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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Gadenne, M. A. (1984). Etude des modifications des propriétés membranaires des cellules embryonnaires de batracien lors des stades précoces du développement (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/213675/1/715a8d05-da0f-4c13-8792-8f0f7a8622f5.txt
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Faculté des Sciences
Laboratoire de biologie du développement
Etude des modifications des propriétés membranaires des cellules embryonnaires de batracien lors des stades précoces du développement.
These présent:ée en vue de
I ' obt:ent;ion du grade légal
de Oocteur en Sciences zoologiques par
Marlsine Gadenne Exemplaire destiné
à la Bibliothèque Année Académique 1S83 -ISSA
Université libre de Oruxeîîes Feeulté des Se;ien*sesà
Laboratoire de biologie du déveiappemant
Etîudcî des modificat;ïons des propriétiés membranaires des cellules embryannaïres de batractsn îors des sfesdes précoces du développement:.
Thèsàe préssen-tée en vue de
robtention du grade légal
de docteur en Gciences
zoo Jc-g ïques par
f-/îarSir<& Giadenne
Année Académique '1303
FUT POUR MOI UN GUIDE ET UN CONSEIL DANS LE CHAMP DE RECHERCHES, OBJET DE CE TRAVAIL,
MA GRATITUDE ET MON RESPECT VONT ÉGALEMENT À MONSIEUR LE PROFESSEUR JEAN BRACHET. L'INTÉRÊT QU'ïL A BIEN VOULU TÉMOIGNER À MES TRAVAUX A ÉTÉ POUR MOI D'UN GRAND
ENCOURAGEMENT.
J
e doisAUSSI TOUS MES REMERCIEMENTS À MONSIEUR DANIEL VRAMCKX POUR SON AIDE TECHNÎQUE,DONT JE TIENS À SOULIGNER TOUTE LA VALEUR, AINSI Qü'A TOUS CEUX QUI, AU LABORATOIRE DE BIOLOGIE DU DÉVELOPPEMENT, M'ONT RÉSERVÉ BON ACCUEIL ET AIDE DANS MES EXPÉRIENCES.
I
l me reste aMENTIONNER QUE L'IRSIA ET L'EMBO M'ONT PFFMIS, PAR L'OCTROI D'UNE BOURSE, D'ENTREPRENDRE CETTE RECHERCHE,
QUE TOUS CEUX GUI, DE PRÈS OU DE LOIN, M'ONT AIDÉ DANS CE TRAVAIL VEUILLENT BIEN TROUVER ICI LE TÉMOIGNAGE DE MA GRATITUDE.
«
Lors de la gastrulation, l'embryon devient le siège de mouvements cellulaires complexes qui aboutissent à la mise en place des trois feuillets embryonnaires:
l'ectoderme à l'extérieur, l'endoderme en profondeur
et le mésoderne en position intermediaire. Cette période du développement coïncide avec l'apparition de nouvelles propriétés pour les cellules de l'embryon; outre l'induction de;s migrations cellulaires, on assiste à un accroissement de; l'adhésion intercellulaire et à l'apparition de
phénomènes de reconnaissance entre les cellules embryonnaires.
Par ailleurs, lorsque l'on procède à la dissociation des embryon de manière à examiner le comportement des cellules in vitro,
or. observe que les cellules sont capables de se mouvoir.
Elles émettent périodiquement des lobopodes hyalins qui effectuent un mouvement de rotation autour du corps cellu- Icire. Par ailleurs, lorsqu'on cultive ces mêmes cellules sur un substrat de plastique, en présence de Ca^'*' Mg 2 + , elles s'étalent sur le substrat plus ou moins rapidement selon
le stade envisagé.
La capacité pour les cellules dissociées de se mouvoir ou d'adhérer sur un substrat survient dans le développement à un stade antérieur à la période de la gastrulation.
Ces propriétés font leur apparition lors de la transition blastuléenne (entre les stades morula et blastula), au même moment où, dans l'embryon se produit l'activation de la transcription.
Il est généralement admis que les constituants de la membrane plasmique et du cytosquelette contrôlent a la fois les
propriétés d'adhésion et la motilité des cellules.
stades précoces du développement (du stade morula au stade neuruia) qui puissent être en relation avec le changement du comportement des cellules ou bien qui puissent être à l'origine de la différenciation des cellules des trois feuillets embryonnaires.
Dans ce but, nous avons utilisé les lectines qui sont des substances qui reconnaissent spécifiquement certains radicaux carbohydrates des glyco--conjugués de la
surface membranaire.
Tout d'abord, nous av^ons observé l'effet de l'incubation d'embryons de batraciens en présence de lectines, de
manière à voir si les trois feuillets sont affectés de la même manière. La lectine affecte exclusivement la couche externe de l'embryon: la formation du sillon blastoporal et le mouvement d'épibolie de l'ectoderme sont inhibés.
La lectine inhibe également les cytodiérèses des cellules de la couche externe.
Par ailleurs, nous avons suivi la fixation de lectines fluorescentes sur la surface des cellules dissociées à différents stades du développement, de manière à obtenir des informations sur les membranes plasmiques nouvellement formées lors de la segmentation de l'embryon. Par cette étude, il apparaît que la transition blastuléenne est
u;ie période de profond changement des propriétés cellulaires
car, outre la capacité de se mouvoir ou d'adhérer sur un
substrat, les cellules acquièrent la compétence d'effectuer
le capping des récepteurs de lectine.
Lc’ phénomène du capping comme d'ailleurs le processus d'étalement des cellules sur un substrat implique la participation du cytosquelette. Il se peut qu'à un stade aussi précoce que ia morula, un constituant
indispensable au couplage entre les récepteurs de surface et les éléments du cytosquelette fasse encore défaut.
Ce composé pourrait faire son apparition au stade blastula mais être encore en quantité assez limitée de sorte qu'à
la fois le processus d'étalement des cellules et le capping soient encore lents à ce stade.
Un accroissement de la fluidité membranaire pourrait être à l'origine de l'accroissement progressif de la vitesse du capping au cours du développement. En effet, la résistance membranaire s'opposant à la migration des récepteurs de surface serait ainsi diminuée.
