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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Rozenfeld, F. (1971). Etude du mode d'action de la gemmulostasine sur les gemmules de spongillidés et notamment sur leur métabolisme protéinique (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/214872/1/c7d45836-85a1-4425-96d5-9d53027af74c.txt
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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
Faculté des Sciences
Laboratoire de Zoologie Générale
Professeur: R. RASMONT.
ETUDE DU MODE D’ACTION
DE LA
GEMMULOSTASINE SUR LES GEMMULES DE SPONGILLIDES
ET
NOTAMMENT SUR LEUR METABOLISME PROTEINIQUE.
Mémoire présenté pour l’obtention du grade
légal de Docteur en Sciences (Zoologie).
Faculté des Sciences
Laboratoire de Zoologie Générale
Professeur : R. RASMONT.
ETUDE DU MODE D’ACTION
DE LA
GEMMULOSTASINE SUR LES GEMMULES DE SPONGILLIDES
ET
NOTAMMENT SUR LEUR METABOLISME PROTEINIQUE.
Mémoire présenté pour l’obtention du grade
légal de Docteur en Sciences (Zoologie).
nux'J.'-THESE ANNEXE :
Dans les phénomènes de phagocytose, l’adénosine monophosphate cyclique
jouer plusieurs rôles :
- signal attractant chez les myxamibes d'Acrasiales.
- signal attractant et messager induit dans les leucocytes polynucléaires
qui, à des degrés divers, ont bien voulu m’accorder leur aide.
Ma profonde reconnaissance s’adresse plus spécialement à Monsieur le
Professeur R. RASMONT qui, par son appui et son dynamisme inaltérable, m’a permis de mener à bien ce travail.
Ma gratitude la plus vive s'adresse à :
Monsieur le Professeur J. Brachet, Mesdames P. Van Gansen et R. Ficq,
Mesdemoiselles R. Tencer et J. Naisse, Mesdames C. De Vos et G. Urbain, pour les conseils scientifiques qu’ils ont bien voulu me prodiguer.
Monsieur le Professeur M. Beumer et son assistante Mademoiselle
C. Godart, Monsieur le Professeur M. Steinert, Monsieur le Professeur
R. Jeener pour m’avoir ouvert les portes de leur laboratoire et permis l’utilisation de leur appareillage.
Mesdames M. Grenson et N. Nolart qui ont préparé à mon intension du matériel expérimental.
Mesdames H. Diserens et N. Van Mol, Monsieur A. Weisman è qui je dois l’illustration impeccable de ce mémoire.
table
des
mTIERES .
~ Pages
I. INTRODUCTION GENERALE... 1. II. BUT ET PLAN GENERAL DES RECHERCfîES...
4.
III. MATERIEL ET îiETHODES... 5. A. Matériel vivant et techniques de culture .
a] Les Spongillldes... 5.
b) Les organismes non Spongillldes... 8.
B. Réactifs utilisés... 10. C. Techniques aytochimiques et biochimiques.
a) Techniques histologiques et autoradiographiques... 11.
b] Techniques biochimiques... 14. D. Technique de microscopie électronique à balayage... IG. IV. RESULTATS.
CHAPITRE I : Influence de certains facteurs endogènes et exogènes sur la sécrétion de germulostasine par de jeunes
éponges... 17. CHAPITRE II : Spécificité de la gemmulestasine.
1. Spécificité de la sécrétion de gemmulostasine.... 23.
2. Spécificité de l'action inhibitrice d’un milieu
conditionné... .. ... ... 25. CHAPITRE III: Effets de la perforation de la coque des gemmules
1. Efficacité de la gemmulostasine à différents
moments de la germination...
... 35
2. Examen histologique de la phase du développement gemmulaire inhibée par la gemmulostasine...
39
Liste des symboles et abréviations utilisés dans le texte
milieu M milieu minéral
gml gemmule
Lx lux
U.a.b. unité d'activité biologique
pCi microcurie
min minute
c • P • m ■ coups par minute
d.p.m. désintégrations par minute RNA acide ribonucléique
DNA acide désoxyribonucléique PDA acide perchlorique
TCA acide trichloracétique
.
I. - INTRODUCTION GENERALE
Les éponges d’eau douce sont soumises à d’importantes vicissitudes du
milieu : le froid, pendant l’hiver dans les régions tempérées ou la dessi cation, pendant les saisons sèches dans les régions tropicales.
Adaptées aux conditions climatériques défavorables à leur via normale, les Spongillides de nos régions forment, dès le début de l’été, des germes asexués, pluricellulaires : las gemmules. Ces bourgeons de résistance ont, au repos, des exigences métaboliques très faibles et sont, contrairement aux
tissus de l’éponge, capables de subsister dans de mauvaises conditions sai
sonnières. Leur rôle primordial consiste à assumer la régénération printa nière de l’éponge.
Soulignons cependant que la gemmulation n’est pas le seul fait des Spongillidesj
elle apparaît en effet chez certaines éponges marines (1).
Mais il sembla que chez ces organismes, les gemmules ne jouent qu’un rôle très secondaire, et apparemment peu connu, dans le cycle biologique de l’éponge. Far contre, des exemples convergents se retrouvent parmi d’autres organismes
tels les Bryozoaires dont les formes dulcicoles élaborent des statoblastes de résistance.
Hibernation des gemmules
Pour que la pérennité de l’espèce soit effectivement assurée, il faut que
les gemmules constituées en été n'éclosent pas aussitôt formées, alors que les
conditions écologiques sont précisément favorables à leur éclosion.
Les mécanismes qui contrôlent le moment précis de l'éclosion des gemmules varient d'une espèce à l’autre.
Chez Ephydatia müllepï (23 et Spoit/ji-tla fvagiti.s (33, les gemmules présentent un stade de diapause thermique. Dans la nature, un abaissement hivernal de la température, entraînant par ailleurs la mort des tissus de l’éponge, est néces saire au déclenchement de la germination printanière des gemmules. Des expérien ces en laboratoire (33 ont néanmoins montré que la vernalisation par le froid
(13 TDPSENT, 1888î MULLER, 1914; PRELL, 1915; ANNANDALE, 1915,1924; HERLANT- MEEWIS, 1948;
(23 RASMDNT, 1954 a, b
2.
n’est pas absolument indispensable au développement des gemmules, mais qu’elle
l’accélère considérablement.
Chez Ephydatia fluviatilis, en revanche, l’éclosion des gemmules est soumise à une régulation chimique exogène (4). Tant qu’ils sont vivants, les tissus de l’éponge sécrètent une gemmulostasine qui inhibe de façon réversible l’é
closion des gemmules (5). Contrairement à ce qui se passe pour les espèces à diapause, les tissus d’Ephydatia fluviatilis peuvent demeurer vivants pendant tout l’hiver (6). Dans le cas où les conditions hivernales seraient suffisam ment rigoureuses pour détruire l’éponge, elles le seraient aussi pour inhiber
temporairement le développement des gemmules.
Enfin, Spoy^giUa taoustris produit des gemmules des doux types : les unes à diapause, les autres dépourvues de diapause. Cependant, chez cette espèce, les gemmules sans diapause renferment, par ailleurs, des zoochlorellos symbiotiques
[7)i une corrélation étroite entre ces deux faits et une relation de cause à effet restent encore à vérifier.
Métabolisme des gemmules en hibernation
Les mécanismes biochimiques impliqués dans les deux modes d’hibernation des Spongillides sont, à l’heure actuelle, peu connus.
ün sait cependant que le métabolisme respiratoire des gemmules en diapause (8) présente certaines analogies avec celui, mieux connu, d’insectes en dia
pause ; par rapport à des individus sortis de diapause, la consommation en
oxygène est fortement réduite et sa susceptibilité au cyanure extrêmement faible.
Mais on ignore encore si, comme chez les stades en diapause d’insectes [9], ces modifications du métabolisme respiratoire résultent d’un remplacement temporai re du système cytochromes-cytochromes oxydases par un système renfermant une cytochrome bsautooxydable.
