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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Pernot, E. (2008). Etude in vivo du rôle de la 5-phosphatase de phosphoinositides SKIP (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des Sciences – Sciences biologiques, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/210473/4/880c300f-37d4-4f27-9650-e43eb47d351b.txt
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DBM 00710
O '^ \ O Z
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
Faculté des Sciences
Institut de Biologie et de Médecine Moléculaires (IBMM)
Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire (IRIBHM)
Faculté de Médecine
Directeur de thèse: Dr S. Schurmans
Etude in vivo du rôle de la 5-phosphatase de phosphoinositides
V SKIP
j ULB - IBMM
i BIBLIOTHEQUE i
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences
Eileen PERNOT
Année académique 2007-2008
Table des matières
Table des matières
A bbreviations ... 17
B ut du travail ... 19
I. I ntroduction 23 I. L es phosphoinositides ...23
A. Le PtdIns(4,5)P2...25
AI. Rôle dans la physiologie cellulaire... 25
A2. Implications dans les pathologies humaines...27
B. Le PtdIns(3,4,5)P3...29
II. L a famille des 5- phosphatases d ’ inositols polyphosphates et DE PHOSPHOINOSITIDES... 31
A. Domaines protéiques... 31
B. Fonctions in vivo...35
III. SKIP... 43
A. Localisation intracellulaire...43
B. Activité 5-phosphatase... 43
C. Profil d’expression... 45
D. Fonctions... 47
IV. TRANSGENESE... 51
A. Techniques de transfert de gènes...51
AI. La microinjection... 51
A2. Utilisation de retrovirus...53
A3. Utilisation de transposons... 55
A4. Le transfert de gènes par les gamètes... 55
A5. Transgenèse ciblée dans des cellules embryonnaires souches... 57
B. Expression conditionnelle des transgènes... 57
BI. Les systèmes de transactivation transcriptionnelle... 59
B2. Les systèmes de recombinaison ciblée d’ADN...59
V. TRANSGENESE LENTIVIRALE... 63
A. Les rétrovirus... 63
B. Les vecteurs lentiviraux... 65
C. Animaux transgéniques lentiviraux...67
D. Limitations de la transgénèse lentivirale... 71
3
Table des matières
VI. L e rein dans le système urinaire ...75
A. Rôle des reins... 75
B. Structure des reins...75
C. Le néphron... 77
Cl. Le corpuscule de Malpighi...77
C2. Le tubule contourné proximal et le tubule droit proximal...79
C3. L'anse de Henlé...79
C4. Le tubule droit distal et le tubule contourné distal...79
D. Le tube collecteur... 81
E. La vasopressine et les aquaporines... 81
II R ésultats ...87
I. A pproches scientifiques ... 87
II. P roduction de souris transgèniques par micro - injection du TRANSGENE SKIP... 87
A. Stratégie scientifique... 87
B. Résultats...89
Bl. Obtention de l’ADNc de SKIP...89
B2. Introduction de mutations dans le domaine catalytique de SKIP... 89
B3. Clonage de l’ADNc sauvage ou muté codant pour la protéine SKIP dans un vecteur d’expression en cellule eucaryote... 91
B4. Excision de la séquence de la GFP dans des bactéries exprimant la recombinase Cre... 91
B5. Transfection des vecteurs d’expression de SKIP dans des cellules COS-7... 91
B6. Analyse par RT- PCR des ARNm de SKIP... 95
B7. Analyse par Western blot de l’expression de SKIP... 95
B8. Test d’activité 5-phosphatase de SKIP sauvage et mutée sur le substrat Ins(l,3,4,5)P4...95
B9. Génération des souris transgéniques par micro-injection des transgènes dans des oocytes fécondés de souris... 97
III. P roduction de souris transgèniques SKIP par transgenese LENTIVIRALE... 101
A. Stratégie scientifique...101
B. Résultats... 103
Bl. Construction du vecteur lentiviral... 103
B2. Excision de la séquence de la GFP et expression de SKIP en cellule...103
B3. Production du lentivirus SKIP sauvage et SKIP mutée... 105
B4. Infection d’embryons de souris... 105
B5. Analyse des nouveaux-nés... 107
B6. Analyse moléculaire des souris lentivirales SKIP... 107
1) Analyse par Southern blot... 107
2) Analyse par Western blot... 109
3) Etude de l’activité 5-phosphatase de SKIP transgénique et endogène... 109
5
Table des matières
B7. Etude de l’expression de SKIP chez la souris sauvage...111
1) Profil d’expression de SKIP chez la souris...111
a) Northern Mot... 113
b) RT-PCR...113
c) Western Mot... 115
2) Etude de la traduction de SKIP...115
3) Immunohistochimie... 121
4) Western Mot à partir d’extraits protéiques de rein enrichis en fraction corticale ou médullaire...121
B8. Analyse phénotypique des souris lentivirales SKIP... 123
1) Paramètres généraux...123
2) Glycémie et insulinémie ... 123
3) Système immunitaire...125
4) Coordination motrice...127
5) Physiologie rénale ... 129
a) Analyse de l’urine et du plasma en conditions basales...129
b) Administration de diurétique...129
c) Test de concentration d’urine...131
d) Test de surcharge hydrique...131
e) PCR en temps réel sur le rein et le cerveau de souris SKIP LVB... 133
f) Western Mot anti-AQP2 et anti-AQP2phosphorylé... 135
III D iscussion ...139
I. E tude de SKIP endogene ... 139
II. G énération des souris transgèniques et etude de la SUREXPRESSION DE SKIP... 143
III. E tude du phenotype des souris transgèniques SKIP ... 147
A. SKIP et la voie de signalisation de l’insuline... 147
B. Rôle de SKIP dans la physiologie rénale...153
Bl. Effets de l ’insuline sur la réabsorption d’eau dans le rein...155
B2. SKIP et le trafic des AQP2... 157
IV A nnexes ... 165
I. M ateriel et méthode ... 165
A. Clonages...165
B. Mutagenèse dirigée...167
C. Transfections... 167
D. Observation de la fluorescence au microscope...167
E. Western blot... 169
El. Préparation des échantillons protéiques... 169
E2. SDS-PAGE... 169
1
Table des matières
E3. Anticorps... 169
F. RT-PCR...171
Fl. RT-PCR sur des ARNs provenant de cellules COS-7 transfectées par les vecteurs pBap-GFP-SKlP... 171
F2. RT-PCR sur des ARNs provenant d’organes de souris et de cellules non transfectées... 171
G. Induction bactérienne à l’IPTG... 171
H. Northern blot... 173
I. Production de lentivirus transgéniques... 173
J. Production des souris transgéniques lenti virales...175
K. Southern blot... 175
L. PCR de génotypage... 177
M. Immunoprécipitation... 177
N. Mesure de l’activité 5-phosphatase par dosage au vert de malachite...177
O. Transcription et traduction in vitro...179
P. Immunohistochimie... 179
Q. Tests de tolérance au glucose et à l’insuline... 179
R. Cytofluorimétrie et immunisation...181
S. Test de coordination motrice sur rotarod... 184
T. Analyse des urines et plasmas... 184
U. Expériences en cages métaboliques... 184
V. PCR en temps réel...184
W. Analyses statistiques... 188
II. B ibliographie ... 190
III. A rticle ... 215
9
Index des figures et tableaux
Index des fig ures et tableaux
I. INTRODUCTION
Figure 1. Molécule de phosphatidylinositol...22
Figure 2. Les localisations subcellulaires préférentielles des différents phosphoinositides... 22