L'apparition de la motilité cellulaire pourrait également être en partie liée à une question de fluidité membranaire;
on peut imaginer qu'un accroissement de la fuidité favorise la déformabilité de surface et dès lors, la production
d'organelles de locomotion.
Nous avons estimé la fluidité lipidique de la membrane en mesurant le coefficient de diffusion latérale d'un lipide exogène incorporé dans la membrane, par la technique de Fluorescence Photobleaching recovery (F.P.R.).
Suite à ces mesures, nous observons un accroissement
particulièrement significatif de la fluidité membranaire entre
les stades jeunes blastula et blastula avancé et entre les
stades gastrula et neurula.
Par la même technique, nous avons réalisé des mesures de la m.obilité latérale des récepteurs de lectine.
Ces mesures nous indiquent que la mobilité des récepteurs de lectine s'accroît au cours du développement
embryonnaire. L'accroissement de la mobilité des
protéines sur la période considérée du développement est beaucoup plus important que celui des lipides.
De plus, l'évolution des cinétiques de diffusion des lipides et des protéines ne s’effectue pas en parallèle.
Dès lors, il semble que leur mobilité respective soit soumise à des mécanismes de contrôle différents.
Nos mesures sur la mobilité des protéines indiquent également qu'une forte proportion des récepteurs de lectine sont imm.obiles dans le plan de la membrane.
Cela suggère que certains constituants du cytosquelette restreignent les déplacements des glycoprotéines
de membranes.
Nos résultats montrent que la fraction de glycoprotéines immobiles augmente au cours du développement embryonnaire
Dès lors, il sem.ble se produire des modifications dans les relations membrane-cytosquelette au cours du
développement. Par ailleurs, nous ne pouvons être assurés d'observer la même population de récepteurs membranaires entre les stades considérés du développement De nouveaux constituants membranaires peuvent faire leur apparition à des moments précis du développement et
présenter differents degrés de liberté au sein de la
membrane vis-à-vis des associations transmembranaires
avec le cytosquelette.
Pages
I. INTRODUCTION 1
2 . mTÉRIIILS ET MÉTHODES 34
3 . COMPORTEMENT IN VITRO DES CELLULES DE BATRACIEN 3.1. Introduction
3.2. Rcisultats
3.2.1. Comportement des cellules dissociées sur agor S2 a - chez l'axolotl et le pleurodèle 52
b - chez le xénope 53
c - traitem.ent par la lidocaîne 60 d - traitement par les acides gras 60 e - traitement par les lectines 64 f - effet de la cytochalasine 64
3.2.2. Comportement des cellules dissociées sur un plastique 72 destiné aux cultures cellulaires CPalconI
a - Observation de cellules dissociées d'axolotl après 72 1H de culture dans le NT
b - Obsei^/ation de cellules dissociées d'axolotl après 82 24H de culture dans le NT
c - Effet des acides gras sur l'adhésion cellulaire 83 d - Effet de la lidocaîne sur l'adliésion cellulaire- 83
3.3. Discussion 90
4.1. Introduction 4.2. Résultats
4.2.1. Redistribution des récepteurs de lectines 4.2.2. Endocytose des récepteurs de lectines 4.2.3. Effet des acides gras sur le capping des
récepteurs de lectines
4.2.4. Effet de substances altérant l'intégrité du cytosquelette sur le processus du capping a -• Traitement par la colchicine, la colcémide
et la Vinblastine
b •• Traitement par la cytochalasine
c - Traitement par les anesthésiques locaux 4.2.5. Ultrastructure du cap
4.2.6. Fiijtation de lectines surdes cellules dissociées à différents stadesdu développement
a - Fixation de SBA-FITC sur des cellules dissociées de pleurodèle et d'axolotl b - Fixation de ConA - FITC sur des cellules
dissociées de xénope 4.3. Discussion
110
no
111 111 112
112 120 120 120 130 130
136
144
5 . EFFET' DES LECTINES SUR LE DÉVELOPPEMENT DE L'EfTBRYON DE BATRACIEN 5.1. Introduction
5.2. Résultats
155 156 5.2.1. Effet de la WzA sur le développement des embr>’onsn 6
de pleurodèle
a “ début du traitement au stade jeune blastula - Bnbryons traités en présence de la -155
membrane vitelline
- Embryons traités en absence de la membrane
vitelline -157
b - début du traitement en jeune et moyenne gastiula
160
a - Embryons traités en présence de la mebrane vitelline 167 b - Dribryons traités en absence de la membrane vitelline 167
5.2.3. Spécificité 168
5.3. Di.scussion 171
6. KESURES DE LA MOBILITÉ U\TFRALE DES CONSÏITLTI'AÎTrS MEMBRANAIRES PAR LA TECHNIQUE DE "FLUORESCENCE PHOTOBLEACHING RECOVERY" (FPR)
6.1. Introduction 175
6.2. Résultats 180
6 .2. -1. Mesures de la mobilité latérale des lipides membranaires 180 6.2.2. Mesures de la mobilité latérale des récepteurs de la ConA 184
6.3. Discussion 191
7 . CONCLUSIONS GÉNÉRALES 201
X
1. INTRODUCTION
L'oeuf vierge de batracien prése”nte une polarité animale/
végétative qui correspond à l'axe céphalo-caudal du futur embryon. A la suite de la pénétration du spermatozoïde qui amène l'oeuf dans sa phase de développement, un plan de symétrie bilatérale apparaît dans l'oeuf. Ce plan peut être reconnu par la présence d'une zone dépigmentée;
le croissant gris qui coïncidera avec le côté dorsal de 1 'embryon.
Peu de temps après la fécondation, l'oeuf s'engage dans un processus de segmentation caractérisé par des cycles cellulaires rapides et synchrones. Tout se passe comme si J durant cette phase de développement, l'embryon n'était concerné que par la multiplication de ses noyaux et la cellularisation de son contenu cytoplasmique. Aucune synthèse de RNA n'est encore décelable à ce stade
(Woodland et Gurdon 1969; Newport et Kirschner 1982b).