Par ailleurs, des recherches plus anciennes (10] mais extrêmement précieuses ont montré que, chez Spongi-tla taoustpi-s, à l’hibernation des gemmules à
diapause est liée une élévation transitoire de la pression osmotique dans les
cellules. Peu avant l’éclosion, la pression osmotique diminue progressivement
(4) RASMONT, 1963; KILIAN, 1964;(5] RASMONT, 1965 (6) WELTNER, 1907; STEPHENS, 1920; WIERZEJSKY, 1935; STEUSLOFF, 1936; RASMONT, 1961; (7] BR0NDSTED, 1936; BR0NDSTED & BR0NDSTED, 1953; RASMONT, 1954; (8) RASMONT 1961; (9) SANBORN & WILLIAMS, 1950; SHAPPIRIO & WILLIAMS, 1953; SCHNEIDERMAN & WILLIAMS, 1954;
jusqu'.2 atteindre une valeur comparaLle celle des tissus de l’éponge. L'élévation de la pression osmotique au sein des gemmules pourrait résulter
d’une dépolymérisation partielle du glycogène de réserve (11) comme c’est
le cas chez certains insectes présentant un stade de diapause (12). Or, bien que les gemmules de l'espèce Ephyâatïa fluviat-itis ne présentent pas de dia pause, leur pression osmotique est néanmoins considérablement élevée et même
comparable à celle de Spongi-tla laoustvis (13).
Il serait dès lors tentant de supposer que l'action de la gemmulostasine et l’action de la diapause révèlent deux aspects d’un mécanisme fondamentale
ment identique.
On pressent ainsi tout l’intérêt que pourrait présenter l’étude du mode d'action de la gemmulostasine pour la compréhension générale des phénomènes
d’hibernation.
Cytologie et différenciation des archéocytes gemmulalres.
La gemmule est initialement constituée d’un certain nombre d'archéocytes (de l’ordre du millier) apparemment tous semblables. Ces cellules sont oaracté-
risées par la présence de deux noyaux, chacun d'eux renfermant un grand nucléole. Cet état binucléé des cellules, observé pour la première fois par
VEJDOVSKY en 1883, résulte d'un phénomène de caryocinèse (14), la cytodiérèse étant temporairement bloquée.
Les archéocytes gemmulaires renferment par ailleurs d'abondantes plaquettes vitellines (15) constituées essentiellement de lipides, de protéines basiques,
de ribosomes et do mitochondries (16).
Avant l'éclosion des gemmules, un grand nombre des cellules subissent une nouvelle caryocinèse (17) avant de se fragmenter en archéocytes mononucléés. Ceux-ci digèrent progressivement leurs réserves vitellines et quittent la gemmule par le micropyle. Sauf quelques rares exceptions, les archéocytes
gemmulaires ne se différencient donc qu'une fois sortis de la gemmule, pour participer ensuite à 1'organogénèse de l'éponge.
(11) RASriGNT, 1961; (12) CHINO, 1957, 1958; (13) SCHMIDT, 1970; (14) WIERZEJSKY, 1915; BRIEN, 1932; PGURBAIX, 1934; LEVEAUX, 1939; (15) MARSHALL, 1883; CASTRO RODRIGUEZ et al, 1930; BRIEN 1932; MEEWIS, 1936; (16) KAUFFOLD & SPANNHOF, 1963; RUTHMAN, 1965; SIMONS & MULLER, 1966; DE VOS, 1971; (17) BRIEN, 1932;
4.
A quel momant du développement gcmmulaire, la gemmulostaslne aglt-ells et par quel mécanisme biochimique cet agent empêche-t-il le déroulement normal de l’un ou l’autre des processus préparatoires à l’éclosion des gemmules ? C’est dans l’espoir de répondre è ces deux questions que nous
avons entrepris le présent travail.
II.-BUT ET PLAN GENERAL DES RECHERCHES
Ce travail a été entrepris dans le but d’analyser sur les plans physiologique, cytologique et biochimique les effets de la gemmulostaslne sur le développement des gemmules de l’espèce Ephydatia fluviatilis
1. Dans une étude préliminaire mais essentielle à l’orientation de notre travail, nous avons porté notre attention sur les 3 problèmes suivants ;
1.1. La réalisation de conditions optimales pour la secrétion de gemmu- lostasine par les éponges.
1.2. L’existence d’une corrélation éventuelle entre la sécrétion ou la non-sécrétion de gemmulostaslne par de jeunes éponges et le mode d’hibernation propre à chaque espèce.
1.3. Le degré de spécificité d’action de la gemmulostaslne.
2. Nous avons ensuite abordé l’étude du mode d’action de la gemmulostaslne
sur 3 plans :
2.1. Physiologique :
- en recherchant son action éventuelle sur le mécanisme d’ouverture
du micropyle.
- en cherchant à déterminer l’efficacité de la gemmulostaslne à
2.2. cytologique :
- en suivant, au moyen de la technique autoradiographique, l’évolu tion du métabolisme cellulaire (DNA, RNA et protéines) au cours du
développement normal des gemmules et au cours de leur inhibition
par la gemmulostasine.
2.3. biochimique :
- en essayant de mettre clairement on évidence un effet éventuel de la gemmulostasine sur l'incorporation des précurseurs radio actifs dans les acides nucléiques et les protéines, extraits des gemmules à divers moments de l'incubation.
III.-MATERIEL ET METHODES
A. MATERIEL VIVANT ET TECHNIQUES DE CULTURE
a) Les Spongillides.
1. Nos recherches portent sur des gemmules de 3 espèces récoltées aux environs de Bruxelles : Ephydatia fluviatilïs. VEJD., Ephydatia rmlleri.
LIES, et Spongilla laoustris^ L.
l’identification spécifique de ces organismes a ôté revue (16) sur la base essentielle de la forme des micro-et macrosclères.
De plus, au sein même de l'espèce Ephydatia ftuviatiUs, certaines formes d’éponges, appelées "types", présentent entre elles des propriétés de non confluence qui se conservent, tant par voie asexuée que par voie sexuée,
d'une génération à l'autre (19). Au moins quatre types û’Ephydatia ftuoiatilis
ont ainsi été identifiés et baptisés a, 3. Y st
<S-Dans le présent travail, nous avons essentiellement expérimenté le type ô.
(18) RASMONT, 1955
6.
2. Techniques de culture
Depuis 3 ans, des membres du laboratoire assurent l'élevage des
4 types ü'Ephydatia fluoïatitis en cultivant, dans las étangs du Château de Lembeek (propriété de 1'Université Libre de Bruxelles), des gemmules écloses au laboratoire.
Vers la fin mars, des gemmules des quatre types sont semées séparément sur des plaques en verre et inoubôes à 20°C pondant 15 jours. Les plaques sont
ensuite immergées dans lo déversoir des étangs.
Au début de l'automne, les éponges bourrées de gemmules sont récoltées et
ramenées au laboratoire où elles sont dilacérées mécaniquement afin de dégager les gemmules incluses dans leur mésohyle. Ces gemmules, abondamment
lavées à l'eau courante, sont conservées à 0°C.
ôy_l3boratoiro.
- Avant la mise en culture, les gemmules sont traitées pendant
5 minutas au peroxyde d'hydrogène (Perhydrol MeroK) dilué à un vingt-cinquième. Puis elles sont rincées 5 fois à l'eau de ville (20). Ce traitement détruit un grand nombre des germas logés à la surface des coques gemmulaires; il
n'assure cependant pas le stérilisation complète du matériel. Cette consta
tation repose en effet sur divers contrôles microbiologiques que nous avions réalisés parallèlement à ce travail.
- Milieu de culture. Les gemmules sont, dans la plupart de nos BxpériencBS, ensemencées dans un milieu minéral dit "M” (21), constitué
d'eau bidistillée dans laquelle sont dissous, en milliéquivalent par litre, les ions suivants : Na"^ : 1,00j : 0,05; Ca^^ : 2,00; Mg^ : 1,00; Cl : 2,05; HCO3 : 0,50; SO4 -! 1,00 et Si O3 : 0,50. Dans quelques cas, les
gemmules ont ôté semées dans de l'eau de ville, ainsi que nous le men tionnerons au cours de l'exposé de nos recherches. Rappelons que la diffé
rence essentielle entre le milieu M et l'eau de ville réside dans la
concen-+ concen-+
tration moindre du Ca dans le milieu M.
- Obtention des milieux dits "conditionnés".
Des lots de 200 gemmules sont eemées dans des boîtes de Pétri contenant chacune 25 ml de milieu M. Les cultures sont maintenues à 20°C dans une obscurité constante.
Les gemmules commencent à éclore après 4 jours, constituant 3 jours plus
tard de jeunes éponges.