Tableau 1. Les kinases et phosphatases de phosphoinositides chez les mammifères... 24
Figure 3. Le cycle des phosphoinositides...24
Tableau 2. Les domaines protéiques fixant les phosphoinositides... 26
Tableau 3. Les fonctions du PtdIns(4,5)P2...26
Figure 4. Le rôle du PtdIns(3,4,5)P3 dans la signalisation cellulaire... 28
Figure 5. La famille des 5-phosphatases d’inositols polyphosphates et de phosphoinositides... 30
Tableau 4. Phénotype des souris invalidées pour un membre de la famille des 5- phosphatases d’inositols polyphosphates et de phosphoinositides...30
Figure 6. La voie de signalisation de l’insuline...38
Figure 7. Profil d’expression de SKJP chez l’homme...44
Figure 8. Profil d’expression de SKIP chez la souris...46
Figure 9. Les méthodes de production d’embryons transgéniques...50
Tableau 5. Caractéristiques de la transgenèse par microinjection d’ADN et par utilisation de vecteurs lentiviraux...52
Figure 10. Les systèmes Tétracycline de transactivation transcriptionnelle... 58
Figure 11. Les systèmes Cre-LoxP et Flp-FRT de recombinaison ciblée d’ADN...58
Figure 12. Le cycle de vie des rétrovirus... 62
Figure 13. La production de souris transgéniques lentivirales... 64
Tableau 6. Les applications de la transgenèse lentivirale sur des souris et des rats...66
Figure 14. La structure d’un rein humain... 74
Figure 15. Le néphron... 76
Figure 16. Le corpuscule de Malpighi... 78
Figure 17. Les effets de la vasopressine sur les canaux hydriques AQP2...80
11
Index des figures et tableaux
II. RESULTATS
Figure 18. Mutagenèse dirigée dans le deuxième domaine catalytique de SKJP... 88
Figure 19. Clonage de l’ADNc de SKIP étiquetée dans un vecteur d’expression en cellule eucaryote... 90
Figure 20. Migration sur gel d’agarose des différents plasmides pBap-GFP-SKJP...92
Figure 21. Transfection des différents plasmides pBap-GFP-SKIP dans des cellules COS-7... 92
Figure 22. RT-PCR à partir de cellules COS-7 transfectées par différents plasmides pBap-GFP-SKIP... 93
Figure 23. Western blot sur des extraits protéiques de cellules COS-7 transfectées par différents plasmides pBap-GFP-SKJP... 93
Figure 24. Induction bactérienne à l’IPTG de SKIP sauvage et mutée...96
Figure 25. Western blot sur les produits de l’induction bactérienne à l’IPTG...96
Figure 26. Southern blot sur l’ADN génomique du fondateur SKIP et sa descendance... 98
Figure 27. Western blot sur des extraits protéiques de rein de souris transgéniques surexprimant SKIP... 98
Figure 28. Construction du vecteur lentiviral pWPXLd-CAG-GFP-SKIP...100
Figure 29. Expression protéique à partir du vecteur pWPXLd-CAG-GFP-SKIP sauvage, recombiné ou non... 102
Figure 30. Infection de cellules HEK 293-T par les lentivirus GFP-SKIP...102
Figure 31. Manipulation et infection d’embryons murins dépellucidés... 104
Tableau 7. Bilan de réimplantation des embryons infectés par les virus SKIP sauvage et SKIP mutée... 106
Figure 32. Analyse des nouveaux-nés SKIP sauvage...106
Figure 33. Southern blot sur de l’ADN génomique de souris transgéniques SKIP... 108
Figure 34. Western blot à partir d’extraits protéiques d’organes de souris transgéniques et contrôles... 108
Figure 35. Dosage d’activité 5-phosphatase sur des immunoprécipités de rein de souris sauvages et transgéniques SKIP... 110
Figure 36. Northern blot à partir d’ARN total d’organes de souris sauvage... 112
Figure 37. RT-PCR à partir d’ARN total d’organes de souris sauvage... 112
Figure 38. RT-PCR à partir d’ARN messager de cellules du système immunitaire... 114
Figure 39. Western blot à partir d’extraits protéiques d’organes de souris sauvage... 114
Figure 40. Western blot réalisé à partir d’immunoprécipités de coeur de souris sauvage, de souris transgéniques lentivirales GFP et lentivirales SKIP... 116
13
Index des figures et tableaux
Figure 41. Contexte de traduction de SKIP endogène et transgénique... 116
Figure 42. Transcription et traduction in vitro de divers ADNc de SKIP...117
Figure 43. Immunohistochimie sur des coupes de rein de souris sauvages et transgéniques SKIP...120
Figure 44. Western blot à partir d’extraits protéiques de reins enrichis en fraction de cortex ou de médulla...122
Figure 45. Test de tolérance au glucose et à l’insuline sur des souris SKIP LVB...124
Figure 46. Immunisation de souris SKIP LVB...126
Figure 47. Test d’équilibre sur les souris transgéniques SKIP... 126
Tableau 8. Paramètres généraux des urines et plasmas des souris transgéniques SKIP LVB et contrôles... 128
Figure 48. Administration de diurétique... 130
Figure 49. Test de concentration d’urine... 130
Figure 50. Test de charge hydrique...132
Figure 51. PCR en temps réel sur des extraits d’organes de souris transgéniques SKIP et sauvages... 134
Figure 52. Western blot anti-AQP2 et anti-AQP2 phosphorylé... 136
III. DISCUSSION Figure 53. Homéostasie du glucose augmentée chez les souris Pps ... 146
Figure 54. Isoformes de SKIP chez l’homme... 148
Figure 55. Isoformes de SKIP sur différents tissus et lignées cellulaires...148
Figure 56. Le transport des AQP2 à la membrane apicale des cellules principales du canal collecteur...152
Figure 57. Effets de la surexpression de SKIP chez la souris... 154
IV. MATERIEL ET METHODES Figure 58. Production de souris transgéniques lentivirales...174
Figure 59. Rotarod...182
Figure 60. Cage métabolique...182
15
Abbréviations
ABBREVIATIONS
AKT/PKB : Protein Kinase B AQP2 : Aquaporine 2
ADN : Acide DésoxyriboNucléique ADNc : ADN complémentaire ARN : Acide RiboNucléique A VP : Arginine Vasopressin Cre : Cyclization recombination EST : Expressed Sequence Tag GFP ; Green Fluorescent Protein GLUT4 : Glucose Transporter 4 1RS: Insulin Receptor Substrat LoxP : Locus of X-over PI
OCRL : OcculoCérébroRenal syndrome of Lowe PCR : Polymerase Chain Reaction
PDK : Phosphoinositide Dépendent Kinase PI3K : Phosphatidyl Inositol 3-Kinase
PtdIns(3,4,5)P3 : Phosphatidyl Inositol 3,4,5 trisphosphate PtdIns(4,5)P2 : Phosphatidyl Inositol 4,5 bisphosphate
RT-PCR : Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction
SHIP : Src-Homology 2 domain containing 5Tnositol Phosphatase (type I ou II) SKIP : Skeletal Mu scie and Kidney enriched Inositol Phosphatase
SKICH : SKIP Carboxyl Homology
VR2/AVPR2 : Vasopressin Receptor type II
17
But du travail
B ut du travail
Les membres de la famille des 5-phosphatases d’inositols polyphosphates et de phosphoinositides sont des enzymes dépendantes, caractérisées par la présence de deux domaines catalytiques conservés qui hydrolysent un phosphate en position 5 sur im noyau inositol. Les phosphoinositides (Ptdins) représentent environ 10% des lipides membranaires et sont impliqués dans de nombreuses cascades de signalisation cellulaire conduisant, entre autres, à la prolifération, l’apoptose, la différenciation, la sécrétion, le trafic vésiculaire et la mobilité cellulaire.