Brusquement, (au 11ème clivage chez l'axololt et au 12ème clivage chez le xénope), la cinétique des divisions se modifie: les cycles cellulaires s'allongent et deviennent asynchrones. (Satoh 1977; Signoret et Lefresne 1971;
Kabayakawa 1981). Les phases G1 et G2 font leur apparition dans le cycle cellulaire; d'autre part, la phase de
syntnèse du DNA et la mitose connaissent un allongement global de leur durée (Nev;port et Kirschner 1982^^).
Cette période de divisions asynchrones correspond au stade de la blastula jeune et a été appelée par Signoret et Lefresne (1971): "la transition blastuléenne".
A ce stade du développement, les blastomères adoptent le cycle cellulaire typique de toute cellule somatique en prolifération.
Il scîmble que cette période coïncide avec de profonds
remaniements de la cliroiriatine car, outre les modifications
du cycle cellulaire, en assiste à 1 'activitation de la
transcription du RNA dans le noyau.
De plus, des RNA messagers particuliers à ce stade, ont été mis en évidence (Davidson et co.1968).
Selon Nevqjort et Kirschner (1 982 b), l'activation de la transcription lors de la"transition blastuléenne", pourrait résulter de la carence d'une substance initialement
présente en excès dans le cytoplasme de l'oeuf; son rôle serait de contrôler le mécanisme de la transcription.
A chaque cycle de réplication du DNA, une certaine quantité de cette substance serait mobilisée par le matériel
nucléaire et cela, jusqu'au 11 ème ou 12 ème clivage; à ce moment, ce facteur serait fortement dilué par rapport à la inasse de matériel génétique croissant.
La segmentation ne semble pas s'accompagner de mouvem.ents cytoplasmiques importants; elle donne naissance à un
germe cellularisé qui conserve apparemment les dispositions qui existaient déjà dans le cytoplasme de l'oeuf indivis.
Par contre, la séquence du développement qui lui succède:
la gastrulation, est une phase essentiellement dynamique.
Lor£i de la gastrulation, l'embryon est le siège de mouve
ments cellulaires complexes qui aboutissent à l'édification d'un germe tridermique.
L'ectoderme s'établit en position extérieure, l'endoderme se confine dans la profondeur de l'embryon et le mésoderme revêt une situation intermédiaire entre les deux autres feuillets.
Après l'édification de cette organisation, les trois feuillets participent à l'élaboration des organes. Par exeirple, le neuroectoderme donne naissance au tube nerveux;
le chordomésoderme à la chorde dorsale (axe de soutien
de l'embryon et aux somites) et l'endoderme au tube digestif.
Chez l'axolotl et le pleurodèle (üi’odcles) , la gastrulation débute par la formation du sillon blastoporal: une encoche située au niveau de la zone marginale dorsale s'étend
latéralement pour former un sillon perpendiculaire au plan de symétrie bilatérale. La lèvre blastoporale progresse en s'incurvant de plus en plus, jusqu'à circonscrire une calotte au pôle végétatif (le bouchon vitellin} , par la fusion de ses bords latéraux. Le blastopore circulaire se resserre progressivement, en faisant disparaître le bouchon vitellin à l'intérieur de l'embryon. La formation du
sillon blastoporal résulte de l'invagination de "cellules en bouteilles" dans la masse endodermique dorsale, juste au-dessous du croissant gris. Ces "cellules en bouteilles"
restent dans la partie profonde du sillon blastoporal et
elles semblent conduire l'avancée do ce sillon dans l'embryon à mesure qu'il s'enfonce pour former 1 'archenteron.
(Keller 1981). L'endoderme pharyngien et le mésoderme préchordal s'invaginent dans l'embryon au niveau du blasto
pore en un ruban cellulaire continu. Une fois à l'intérieur de l'embryon, la masse cellulaire invaginée perd sa cohérence.
Les cellules migrent dans un ordre beaucoup plus dispersé sur le plafond du blastocoele en direction de l'extrémité céphalique de l'embryon (Iloltfreter 1 943-1944). La masse endodermique végétative bascule passivement à l'intérieur de l'embryon (Nakatsuji 1974). Simultanément, l'ectoderme effectue un mouvement d'expansion qui l'amène à recouvrir tout le germe: c'est le mouvement d’épibolic (Holtfreter '
1944) .
Chez le xénope (Anoure) , la disposition des territoires
embryonnaires est un peu différente, ce qui entraîne
quelques variantes dans le processus de la gastrulation.
En surface, l'embryon se compose presqu'exclusivement d'ectoderme et d'endoderme; le mésoderme est confiné principalement dans les couches profondes de la zone
marginale. Chez d'autres Anoures comme Bufo, les cellules mésodermiques semblent aussi originaires de la zone
marginale interne (Nakatsuji 1974). Lorsque débute la gastrulation, la migration des cellules mésodermiques internes précède la formation du sillon blastoporal et l'invagination de l'endoderme pharyngien dans l'embryon
(Keller 1975-1976-1977).
Précédemment, on avait attribué aux "cellules en bouteilles"
un rôle déterminant dans le processus de la gastrulation.
Des observations d'Holtfreter (1944) incitaient à penser que, par leur migration active à l'intérieur de l'embryon, les cellules en bouteilles entraîneraient à leur suite la couzhe cellulaire superficielle. Hoitfreter a montré notamment que les "cellules en bouteilles" déposées sur un expiant d'endoderme, migrent à l'intérieur de la masse endodermique et simulent la formation d’un petit archen- téron. Ce comportement constituait pour Hoitfreter, une démonstration du caractère infiltrant de ces cellules.
Cependant, les travaux de Keller (1981) ont remis en
question le rôle assigné aux "cellules en bouteilles" lors de la.gastrulation, (du moins, chez l’embryon de xénope).
Selon Keller (1981), les m.ouvements principaux de la
gaserulation sont constitués par la migration des cellules mésodermiques et le mouvement d'expansion de la couche
ectodermique vers l'extrémité végétative. Les "cellules en bouteilles" seraient entrainées passivement par le courant des cellules rcésodermiques. Il montre, en accord avec Cooke (1 975), que 1 ' onlèvem.ont des "cellules en
bouteilles" n'affecte ni l'invagination de l'endoderme
àupra-blastoporal, ni la migration des cellules profondes
de la zone marginale.