15 jours après l'ensemencement, le surnageant des cultures est prélevé et filtré sur filtre Seitz préalablement rinçé à l’eau distillée. Cette pré
caution permet d'écarter tout facteur toxique hydrosoluble pouvant provenir
du filtre lui-même (22).
Nous avons contrôlé la présence de gemmulostasine dans les surnageants
en comparant l’activité inhibitrice de ceux-ci à des témoins constitués d’aliquotes inactivés par une ébullition de 10 minutes. En effet, il est démontré que la gemmulostasine est thermolabile (23) .
Les surnageants ainsi obtenus et contrôlés constituent le "milieu
conditionné”.
Hesure de l'activité inhibitrice du milieu conditionné.
La nature chimique de la germiulostasine n’étant pas connue, nous avons repris la technique de dosage biologique de 1’ inhibiteur décrite par RASNONT en 1965 : 3 lots de 50 gemmules constituant un premier groupe expérimental, sont mis chacun à incuber dans 10 ml du milieu conditionné. Cinq autres groupes de 3 lots sont incubés identiquement dans des dilutions 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, et 1/32 du milieu conditionné. Un septième groupe de 3 lots est incubé dans de l’eau de villej il constitue le témoin.
L’ensemble est placé à 20°C sous un cycle lumineux 12:12 (éclairage incandescent 45 Lx : obscurité). Le pourcentage de gemmules écloses est suivi de 24 an 24 h. par comptage du nombre de coques vides.
Les résultats sont exprimes en unités d’activité biologique (u.a.b.) selon la définition proposée par RASNONT : "l’unité de concentration de l’inhibiteur Cia gemmulostasine) est la concentration qui double le temps de germination à 50% de gemmules de référence, par rapport à la valeur de
CB temps dans la solution témoin". Au cours de l’exposé de nos résultats, nous
8.
aurons d'ailleurs l'occasion de revenir sur cette technique en donnant un exemple concret.
Concentration du milieu conditionné
La concentration en gemmulostasine du milieu conditionné est vraisem
blablement de loin inferieure à celle qui règne à l'intérieur des tissus de l'éponge. Dès lors, pour mettre en évidence des phénomènes aussi précis
qu'une éventuelle activité antimicrobiale ou l'effet biochimique de la gemmulostasine sur le métabolisme gemmulaire, il fallait, à notre avis, concentrer le milieu conditionné. Cette opération a été réalisée en colla boration avec A. WEISMAN : elle consiste à évaporer sous vide à basse
température (14 à 16° C] le surnageant d'une culture préalablement filtrée. Dans ces mêmes conditions, du milieu M est également concentré par évapo
ration sous vide; il sert de témoin.
b) Les organismes non Spongillides
La gemmulostasine est testée sur divers organismes afin de mettre en évidence, comme nous le verrons ultérieurement, une éventuelle activité antimicrobienne. Avant de réaliser ces tests, le milieu conditionné et le milieu M, tous deux concentrés par évaporation, ont été stérilisés par filtration "Nillipore" (diamètre des pores : 0,45 y).
I. BACTERIES
D’autre part, 5 colonies bactériennes morphologiquement différentes [taille,
couleur] mais non identifiées (deux d’entre elles sont Gram*] ont été isolées, par repiquages successifs, à partir de l’eau d’où provenaient
les gemmules.
La sensibilité à la gemmulostasine de ces divers organismes a été
testée par la méthode classique [24] de diffusion de l’agent sur milieu solide. Ce dernier, servant de support nutritif aux bactéries, est consti tué de : Bactopeptone [DIFCO] : 7,5 g; Proteose peptone [DIFCÜ] : 7,5 g; NaCl : 3,5 g et de gélose : 7 g pour 500 ml d’eau distillée.
2. CHAMPIGNONS
Des représentants de la classe des Phycomycetes : Ifuaov pus'itïuSy Rhizopus miorospovuSj Absidia ramosa et de la classe des Adelomycetes :
Aspergillus fungatue^ /l. flavus^ A. nigeVj A, nidulans BtRenioilliwn notatum^
ont servi de matériel expérimental. La détection d’une action fongicide de la gemmulostasine a été réalisée en milieu liquide [25] renfermant les consti tuants suivants : neopeptone : Ig; glucose : 2g; gelose : 2g pour 100 ml du
milieu conditionné ou du milieu M.
3. PROTOZOAIRES
La gemmulostasine est testée sur les deux organismes suivants : Eugtena graoilis (variété bacilferis], un Rhizoflagellé du groupe des Eugleniens et, sur Crithidtia Vua'tZ'iae, un Zooflagellé du groupe des Trypanosomides. Comme pour les germes bactériens, ces expériences ont été effectuées en milieu solide dont la composition, pour chacune des espèces, est la suivante :
- Eugtena grao-ilia : [26]
Beef extract [Difco] : 0,1g; Bacto peptone [Difco] 0,2g;
Yeast extract [Difco] 0,2g; gélose 2g pour 100ml d’eau distillée.
10.
- Cvithid'ia luailiae : (27)
NaH2P04:0,23g3 NaCl : 0,4g; KOI : 0,04; glucose : 0,2g; oxoîde : 0,1g; Tryptose : 1,5g; Himine : 2 mg; NaOH Il\l : 0,02 ml; 0,5 ml alcool absolu et
0,15g gélose pour 100 ml d'eau distillée.
Les expériences réalisées sur Cvithidia luoiliae ont été exécutées à Rhode St. Genèse dans le laboratoire du Professeur M. STEINERT.
4. BRYOZOAIRES
Des statoblastes de l’espèce Flumatella fungoza (Phylactolemate) récoltés en même temps que les gemmules, ont été mis en culture dans les mômes conditions que celles-ci. Nous avons suivi parallèlement, au cours du temps, le pourcentage de statoblastes éclos dans du milieu N et dans
du milieu conditionné.
B. REACTIFS UTILISES
1. Radioisotopes (Radiochemical Centre Amersham, England).
Précurseurs radioactifs activité spécifique Concentration
mCi/mg y Ci/ml
Thymidine - B - T (n) 20,6 20
Uridine - T (G) 18,6 20
DL - Leucine - 4,5 - T 3,8 20
2. Précurseurs non radioactifs (Sigma)
Thymidine - Uridine - Leucine.
C. TECHNIQUES CYTOCHIMIQUES ET BIOCHIMIQUES
a) Techniques histologiques classiques
1. Fixation :
Divers échantillons de gemmules ont été fixés par le procédé de congélation-dissolution (28) : les gemmules sont congelées par immersion
dans de l’isopentane refroidi à - 158°C par de l'azote liquide. Elles sonttrans-
férées dans une solution éthanolique d'acide plcrique (1%) refroidie à + --4Q^C. Après 60 heures, les gemmules, réchauffées à la température ambiante, sont
lavées par de l'éthanol avant d'être plongées dans deux bains successifs de toluène.
2. Enrobage et coupe :
Les gemmules ont été enrobées dans du Paramat (Gurr) qui
remplace efficacement le double enrobage celloïdine-paraffine. Le matériel a été ensuite débité en coupes plus ou moins sériées de 7y d’épaisseur.
3. Coloration de routine :
Afin de mettre en évidence rapidement et les noyaux et les plaquettes vitellines sans que ces dernières, riches en acides nucléiques, ne masquent les noyaux , les coupes ont été colorées par l'association de la phloxine et du vert-lumière.
b) Techniques autoradiographiques.
1. Fixation
La technique de congélation - dissolution nous a incontesta blement donné d’excellents résultats sur le plan histologique^- néanmoins, ceux-ci ne sont pas toujours reproductibles d’un échanti]lon à l’autre. Dr, nous avons fait divers essais : température variable et durée de fixation
variable sans pourtant arriver à définir la cause de cette non reproductibilité. De ce fait, cette technique n’a pu être utilisée pour des expériences d'auto
radiographie qui nécessitent des données statistiquement valables.
12.
Par ailleurs, certains fixateurs, parce qu'ils contiennent des sels de
mercure ou du bichromate, ne peuvent être utilisés en autoradiographie.
En effet, ils agissent chimiquement sur l’émulsion photographique en produisant une image latente (phénomène dit de chémographie positive}
et augmentent ainsi considérablement le nombre de grains de fond dans 1'émulsion.
Par contre, le formol peut parfois provoquer le phénomène inverse : désen-
sibilisation de l'émulsion (chémographie négative) (29).
