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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Kemp, T. (1987). Utilisation des leucocytes polynucléaires neutrophiles humains pour l'identification du défaut biochimique primaire de la mucoviscidose (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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Laboratoire de Biologie du Développement

UTILISATION DES LEUCOCYTES POLYNUCLEAIRES NEUTROPHILES HUMAINS POUR L*IDENTIFICATIOM DU DEFAUT BIOCHIMIQUE PRIMAIRE

DE LA MDCOVISCIDOSE

Thèse présentée pour 1' obtention du grade scientifique de

Docteur en Sciences

(orientation Biologie Moléculaire)

Université Libre de Bruxelles Thierry KEMP

Juillet 1987

différenciation cellulaire par 1'utilisation d'ARN anti-messagers.

UTILISATION DES LEUCOCYTES POLYNUCLEAIRES NEUTROPHILES HUMAINS POUR L'IDENTIFICATION DU DEFAUT BIOCHIMIQUE PRIMAIRE

DE LA MUCOVISCIDOSE

Thèse présentée pour 1'obtention du grade scientifique de

Docteur en Sciences

(orientation Biologie Moléculaire)

Thierry KEMP

Juillet 1987

d'accoucher d'un chef-d'oeuvre de littérature qui soit original tout en restant dans les limites du respect du lecteur et des personnes

concernées. J'ai bien peur de n'avoir réussi à faire ni l'un ni l'autre et je prie tous ceux qui auront le courage de s'aventurer dans la lecture des lignes qui suivent de ne pas prêter attention aux "erreurs" qui pourraient s'y être glissées et si, par mégarde, ils avaient l'impression d'être oubliés ou lésés, de m'excuser de ce manque de reconnaissance ou de tact.

Lorsque je me suis mis en quête (un peu tard, j'en conviens!) d'un laboratoire pour réaliser ma thèse de doctorat, la seule proposition intéressante émana d'un laboratoire que la plupart des étudiants

évitaient. Et bien, ils avaient tort! Non pas de fuir un personnage qui pouvait paraître rebutant au premier abord, mais de ne pas tenter

l'aventure avec un personnage intelligent et plein d'idées, le professeur Raphaël Kram. Ce serait pure injustice de ma part si je ne lui

reconnaissais pas la paternité du modèle que nous avons utilisé pour

organiser nos recherches. Et je regrette profondément qu'il ne soit pas là

aujourd'hui pour recueillir le fruit des recherches dont il a été le

génial promoteur. Je ne prétends pas vouloir faire un portrait idyllique

du professeur Kram mais, malgré que la vie et les discussions ne soient

pas toujours roses avec lui, on pouvait toujours être sur qu' il était prêt

à vous écouter et à vous donner des idées et des conseils avisés et que,

par dessus tout, il était profondément humain. Sa disparition, qui ne sera

jamais totale pour moi, a causé un bouleversement du laboratoire à la

mesure du patron qu'il avait été.

promoteur de ma thèse, alors qu'il dirigeait déjà une équipe de recherches et que le domaine abordé par mes recherches était plutôt éloigné de ses préoccupations génétiques. Je lui suis reconnaissant d'avoir agi avec nous tous comme un leader avisé, c'est-à-dire de nous avoir fait confiance pour 1' organisation des recherches en ne cherchant qu' à superviser ce que nous réalisions et non à imposer ses propres idées. Par la discussion, il nous faisait sentir qu'il était là pour nous aider mais qu'en définitive c'était nous qui étions capables, plus que lui, de juger de l'opportunité de ce que nous faisions. C'était là, selon moi, une bonne tactique pour nous donner confiance en notre approche du problème et le meilleur moyen de m'apprendre à me débrouiller seul (et n'est-ce pas là le but d'une thèse de doctorat?). Pour l'article, pour cette thèse et pour tout le reste, je remercie chaleureusement Claude.

Mes remerciements vont aussi au docteur René Van Geffel, autre promoteur de ces recherches, sans lequel rien n'aurait pu être fait. Je le remercie pour tous les efforts qu'il a fourni afin de nous permettre de travailler sur la mucoviscidose et pour le temps qu' il a pu nous consacrer malgré ses nombreuses autres activités.