L*a.rchenteron appaT'ait simplement tronqué dans sa région antérieure. Par contre, l'ablation des cellules profondes de la zone marginale entraîne le blocage des migrations internes et inhibe le mouvement de la couche cellulaire superficielle.
L'invagination cellulaire dans l'embryon semble donc être uniquement dépendante de la motilité des cellules profondes de la zone marginale.
Lesmécanismes qui induisent et contrôlent les mouvements de la gastrulation restent tout à fait inconnus à ce jour.
De toute évidence, l'établissement de la polarité animal- végétative et la symétrisation de l'embryon, qui s'effectuent très tôt dans l'embryogénèse, semblent être déterminants.
L'importance de ce plan d'organisation antérieur à la gastrulation se révèle notamment dans le phénomène de la pseudogastrulation (Holtfreter 1943; Smith et Ecker 1970) que l'on peut induire en traitant des oocytes de grenouille par la progestérone. Les oocytes ainsi traités sont le siège de mouvements cytoplasmiques qui ressemblent, d'un point de vue morphologique et tem.porei, au processus normal de la gastrulation. Ces mouvements s'amorcent dan:; l'oocyte en l'absence de toute cellularisation, après une période de latence qui coïncide avec le moment où débute la gastrulation dans l'oeuf fécondé.
Au terme de la phase de segmentation, l'apparition de propriétés d'adhésion' et de reconnaissance cellulaires, la manifestation d'une certaine motilité cellulaire,
constituent des évènements fondam.cntaux pour le déroulement
de ]a gastrulation.
L'invagination du chordoniésoderrae et de l'endoderme pharyngien résulte essentiellement de la migration active des cellules individuelles sur le plafond du blastocOele (Nakatsuji 1974; 1975a; 1975b; 1976). Les ceü.ules embryonnaires, jusqu'alors immobiles, acquièrent la capacité de sc mouvoir. L'activité dynamique des
cellules débute par l'émission de protubérances cyto
plasmiques de faible amplitude à la surface des cellules
(les blebs). Ensuite, les mouvements de surface s'amplifient et donnent naissance à des projections hyalines jouant un rôle: actif dans la locomotion tels que les lobopodes, les filopodes et les lamellipodes. Les lobopodes sont des
protubérances de forme globulaire, tandis que les filopodes sont des projections longuement effilées sur le substrat;
les lamellipodes sont des lames de cytoplasme largement étalées en bordure des cellules, qui présentent souvent de fines projections rayonnantes.
Chez d'autres espèces embryonnaires, des organites de locomotion très semblables apparaissent sur la surface des cellules migrantes au moment de la gastrulation.
Chez l'oursin, lors de la migration du mésenchyme primaire, les cellules étendent de longs filopodes par lesquels,
elles établissent des contacts avec les cellules ecto- dermiques de la paroi du blastocoele (Gustafson et Wolpert
1961) .
Chez le poulet, les cellules mésodermiques adoptent un aspet fibroblastique et forment activement des filopodes lorsqu' elles s'invaginent au niveau de la ligne primitive entre l'épiblaste et l'hypoblaste (Trelstad 1967).
Le transparence des oeufs d'Oryzias latipes (Téléostéen) permet de suivre in vivo les migrations cellulaires pendant
toute la gastrulation. Dès le stade morula, la surface
des blastomères commence à onduler; au stade jeune blastula,
des blebs apparaissent et se rétractent rapidement.
Au stade de la blastula moyenne, de V'éritables lobopodes sort visibles; très souvent ils se propagent en un
mouvement circulaire autour du corps cellulaire. En blastula avancée et pendant toute la gastrulation, la locomotion des cellules profondes du blastoderme devient évidente et la distance de tranlocation des cellules augmente graduellement. A ce stade, les lamellipodes et les filopodes deviennent le trait dominant de la locomotion cellulaire (Kageyama 1977).
Chez les batraciens, Kubota et Durston (1978) ont recouru à un artifice afin de suivre les moiu'-em.ents de la gastrulation sans provoquer de trop grandes perturbations. Ils ont
ouvert des gastrulasd'axolotl en déroulant l'ectoderme qui forme le plafond du blastocoele sur une lame porte- objet. Au début de la gastrulation, (st 10), ils observent que le sillon blastoporal s'est dessiné en surface;
cependant, les cellules marginales internes entament leur progression sur la face interne de la couche ectodermique.
Les cellules migrantes adhèrent lâchement les unes aux autres. elles possèdent un lamellipode à leur extrémité antérieure et de leur extrémité postérieure arrondie émerge une fine projection connectée à une autre cellule.
Ces interactions entre cellules migrantes sont indispensa
bles pour permettre un mouvement directionnel normal.
Les cellules isolées de la masse des cellules migrantes, sans doute à la suite de la dissection de l'embryon, restent im.mobiles ou ne se déplacent qu'à une vitesse réduite.
Lors de leur migration, les cellules du chordomésoderme et de l'endoderme phaiyngien forment des projections de surJ'ace dont la forme varie chez différentes espèces de batraciens (Nakatsuji 1976). Chez Bi.ifo, les cellules progressent à l'aide de lobopodes morphologiquement
semblables à ceux décrits chez les Téléostéens par Trinkaus
et Lenz (1967) et par Trinkaus (1973). Les projections
émises chez le Xénope sont beaucoup plus fines et plus angulaires. Cependant, les filopodes semblent être les structures les plus fréquentes chez ces deux espèces.
Chez les Urodèles, Nakatsuji (1976) a observé à la fois des blebs, des lobopodes, des filopodes et des lamellipodes à la surface des cellules migrantes.
Un réseau de matériel fibrillaire tapisse la couche ecto- dermique formant le plafond du blastocoele. Cette trame fibrillaire est orientée dans le sens de l'axe céphalo
caudal et pourrait guider le mouvement des cellules. En effet, les filopodes des cellules migrantes semblent s'y attacher préférentiellement (Nakatsuji et Johnson (1983a).