Compte tenu de toutes ces remarques, les gemmules ont ôté fixées d’une manière satisfaisante par l'aldéhyde glutarique (Fluka) à 2% dans
un tampon au cacodylate 0,05 M à pH 7,2. Ce fixateur est souvent utilisé en microscopie électronique (30).
Pendant la fixation, dont la durée est de 4 heures, nous avons perforé la coque des gemmules à l'aide d'une micro-aiguille. En effet, il est apparu
que la coque des gemmules, constituée d’une scléroprotéine de type collagène (31), semble être imperméable à divers agents.
Les figures 1, A,B, ci-dessous mettent clairement en évidence la nécessité
de perforer la coque des gemmules.
A. aspect des gemmules (dans l’alcool 70°) sans perforation préalable de la coque.
B. aspect des gemmules dans l'alcool 70° après perforation préalable de la coque
Le matériel ainsi fixé est ensuite lavé par le tampon pendant 12 heures
et déshydraté avant l'enrobage au Paramat.
2. Manipulations précédant l’application de l'émulsion photo graphique .
Les coupes d'une épaisseur de 5 um réalisées au microtome ordinaire, sont étalées sur des lames préalablement gelatinées (gélatine
0,5% + 0,05% d’alun de chrome); ce film de gélatine remplace l’albumine à laquelle l’émulsion photographique n'adhère que faiblement (32). le
déparaffinage et la réhydratation des coupes sont classiques.
Après un traitement à froid (4°C) de 20 minutes au PCA 2% qui élimine
les précurseurs non incorporés dans les macromolécules, les préparations sont lavées à l’eau courante, puis plongées dans une solution de précurseurs non marqués (à une concentration molaire 10 fois supérieure à celle du
milieu radioactif utilisé).
Les coupes sont alors rincées à l’eau distillée, puis séchées. Remarques :
Après incorporation de thymidine et d’uridine ^H, les coupas d’une même gemmule sont réparties successivement sur 3 lames, la première lame est
traitée par une solution de DNAse( Worthington : 0,2 mg/ml de tampon "Tris" à pH 7,5 contenant du MgCla M/300) pendant 1 h 30 à 37°C. La deuxième lame est traitée par la RNAse (RNAse Sigma : 0,2 mg/ml du même tamponî pendant
1 h 30 à 37°C .
La troisième lame témoin des traitements est traitée uniquement par du tampon, pendant 1 h 30 à 37°C. On pourra ainsi déterminer la part de radioactivité revenant respectivement au DNA et au RNA.
Soigneusement lavées et séchées, cos préparations sont prêtes à recevoir
l’émulsion photographique.
3. Technique photographique
Selon la technique dite de "dipping" c’est-à-dire par
trempage des lames (33), les coupes sont couvertes d'une émulsion photo graphique Ilford (in gel form) de type K2 diluée de moitié,
Après une durée d’exposition de 3 semaines à 4°C dans une atmosphère
sèche, les autoradiogrammes sont développés 2 minutes à 15°C dans le
14.
révélateur Kodak Dektel.
Après un bain d'arrêt dans une solution d’acide acétique 1% pendant 4 minutes, les lames sont ensuite fixées pendant 5 minutes dans le Kodak Rapid fixer et lavées à l’eau courante pondant 1 heure.
f
Les lames sont alors placées une nuit dans un bain d’éthanol 70%j ce traite ment favorise la diffusion ultérieure des colorants à travers l’émulsion. Après ces divers traitements, les préparations sont colorées au mélange
vert de méthyle-pyronine de Unna (34), séchées et montées au baume de
Canada sous lamelle couvre objet.
b) Techniques biochimiques
1. Isolement des acides nucléiques et des protéines.
Les différentes étapes de l’extraction du DNA, du RNA et des
protéines décrites ci-dessous sont basées sur les techniques de SCHMIDT
& TANNHAUSER (35) et de SCHNEIDER (36) modifiéelpar KENNEL (37).
1.1. Préparation du matériel gemmulaire. - Après avoir séjourné dans un milieu radioactif donné, les gemmules sont soigneusement lavées par
du milieu M contenant le même précurseur mais non radioactif.
Leurs coques, source d’éventuelles contaminations, ont été éliminées de la manière suivante : les gemmules sont écrasées doucement dans D,5 ml H2D distillée à Ü°C à l’aide d’un broyeur de Potter-Elvejhem. Les coques à peine déchiréer sédimentent aussitôt, tandis que leur contenu est prélevé
en pipettant le surnageant. Les coques sont ensuite lavées 2 fois par 0,5 ml d’eau distillée afin de prélever le reste du contenu des gemmules et de le joindre au prélèvement précédant. Le matériel ainsi obtenu est congelé et décongelé dans le but de rompre les cellules restées intactes. L’efficacité de ces traitements est contrôlée au microscope photonique.
(34) BRACHET, 1941; (35) SCHMIDT S TANNHAUSER. 1945; (36) SCHNEIDER, 1945
1.2. Extraction du RNA.
Rj - Le matériel gemmulaire (1,5 ml) est homogénéise dans un volume égal
de TCA 20% à 0°C (concentration finale : 10%).
Rj - Après 30 minutes à 0°C, l’échantillon est centrifugé à 5.000 t/m
pendant 10 minutes. Le sédiment est ensuite lavé 3 fois au TCA 10%
(0°C) et une fois à l'éthanol 70% (0° ).
Rs - Le sédiment est alors délipidé à 45°C par deux lavages à l’éthanol 70%, 2 lavages à l’éthanol-éther (3:1) et un lavage à l’éther. R4 - Le résidu est ensuite dissous dans 0,5 ml TCA 5% (0°C) et conservé
à 0°C pendant 30 min. Après centrifugation, la phase aqueuse contenant le RNA est soigneusement recueillie tandis que le culot est soumis
à une deuxième extraction. Les deux surnageants sont finalement réunis.
1.3. Extraction des protéines.
Pi - Le matériel est homogénéisé comme en Ri dans du TCA froid mais à
10% (5% en concentration finale).
P2 - Après 30 min. à 0°C, l’échantillon est transféré à 80°C pendant 30 min.
P3 - Le milieu, une fois refroidi, est centrifugé ; le sédiment est lavé 3 fois par du TCA 10% à 0°C et une fois par de l'éthanol 70% à 0°C.
P4 - Le culot est délipidé comme en R3 .
Ps - Le résidu, renfermant la fraction protéinique, est séché sous vide.
1.4. Extraction du DNA.
Di - Voir les étapes Ri,R2,R3,et R4 .
D2 - Après 30 min. à 0°C, le milieu est centrifugé et le culot renfermant le DNA est dissous dans 0,5 ml TCA 5%. L’homogénat est maintenu à 80°C pendant 30 min. Après centrifugation, la phase aqueuse contenant
16
.
2. Détermination de la radioactivité des divers extraits.
2.1. - Les extraits aqueux de DNA et de RNA sont mélangés à
1D ml d'un milieu scintillant dont la composition, adaptée à des échantillons aqueux (38} est la suivante : 1 volume de triton X-10D (agent émulsif) pour 2 volumes de toluène renfermant 0,5% de PPO (2,5 - diphenyloxazole) et 0,05% PDPOP
[c
1,4 bis - 2 (5 phenyloxazole) - benzène]2.2. - Le culot sec de protéines est dissous à 60°C dans du soluène-lOO (Pakard) et mélangé è 10 ml de liquide scintillant constitué
uniquement de toluène renfermant 0,5% de PPO et 0,025% de POPOP.
2.3. - La radioactivité de ces divers échantillons est mesurée à l'aide d'un compteur à scintillation du type Nuclear Chicago enregistrant, pour chacun d'eux, le nombre do coups par minute (c.p.m.)-Ces masures ont
été effectuées au laboratoire d'immunologie du Professeur R. JEENER.
0. TECHNIQUE . DE HICROSCOPIE ELECTRONIQUE A BALAYAGE
Le micropyle et la coque des gemmules ont été observés au microscope électronique à balayage (Stéréoscan, Cambridge, S.A.}. Pour pouvoir effectuer ces observations, les gemmules, préalablement séchées sous vide, ont été recouvertes d'or et de palladium.
Remarques
A l'exception de l'autoradiographie, toutes les expériences présentées dans ce travail ont été faites trois fois.