SKIP (Skeletal Muscle and Kidney enriched Inositol Phosphatase) est un des derniers membres de la famille des 5-phosphatases à avoir été découvert à ce jour. Cette enzyme hydrolyse majoritairement le PtdIns(4,5)P2 et le PtdIns(3,4,5)P3, son affinité pour les substrats hydrosolubles semblant faible ou inexistante. Des études de surexpression de SKIP en cellules tendent à montrer que cette protéine pourrait jouer un rôle de régulateur négatif dans la formation du cytosquelette d’actine et/ou dans la voie de signalisation de l’insuline.
Afin d’étudier in vivo la fonction de la protéine SKIP nous avons décidé de générer des souris transgéniques surexprimant cette protéine de manière conditionnelle.
19
--- N
INTRODUCTION
_______________________ J
21
Figure 1. Molécule de phosphatidylinositol.
Les trois cercles indiquent les trois sites potentiels de phosphorylation sur les carbones 3,4 et 5.
Figure 2. Les localisations subcellulaires préférentielles des différents phosphoinositides.
Des événements de phosphorylation et de déphosphorylation des phosphoinositides ont lieu au sein de la membrane plasmique, de l’appareil de Goigi, du réticulum endoplasmique et des endosomes précoces et tardifs.
D’après Di Paolo 2006.
Meinhraiie plasmique
PUllns(4)l^^ l•tdlns(^.5)l■2
puiiiis(5)r
y
l>l(lliis(J.4.5)P3
i
Ptdlns(3.4)P2
^ X
Introduction
I. INTRODUCTION
I. L es phosphoinositides
Le phosphatidylinositol et ses dérivés phosphorylés (PI ou Ptdins), plus communément appelés phosphoinositides, sont des composants mineurs mais ubiquitaires des membranes eucaryotes. Ces lipides sont constitués d’un noyau inositol phosphorylable en diverses positions et d’un squelette glycérol présentant deux chaînes d’acides gras (Xiaoling Zhang et Majerus 1998) (Fig.l).
Les phosphoinositides représentent environ 10% des lipides membranaires et sont impliqués dans de nombreuses cascades de signalisation cellulaire régulant, entre autres, la prolifération cellulaire, l’apoptose, la différenciation des cellules et tissus, la sécrétion cellulaire, le trafic vésiculaire et la mobilité cellulaire. Ils présentent, en fonction de leur espèce, une distribution subcellulaire préférentielle (Fig. 2). En effet, les membranes de l’appareil de Golgi sont riches en phosphatidylinositol 4-phosphate (PtdIns(4)P) tandis que le phosphatidylinositol 3-phosphate (PtdIns(3)P) est majoritairement concentré au niveau des endosomes. Le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) ainsi que le phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3) sont essentiellement localisés au niveau du feuillet interne de la membrane plasmique, le PtdIns(3,4,5)P3 s’y accumulant suite à une stimulation par des facteurs de croissance.
La production et l’hydrolyse des différentes espèces de phosphoinositides sont régulées par de nombreuses kinases et phosphatases (Tableau 1 et Fig. 2), permettant une modulation des diverses voies de signalisation dans lesquelles ces lipides sont impliqués.
Actuellement, cinq familles de kinases de phosphoinositides ont été caractérisées (Tableau 1). Il s’agit de la famille des PI 3-kinase, des PI 4-kinase, des PI 5-kinase, des PIP4Kinase et des PIPSKinase (Krauss et Haucke 2007). En fonction de lems affinités pour les différents substrats, ces kinases sont capables de phosphoryler in vivo le Ptdins, le PtdIns(3)P, le PtdIns(4)P, le Ptdlns(5)P ainsi que le PtdIns(4,5)P2 (Fig. 2) (Toker 2002).
Les phosphatases de phosphoinositides sont, quant à elles, regroupées au sein de trois grandes familles (Tableau 1). Les membres de la famille des 5-phosphatases peuvent, en fonction de leur spécificité de substrat, hydrolyser le phosphate en position 5 du cycle inositol du PtdIns(4,5)P2 et/ou du PtdIns(3,4,5)P3. Ceux de la famille des 4-phosphatases déphosphorylent le PtdIns(4)P et le PtdIns(3,4)P2 en position 4. Enfin, les membres de la
23
Tableau 1. Les kinases et phosphatases de phosphoinositides chez les mammifères
D’après Krauss et Haucke, 2007.
Esr> mes Iwformr Sabtiral préttmllci. LacafiaatiOB Pfttfaotosk !
Kinases PI3K PlIOu-d Pldln>44.5)P2 Membrane plasmique, noyau Cancer (pl lOa)
PI3Kt'2u Pldlns Membrane pla.smique. réseau trans-golgi -
PI3KC2($ Ptdln% Membrane plasmique -
PI3KC2y Ptdlns Appareil de Goigi -
VpN.Vt Pidlns Appareil de (iolgt. endosomc -
PI4K PMKtIa Ptdlns Appareil de (»o!gi. réseau trans-Ciolgi.
(membrane plasmique)
Désordre bipolaire
PI4KIII) Ptdlns Appareil de Cioigi. réseau trans>(k>lgi.
(membrane plasmique)
-
PMKIIIii Ptdlns RE. appareil de Cioigi -
PMKIIIf) Ptdlns Non au. appareil de Cîoigi -
Pl.-iK PIK-fyve Pldlns(3lP {'.ndosonw tardif Dystrophie coméenne
de |■ranv■ois-Ncctens
PIP4K PIP4Ko.p.Y l*tdlns(5)P Membrane plasmique (a. p); RL(y) -
PIP5K PlP5Ka.p.y Ptdlns<4)P Membrane plasmique -
3*ph4>Nphaia\C'i pti;ni,2 Ptdlns(3.4)P2. Ptdlns(3.4..S)P3 Membrane plasmique, appareil de (îolgi. noyau Cancer, maladie de ('owden
MIMI l>tdlns(3)P. Ptdlns(3.5)P2 MembrarK plasmique Myopathie
MTMRl-8 Ptdlns(3)P. Ptdlns<3.5lP2 Membraru.* plasmique, autres Maladie de Charcot-Marie-Tooth typc4BI (MTMR2)
4*phi>sphalascs Sac 1-3 Ptdlns(4)P Rb. appareil de (iolgi -
- Synaptojanlnl.2 Ptdlns(4)P? - -
TypcI.II Ptdlns(3.4)P2 - -
5-phosphatascs S) naplojanin 1.2 Ptdlns(4.5)P2 Vésicules de sécrétion, membrane plasmique. Désordre bipi>lairc.
mitochondrie syndrome de I3own
OCRL Ptdlns(4.5)P2 Réseau Irans-Golgi, lysi>some Syndrome oeculocérébral de Lonnc
SKIP l‘tdlns(4.5)P2 Rb. membrane plasmique -
PI PP Ptdlns(4.5)P2 Membrane plasmique -
SIIIPI Ptdlns(3.4.5)P3 Membrane plasmique Leucémie myéloïde,
syndrome de Pagef *
SHIP2 Ptdlns(3.4.5|P3 Membrane plasmique Diabète de type II?
5-phosphaiasc II Ptdlns(3.4.5)P3 - -
Pharbin Ptdlns(3.4.5)P3 - -
Figure 3. Le cycle des phosphoinositides.
La production et l’hydrolyse des différentes espèces de phosphoinositides sont régulées par des kinases et des phosphatases.
Déphosphorylation in
vivo par unephosphatase
^ Déphosphorylation in
vitro par unephosphatase Phosphorylation in
vivo par une kinase.
... ^ Phosphorylation in
vitro par une kinase.Ptdlns: phosphatidylinositol
Ptdins 3/4/5-P: phosphatidylinositol phosphorylé sur les carbones 3,4 ou 5.
Ptdlns (3/4/5)Px: phosphatidylinositol phosphorylé sur les carbones 3,4 et/ou 5.