L'apparition de ces fibrilles coïncide avec le départ
des migrations cellulaires vers le pôle animal. Il semble que ce réseau fibrillaire soit moins abondant chez les anoures que chez les urodèles (Nakatsujiet Johnson 1983b).
Il apparaît donc que la formation de projections de surface servant à la locomotion, le maintien des contacts entre cellules et la présence d'un réseau fibrillaire extra
cellulaire pour guider les migrations constituent trois facteurs d'importance lors de la progression des cellules.
Plusieurs auteurs ont suggéré que des modifications de
surface relatives aux pliénomènes de reconnaissance cellulaire et aux propriétés d'adhésion, seraient à la base de l'induc
tion des mouvements morphogénétiques de la gastrulation.
Selon Trinkaus (1963-1973), certaines propriétés d'adhésion sont essentielles au mouvement des cellules.
Chez les poissons, les cellules dissociées au stade jeune
blastula forment activement des blebs et se réagrègent très
peu les unes avec les autres. En blastula avancée et en
jeune gastrula, les cellules ont tendance à s'étaler sur
un substrat comme le verre et sont ca]>al>les de se réagréger
rapidement (Trinkaus 1963).
L'examen de 1 ' ultrastrin'ture révèle que les cellules des blastulas avancées où des gasti'ulas sont capables de former des jonctions intercellulairos; par contre, les cellules de blastula n'établissent jamais de contacts entre elles
(Txinkaus 1963).
Trelstad, Hay et Revel (1967) ont observé, chez l'embryon de poulet, que lorsque les cellules du mésenchyme migrent latéralement à partir de la ligne primitive, elles
établissent, avec la surface basale de l'épiblaste et de 1 'hypoblaste, des "close junctions", c'est-à-dire des aires de contacts entre deux cellules où l'espace intercellulaire est réduit, et des "tight junctions", c'est-à-dire des aires de contacts au niveau desquelles on ne discerne pas d'espace extracellulaire entre les membranes apposées. Ce type de jonctions s'observe également entre les cellules migrantes elles-mêmes, essentiellement au niveau de leur pôle postérieur, car
un filopode est généralement présent sur le pôle antérieur.
Chez les batraciens, Johnson (1972) suggère qu'un accroisse
ment de l'adhésion intercellulaire est indispensable aux mouvements de la gastrulation. Ses travaux en microscopie éleztronique ont montré que les cellules d'un embryon en cours de gastrulation établissent entre elles des contacts de olus en plus étroits.
En 1955, Holtfreter a apporté une nouvelle interprétation des mécanismes de la gastrulation: le concept des affinités tissulaires. Il a suggéré que la gastrulation serait
contrôlée par les propriétés d'association des feuillets embryonnaires inhérentes aux cellules qui les composent.
Au cours d'expériences où il a combiné des fragments des différents feuillets, il a montré que la configuration tridermique finale de l'embryon résulte de l'expression d'affinités positive ou négative entre les feuillets
embryonnaires. Ainsi, lorsqu’il a combiné de l'ectoderme
avec de l'endoderme, les deux fragP'cnts ont formé tout
d'abord une masse compacte; mais plus tard, ils se sont
sépares l’un de l'autre. Si on associe du mésoderm.e à la
combinaison, l’affinité négative disparait: le mésoderme
empêche la ségrégation des deux fragments. Le schéma d ' cirganisat ion des trois fragments ainsi combinés,
res.semble à celui de l'embryon: un épithélium d'origine ectodermique recouvre la masse embryoîde; un épithélium tubulaire d'origine endodermique occupe la profondeur de cette masse tandis qu'une couche de cellules mésenchyma
teuses se trouve en position intermédiaire.
Les quelques exemples cités ci-dessus témoigent de l'importance des interactions cellulaires lors des
mouvements morphogénétiques. Il est généralement admis que les molécules qui interviennent dans les processus
d'adhésion et de reconnaissance cellulaire, sont localisées au niveau de la membrane plasmique (Curtis 1978; Frazier et Glazer 1978). C'est pourquoi, la membrane a fait l'cbjet de nombreuses études, relatives à sa structure et à ses fonctions.
La membrane plasmique forme une enveloppe continue autour de la cellule, en contact par l'une de ses faces avec le milieu extracellulaire et par l'autre, avec le cytoplasme de la cellule. Elle se compose de lipides, de protéines et de chaînes polysaccharidiques. Les polysaccharides sont attachés soit à des polypeptides (les glycoprotéines),
soit à des lipides (les glycolipides) et sont localisés du côté extracellulaire de la membrane (Singer 1974).
Parmi les lipides membranaires, les phospholipides forment la matrice de base (55 % des lipides totaux). Ce sont des composés dérivés du glycérophosphate. La molécule de
glycérophosphate est estérifiée par deux chaînes d'acides gras formant l'acide phosphatidique. L'un des trois
composés aminés suivants; la sérine, 1 'éthanolamine ou la choline peut éventue 11 ement s'attacher au groupement
phosphate de l’acide phosphatidique.
Les composés ainsi formés sont amphotères: acides par le groupement phosphoryle (et éventuellement par le groupement caiboxyle d'une sérine), et basiques par la présence des groupes aminés ou N-triméthylés. Il existe aussi des lip'ides membranaires qui ne sont pas construits à base de glycérol; ce sont des dérivés d’une longue chaîne
aliphatique d'une base aminée: la sphingosine, portant une chaîne d'acide gras. Ils peuvent être phosphorylés ou non. C'est dans cette famille de lipides que l'on trouve
les glycosphyngolipides qui contiennent un ou plusieurs résidus glucidiques (5 % des lipides totaux dans la couche lipidique externe).
La diversité des acides gras est relativement grande, il
existe des chaînes saturées et non saturées. La conformation des chaînes saturées est beaucoup plus compacte que celle des chaînes non saturées. Leur proportion relative est déterminante pour les propriétés physiques de la membrane et notamment pour la fluidité de la memorane.
La présence d'une double liaison dans la molécule d'acide gras produit un coude dans la chaîne hydrocarbonnée.
Seule la double liaison est rigide tandis que le reste de
la chaîne est capable de m.ouvements de rotation et de flexion.