Je remercie le professeur Eric Schram pour nous avoir permis

d'avoir accès aux appareillages de son laboratoire pour réaliser nos

expériences de chémi1uminescence et de fluorescence ainsi que pour les

précieux renseignements qu'il m'a fourni de temps à autre en toute

simplicité. Merci aussi à Henri Roosens pour son aide efficace.

laboratoire, est probablement une des rares personnes capables d'évoluer entre les écueils de l'expérimentation sans en perdre sa conscience professionnelle. Je dois lui reconnaitre un talent certain au

perfectionnement constant des techniques qu'elle utilise et une volonté de s' engager à fond dans tout ce qu'elle a fait. Mais, au-delà de la rigueur scientifique des expériences que nous avons réalisées, il y a le besoin de communiquer et je dois dire qu'à ce niveau-là, Angèle était plutôt mal récompensée avec moi. Je ne suis pas très bavard et, en-dehors des

considérations purement scientifiques, il ne fallait pas s' attendre à un délire de paroles de ma part. Cependant, par sa gentillesse et sa

patience, Angèle a pu m' amener à sortir peu à peu de ma réserve et elle est devenue plus une amie qu'une collaboratrice. Quoi qu'il en soit, je ne sais pas si, sans elle, j'aurais pu obtenir tous les résultats qui sont regroupés dans ce volume et cette thèse est autant la sienne que la mienne. Pour toutes les choses que je te dois (dans et en-dehors de la collaboration), je te remercie de tout coeur, Angèle.

Je terminerai (enfin, me direz-vous! ) ce long discours en citant brièvement ceux qui ont eu une incidence sur cette thèse: Monique (pour tout ce qu'elle a pu taper pour moi et m'a supporté d'entendre taper),

Edmond ( pour des conversations intéressantes et 1' humour omniprésent), Luc (pour sa compagnie les neek-ends), Jean (pour sa bonne humeur) et les

"dames du laboratoire" (Eliane, Françoise, Jacqueline, Marianne, Michèle,

Renée et Sylvie) qui, à un moment ou à un autre, m' ont apporté aide et

assistance. Enfin, je n'oublierai pas de remercier les parents et amis qui

m' ont donné leur soutien durant toutes ces années.

ABBREVIATIONS PREFACE

INTRODUCTION

1) La mucoviscidose: page 1

Altérations biochimiques et physiologiques page 3

a ) g1

yCoppute 1neS

page 3

Df

conuenu en eiecLroiyLes page

L. } page 6

U

aX

a LXUiio

Co page 9

e ;

page

I ) auLres ODservations page 1 2

r acteurs page

a) facteurs affectant la mobilité ciliaire page

b) facteurs influençant la sécrétion page

c) facteurs influençant le transport membranaire page 16

d) les polyamines page 16

e) interactions protéase-antiprotéase page 17

f ) autres facteurs sériques page 18

Modèles animaux page iq

Immunologi e page 20

Diagnostic page 22

1) électrolytes page 22

2) albumine et enzymes page 23

3) trypsine immunoréactive page

4) sondes d'ADN page 26

b) fonction page 29

c) phagocytose et dégranulation page 30 i) aspect dynamique page 30

ii) aspect énergétique et métabolique page 32 d) production de superoxydes et chémiluminescence page 35

i) NADPH oxydase page 35

ii) activation de la NADPH oxydase page 37 iii) chémiluminescence page 38

e) rôle du cytosquelette page ^0 i) microtubules page 40 ii) microfilaments page 41

II) Séquence stimulation-activation du neutrophile page 42

a) chronologie des réponses du neutrophile stimulé page 42 b) interactions 1igand-récepteur page 43

c) récepteurs des peptides chémotactiques page 45 III) Réponses physiologiques du neutrophile stimulé page 49