PI3K: Phosphatidylinositol 3 kinase PI4K: Phosphatidylinositol 4 kinase
PIP4K; Phosphatidylinositol Phosphate 4 Kinase PIP5K; Phosphatidylinositol Phosphate 5 Kinase
PTEN: Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome TBN SHIP (I et 2y Src-Homology 2 domain containing S’Inositol
Phosphatase ( type I et II)
SKIP; Skeletal Muscle and Kidney enriched Inositol Phosphatase
Introduction
famille des 3-phosphatases peuvent déphosphoryler le PtdIns(3)P, le PtdIns(3,5)P2, le PtdIns(3,4)P2 et le PtdIns(3,4,5)P3. Il est à noter que certains des membres des ces trois familles sont aussi capables d’hydrolyser les inositols polyphosphates comme rins(l,4,5)P3 ou rins(l,3,4,5)P4.
Certaines protéines telles que des canaux membranaires, des adaptateurs ou des transporteurs sont capables de se fixer directement à des phosphoinositides, ce qui peut conduire à une modification dans leur localisation cellulaire et/ou dans leur activité.
Plusieurs domaines protéiques de fixation aux phosphoinositides ont été identifiés à ce jour, et présentent des affinités différentes en fonction des espèces lipidiques (Tableau 2) (Gilbert Di Paolo et Pietro De Camilli 2006) (Balla 2005)(Krau[ss] et Haucke 2007)(Lemmon 2008).
A. Le Ptdins (4,5)P2
AL Rôle dans la physiologie cellulaire
Le PtdIns(4,5)P2 a longtemps été considéré comme un simple précurseur d’Ins(l,4,5)P3, de diacylglycérol et de PtdIns(3,4,5)P3, trois messagers secondaires générés en réponse à la stimulation de divers récepteurs membranaires (Suh et Hille 2005).
Toutefois, il est aujourd’hui admis qu’outre son rôle de substrat pour les kinases, phosphatases et phospholipases de phosphoinositides, le PtdIns(4,5)P2 participe directement à la transduction de signaux intracellulaires en se liant à des protéines effectrices ou régulatrices de nombreuses cascades de signalisation (Tableaux 3A et 3B).
Par exemple, il a été démontré que le PtdIns(4,5)P2 favorise la polymérisation des filaments d’actine en fixant directement la profilin ce qui perturbe la capacité de cette protéine à séquestrer les monomères d’actine (Sohn et coll. 1995)(Lassing et U Lindberg 1988). En outre, la modulation artificielle du niveau de PtdIns(4,5)P2 au sein de la cellule conduit à une modification de la polymérisation du cytosquelette d’actine (Janmey et Uno Lindberg 2004). Ainsi, in vitro, des protéines qui dépolymérisent Tactine telle que la gelsolin, la villin, la cofilin et la profilin sont inactivées par le PtdIns(4,5)P2 tandis que des protéines telles que la vinculin, la talin, Tezrin et l’a-actinin qui lient les filaments d’actine les uns aux autres ou à la membrane peuvent être activées par ce lipide. Il est probable qu’en se liant aux protéines fixant l’actine, le PtdIns(4,5)P2 provoque leur déploiement et entraîne leur activation ou leur inactivation.
25
Tableau 2. Les domaines protéiques fixant les phosphoinositides
D’après Di Paolo 2006.
bùii.tt-ii',tA.u.iHfrpra Esenipie de protéines
PU PtdIn.s(4)P F.^PPl/2. OSBP
Ptdlns(3.4|P2 AKT PKB.TAPPI.2 Ptdlns(4.5)P2 PLCdcItal, dynamin
PtdInsI 3.4.5 )P3 BTK. AKT PKB. ARNO. GRPl
n \ 1 Ptdlns(3)P FEAL Mrs. SARA. PlKfyve
p\ Ptdlns(3)P SNX2.3.7.13
Pidlns(5)P SNXI3
Pidlns(3.4)P2 P47PHOX Ptdlns(4.5)P2 PI3kinase 11 Ptdlns(3.4.5)P3 CI SK
PTB Ptdlns(4.5lP2 Dabi. ARH. SUC
Ptdinst 3.4.5 )P3 sue
FERM Ptdlns(4.5)P2 Ezrin. mucsin. radixin. lalin
A/ENTH Pidlns(4)P EpsinR
Ptdlns(3.5)P2 Ent3p. Ent5p
Ptdlns(4.5)P2 APlSO.CALM.cpsin. IIIP
C2 Pidlns(4.5)P2 Synaptotapmin
GRAM I’tdlns(3.5)P2 Myotubularin
PDZ Ptdlns(4.5)P2 Syntonin
PHD Ptdlns(5)P ING2
Tableau 3. Les fonctions du PtdIns(4,5)P2.
Le tableau A présente les principales fonctions du PtdIns(4,5)P2 au sein de la cellule.
D’après Halstead et coll. 2005.Le tableau B présente de manière plus détaillée les familles de protéines interagissant directement ou non avec le Ptdlns(4,5)P2, afin de moduler diverses cascades de signalisation.
D’après Suh et Mille. 2005.A.
Fonctiou Suli'liat pour la phospholipase C Substrat pour la PI3kinasc
Substrat pour les phosphatases
Séquestration ou ré}>ulatiun de protéines lisant le Ptdlns(43>)P2
Réaction cnevmatique EfTets biologiques Hydrolyse en lns( 1.4.5 )P3 et
diaeylj’lyccrol
Régulation du relarguage de calcium intracellulaire via l'ln.s( I.4.5IP3.
Activation de la PKC (Protein Kinase C) par le diacylglyeerol.
Génération de Pldlns(3.4.5)P3
Régulation du chimiotactisme, de la migration cellulaire, de la survie cellulaire et du rendement membranaire.
Déphosphory lation par la 4- phosphatase IpjîD
Diminution locale de l'adhésion cytosquelette-membrane.
Stimulation du rendement membranaire nécessaire à l’internalisation bactérienne.
Déphosphory lation par une 5- phosphatase
L’hydrolyse du Ptdlns(4.5)P2 pennet la régulation de nombreux événements impliqués dans le tralTic vers la membrane.
Régulation de la migration cellulaire et de l’invasion tumorale \ ia la Synaptojanine 2
Fixation à des domaines protéiques spécifiques (ex: FERM. PH. ENTH)
Modulation de la polymérisation du cytosquelette d'actine. de l'endocytose, de l'exocytose, de la transcription et de la mobilité vésiculaire. Régulation de l'activité de certaines caspases et eanaux ioniques.
Fonction cellulaire Protéines impliquées
Localisation membranaire cPLA2a, mSOSI.PLCd. Pleckstrin. PLD. MARCKS, ARFI, GAP43, ARNO. CAP23
Trafic vésiculaire Spcctrin. Ankyrin, Actin. Synaptotagmin, Synaptobrevin. AP-2. API 80, Epsin. Dynamin. CTathrin Remodelage du cytosquelette
d'actine
a-Actinin. Gelsolin. Profilin. Cofilin. Vilin, Filamin. Destrin. Cap<i. capZ. Vinculin. Talin. WASP.
ER Ms. etc
Transj-orteurs NCXl, NUE 1-4, NME. PMCA
Canaux ioniques Kir, Kv. KCNQ. HERG, K2P, Cav, TrpL. TRP. CNG. ENAC, CFTR, RyR. lns( 1,4.5)P3R
Introduction
Le PtdIns(4,5)P2 semble aussi jouer un rôle important dans la régulation du trafic vésiculaire en servant de cofacteur à la phospholipase D qui stimule alors le bourgeormement de vésicules naissantes à partir de l’appareil de Golgi (Y G Chen et coll.
1997) (Oude Weemink, Lôpez de Jesùs, et Schmidt 2007).