Cette conformation des molécules d'acides gras insaturés rend l'assemblage des chaînes hydrocarbonnées beaucoup
plus difficile dans la membrane et engendre une organisation des lipides peu compatible avec l'état cristallin.
Le cholestérol est un lipide membranaire qui joue également un rôle important dans la modulation de la fluidité et
dans la stabilité de la membrane par ses intéractions avec les phospholipides.
Le noyau stéroïde du cholestérol immobilise partiellement la portion de la chaîne d'acide gras proche du groupement polaire du phospholipide, mais le reste de la chaîne
hydrocarbonnée est libre de se fléchir. Aux basses
températures, la prcser.ce de cholestérol dans la membrane
émpèche également les chaînes d’aciues gras de s'approcher
les unes des autres, do manière à créer un état cristallin.
certaines données pliysiques, chimiques et biologiques relatives à la structure membranaire. Les modèles
membranaires les plus courants postulent une organisation des lipides en double feuillets. Les chaînes hydrophobes
(chaînes acyls des acides gras sont en vis-à-vis, les pôles hydrophiles sont en regard des milieux aqueux.
Dans la membrane d'érythrocytes, les phospholipides sont distribués de manière asymétrique entre les deux moitiés de La double couche lipidique (Bretscher 1975). Les plio.sphatidyléthanolamines et phosphatidylsérines sont concentrées essentiellement dans la moitié cytoplasmique de La double couche; les phosphatidylcholines et sphyn- gomyélines sont concentrées dans la moitié qui fait face à l'espace extracellulaire. Cependant, il n'existe pas encore de preuves d'une distribution asymétrique des
phospholipides dans la membrane d'autres types cellulaires.
Les premiers modèles membranaires de Danielli et Dawson (1935) ou le modèle de la "membrane unitaire" de Robertson (1959) ont proposé un arrangement trilamellaire: la double couche lipedique serait prise en sandwich entre deux couches
de protéines. Ce type de modèle est loin d'etre compatible avec: l'ensemble des résultats expérimentaux. Le recouvrement des pôles hydrophiles des molécules lipidiques par les
protéines est un arrangement thermodynamiquement instable (Singer et Nicolson 1972). De plus, les portions hydro
philes des phospholipides sont susceptibles d'être attaquées
•par des enzymes (Lenard et Singer 1 966), ce qui est en
contradiction avec leur masquage éventuel par des protéines.
Schéma 1 et 2
Le modèle de la mosaïque fluide d’après SI Singer et GL Nicolson
(1972) Science 1?5, ?20.
En 1972, Singer et Nice]son ont apporté, grâce à leur modèle de la "mosaïque fluide", deux éléments importants pour la compréhension de la structure de la membrane. Tout d'abord, la double couche lipidique est interrompue par des protéines int(îgrales qui pénètient au travers de la matrice lipidique.
Ensuite, la membrane est une organisation dynamique dont les constituants sont susceptibles de diffuser latéralem.ent.
La membrane consiste donc en une matrice lipidique fluide contenant des protéines intégrales sous forme monomériques ou agrégées. La structure amphipathique des protéines
int(îgrales conditionne leur orientation moléculaire et leur degré de pénétration dans la double couche lipidique.
En fait, il existe deux catégories de protéines liées à la membrane: les protéines périphériques et les protéines
intégrales (Singer et Nicolson 1972; Singer 1974). Les protéines périphériques se rencontrent de part et d'autre de ;.a double couche lipidique et ne sont que faiblement liées aux lipides par des interactions ioniques.
La spectrine do la membrane d'érythrocyte est un exemple typique de protéine périphérique; elle peut s'extraire
aisément à l'aide d'un agent chélateur ou dans des conditions de j'aible force ionique (Marchesi et Stéers 1968).
Les protéines intégrales représentent plus de 701 des
protéines totales de la membrane et sont amphipathiques
comme le sont les phospholipides. Elles possèdent une
portion hydrophobe enchâssée dans la matrice lipidique
et une portion hydrophile faisant saillie du côté intra
ou extracellulaire. l’isolement des pi’otélnes intégrales
nécessite des traitements par des agents chaotropiques tels
que les détergents, les acides biliaires, les dénaturants
et les solvants organiques. Isolées, elles restent souvent
associées à des lipides et sont quasi insolubles dans les
solutions aqueuses. La glycophorine de la membrane des
érythrocytes est une proteine intégïale dont la partie
hydrophile présente, du cété extracellulaire, des chaînes polysaccharidiques riches en acides sialiques. ■
Le corps de la molécule est profondément hydrophobe et traverse la matrice lipidique de part en part (Marchesi et Andrews 1971).
Les structures de base des chaînes
polysaccharidiques des glycoprotéines sont bien définies.
On distingue deux types de liaison entre le glycan et la protéine: les liaisons 0-glycosidiques où une N-acetyl- galactosamine (GalNac) est liée à un acide aminé hydroxylé, comme la sérine ou la thréonine et les liaisons N-gly-
cosidiques dans lesquelles la N-acetylglucosamine (GlucNac) est lié à un résidu asparagine.
Le rôle de la portion glycosylée dans la fonction de la
molécule reste tout à fait obscur, dans la majorité des cas.
Cependant, la structure bien définie des chaînes polysaccha
ridiques des proteines membranaires suggère que leur
existence n'est pas le fruit du hasard, d'autant plus que leur séquence est contrôlée par la haute spécificité des glycosyltransférases. Dans certains cas, la présence de la chaîne glycosylée est indispensabie au maintien de la conformation de la molécule. Si l'on traite une
solution contenant de la mucine (glycoprotéine de la salive) par la neuraminidase, qui enlève les acides sialiques,
la solution perd sa viscosité. Il est possible aussi que la présence des portions glycosylées protège les protéines contre les actions protéolytiques; il faut parfois faire agir la neuraminidase avant d'effectuer un traitement
par les protéases. La mêm.e séquence de base de la portion carbohydrate se rencontre chez de nombreuses glycoprotéines;
par contre, dans les glycolipides, la diversité des sucres est extrême. Dans les glycosphingolipides, les séquences possibles de la chaîne osidique liée à la chaîne céramide
(sphingosine + acide gras variable) sont extrêmement
variables. (Cer~Gal ; Cer-Gluc; Cer-GIuc-Gal; Cer-Gluc-GalNac,
A partir de ces structures de' base, on définit la série des
globosides, lactosides, gangliosides,...