IV. - RESULTATS
CHAPITRE I
Influence de certains facteurs endogènes et exogènes sur la sécrétion de gemmulostasine par de jeunes éponges.
Ilétaitindispensable, avant d'aborder l'étude de l'action de la gemmulostasine, de mettre au point des conditions de culture permettant
l'obtention maximale de cet agent.
1.1. Faits expérimentaux
Données
Dans toutes les expériences,effectuées, le milieu conditionné
(contenant de la gemmulostasine) est obtenu en prélevant le surnageant d'une culture d'éponges issues de 2DD gemmules d ’ Ephydat'ùa ftuvïat-ilie
semées dans 25 ml de milieu H. Sur cette base, nous avons réalisé 4 groupes expérimentaux suivant que nous modifions séparément l'âge des cultures, le type des gemmules souches, la température et les conditions d'éclairement.
- 1'âge des cultures : Des lots de gemmules de type ô sont placés à 2D°C, dans une obscurité constante, pendant des temps variables :
5, 7, 14 et 21 jours - groupe I.
- Type de gemmules souches : Des lots de gemmules de type a. B, Y Qt 6
sont mis à incuber à 20°C pendant 15 jours, dans une obscurité permanente - groupa 2.
- La température : 3 lots de gemmules de type 6 maintenus dans une obscurité constante, sont incubés pendant 15 jours respectivement à 17,
TABLEAU 1. Influence de certains facteurs [VARIABLES) sur la production
de gemmulostasine Cu.a.b.) par des éponges de l'espèce
Ephydatia ftuoiatitia,
CONSTANTES VARIABLES
éclairm. tempér. âge type
- L * éclairement : Des lots de gemmules de type 6 sont mis à incuber
à 20°C pendant 15 jours, mais dans des conditions d'éclairement très diffé rentes ; un premier lot est maintenu dans une obscurité totale (DD3j un second lot est soumis à un cycle lumineux (L.D.) 12 : 12 (éclairage incan
descent 45 Lx ; obscurité) et un troisième lot est placé sous un éclairage incandescent constant de 45 Lx (L.L.). - groupe 4.
Les surnageants des cultures réalisées dans ces diverses conditions sont ensuite prélevés, filtrés bactériologiquement et dosés sur un échan tillon de gemmules du même type que les éponges productrices.
Résultats.
Nous ne ferons pas apparaître ici tous les graphiques établis pour les différents dosages. Un seul d'entre eux (fig. 2) est repris à titre
d'exemple; les autres résultats, exprimés directement en unité d'activité biologique, sont consignée dans le tableau 1.
On peut conclure que l'intensité de 1' -nhibition exercée par un milieu conditionné dépend :
1°) de l'âge des cultures. A 5 Jours d'incubation, l'activité biologique des surnageants n'est pas encore décelable. Nais il faut remarquer qu'à cet âge,
l’organisation des éponges n’est pas encore achevée, en particulier celle du système aquifère (fig. 3). Or ce dernier doit normalement jouer un rôle important dans la diffusion de l’agent à l'extérieur de l’éponge.
Plus tard, l’activité des milieux augmente progressivement jusqu'à atteindre
un palier au quatorzième jour.
Ajoutons encore que dans ces expériences, nous n'avons jamais nourri les éponges. Oès lors, ces résultats pourraient être l’expression de 1'état physiologique de l’éponge non nourrie. Aussi longtemps que l'éponge peut croître par l’utilisation des réserves gemmulaires, elle sécrète de la gemmulostasine; dès qu’elle cesse de croître, la sécrétion s'arrête. Une conclusion concordante a été émise par RASNONT (39) en montrant que
l’inhibition est plus intense lorsqu’une éponge est nourrie périodiquement par des bactéries tyndallisées que lorsqu'elle est affamée.
19.
100^^ Otnimules écloses (coques «ides)
temps d' incubation à 20°c (en heures)
Fig. 2 - Représentation graphique en fonction du temps, des pourcentages moyens cumulés de germination (déterminée par le nombre de coques vides) calculés sur 3 lots de 50 gemmules pour 5 séries incubées respectivement dans du milieu (MM) et dans un milieu conditionné à diverses dilutions (MC). Ce milieu provenait d'une culture
d’Ephydatia fluviatilis (type a) après un séjour de 15 jours à 20°C et en obscurité constante.
ün voit que le temps de germination à 50% dans lo milieu M est de 144 h.La dilution de milieu conditionné qui double ce temps est comprise entre 1/4 et 1/0. Par interpolation géométrique, on peut calculer que cette dilution serait de 1/6,4 : par définition, nous
Fig. 3 A.B. - Organisation d’une éponge CE. fluviatilis) après 5 jours d'incubation à 20°C.
21.
Nous avons néanmoins évité do nourrir nos cultures car l’administration d'une suspension de bactéries entraîne aussi un apport d’éléments autres, difficilomont contrôlables.
2°) du type de gemmules souches : contrairement aux éponges de type a ou 6, les éponges de type 6 et y sécrètent apparemment de très faibles quantités de gemmulostasine. Or, les travaux de VAN DE VWER (40} ont montré de
façon évidente que la distinction entre types qui, rappelons-le, est basée sur la propriété de non confluence intraspécifique, se transmet d’une géné ration asexuée à l’autre. On est dès lors en droit de penser que, toutes choses égales d’ailleurs, la secrétion de gemmulostasine est contrôlée par certains facteurs héréditaires.
3°) do la température : on remarque d’emblée que l’activité du milieu condi tionné est anormalement faible lorsque les éponges sont maintenues à 23°C.
4°} de l’éclairement : par rapport à l’obscurité constante ou au cycle
lumineux, un éclairage permanent semble influencer défavorablement la production de gemmulostasine par les éponges.
Il serait toutefois prématuré de tirer des conclusions théoriques des effets de la température et de l'éclairement sans avoir au préalable vérifié si ces facteurs exogènes agissent sur les mécanismes de sécrétion de la gemmulostasine (donc sur la quantité de gemmulostasine produite} ou s’ils agissent directement sur la gemmulostasine déjà sécrétée (donc sur son activité}.
Données
Après une incubation de 15 jours à 20®C dans une obscurité constante, le surnageant provenant d’une culture de gemmules de type 6 est prélevé, filtré et réparti en 4 fractions :
" témoin principal de l’expérience, est aussitôt dosée, tandis que les 3 autres subissent d’abord les traitements suivants :
" l§_§§59Dd?_fEË5tion est placée à 20°C dans une obscurité constante (00} pendant 15 jours, témoin d’une éventuelle dégradation naturelle de la gemmu lostasine.
- la troisième fraction est transférée pendant 15 Jours dans une obscurité constante CDD) et à 23°C. Elle permettra de voir si, dans ces conditions»
la dégradation de la gemmulostasine est ou non accélérée.
- la quatrième fraction est maintenue à 2D°C sous un éclairage incandescent
de 45 Lx (LL) pendant 15 jours; la gemmulostasine pourrait en effet être
photolabile.
Résultats
Le tableau 2 réunit les résultats finaux du dosage des diverses
fractions.
TABLEAU 2. - Influence des conditions d’éclairement et de température sur l'activité inhibitrice de la gemmulostasine libéréedans le
milieu conditionné.
TRAITENENT DE 15 JOURS DOSAGE
U .a . b. éclairement température fraction 1 - - 7,5 fraction 2 DD 20°C 7,5 fraction 3 DD CM en 0 U CM fraction 4 LL 20°C 7,5
Il indique tout d’abord qu’au moment du prélèvement, l’activité
inhibitrice du milieu conditionné était de 7,5 unités (fraction I). Il montre par ailleurs que le fait d’avoir maintenu les milieux conditionnés pendant 15 jours à 20°C (fraction 2), à 23°C (fraction 3) ou sous un éclairage constant (fraction 4) ne modifie en rien leur acti
23.
Il ne fait donc aucun doute que les processus impliqués dans la sécrétion de gemmulostasine sont, dans une certaine mesure, thermosen sibles et photosensibles.
1.2. Conclusions techniques
Les conditions optimales de la production de gummulostasine par l'espèce
Ephydatia fluviatiZi-s sont réalisées lorsque les gemmules de type 6 sont mises à incuber pendant 15 jours soit à 17°C, soit à 20°C dans une obscurité cons- tante.