De plus, l’hydrolyse du PtdIns(4,5)P2 semble nécessaire pour le démantèlement des vésicules de clathrin. Son affinité pour certains domaines protéiques lui permet de séquestrer à la membrane des protéines impliquées dans les processus d’endocytose, comme les adaptateurs AP2 et AP 180 ou bien la dynamin (Halstead, Jalink, et Divecha 2005) (Ford et coll. 2001) (Christina A Mitchell et coll. 2002).
Outre ses interactions avec des protéines cytoplasmiques, le PtdIns(4,5)P2 est aussi capable d’interagir avec de nombreux canaux ioniques et transporteurs membranaires.
Parmi les canaux ioniques, nous pouvons citer les canaux potassium comme les Kir (Inward-rectifier K+ Chaimels) qui sont impliqués, entre autre, dans la repolarisation des neurones, la maintenance de l’homéostasie du potassium et la signalisation par les protéines G (Gamper et Shapiro 2007). L’activation optimale des canaux K+ voltage- dépendant est aussi dépendante de la présence de PtdIns(4,5)P2. D’autres canaux ioniques régulant l’entrée d’ions calcium (Cav2.2), chlorure (CFTR) ou sodium (ENac) semblent aussi diversement affectés par la présence et la concentration de ce phosphoinositide. De plus, il participe à la modulation de l’activité de certains membres de la famille des TRP dans laquelle sont regroupés les canaux impliqués dans la perception sensorielle du froid, du goût, du menthol, de la douleur, etc. (Rohacs 2007).
A2. Implications dans les pathologies humaines
D’un point de vue physiopathologique, de plus en plus d’évidences permettent aujourd’hui de faire un rapprochement entre certaines pathologies humaines et les anomalies dans les voies de signalisation régulées par le PtdIns(4,5)P2 (Halstead, Jalink, et Divecha 2005).
L’hydrolyse anormalement élevée de ce lipide par la phospholipase C pourrait jouer im rôle délétère dans les déficiences cardiaques. En effet, en cas d’hypertrophie cardiaque, il est probable qu’une apoptose accrue de cardiomyocytes conduise à l’arrêt de l’activité cardiaque. Or, il a été démontré que le PtdIns(4,5)P2 réduisait l’activation de certaines caspases, responsables de l’apoptose des cardiomyocytes (Mejillano et coll. 2001).
Le PtdIns(4,5)P2 semble aussi être impliqué dans le syndrome de Lowe. Cette pathologie est provoquée par une mutation dans le gène de la 5-phosphatase OCRL (voir
27
Figure 4. Le rôle du PtdIns(3,4,S)P3 dans la signalisation cellulaire.
Au sein de la cellule, le PtdIns(3,4,5)P3 ainsi que le Ptdlns(3,4)P2 se fixent sur différentes protéines afin de moduler leur activité ou leur localisation. Ces interactions permettent de réguler certaines cascades de signalisation aboutissant à la survie cellulaire, au remodelage du cytosquelette d’actine, à la mitogenèse et au trafic vésiculaire.
D’après Toker 2002.
Remodelage de l’actine Survie Mitogenèse
Trafîc vésiculaire
Introduction
I.II.B) dont le substrat préférentiel est le PtdIns(4,5)P2. Cette anomalie génétique induit chez les patients un retard mental, une cataracte, un défaut de croissance ainsi qu’une pathologie rénale (Lowe 2005). Bien qu’actuellement les mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant à ce phénotype ne soient qu’imparfaitement connus, des expériences sur des fibroblastes de patients tendent à montrer qu’un défaut d’activité de la 5-phosphatase OCRL provoque des anomalies au niveau du cytosquelette d’actine, suite à une accumulation de PtdIns(4,5)P2 (Sharon F Suchy et Robert L Nussbaum 2002). En outre, cette protéine semble impliquée dans le trafic des endosomes précoces (Erdmann et coll. 2007).
Etant donné ses interactions avec les canaux potassium de la famille Kir, le PtdIns(4,5)P2 pourrait être impliqué dans les syndromes d’Andersen-Tawil et de Bartter.
Dans ces pathologies, des mutations au niveau des gènes Kir2.1 et Kir 1.1 respectivement, induisent une diminution de la fixation du PtdIns(4,5)P2 sur ces canaux potassium, ce qui altère leur activité et conduit au développement de la maladie (Lopes et coll. 2002).
Enfin, le PtdIns(4,5)P2 est aussi impliqué dans le développement des dysenteries bacillaires qui sont causées par les bactéries Shigella Jlexneri. Lors de leur entrée dans la cellule, ces bactéries expriment une 4-phosphatase de PtdIns(4,5)P2 ce qui permet de désorganiser le réseau d’actine à leur avantage (Niebuhr et coll. 2002).
B. Le PtdIns(3,4,5)P3
Le PtdIns(3,4,5)P3 est présent en quantité négligeable dans les cellules au repos. Lors d’une stimulation par un facteur de croissance, il est généré par la PI3Kinase à partir de PtdIns(4,5)P2 et sa concentration au niveau de la membrane plasmique augmente drastiquement. Sa présence, même transitoire, permet toutefois de réguler un grand nombre de processus cellulaires comme la prolifération, la migration, le chimiotactisme, la phagocytose, la différenciation ou la survie (Fig. 4) (Gilbert Di Paolo et Pietro De Camilli 2006) (Christina A Mitchell et coll. 2002).
Parmi les protéines activées directement ou non par le PtdIns(3,4,5)P3, nous pouvons citer Rac qui intervient dans le remodelage du cytosquelette d’actine, ainsi que les kinases PDK (Phosphoinositide-Dependent protein Kinases) et AKT/PKB (Protein Kinase B) qui sont impliquées dans le contrôle de la synthèse protéique, le métabolisme, la survie et le démarrage du cycle cellulaire (Toker 2002) (Lewis C Cantley 2002) (Takehiko Sasaki et coll. 2007).
29
Figure 5. La famille des 5-phosphatases dMnositols polyphosphates et de phosphoinositides.
Type de 5-phosphatase seion le substrat hydrolysé
Domaines protéiques
Typel:
1(1,4,5)P3 1(1,3,4,5) P4
QQ Q Q QQ
Type II:
I(1,4,5)P3 I(1,3,4,5)P4 P1(4,5)P2 PI(3,4,5)P3
___ LJ ■ !■
1r M I vpe 11 (lnpp:)D, 75 lOJa)
C... - ■ !■ I . 1 OCRL(Inpp5f)
r 1 T □□ 1 ^ Synaptojanin 1 (Inpp5g)
et 2 (Inpp5h)
0 : □□□'# PIPP(Pib5pa, 107kDa)
... QQ. . r~ii ÿ» sKiP(Pps)
Type III:
I(1,3,4,5)P4 P1(3,4,5)P3
Type IV:
PI(3,4,5)P3
■ L m I u JI □O
□□ ____
SHIP 1 (InppSd)
CL___ jujoa:
Q CLU IL3 [L3 i ::3
catalytique domaines riche en SH2 conservés proline
Sacl
iL-a SHIP2(lnppll)
Pharbin (InppSe, Type IV, 72 kDa)
1 a 1--- ■ 1--- 1
t motif motif motif domaine 14-3-3 zêta NPXY CAAX RhoGap
Tableau 4. Phénotype des souris invalidées pour un membre de la famille des 5-phosphatases dMnositols polyphosphates et de phosphoinositides.
5-phosphata$e Phénotype de souris invalidée
Type I
-Type II Dcgcncrcsccncc testiculaire progressive conduisant à la stérilité.
La double invalidation avec des souris OCRL KO provoque une létalité embryonnaire.
OCRL Chez l'homme: syndrome de Lovvc avec anomalies rénales, retard mental, cataracte.
Chez la souris: légers défauts dans la coordination motrice.
La double invalidation avec des souris Type II KO provoque une létalité embryonnaire.