Paifois on remarque que les glycolipides travaillent en cor jonction avec des glycoprotéines. Par exemple, des glycolipides sont impliqués dans l'action de l'hormone
thyroïdienne, la TSH. Lorsqu'on incube les cellules cibles en présence de la toxine tétanique qui se fixe sur les
gangllosides, on inhibe la fixation de la TSH sur son récep
teur protéique de surface. Les glycolipides semblent
jouer un rôle dans la transformation des cellules 3T3. Quand on infecte ces cellules par un virus transformant, on
observe la disparition des gangliosides GM1 de la surface.
On peut par ailleurs bloquer la transformation des cellules en les traitant par un anticorps anti-GMI.
I^es glycoprotéines de membrane sont directement impliquées dans les mécanismes d'adhésion cellulaire. Certains de ces composés de surface commencent à être caractérisés bio chimiquement.
Les premières observations qui ont été faites à ce sujet se rapportent à l'agrégation des cellules neurales de la rétine du poulet. Des glycoprotéines différentes ont été impliquées dans le processus d'agrégation des cellules du poulet.
L'une de ces molécules, la cognine (50.000 d) a été isolée sur la base de sa capacité de promouvoir l'agrégation
cellulaire (Lilien et Moscona 1967; Mc Clay et Moscona 1974;
Hausman et Moscona 1976).
La deuxième molécule identifiée est la N-CAM (nerve - cell adhésion molécule - 140.000 d) qui s'est révélée capable de neutraliser des anticorps dirigés contre la surface membranaire et qui inhibent l'agiégation cellulaire
(Thiery et co 1977).
Dept.is loi’S, la N-CAM a été mise en évidence dans différents tissus tels que le iiîuscle strié et le cerveau; et, de plus, on a découvert un constituant spécifique du foie: la L-CAM
(Liver-CAM) (Edelman 19S36).
Ler. molécules de N-CAM et de L-CAM apparaissent très tôt au cours de l’embryogénèse; leur distribution respective se chevauche lors des stades précoces du développement.
Cependant, à partir de la neurulation, la N-CAM se limite préférentiellement au tissu nerveux et, durant l'organo- génèse, la L-CAM domine dans les structures dérivées de l'endoderme (Edelman 1983a).
La L-CAM do l'embryon de poulet semble analogue à
1 'cvomoruline do l'embryon de souris, une glycoprotéine de membrane impliquée dans la com.paction des blastomères au stade morula (Hyafil et co 1982).
En raison de la large distribution des glycoprotéines N-CAM et L-CAM et de la précocité de leur apparition au cours du développement, Edelman Cl 983 a et b) suggère
qu'il n'y aurait que quelques types de molécules d'adhésion, correspondant tout au plus aux classes majeures de cellules et de tissus.
Ces molécules d'adhésion seraient soumises à des modulations au cours du développement, soit par des changements de
leur prédominance à la surface de cellules particulières soit par des altérations chimiques de ces molécules
conduisant à des modifications de leurs propriétés de 1 iaison.
Chez la souris, la N-CAM subit des modulations au cours du développement qui la convertissent en une forme adulte.
La nolécule impliquée dans l'adhésion des neurones de souris est une sialoglycoprotéine qui représente 11 des protéines de surface. Autour de la période périnatale,
la forme embryonnaire de la molécule est convertie en des formes adultes par perte d'acides sialiques et cela, dans plusieurs parties du cerveau.
Des expériences in vitio ont montré que la glycoprotéine désLalisée par l'action de la neuraminidase s'associe avec une autre molécule identique avec une efficacité beaucoup plus grande que la sialoglycoprotéine native.
Dès lors, une perte en acide sialique pourrait favoriser la liaison entre des molécules situées sur des cellules
adjacentes, en créant une diminution des forces de répulsion
électrostatiques fEdclman 1983b).
Chez la souris, il existe un mutant homozygote qui présente des anoinalies graves dans la constitution
du système nerveux. On remarque que, chez ces mutants, la conversion de la forme embryonnaire de la glyco- prctéine en forme adulte ne se fait pas; leur cerveau conserve les antigènes de surface embryonnaires (Hatten et Sidman 1 978) .
Les glycoprotéines de membrane sont aussi directement
impliquées dans les phénomènes de reconnaissance cellulaire.
Chez l'oursin, la fécondation en présence de sucres comme le L. fucose ou le N. acetylgalactosamine diminue le
pourcentage des spermatozoïdes attachés à la surface de 1 'oeuf.
Rosati et Co. Cl 980) ont montré que ces sucres qui sont présents sur la membrane du spermatozoïde et/ou sur la
surface de l'oeuf, sont fonctionnellement impliqués dans la reconnaissance entre l'oeuf et le sperm.atozoïde.
Les antigènes de membrane H 2 (chez la souris) et HLA
(chez l'homme) interviennent dans la reconnaissance du soi et du non soi et représentent une sorte de carte d'identité de la cellule. Ils appartiennent à un groupe de glyco
protéines possédant un polymorphisme génétique énorme.
Ces antigènes d'histocompatibilité sont, entre autres
choses, responsables du rejet des greffes par les lymphocytes T cytotoxiques; ils sont aussi capables de reconnaître
et de provoquer la destruction de cellules syngéniques infectées par des virus (Edelman 1976).
Certains travaux ont montré que la glycosylation des
protéines peut s'effectuer partiellement à la surface des
cellules grâce à la présence d'enzymes spécifiques: les
glycosyltransférases. Ces enzymes catalysent le transfert
d'un monosacchaiide sur une glycoprotéine ou un glycolipide
à partir d'un monosaccjiar
jde activé et cela, en l'absence
de tout "template" fShur et Roth 197.-').