CHAPITRE 2
Spécificité de la Gemmulostasine
Parallèlement à cette recherche portant sur les conditions de la production de gemmulostasine, nous avons entrepris de circonscrire la spécificité de ce métabolite tant du point de vue do sa sécrétion par d'autres Spongillides que du point de vue de son action parmi ces orga nismes, voire même en dehors de ceux-ci. En effet, certains auteurs (413
ont signalé la présence d'agents antimocrobiens chez les éponges marines.
2.1. Spécificité de la sécrétion de gemmulostasine ; mesure de l'activité des milieux conditionnés provenant des 3 espèces de Spongillides.
Nous avons étendu nos expériences aux 3 espèces suivantes :
Ephydatia ftuvïatï.lïs [t'^pe non déterminé], SpongiVLa laoustv'is et
Ephydatia mülteri. Les milieux conditionnés sont obtenus suivant les modalités expérimentales détaillées précédemment (Matériel et Technique].
Cependant, comme Ephydatia rmlZeri se développe apparemment mal dans du milieu M, vraisemblablement à cause du pH (“v 9], nous avons effectué toutes les cultures, y compris celles des 2 autres espèces, dans de l'eau de ville filtrée bactériologiquement.
Le surnageant de chaque espèce a été dosé sur un échantillon de gemmules de même espèce. Les résultats finaux, exprimés en unité d'activité bio
logique (u.a.b.) sont réunis dans la figure 4.
Fig. 4 - Activité inhibitrice (en u.a.b.) des milieux conditionnés
provenant respectivement de l’espèce Ephydatia fluviatilia
(E.f.), Ephydatia miitteri (E.m.) et Spongilta laoustris (S.l.) et testés sur les gemmules dos memes espèces.
Ils montrent que l’activité biologique du surnageant s’élève à
8,2 u.a.b. chez l’espèce Ephydatia ftuoiatiZis, est de 5,4 chez SpongiVLa taauatvie et n’est pas détectable chez l’espèce Ephydatia müttevi.
La comparaison des résultats obtenus pour les 2 espèces Ephydatia fluviatilia et Ephydatia rrülleri met en évidence une corrélation entre
le mode d’hibernation propre à l’espèce (inhibition chimique exogène ou diapause) et sa capacité ou non de sécréter de la gemmulostasine. Chez
25.
La démonstration de la production de gemmulostasine par au moins deux espèces, fait naître la question suivante ; le milieu conditionné a-t-il une action spécifique sur les gemmules de l’espèce productrice ou peut-il inhiber la germination des gemmules d’autres espèces ?
2.2. Spécificité de l’action inhibitrice d’un milieu conditionné.
2.2.1. Au_sein_des_Spongillides
Dans cette expérience, nous avons utilisé les surnageants prélevés précédemment ii 2.1.) et dont, par conséquent, nous connaissons l’activité biologique. Chaque milieu conditionné est testé simultanément sur un échan tillon de gemmules des 3 espèces.
u.a.b. 10
,
0,___
Fig. 5 - Activité inhibitrice (en u.a.b.) dos milieux conditionnés provenant
d'Ephydatia fluviatilis (colonne noire), Spongilla laoustrïa
(colonne hachurée) et Ephydatia mütleri. (flèche) testés simul tanément sur des gemmules d’Ephydatia fluoiatilis (E.f.),
La figura 5, résumant les résultats obtenus, montre que le surnageant
de l’espèce Ephydatia fluviatili-s inhibe aussi bien les gommulas de sa propre espèce que celles d’Ephydatia mUllevi ou de Spongilla laoustris.
De môme, le surnageant de Spongilla laauatris inhibe de façon égale les gemmules des 3 espèces.
Ces données permettent do conclure qu'il existe une différence spéci
fique dans la production de la geinmulostasine par de jeunes éponges mais que l'action inhibitrice de la gemmulostasine n’est pas spécifique au sein des 3 Spongillides étudiées.
Il nous a, dès lors, paru intéressant de vérifier si l’action de la gemmulostasine ne pourrait pas s’étendre à d’autres organismes en inhibant ou en favorisant leur croissance ?
2.2.2. Sur divers organismes_non_spongillides
Pour pouvoir mettre en évidence des effets de la gemmulostasine
sur d’autres organismes, nous avons préféré utiliser des concentrations élevées. Partant d’un milieu conditionné dont l’activité est de 4 u.a.b., nous avons obtenu, après évaporation, un résidu d’une activité de 60 unités,
Les divers essais d’antibiose réalisés sur les Bactéries, les
Protozoaires et les Bryozoaires, cités au paragraphe : Matériel vivant et techniques de culture, ont tous été négatifs.
Dans l’état actuel de nos connaissances, la gemmulostasine doit donc être
considérée comme un agent chimique inhibant uniquement le développement des gemmules des Spongillides, mais sans spécificité d’espèce au sein de cette famille.
Dans une première phase, nous avons voulu vérifier si la gemmulostasine
contrôle le développement précoce des gemmules en agissant spécifiquement sur le mécanisme d’ouverture du mlcropyle. Los expériences relatées dans le
27.
CHAPITRE 3.
Effets de la perforation de la coque des gemmules sur leur
développement ultérieur.
3.1. - Pour vérifier l’hypothèse émise ci-dessus, nous avons imaginé d'imiter mécaniquement l'un des phénomènes de l'éclosion des gemmules en
perforant leur coque.
( 3.1.1. Données techniques
(a] Les expériences ont été réalisées sur des gemmules
de l’espèce Ephydatia fluviatilis, type ô, cultivées à 20°C sous un cycle lumineux 12 : 12 (éclairage incandescent de 35 Ix : obscurité).
(b) Avant la mise en incubation, la coque des gemmules a été perforée soit au pôle opposé au micropyle (fig. B) soit au micropyle
lui-même. Ces traitements ont été réalisés à l'aide d'une micro-aiguille dont le diamètre est voisin de celui du micropyle (4üym).
Fig. 6 - Perforation réalisée dans la coque à l'aide d'une microaiguille; son diamètre est voisin de celui du micropyle (Microscopie
(c) La perforation de la coque provoque la sortie d'un
certain nombre d’archéocytes, que nous pouvons estimer à 2 à 5% de la masse archéocytaire totale.
Si toutefois une partie plus importante du contenu gemmulaire est expulsée, la gemmule est aussitôt écartée des cultures. Les gemmules conservées sont
ensuite réunies par lots de 50 selon les données oxpérimentales décrites ci-dessous.
3.1.2. Données_exgârimentales
4 groupes de 3 boîtes de Pétri contiennent chacune 50 gemmules semées dans 10 ml de milieu:
- Le premier groupe est formé de gemmules intactes réparties dans du milieu M; il constitue le témoin principal de l'expérience. Nous dési gnerons ce groupe par le sig.ie Ifl.
- Un second groupe de gemmules intactes est mis à incuber dans du milieu conditionné contenant 4 unités d'inhibiteur afin de tester son activité
inhibitrice. Ce lot portera les lettres IC.
- Le troisième groupe comporte des gemmules incubées dans le milieu
conditionné, mais dont la coque a été perforée au pôle opposé au micropyle.
Ce traitement permettra de démontrer l’éventuelle action de l'inhibiteur sur le mécanisme d'ouverture du micropyle. Les lettres PC représenteront ce groupa.
- Le quatrième groupe est constitué de gemmules perforées de la même façon, mais placées en milieu M. Ce dernier lot est destiné à mettre en évidence une éventuelle altération du développement a la suite du trauma tisme. Nous l’appellerons Pii.
3.1.3. Résultats
(a] Les archéocytes, expulsés de la gemmule lors de la
perforation de sa coque, éclatent par turgescence au contact du milieu externe.
29.
Illustration des effets de la perforation de la coque sur le développement ultérieur de la gemmule :
Fig. 7, 6 - Jeune éponge issue d'une gemmule après 120 et 16B heures d’incu bation (20°C) dans du milieu M (lot IM). G X 18
Fig. 9, 10 - Différenciation apparemment normale du contenu d'une gemmule après perforation de sa coque dans le milieu M (lot PM âgé respectivement de 120 et 166 heures).
le développement ultérieur du contenu gemmulaire.
(b) En comparant d'une part le groupe IC au groupe PC, le fait suivant apparaît : alors qu’aucune des gemmules intactes n'a éclos
après 10 jours d'incubation, 70% des gemmules perforées ont donné naissance à de jeunes éponges parfaitement viables. Les gemmules dont la coque a été percée sont donc devenues capables de se développer malgré la présence de gemmulostasine dans la milieu.