Synaptojanin I Défauts neurologiques, mort post-natale.
Synaptojanin 2 -
PIPP -
SKIP -
SHIPl Activation accrue des cellules B et des macrophages, mort précoce par infiltration des poumons.
SH1P2 Résistance à l'obésité sous régime riche en graisses, anomalies dans le métabolisme du glucose.
Pharbin Ciliopathie similaire au syndrome de Bardet-Biedl conduisant à une létalité embryonnaire péri
natale.
: non renseigné
Introduction
IL L a famille des 5- phosphatases d ’ inositols
POLYPHOSPHATES ET DE PHOSPHOINOSITIDES.
Les membres de la famille des 5-phosphatases d’inositols polyphosphates et de phosphoinositides sont des enzymes dépendantes, caractérisées par la présence de deux domaines catalytiques conservés qui hydrolysent im phosphate en position 5 sur un noyau inositol (Fig.5) (C Emeux et coll. 1998). De plus, quatre autres domaines conservés, présents aussi chez certaines endonucléases, joueraient un rôle important dans le maintien de l’activité catalytique de ces enzymes (J C Whisstock et coll. 2000).
La famille des 5-phosphatases est classiquement divisée en sous-groupes selon les spécificités de substrat de chacim des membres (Fig.5). Quatre substrats peuvent être hydrolysés: deux inositols polyphosphates solubles en milieu aqueux (Ins(l,4,5)P3 et Ins(l,3,4,5)P4), ainsi que deux phosphoinositides membranaires (PtdIns(4,5)P2 et PtdIns(3,4,5)P3) (Schmid et coll. 2004).
A. Domaines protéiques.
Outre leur domaine catalytique capable de déphosphoryler différents substrats en position 5 de l’inositol, les 5-phosphatases présentent plusieurs domaines protéiques qui facilitent leur localisation subcellulaire et/ou la fixation de partenaires protéiques.
Par exemple, les 5-phosphatases de type I et de type II ainsi que la Pharbin possèdent un domaine CAAX (où C représente une cystéine, le A représente un acide aminé aliphatique et le X, un acide aminé quelconque) qui est un signal de modification post-traductionnelle consistant en l’ajout d’un lipide isoprenoïde (isoprenylation) à l’extrémité C-terminale de la protéine. Ce lipide permet alors l’insertion de la protéine aux membranes cellulaires ou bien facilite les interactions avec d’autres protéines (Wright et Philips 2006) (Sinensky 2000).
Les 5-phosphatases PIPP et SKIP ont im domaine SKICH qui assure leur localisation au niveau des renflements membranaires. Toutefois, les séquences de leur domaine respectif ne sont pas tout à fait identique (SKIP possède une séquence supplémentaire qui borde le domaine SKICH du côté carboxy-terminal). Des expériences en cellules COS-7 ont montré que ces différences se traduisent par la localisation constitutive de PIPP à la membrane plasmique alors que SKIP, situé au niveau de l’appareil de Golgi à l’état basal, migre vers les renflements membranaires sous l’effet de
31
Introduction
facteurs de croissance (Rajendra Gurung et coll. 2003). Le domaine SKJCH est aussi présent chez T6BP (TRAF6-Binding Protein) et NDP52 (Nuclear Dot Protein 52), deux partenaires protéiques de la Myosin VI. Toutefois, dans le cas de ces protéines, le domaine SKICH ne permet pas leur localisation aux renflements membranaires (Morriswood et coll.
2007).
Le domaine SH2 (Src Homology domain type 2), présent dans SHIPl et SHIP2, se lie spécifiquement à des séquences peptidiques contenant des tyrosines phosphorylées. Les interactions protéiques résultantes peuvent non seulement conduire à un changement de localisation subcellulaire afin de propager un signal, mais sont aussi susceptibles de moduler l’activité enzymatique d’un des deux partenaires (Cohen, Ren, et D Baltimore 1995). Des protéines telles que Grb2 (Growth factor Receptor-Bound protein 2) ou la PI3K (PI3-Kinase) interagissent avec le récepteur à l’EGF et IRS-1, respectivement, via leur(s) domaines(s) SH2.
Le motif NPXY (Asn-Pro-Xaa-phosphotyrosine), aussi présent chez SHIPl et SHIP2, interagit avec des protéines comportant un domaine PTB (PhosphoTyrosine Binding domain) qui, à l’instar du domaine SH2, intervient dans la formation de complexes de signalisation (Songyang et coll. 1995) (Uhlik et coll. 2005). La présence d’une tyrosine phosphorylée au sein de ce motif est nécessaire au recrutement de Shc par certains récepteurs aux facteurs de croissance (Margolis 1996).
Les synaptojanines, PIPP, SHIPl, SHIP2 et Pharbin possèdent un ou plusieurs domaines riches en proline (PxxP), cible(s) de protéines contenant un domaine SH3 (Src Homology domain 3). Au sein de la cellule, l’interaction de ces deux types de domaines conduit, en fonction des partenaires protéiques, à la régulation de l’activité d’enzymes, à des variations de concentration ou de localisation de composants participant à des voies de signalisation, ou bien encore, à l’échafaudage de complexes protéiques (Mayer 2001). Par exemple, le recrutement de SOS par Grb2 se fait grâce à leur domaine SH3 et PxxP, respectivement, ce qui permet par la suite d’activer Ras (voir Fig.6) (F McCormick 1993).
Le domaine SAM (Stérile Alpha Motif), présent dans SHIP2, est un module d’interaction protéique qui a la particularité de reconnaître ime grande variété de ligands.
En effet, il est capable d’homo- et d’hétéro-dimériser, de fixer des protéines ne comportant pas de domaine SAM et aussi de se lier à des ARN (Chongwoo A Kim et Bowie 2003) (Green et coll. 2003). Les protéines comportant un domaine SAM sont impliquées dans ime multitude de processus cellulaires allant de la transduction de signaux jusqu’à la régulation traductionnelle.
33
Introduction
Le domaine 14-3-3 présent dans la 5-phosphatase de type I et dans PIPP est un motif reconnu par la protéine 14-3-3 C» un adaptateur dimérique impliqué, entre autres, dans la migration cellulaire (Darling, Yingling, et Anthony Wynshaw-Boris 2005) et dans la voie des MAP-kinases (Mitogen Activated Protein Kinase) (Freed et coll. 1994). Des expériences in vitro ont montré que la fixation de 14-3-3 Ç à la 5-phosphatase de type I accroît l’activité catalytique de celle-ci (Campbell et coll. 1997).
Le domaine ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) de la Pharbin est un motif que l’on retrouve fréquemment dans la queue cytoplasmique de nombreux récepteurs immunologiques et qui permet la transduction de signaux depuis la surface cellulaire (Christina A Mitchell et coll. 2002). Son rôle dans la Pharbin est incormu à ce jour.
Le domaine RhoGap de l’OCRL permet à cette 5-phosphatase de se fixer à la protéine Rac GTPase, ce qui pourrait moduler la polymérisation d’actine dépendante de Rac au sein de la cellule (Faucherre et coll. 2003).
Enfin, le domaine Sac, découvert à l’origine chez la levure Saclp, est présent chez les Synaptojanins 1 et 2 mais aussi chez la 5-phosphatase humaine Hsac2. Dans le cas des Synaptojanins, il s’agit d’un domaine catalytique supplémentaire qui déphosphoryle in vitro le PtdIns(3)P, le PtdIns(4)P et le PtdIns(3,5)P2 (Hughes 2001). Par contre, chez Hsac2, ce domaine est capable de déphosphoryler le PtdIns(4,5)P2 et le PtdIns(3,4,5)P3 (Minagawa et coll. 2001).
Ces différents domaines confèrent aux membres de la famille des 5-phosphatases des interactions protéiques spécifiques ainsi qu’une localisation subcellulaire déterminée.
