accompagne donc d'une homologie fonctionnelle.
Analyse "développementale" de la pDC
Revenons à notre pDC, que nous avions quelque peu perdue de vue. Le produit du gène achaete est-il requis localement, à l'endroit où est générée la soie, ou bien exerce- t-il une fonction à large échelle (de type hormonal par exemple) sur les tissus en cours de différenciation ? L'analyse par la méthode des gynandromorphes répond à cette question (Stern, 1954). La méthode consiste à générer des larves femelles chez lesquelles certaines cellules perdent un chromosome X. La perte de ce chromosome n'empêche ni la prolifération ni la différenciation de ces cellules, qui formeront donc des clones de cellules mâles (le chromosome Y n'est pas indispensable au développement des mâles chez la mouche) au sein d'un individu femelle. Si on applique cette méthode à des femelles hétérozygotes (et donc phénotypiquement sauvages) pour la mutation ac^, les clones mâles perdent la copie fonctionnelle du gène achaete, et ne conservent que la copie flcL La localisation des clones ac^ est généralement aléatoire. Il arrive que la région postérieure dorsocentrale soit incluse dans un clone ac^. On constate alors que le phénotype mutant s'exprime : la pDC est
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-Jacques van Helden 5 Septembre 1995 Développ)ement du système nerveux
fréquemment absente (figure 1.13A). La présence de tissu sauvage environnant ne compense pas l'absence d'achaete au sein du clone. Par contre, si la région de la pDC est constituée de cellules sauvages, même entourées de tissu mutant, la soie est toujours présente (figure 1.13B). La fonction sauvage du gène achaete est donc requise localement, à l'endroit même où se forme l'organe sensoriel (autonomie cellulaire).
Il existe toutefois une non-autonomie partielle : quand un clone ac^ recouvre la région où devrait se former la pDC, il arrive qu'une soie se forme dans le tissu sauvage avoisinant, légèrement déplacée par rapport à la position normale de la pDC (figure 1.13C). La capacité à former la pDC n'est donc pas limitée à une seule cellule, mais à une petite région du thorax.
Figure 1.13 : autonomie cellulaire de la fonction d'achaete. Les schémas représentent des demi- thorax, comportant des clones de cellules ad (régions noires) entourées de cellules comportant une copie sauvage d'achaete (ad/achaete-^). Les signes - et + indiquent respectivement l'absence et la présence de la pDC. A : le phénotype mutant s'exprime dans les clones ac^, en dépit du tissu sauvage avoisinant. B: le phénotype mutant ne s'exprime pas dans les clones acVac+
même s'ils sont entourés de cellules ac'. C: occasionnellement, la pDC est légèrement déplacée, quand la région où elle devrait se former est occupée par des cellules ad.
L'analyse par gynandromorphes nous a permis de définir en quels endroits du corps l'expression d'achaete est nécessaire, et a montré une autonomie régionale de la fonction du gène. Une méthode apparentée, l'analyse clonale par recombinaison mitotique, permet de déterminer à quel moment cette fonction s'exerce, ou plus précisément, à partir de quel moment elle n'est plus requise (perdurance de la fonction, Garcia-Bellido & Santamaria, 1978). Comme pour l'analyse par gynandromorphes, cette méthode consiste à générer chez une larve hétérozygote des clones déficients pour achaete, mais il est en outre possible de contrôler le moment
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-Figure 1.14
E m
AOC
Jacques van Helden 5 Septembre 1995 Développement du système nerveux
d'apparition de la cellule homozygote initiale^. Des clones de cellules déficientes pour achaete et scute ont ainsi été générés à différents stades du développement. Les clones précoces sont dépourvus d'organes sensoriels. Ils expriment donc pleinement le phénotype de la déficience. Par contre, la pDC se forme normalement dans des clones plus tardifs (40h avant FP), en dépit de l'absence du gène achaete{Cuhas et al., 1991). Ceci signifie que le produit du gène n'est plus nécessaire à la formation de l'organe sensoriel à partir de la division cellulaire suivante"^.
La fonction d'achaete est donc requise durant le troisième stade larvaire, dans les cellules qui vont former la pDC. Les structures externes de l'adulte dérivent des disques imaginaux, qui se développent durant les stades larvaires et pupal^. Le gène est-il exprimé dans ces tissus ? Est-il exprimé dans l'ensemble des cellules ou uniquement dans celles qui engendreront la pDC ?