Ce) Nous pouvons, d’autre part, suivre parallèlement la vitesse de développement des gemmules perforées dans le milieu conditionné
(PC fig. 11, 12) et celle des gemmules perforées dans le milieu M CPU, fig. 9, 10). Nous constatons alors que la différenciation du contenu gemmulaire
est considérablement ralentie dans le milieu conditionné. En effet, si l’on choisit arbitrairement comme point de comparaison l’apparition dans chaque éponge de l’oscule, ce retard est estimé à 96 heures : dans 95% des lots PN, l’oscula est visible après 144 heures d’incubation. En revanche, il n’apparaît qu’après 240 heures d’incubation dans toutes les éponges issues de gemmules du lot PC. Pour plus de clarté, nous avons réuni dans le tableau 3 l’ensemble des données numériques.
TABLEAU 3. N C (4 U. a . b. ) I 96% (^) 0% ... 144 h. -P 95% 70% 144 h. 240 h.
31.
Signification des abréviations utilisées dans ce tableau.
M = milieu H t C = milieu conditionné I = gemmules intactes
P = gemmules dont la coque a été perforee u.a.b. = unité d'activité biologique
% = pourcentage d'éponges parfaitement différenciées après 240 heures
d'incubation à 20'^C.
h = âge des épongés au moment où toutes sont pourvues d'un oscule (exprimé en heures)
(x) = de nombreux tests ont montré qu'un faible pourcentage (3 à 5%) des gemmules n'éclosent Jamais, quel que soit le traitement subi.
Ces résultats font naître la question suivante : existe-t-il une corrélation entre le ralentissement du développement gemmulaire après perforation de la coque et la concentration en gemmulostasine du milieu ?
L'expérience suivante est réalisée dans le but de répondre à cette question :
1) Oonnées
Nous avons constitué 4 lots de gemmules comparables à ceux de l'expérience précédente; seule l'activité du milieu a varié : elle est de 2 unités seulement.
2) Résultats
Le tableau 4 illustre l'ensemble des résultats obtenus.
TABLEAU 4. M C (2 u.a.b.) I 95% 12% 144 h. 216 h. P 95% 92% 144 h. 168 h.
2.1. - L’examen de ce tableau permet de confirmer les principaux
résultats de la première expérience :
- Il suffit de perforer la coque pour que le développement des gemmules se déclenche malgré la présence d'inhibiteur dans le milieu (groupes expéri mentaux : IC et PC);
- par rapport aux témoins perforés dans le milieu M, le développement gemmulaire est néanmoins ralenti dans le milieu conditionné (PM et PC).
2.2. - Cependant, la comparaison des tableaux 3 et 4 (groupe^C) permet de constater que la vitesse du développement gemmulaire varie en
fonction de l’activité inhibitrice du milieu.
De même, le pourcentage d’éponges Issues de gemmules tant perforées (PC) qu’intactes (IC) dépend de la concentration en gemmulostasine du milieu.
Avant d’examiner, à la lumière des faits nouveaux, l’hypothèse émise au départ de ces expériences, il est évidemment indispensable de contrôler l'état du micropylo des gemmules.
Examen_morghologigue_du_micrQpyle
Les gemmules de la première expérience ont été prélevées au onzième
jour d’incubation en vue d’examiner le micropyle au microscope électronique à balayage. Cet examen conduit aux conclusions suivantes :
1) Le micropyle des gemmules perforées dans le milieu M (PM) apparaît aussi largement ouvert que celui des témoins non perforés (IM).
La perforation précoce de la coque semble ne pas modifier l’ouverture ultérieure du micropyle.
2) Le micropyle dos gemmules perforées dans le milieu conditionné (PC; fig. 15,) contrairement à celui des gemmules intactes semées dans le même milieu (IC; fig. 14) est largement ouvert.
33.
Morphologis du micropyle des gemmules.
Fig. 14 - Vue au microscope électronique à balayage du micropyle d'une gemmule intacte inhibée par la gemmulostasine (264 heures d'incubation].G x3»o
Fig. 15 - Micropyle largement ouvert, d'une gemmule dont la coque a été
perforée lors de son ensemencement dans la gemmulostasine (264 heures d'incubation) microscopie électronique. &x5io
Fig. 16 - Coupe histologique (7 ym) passant par le micropyle d'une gemmule
»
Cetts observation démontre que le micropylg a été digéré enzymatlque- ment par les cellules sous-jacentes. Plus précisément, en comparant les micro graphies réalisées au "Stéréoscan” (fig. 14) aux coupes histologiques de la région micropylaire Cfig. 16) observées au microscope photonique, on
constate que c'est la région centrale du micropyle, particulièrement mince, qui est digérée.
4) La comparaison entre gemmules piquées et intactes en milieu condi
tionné, nous permet de penser que cette digestion enzymatique du micropyle
est une conséquence et non pas une condition du développement des gemmules.
Sans vouloir anticiper sur une discussion ultérieure, nous pouvons dès à présent émettre les conclusions suivantes :
- L'expulsion prématurée d'archéocytes gammulaires à la suite de la perforation de la coque, et leur éclatement subséquent, confirment les conclusions de ZEUTHEN (42) : "the Shell allows a high hydrostatic
pressure to develop and thereby prevents osmotic rupture of the gemmule".
SCHMIDT (43) a montré par ailleurs que la différenciation de tels archéo- cytes isolés précocement de la gemmule, peut être rendue possible par une augmentation temporaire de la pression osmotique du milieu de culture. Au contraire, les cellules restées à l'intérieur de la coque sont suffi samment protégées d’un éclatement puisque leur différenciation se poursuit normalement.
- Le fait que le micropyle des gemmules soit ouvert malgré la présence
de gemmulostasine montre que, contrairement à notre hypothèse de départ, la cause directe du blocage du développement gemmulaire ne peut donc être recherchée dans une inhibition du mécanisme d’ouverture du micropyle.
- La constatation que la perforation de la coque permet aux gemmules de sa développer malgré la présence de gemmulostasine, indique d'ailleurs
que celle-ci n'est pas seule responsable de l'inhibition.
35.
3.2. - En présence de ces résultats, nous avons voulu suivre l'effet éventuel d'une perforation de la coque sur le développement des genroules
d'Ephydatia mülleri^dlapause.
3.2.1. Q9nnées_Bxgérimentales
La principe de l'expérience est le meme que pour
Ephydatia fluvCatïUs : les gemmules, récoltées au mois de juillet sont semées par lots de 50 dans 10 ml d'eau de ville filtrée bactériologiquement.
Dans un premier groupe expérimental, des gemmules intactes sent mises à incuber à 20°C, sous un cycle lumineux 12 : 12 (éclairage incandescent
de 45 Lx : obscurité).
Dans un deuxième groupe, des gemmules sont perforées au pôle opposé au micropyle avant d'être transférées à 20°C.
3.2.2. Résultats
- Après B jours d'incubation, 73% des gemmules perforées
ont donné naissance à de jeunes éponges parfaitement organisées.
- En revanche, aucune des gemmules intactes n'a éclos.
- L'analogie entre les effets d'une perforation de la coque sur le développement des gemmules inhibées par la gommulostasine et les
effets d'une telle opération sur des gemmules en diapause est saisissante.
- Par ailleurs, le fait que la gommulostasine peut inhiber les gemmules d'Ephydatia mülteri sorties de diapause (chapitre 2) renforce l'hypothèse émise dans l'introduction de ce mémoire : "l'action de la gemmulostasine et l'action de la diapause révéleraient deux aspects d'un
mécanisme fondamentalement identique.
CHAPITRE 4.
Homent d'action de la gemmulostasine
4.1. Efficacité de la gemmulostasine à différents moments de la
germination.
Nous avons expérimenté uniquement sur l'espèce Ephydatia fluviatiZis,
dont la physiologie est la mieux connue. Des groupes de 3 lots de 50
3t maintenus à 2G°C pendant 14 jours. En outre, ces cultures sont soumises
durant toute l’incubation à un cycle lumineux 12 : 12 (éclairage incandes cent de 45 Lux : obscurité).