Si l’on ajoute à cela leur distribution tissulaire hétérogène, il devient plus aisé de comprendre pourquoi, malgré des spécificités de substrat qui se chevauchent, les membres de cette famille présentent des fonctions très différentes in vivo (Tableau 4).
B. Fonctions in vivo.
La 5-phosphatase de type I a la particularité de ne déphosphoryler que les inositols phosphate solubles comme l’Ins(l,4,5)P3 et l’Ins(l,3,4,5)P4. Au sein de la cellule, l’Ins(l,4,5)P3 joue un rôle déterminant dans le relarguage du calcium à partir des compartiments intracellulaires localisés au niveau du réticulum endoplasmique.
L’accroissement du niveau de calcium cytoplasmique régule de nombreuses fonctions cellulaires comme la prolifération, la contraction des cellules du muscle lisse, la sécrétion
35
Introduction
de neurotransmetteurs ou la fertilisation (Astle et coll. 2007). Des expériences de sous- expression de la Type I dans des cellules rénales de rat ont montré une augmentation du niveau d’Ins(l,4,5)P3, accompagnée d’ime prolifération accrue de ces cellules. Après injection dans des souris « nudes », ces cellules induisent la formation de tumeurs (Speed et coll. 1996). De plus, chez le nématode Caenorhabditis elegans, l’invalidation de cette 5- phosphatase conduit à des perturbations dans le cycle d’ovulation (Bui et Sternberg 2002).
La 5-phosphatase de type II semble impliquée dans les processus de maturation des spermatozoïdes et son invalidation chez la souris conduit à une dégénérescence testiculaire provoquant, à terme, la stérilité. L’analyse des testicules des souris mutées a montré ime vacuolisation du cytoplasme des cellules de Sertoli, un relarguage précoce des cellules germinales en développement dans l’épididyme, ainsi qu’une mobilité réduite des spermatozoïdes immatures (Elina Hellsten et coll. 2002) (E Hellsten et coll. 2001).
L’OCRL (OculoCerebroRenal syndrome of Lowe) est une 5-phosphatase dont la mutation chez l’homme conduit au développ>ement du syndrome de Lowe, une pathologie touchant une personne sur 200.000 et qui est caractérisée par des anomalies rénales (syndrome de Fanconi), un retard mental et une cataracte. Bien que le rôle de l’OCRL au sein de la cellule ainsi que les mécanismes conduisEint au développement de la maladie n’ont pas encore été parfaitement élucidés, cette protéine semble intervenir dans le trafic membranaire à partir de l’appareil de Golgi, dans la régulation du cytosquelette d’actine ainsi que dans les voies endocytiques précoces (Lowe 2005)(Erdmann et coll. 2007).
Toutefois, son invalidation chez la souris ne conduit qu’à un léger défaut de coordination motrice, ce qui suggère une compensation par une autre 5-phosphatase. Cette hypothèse a été confirmée par l’observation d’une létalité embryonnaire après croisement de souris invalidées pour l’OCRL et la Type II (Janne et coll. 1998).
Différentes études in vivo ont montré que la Synaptojanin 1 joue un rôle important dans l’endocytose des vésicules synaptiques (Astle et coll. 2007). Les souris invalidées pour cette 5-phosphatase meurent peu de temps après la naissance et présentent des défauts neuronaux se traduisant par une accumulation anormale de vésicules à manteaux de clathrin dans les neurones corticaux, ainsi qu’une augmentation de la concentration de PtdIns(4,5)P2 (Cremona et coll. 1999). C’est pourquoi il a été proposé que la Synaptojanin 1 favoriserait le démantèlement (uncoating) des vésicules à manteaux de clathrin, via l’hydrolyse du PtdIns(4,5)P2 qui est essentiel au recrutement d’AP2 et de la clathrin.
SHIPl (Src-Homology 2 domain containing 5’Inositol Phosphatase type I) joue un rôle important dans la régulation du système immunitaire et dans la tumorigenèse. Son
37
Figure 6. La voie de signalisation de IMnsuline.
L’insuline est une hormone sécrétée par les cellules B des îlots de Langerhans du pancréas en réponse à une augmentation de la glycémie. Elle se combine à son récepteur membranaire qui est composé de deux sous-unités a et de deux sous-unités p et qui est présent à la membrane plasmique des cellules sensibles à l’insuline. En se fixant sur les sous-unités a de son récepteur, l’insuline active l’activité tyrosine kinase intrinsèque des sous-unités P ce qui permet leur auto-phosphoiylation. Le récepteur phosphorylé recrute et phosphoryle les protéines 1RS qui vont à leur tour permettre le recrutement d’autres protéines impliquées dans diverses cascades de signalisation favorisant l’anabolisme ainsi que la prolifération et la différenciation cellulaire.
Au niveau du tissu adipeux et du muscle squelettique au repos, l’insuline provoque l’insertion des transporteurs de glucose Glut4 à la membrane plasmique, ce qui permet l’entrée du glucose dans la cellule.
Vlcnibnino pljsmiijiii.'
Prolifération cellulaire Différenciation
Cellule sensible à l'insuline
IRS:Insulin Receptor Substrat PI3K: Phosphatidylinositol 3 Kinase
SHIP2; Src-Homology 2 domain containing 5’InositoI Phosphatase type II PDK 1/2: Phosphoinositide E)ependent kinase 1 et 2
AKT/PKB: Protein Kinase B Glut4: Glucose Transporter 4
Shc: Src-Homology 2 domain containing Grb2: Growth factor receptor-bound protein 2 SOS: Son Of Sevenless
MAPK: Mitogen Activated Protein Kinase
Introduction
invalidation chez la souris conduit, entre autres, à une splénomégalie, à ime maturation accélérée des cellules B dans la moelle osseuse et dans la rate, ainsi qu’à un syndrome myéloprolifératif entraînant une mort précoce par infiltration des poumons (Helgason et coll. 1998) (Astle et coll. 2007). L’ensemble des données collectées à partir de ces souris, ainsi qu’à partir de cellules dérivées de ces souris, tend à montrer que cette 5-phosphatase est un régulateur négatif de la prolifération et de la survie des cellules hématopoïétiques (Christina A Mitchell et coll. 2002). Parmi les diverses voies proposées pour expliquer les mécanismes d’action de SHIPl, il est probable que son recrutement par des immunorécepteurs au niveau de la membrane plasmique favorise l’hydrolyse de son substrat préférentiel, le PtdIns(3,4,5)P3, qui régule la survie cellulaire et la prolifération via la voie d’Akt/PKB et mTor.
La protéine SHIP2 (Src-Homology 2 domain containing 5’Inositol Phosphatase type 2) est, quant à elle, impliquée dans la voie de signalisation de l’insuline et dans la résistance à l’obésité. Des expériences de surexpression et de sous-expression de SHIP2 dans des cellules sensibles à l’insuline ont montré que cette 5-phosphatase régule négativement l’activation d’Akt/PKB et la translocation des transporteurs de glucose Glut4 à la membrane plasmique, via l’hydrolyse du PtdIns(3,4,5)P3 (Dyson et coll. 2005) (Fig.6).
Deux modèles de souris invalidées pour SHIP2 ont été publiés à ce jour et présentent des phénotypes différents en fonction des exons délétés. Dans le premier modèle, les souris -/- souffrent d’hypoglycémie et meurent peu de temps après la naissance, tandis que les souris +/- ont ime sensibilité à l’insuline ainsi qu’une tolérance au glucose accrues (Clément et coll. 2001). Toutefois, la délétion de certains exons du gène SHIP2 dans ce modèle a aussi accidentellement entraîné l’invalidation du gène adjacent, Phox2a, rendant plus difficile l’interprétation du phénotype observé. Dans le deuxième modèle, une résistance à l’obésité sous régime riche en graisses a été observée chez les souris SHIP2 -/-, et celles-ci ne semblent pas présenter d’anomalies évidentes dans l’homéostasie du glucose ou de l’insuline (Sleeman et coll. 2005). Une troisième souris invalidée pour SHIP2 a récemment été générée au sein du laboratoire et présente une résistance à l’obésité sous régime riche en graisse ainsi que des anomalies du métabolisme du glucose sous régime pauvre en graisse (M. Jacoby, données non publiées).