Dans les premières théories concernant les mécanismes d'adhésion et de reconnaissance cellulaire, il a été pi'oposé que les cellules adhèrent et se reconnaissent
entre elles à l'aide de molécules complémentaires, localisées à la surface des cellules. A ce sujet, Roth et co.(1P71) ort suggéré que les molécules complémentaires, entre deux cellules apposées, seraient constituées par des enzymes et leurs substrats (en particulier, par les complexes carbohydrates et glycosyltransférases). Cette hypothèse leur était suggérée par des données montrant que des
éléments qui interfèrent avec l'activité des transférases inhibent l'adhésion intercellulaire chez les cellules embryonnaires de la rétine du poulet.
Chez la souris, le complexe T situé sur le chromosome
17 est susceptible de comporter diverses mutations léthales qui interfèrent avec le développement embryonnaire. Les produits du complexe T sont des antigènes de surface qui gouvernent certains mécanismes de reconnaissance et des interactions cellulaires dans les spermatozoïdes, les cellules de jeunes embryons et les cellules du térato- carcinome. Des résidus carbohydrates associés à ces ancigènes déterminent la spécificité des différents hajîlotypes t de ce complexe. (Cheng et Bennett 1 980).
Certains résultats suggèrent que les galactosyltransférases interviennent dans la fonction de ces antigènes de surface.
Par exemple, les spermatozoïdes qui expriment différents antigènes t ont un pouvoir fécondant supérieur aux
spermatozoïdes sauvages. Chez ces mutants, on observe
un accroissement considérable de l'activité des galactosyl- trg.nsférases par rapport au type sauvage (Shur et Bennett 1979).
D'autre part, 1'uridinediphospho (UDP)-galactose a un effet tératogène sur le développement des em bryons de souris (Shur, Oettgen, Bennett 1 9 79). Les niorulas incu
bées on présence d'UDP-galactosc, substrat des galacto-
syltransférases, ne se différencient pas en blastocyste
d'UDP galactose exogène contraint l'enzyme à effectuer le transfert du sucre sur un accepteur localisé entre les blastomères adjacents; elle affecte de ce fait, la
stabilité des associations inter-blastomériques.
Dans le modèle membranaire de la "membrane unitaire", (Roberson 1959), ou celui de la "mosaïque fluide"
(Singer et Nicolson 1972), la double couche lipidique fait office de membrane semi-perméable entre les environnements intra et extracellulaires. Elle anparait comme une matrice structurelle dans laquelle les protéines remplissent des fcnctions bien précises (transports actifs ou facilités, reconnaissance cellulaire,...). Cependant, le fait que, dans une membrane cellulaire typique, on recense plus d'une centaine de lipides différents suggère, de manière implicite, que les lipides membranaires constituent autre chose que
de simples "blocs de constructions" dans la membrane biologique, mais qu'ils peuvent participer à bon nombre de processus fonctionnels, (de Kruijff, Cullis et Verkleij
1980). En effet, la structure bilamellaire peut être réalisée à l'aide d'une seule espèce lipidique comme les phosphatidylchoiinos (Cullis et de Kruijff 1979). La
grande diversité des lipides membranaires pourrait s'expli
quer par le contrôle éventuel qu'ils peuvent exercer sur les fonctions des protéines. Cependant, il existe peu de faits montrant que l'activité des protéines nécessite un environnement lipidique particulier. De nombreux enzymes membranaiies, comme l'ATPase du réticulum
endoplasmique (Warren 1974, 1975), le cytochrome oxydase (Yu et co. 1975), la Na ^ K +ATPase du rein (De Pont et co 1978); la Ca 2+ Mg 2+ ATPase (Roolcfscn et co. 1977) sont actifs dans des îpi.lieux reconstitués à l'aide de phospholipides va)iés ou même dans du détergent pur
(Dean et Tanford 19/7).
Cullis et de Kruijff (1 979) oiir proposé que la grande variété des lipides irembranaires pouvait être nécessaire pour induire, dans la membrane, des alternances entre la structure classique en double feuillet et des configura
tions non bilamellaires.
A partir d'études réalisées sur des membranes artificielles, on a observé que les lipides membranaires sont susceptibles d'adopter toute une variété de phases différentes: bila- mellaire, hexagonale, cubique, rhombique, micellaire et en micelles inversés (Luzatti et co. 1968). Il semble que les phases hexagonales et bilamellaires soient adoptées de manière préfèrentielle (de Kruijff, Cullis et Verkleij 1980).
Par exemple le phosphatidyléthanolamine, isolée à partir de membranes d'érythrocytes existe en phase hexagonale à de; températures supérieures à 10°C. Par conséquent, aux températures physiologiques, ce constituant qui re])résente 301 des phospholipides membranaires, va s'opposer au maintien de la structure bilamellaire
(Cullis et de Kruijff 1978).
Il existe d'autres espèces lipidiques qui, à l'état
individuel, ont tendance à s'organiser en phase hexagonale;
c'est le cas du monoglucosy1diglycéride (Wieslander et
CO
1978; de Kruijff et co 1979), de l'acide phosphatidique (Papahadjopoulos et co 1976).
Le cholestérol (Cullis et co. 1978a; 1978b) et les acides gras insaturés (Cullis et Hope 1978c) peuvent induire la formation de phases hexagonales à partir d'un système en double feuillet. Les transitions entre phase hexagonale et bilamellaire s'effectuent aussi sous l'effet de
vaiiaticns de température ou de changement dans la cor.centration en cations bivalents (de Kruijff, Cullis et Verkleij 1980). Les lipides tels que les phosphatidyl- chelines ont par contre tendance à stabiliser la configu
ration en double couche.
La forme globale de la laolécule lipidique pourrait être
à l'origine de la préférence d'une espèce lipidique pour
une phase déterminée (voir Schéma 3). Les lipides qui
Oetergeots
W
Micellar Inverted Cône
,?>>c6phQt.dylcho(ine Sphingo^ebn Phospbovdylser.ne Pho&phot.dylglycef». l
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Schéma 5•
Différentes fonction
P R Cullis,B
DgKrui.jff 1979)
molécules de lipides.
(Bioch,Bioph A. 559,^-10 phas'es lipidiques possibles en de la forme dos
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