Dans une première série d’expériences, le milieu ”M" de culture est remplacé après des temps variables au cours de l’incubation gemmulaire par un milieu conditionné (4 u.a.b.). Nous avons effectué le changement
de milieu après 12, 24, 36, 40, 60 et 72 heures. Dans une seconde série d’expériences réalisées simultanément, et dans les mêmes conditions que
la première, les gemmules subissent le traitement inverse : mises en culture en milieu conditionné, clics sont transférées on milieu "fl'’ après des temps variables; lors du transfert, elles sont abondamment lavées
avec du milieu "M" afin d'éliminer toute trace de gemmulostasine.
Parallèlement, des gemmules sont ensemencées dans le milieu '’M" et dans le milieu conditionné depuis le temps D de l’incubation jusqu’à la fin de l’expérience. Ces lots servent de témoin aux deux séries d’expériences.
Pour chaque condition expérimentale, le pourcentage d’éclosion gemmulaire est suivi de 24 en 24 heures.
Les résultats sont portés sur les graphiques des fig. 17 et 18 où les
37.
Fig. 17-13 - PourcentagGs de gemmules écloses au cours du temps
(exprimés en heures] dans diverses conditions expérimentales
(voir texte].
Le traitement subi par chacun d'eux est représenté par les sigles :
rc : lorsque du milieu "M", ajouté au temps 0, est remplacé ultérieu
rement, par du milieu conditionné ”C".
CM : dans le cas inverse.
Chaque groupe de lettres est précédé d'un nombre correspondant à la durée en heures du séjour des gemmules dans le premier trilieuj elles sont
Quelques uns des résultats sont présentés de façon différente dans le tableau 5 en vue de mettre certaines de leurs implications en évidence. Les lignes C et D correspondent aux transformations aritHetotiques succes sives de cos données.
TABLEAU 5 : Influence de la gommulostasine introduite à des moments
différents de la germination sur l'éclosion des gemmules après 14 jours.
A. Temps t (on jours )du transfert des gemmules du milieu ”14” dans le milieu conditionné (MC) 0 0.5 I 1,5 2 2,5 3 j. B. Pourcentage P d'éclosion après 14 jours de culture 0 0 23 44 69 92 95% C. Pourcentage de non éclosion après 14 jours de culture (1ÜÜ-P) 100 100 77 56 31 8 5%(1) 0. Pourcentage d’inhibition après le temps t parmi les gemmules suscepti bles d'éclore (1) (1ÛÜ-P-5) 100
95
100 100 76 53 27 3 0%
39.
Les données des fig. 17 et 18 permettent de tirer les conclusions suivantes
1°) L’action inhibitrice de la gemmulostasinc est réversible puisqu’il
suffit de laver les gemmules inhibées pour que leur germination débute aussi tôt. En effet, si l’on compare [fig. 17} le temps d'éclosion de 5G% des gemmules du lot 36 CM avec celui du lot 12 CM, il apparaît un retard de
26 heures qui correspond, à 2 heures près, à la différence des durées de leur inhibition initiale.
2°) La comparaison des différentes courbes de la fig. 16 montre que plus le temps d’incubation initial dans le milieu "M" est long, plus le pourcentage d'éclosion gemmulaire est élevé- Contrairement à l’hypothèse que nous avions formulée au chapitre 3, la gemmulostasine agit donc sur
le développement de la gemmule en inhibant une phase précoce de leur germination.
D’autre part, en examinant le tableau 5 (lignes A et D), nous pouvons
préciser que pour un bon nombre des gemmules testées, la gemmulostasine n’agit plus après 2 jours d’incubation, c’est-à-dire pendant toute la seconde moitié de celle-ci. Des résultats analogues ont été obtenus sur des gemmules qui, provenant d’une autre souche 6’Ephyâ/itïa fluviatit-is
(type ô}»éclosent après 3 jours d’incubation (la phase sensible est de 36 heures).
Par ailleurs, en observant les lots- MC, nous constatons que lorsque la gemmule éclot dans le milieu conditionné, elle se différencie en une jeune
éponge parfaitement viable. La gemmulostasine inhibe donc spécifiquement les archéocytes gemmulaires; elle n’a aucune action sur 1’organogénèse ultérieure de l’éponge. Par l’ensemble de cos données, nous sommes amenée à examiner ce qui, sur le plan morphologique, caractérise la phase sensible du développement de la gemmule.
4.2. Examen histologique de la phase du développement gemmulaire inhibée par la gemmulostasine.
4.2.1. Développement normal de la gemmule
La germination des gemmules d’Ephydatia fluviatitis a fait l’objet d’un récent travail (44) qui, basé sur le dénombrement des
différents types cellulaires, apporte d’importantes précisions aux
avant la mise en incubation à 20°C. Les archéocytes [32) sont les seuls types cellulaires constituant la gemmule.
Fig. 20 - Détail d’un archéocyte montrant les deux noyaux (N) nucléoles proches l’un de l'autre ainsi que les plaquettes vitellinos (P.V.).
Fig. 21 - Un archéocyte d’une gemmule non incubée vu au microscope électronique Ni ,N2 : noyaux
P.V. ; plaquettes vitellines L. : gouttelettes lipidiques.
(Nous remercions notre collègue Nonsieur L. DE VDS pour nous avoir aimablement cédé ce cliché).
40.
connaissances acquises (45).
Rappelons que les données physiologiques de l'expérience précédente ont permis de conclure que, pour des gemmules susceptibles d’éclore après 3 jours d'incubation è 20°C (type 6) la phase sensible est de 36 heures
(à dater de l'ensemencement).
Compte tenu de ce résultat, nous avons suivi (sur coupes sériées) de 12
en 12 heures les transformations cytologiques subies par les archéocytes gemmulaires; nos résultats ont été confrontés avec ceux obtenus par
BERTHOLD. Il convient de noter que 66% des gemmules testées éclosent dans le milieu "M” après 72 heures d'incubation à 20°C, soit deux fois plus lentement que dans les conditions expérimentales décrites par cet auteur
(25°C, dans une eau d'étang). En fait, le choix d’une température plus basse présente un double avantage : d'une part elle est plus proche des conditions naturelles d’éclosion, d’autre part, elle nous permet d’établir avec une meilleure définition la chronologie des différentes étapes du
métabolisme germinatif.
Résultats
Avant la mise en incubation, la gemmule est formée d'un
nombre variable d'archéocytes (fig. 19) : cellules apparemment toutes semblables, bourrées de plaquettes vitellines dont 1’ultrastructure a été
étudiée par divers auteurs (46). Chaque archéocyte (fig. 20) est en outre caractérisé par la présence de deux noyaux accolés mais distincts. Ce dernier point a été vérifié au microscope électronique (fig. 3. ). Nos documents photographiques confirmant donc les dessins réalisés par BRIEN,
LEVEAUX et WIERZEJSKY.
b) Au bout de 24 heures, un écartement des noyaux se produit dans certains archéocytes (35 à 60%). Ceux-ci conservent cependant la structure fondamentale décrite précédemment. Ce phénomène, qui apparaît dans nos préparations avec une fréquence très variable, a été systématique ment suivi par BERTHOLO : il s’observe dès les 5 premières heures dans 90% des cellules. La différence quantitative entre ces résultats et les nôtres nous paraît peu importante compte tenu des différences dans nos conditions
(45) BRIEN, 1932J LEVEAUX. 1939j WIERZEJSKY, 1935.
.
de culture et des éventuelles propriétés intrinsèques liées aux différentes
souches d’Ephydatia fluviatilis.
D’ailleurs, ni BERTHOLD ni nous-même n'appuyons nos observations sur des données statistiquement valables. En effet, une étude statistique du phé nomène impliquerait un travail extrêmement long en raison du caractère peu
synchrone de l’éclosion gemmulaire et des difficultés techniques de la fixa
tion histologique.
L’importance exacte des mouvements d’écartement des noyaux décrits par
BERTHOLD nous échappe encore; la réorganisation cytoplasmique à laquelle
ils correspondent mériterait, sans doute, un examen plus approfondi au microscope électronique.
c) Au cours des 12 heures suivantes (36 heures à dater de
1’ensemencement) aucune autre modification cytologique n’apparaît. Néanmoins, comme l’illustre la figure 22, des réserves doivent être faites concernant l’état binucléé de certaines cellules.
heures d’incubation.
Fig. 23 - L'utilisation d’un filtre-orange (505 nm) lors de la photographie met en évidence les noyaux des cellules.