La Pharbin (5-PHosphatase that induces ARBorization) est une 5-phosphatase qui, lorsqu’elle est surexprimée dans des fibroblastes, induit une forme dendritique des cellules (Asano et coll. 1999). De plus, lorsqu’elle est surexprimée dans des cellules HEK-293T, elle hydrolyse rapidement le PtdIns(4,5)P2 et le PtdIns(3,4,5)P3, provoquant alors une
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Introduction
inhibition de la phosphorylation d’Akt/PKB, ainsi qu’une augmentation de l’apoptose induite par Fas (Kisseleva, Cao, et Majerus 2002). A ce jour, aucune souris invalidée pour la Pharbin n’a encore été publiée. Au sein de notre laboratoire, ces souris ont été générées récemment et présentent une mortalité post-natale précoce avec le développement d’une ciliopathie ressemblant au syndrome de Bardet-Biedl (M.Jacoby, données non publiées).
Des expériences de sous-expression de la PIPP (Proline-rich Inositol Polyphosphate 5-Phosphatase) dans des cellules de phéochromotocytome de rat (PC 12) tendent à montrer que cette 5-phosphatase régule négativement l’élongation des neurites via l’hydrolyse du PtdIns(3,4,5)P3 (Astle et coll. 2007). Les souris invalidées pour la PIPP ont été générées dans notre laboratoire (M.Jacoby) et leur analyse est en cours.
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Introduction
III. SKIP
SKIP (Skeletal Muscle and Kidney enriched Inositol Phosphatase) est un des derniers membres de la famille des 5-phosphatases à avoir été découvert à ce jour. Le criblage d’une banque d’ADNc de testicules humains a permis à l’équipe de T.Takenawa (T Ijuin et coll. 2000) de découvrir trois isoformes de SKIP chez l’homme correspondant à des protéines des 51, 43 et 36 kDa respectivement.
A. Localisation intracellulaire
Des expériences d’immunomarquage réalisées sur des neuroblastomes NIE-115, différenciés ou non, ont montré une localisation intracellulaire diffuse de SKIP excepté aux endroits riches en actine (T Ijuin et coll. 2000).
Outre ses deux régions catalytiques centrales, SKIP possède un domaine SKICH (SKIP Carboxyl Homology) (Fig. 5) qui assure sa localisation périnucléaire au sein de la cellule au repos ainsi que sa translocation au niveau des renflements membranaires lors d’une stimulation par des facteurs de croissance. Des expériences de colocalisation sur des cellules COS-7 et U87 non stimulées ont montré une localisation majeure de SKIP au niveau du réticulum endosplasmique (Rajendra Gurung et coll. 2003), tandis que dans des cellules CHO non stimulées, cette protéine semble plutôt localisée dans le réticulum trans- Golgi (Takeshi Ijuin et Tadaomi Takenawa 2003).
B. Activité 5-phosphatase
Son activité 5-phosphatase sur les inositols polyphosphate et phosphoinositides a été testée in vitro, une première fois par l’incubation de la protéine humaine avec de l’Ins(l,4,5)P3, du PtdIns(3,4,5)P3 et du PtdIns(4,5)P2. Malgré une certaine affinité pour ces trois substrats, l’hydrolyse du PtdIns(4,5)P2 semblait 6 fois plus importante que celle de l’Ins(l,4,5)P3 (T Ijuin et coll. 2000). Plus tard, cette même équipe a précisé les valeurs de Km spécifiques à ces différents substrats, et en a conclu que malgré son affinité pour le PtdIns(4,5)P2, SKIP était majoritairement une 5-phosphatase de PtdIns(3,4,5)P3 (Takeshi Ijuin et Tadaomi Takenawa 2003). D’autre part, des dosages de phosphoinositides extraits de cellules surexprimant SKIP, ont montré qu’zn vivo, cette protéine déphosphorylait bien le PtdIns(4,5)P2 et le PtdIns(3,4,5)P3. Une autre étude menée in vitro par l’équipe de C.Mitchell (Rajendra Gurung et coll. 2003) a confirmé l’affinité de SKIP pour le
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Figure 7. Profil d’expression de SKIP chez Phomme
La figure A présente l’expression de l’ARNm de SKIP étudié par Northern Blot.
ljuin et coll. 2000
La figure B présente les résultats d’analyses par micropuce de SKIP sur de l’ARN d’organes humains.
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B.
750 1000 1250 (C) 2003-2(H>5 CNF
Introduction
PtdIns(3,4,5)P3 et a aussi montré une absence d’affinité pour le PtdIns(3,5)P2. Enfin, l’équipe de R.Woscholski a réalisé une étude comparative des activités catalytiques de différents membres de la famille des 5-phosphatases et a montré qu’m vitro, SKIP humaine hydrolyse fortement le PtdIns(4,5)P2, faiblement le PtdIns(3,4,5)P3, et ne présente aucune affinité pour les inositols phosphate (Schmid et coll. 2004). Au vu de tous ces résultats, et malgré une controverse concernant son substrat préférentiel, il semble que SKIP hydrolyse majoritairement le PtdIns(4,5)P2 et le PtdIns(3,4,5)P3, son affinité pour les substrats hydrosolubles étant faible ou inexistante.
C. Profil d’expression
La distribution tissulaire de SKIP a été testée par Northern blot sur de l’ARNm provenant de différents organes humains (Fig.TA) (T ljuin et coll. 2000). Il semble que cette 5-phosphatase présente deux transcrits alternatifs et qu’outre leur expression ubiquitaire, ceux-ci soient particulièrement présents dans le cœur, le muscle squelettique et le rein. Des analyses de transcriptomes par biopuces (jnicroarray), réalisées par l’équipe de Hogenesch (Su et coll. 2004) (http://svmatlas.gnf.org). ont complété ces résultats chez l’homme, incluant en plus les testicules, les poumons, la rate ainsi que diverses cellules immunitaires dans la liste des organes où SKIP est préférentiellement exprimée (Fig.7B).
Toutefois, chez la souris, l’analyse par biopuces donne des résultats sensiblement différents (Fig.8). En effet, malgré une distribution tissulaire assez ubiquitaire, il semblerait que SKIP soit majoritairement transcrite dans la glande mammaire, l’œil, les testicules, l’épithélium olfactif et les poumons.
Du point de vue de l’expression protéique de SKIP, des expériences de Western blot sur des lignées cellulaires murines (C2C12, C3H/10T1/2, Swiss-3T3, Sol8), ont montré la présence de plusieurs signaux qui correspondraient, en fonction du type cellulaire testé, à des isoformes de 51, 43 et 36kDa (T ljuin et coll. 2000) (Rajendra Gurung et coll. 2003). Toutefois, contrairement à ce que l’on peut trouver dans les banques de données hinnaines, il n’existe actuellement qu’une seule séquence d’ADNc de SKIP connue chez la souris, correspondant théoriquement à une protéine de 54kDa.
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Mouse
Cene Ailas C N F IM Sa mp le s
Figure 8. Profil d’expression de SKIP chez la souris.
Analyse par micropuce de SKIP sur de TARN d’organes murins.
http://symatlas.gnf.oig
Pps gnflml2985_a_at
0 250 500 750 1000 1250
Expression (c) 2003 CNF