Les gènes achaete et scute sont exprimés dans le disque d'aile, dans la région présomptive de la pDC
Au cours du troisième stade larvaire, le gène achaete est exprimé dans le disque imaginai d'aile-thorax, en plusieurs groupes de cellules (Romani et ah, 1989).
L'hybridation in situ des transcrits de scute montre le même pattern que celui d'achaete. Le marquage des protéines au moyen d'anticorps confirme la similarité des patterns d'expression d'achaete et scute (Skeath & Carroll, 1991).
Figure 1.14 : Expression d'achaete et scute dans le disque imaginai d'aile-thorax. A: Vue d'ensemble du disque d'aile-thorax. Les annotations indiquent les structures adultes dérivant des différentes régions du disque. Encadré : la région dorsocentrale, illustrée à plus grande échelle dans les figures B à E.. B-E : dynamique d'expression de la protéine Scute dans le groupe dorsocentral (ce pattern est identique à celui d'Achaete [Skeath & Carroll, 1991 ]). B : plusieurs heures avant formation de la pupe (avant FP). C : peu de temps avant FP. D : au moment de la formation de la pupe. E : 2h après formation de la pupe. DC : groupe proneural dorsocentral;
pDC, aDC, pPA, pSA : cellules où l'expression est renforcée, et qui deviendront CMOS.
Focalisons-nous sur la région dorsocentrale du disque. On y trouve un groupe d'expression d'ac-sc (le groupe proneural). L'expression des gènes au sein de ce groupe évolue au cours du temps. Skeath & Carroll (1991), ainsi que Cubas et al.
(1991) ont fourni une description de la dynamique d'expression de scute dans le groupe dorsocentral (l'expression d'achaete n'y est pas illustrée, mais les deux articles
^ Les clones générés en soumettant les larves à des rayons X, ce qui provoque des recombinaisons mitotiques.
^ L'irradiation provoque une recombinaison chromosomique dans des cellules en phase G2, après la réplication du DNA. Celles-ci sont toujours porteuses des 4 copies du gène. La ségrégation des chromosomes n'a lieu qu'au cours de la mitose, dormant naissance à une cellule-fille homozygote pour la déficience, et une homozygote pour le gène sauvage. La première cellule homozygote pour la déficience est donc la cellule-fille de la cellule irradiée. Cette distinction est importante, car les cellules impliquées dans la genèse des organes sensoriels sont arrêtées en phase G2 durant plusieurs heures (Usui & Kimura, 1992).
^ Le développement de la drosophile comporte un stade embryonnaire (d'une durée de 1 jour), trois stades larvaires (1,1 et 3 jours respectivement), et un stade pupal (5 jours).
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-Jacques van Helden 5 Septembre 1995 Développement du système nerveux
la décrivent comme similaire à celle de seule). A partir de 35 heures avant la formation de la pupe (avant FP), la protéine Scute^ est détectable dans un groupe de cellules localisées dans la région présomptive des macrochètes dorsocentrales. La protéine est localisée dans les noyaux cellulaires. Quelques heures plus tard (25h avant FP), le groupe dorsocentral comporte une trentaine de cellules. Le marquage n'est pas homogène au sein du groupe : on note en particulier un renforcement de l'expression dans une cellule postérieure. Une autre cellule, antérieure, montre un renforcement similaire un peu plus tard (20h avant FP). Des doubles marquages (Achaete + AlOl, un marqueur spécifique des cellules-mères) ont montré la correspondance univoque entre les cellules montrant un renforcement de l'expression d'achaete et les cellules-mères d'organe sensoriel (Skeath & Carroll, 1991).
La cellule-mère de la pDC correspond à la cellule renforcée située postérieurement dans le groupe dorsocentral (figure 1.14). L'autre cellule renforcée dans ce même groupe engendrera une autre macrochète : l'aDC.
Peu de temps avant la formation de la pupe, l'expression commence à décliner au sein du groupe. Au moment de la formation de la pupe, le marquage est limité aux deux cellules qui montraient précédemment un renforcement d'expression.
L'expression d'achaete et seule disparaît de ces dernières cellules avant qu'elles ne se divisent (figure 1.14E, l'expression a déjà disparu dans la pDC mais pas encore dans l'aDC).
Variations sur la dynamique du groupe proneural dorsocentral
La taille du groupe proneural varie d'une soie à l'autre. Certains groupes engendrent deux soies, comme nous l'avons vu pour les dorsocentrales, d'autres n'engendrent qu'une soie. Le groupe de la pSA est particulièrement restreint et n'apparaît que transitoirement. La spécificité individuelle des groupes (taille, dynamique d'expression) est remarquablement reproductible d'une mouche à l'autre.
Qu'est-ce qui déclenche l'expression proneurale dans la région dorsocentrale du disque d'aile-thorax ?
Les gènes proneuraux sont exprimés suivant un pattern précis, en certaines régions limitées du disque imaginai. On appelle gènes de prépattern les gènes qui définissent ce pattern d'expression. A ce jour, on ignore tout des gènes de prépattem qui activent l'expression d'achaete et seule dans la région dorsocentrale. On connaît par contre quelques éléments intervenant dans d'autres régions du disque, et dans le contrôle du pattern d'expression embryonnaire d'achaete.
^ Conventionnellement, on note en italiques les noms de gènes (achaete) et leurs mutations (ac^), tandis que les protéines (Achaete) sont notées en caractères droits, en commençant par une majuscule.
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-Jacques van Helden 5 Septembre 1995 Développement du système nerveux
Variations sur les gènes de prépattem contrôlant le groupe dorsocentral : contrôle des macrochètes latérales et du pattern embryonnaire
On ne connaît qu'un seul gène qui active l'expression des gènes proneuraux dans le disque imaginai : Iroquois (Dambly-Chaudière & Leyns, 1992; Leyns et al, in prepj Gomez-Skarmeta et al, in prep). Ce gène active l'expression du complexe achaete-scute dans les régions présomptives des soies latérales du thorax. Outre ce gène activateur, on a isolé deux gènes qui répriment l'expression proneurale dans certaines régions du disque : pannier (Ramain et al, 1993) et u-shaped (P. Simpson, données non publiées). La complexité du pattern d'expression des proneuraux résulte donc de la contribution de plusieurs gènes de prépattern.
Dans l'embryon, on a caractérisé plusieurs gènes de prépattern (Skeath et al, 1992). il s'agit des gènes de segmentation antéro-postérieure et dorso-ventrale. A l'intersection de certaines bandes verticales (définies par les domaines d'expression des gènes de segmentation) et horizontales (définies par les gènes dorso-ventraux), les gènes proneuraux sont activés. En mutant les gènes de prépattem, on observe la disparition de certaines bandes, ou au contraire leur extension, suivant la mutation.
Autoactivation et activation réciproque d'acfiaete et scute
Martinez & Modolell (1991) ont réalisé une construction (ac-lacZ) plaçant le gène bactérien lacZ sous contrôle d'un fragment de 0.9 Kb de la région en amont d'achaete, et réinséré cette construction dans le génome de la drosophile (Figure 1.15A). Le fragment de 0.9 Kb est capable d'activer le gène rapporteur suivant un pattern réminiscent de celui des gènes proneuraux (figure 1.15B). Ce résultat est inattendu, puisque le gène rapporteur ne contient qu'une infime partie de la région de contrôle d'achaete. Le marquage disparaît toutefois chez des mouches mutantes pour achaete et scute (figure 1.15C). La construction ac-lacZ est donc activée par les gènes proneuraux endogènes, ce qui suggère l'existence d'un site d'autoactivation dans le fragment de 0.9 Kb. Le séquençage du même fragment a effectivement montré qu'il contient 3 E- boxes (Van Doren et al, 1991). In vitro, des hétérodimères achaete-daughterless et scute- daughterless ont la capacité de se fixer spécifiquement à ce fragment, et d'activer l'expression d'un gène rapporteur (CAT). Quand on mute les 3 E-boxes, le fragment de 0.9 Kb perd ses propriétés de fixation à l'ADN, d'activation de CAT in vitro, et d'activation du rapporteur lacZ dans les disques (figure 1.15D, Van Doren et al, 1992). Ces expériences démontrent la capacité du gène achaete à s'autoactiver, et à être activé par scute.
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-Figure 1.15 EE E
ac 0.9 Kb lacZ h-
Figure 1.16
distal kb 80
In(l)sc^
ac
I
SC60 40
aDC, pDC □
. ^ proximal
20 0 -20 -40