1) changements membranaires page 49

a) changements de microviscosité page 49

b) changements de potentiel membranaire page 50 2) mouvements ioniques page 52

a) l'ion calcium page 52

b) les cations monovalents page 5fa c) les anions page 57

3) nucléotides cycliques page 58

4) phosphorylation des protéines page 59 protéine kinase C (PKC) page 61 5) métabolisme des phospholipides page 63

a) métabolisme des phosphoinositides page 64 b) 1'IP3 et la mobilisation du calcium page 65 c) le DAG et 1'activation de la PKC page 67 d) rôle complémentaire du métabolisme

des phosphoinositides page 67 e) les nucléotides guanylés et la

régulation de 1'activation du neutrophile page 68

f) contrôle de la production d'icosanoïdes page 71

FI) voie de la cyclo-oxygénase page 73

d u P A F e t d u L T B * p a g e 7 6 h1) 5 - H E T E page 76

h2) PAF page 76 h3)

page 77

M) synergisme de ces 3 agents page 78 6) synthèse page 79

B U T D U T R A V A I L

page 81

M A T E R I E L E T M E T H O D E S

page 83

1) matériel 2) méthodes

a) isolement des neutrophiles b) procédures d'incubation c) dosages des constituants

granulai res i) beta-glucuronidase ii) protéine liant la

vitamine B12 iii) intégrité des

cellules

d) mesure de la chémiluminescence e) dosage des récepteurs du FMLP f) dosage du calcium cytoplasmique

libre par le Quin-2 g) mesure du calcium associé

à la membrane par la chlortétracycline

h) électrophorèse à 2 dimensions des protéines

i) marquage des cellules au

page 83 page 84 page 8H page 84

page 84 page 84

page 85

page 86 page 86 page 87

page 87

page 88

page 89

page 96

a) isolement des neutrophiles page 97 b) contenu granulaire page 99

c) analyses de corrélation page 102 d) intervention de la CB page 105 e) conclusion du chapitre 1 page 1 0 5 2) modulation de l'activité sécrétoire

des neutrophiles page 107 a) modulation par les nucléotides

cycliques page 107 b) agents altérant la perméabilité

membranaire page 112 c) agents affectant le métabolisme

des phospholipides membranaires page 117 d) conclusions du chapitre 2 page 126

3) comparaison de la réponse des neutrophiles

à différents stimuli page 129 Altération of the FMLP-induced

Response in Cystic Fibrosis

Neutrophils ( Pediatr. Res.) page 130 Résultats complémentaires page 137 Conclusions du chapitre 3 page 149 4) dissection du couplage stimulus-réponses

du neutrophile page 151 a) protéines N page 151

b) activation de la PKC page 153 c) calcium intracellulaire page 1 5 7

cl) chlcrtétracycline page 157 c2) Quin-2 page 160

d) analyse des protéines du neutrophile sur gel

d'électrophorèse page 163 e) conclusions du chapitre 4 page 170

DISCUSSION page 173

BIBLIOGRAPHIE page 185

àk : acide arachidonique

âMPc : adenosine monophosphate cyclique â23l87 : ionophore du calcium A23187

analyse 1D : analyse des protéines à une dimension (sur base du pl ou du Mr) analyse 2D : analyse des protéines à deux dimensions (sur base du pl et du Mr) BSA : bovine sérum albumin

C3b : facteur du complément C5a : facteur du complément CB : cytochalasine B

CBZ-phe-met : carbobenzoxy-phénylalanine-méthionine CF : cystic fibrosis ou Mucoviscidose

Con A : concanavaline A CTC : chlortétracycline da : daltons

1,2-DAG : 1,2-diacylglycérol DS : déviation standard

EDTA : ethylene diaminetetraacetic acid

EGTA : ethylene glycobis-(beta-aminoethyl) ether tatraacetic acid FAD : flavine adenine dinucleotide

FMLP : N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine

fraction Fc : fraction des immunoglobulines après digestion par la papaïne GGTP : gamma-glutamyl transpeptidase

GMPc : guanosine monophosphate cyclique 5-HETE : acide 5-hydroxyéicosatétreènoïque Ig : immunoglobuline

Ins : inositol

IP : inositol-1-phosphate

IP2 : inositol-1, 4-biphosphate IP3 : inositol-1, 4, 5-triphosphate IP4 : inositol-1, 3, 4, 5-tetraphosphate IRT : trypsine immuno-réactive

Kda : kilodaltons

LDH : lactate déshydrogénase LTB4 : leukotriène B4

MPO : myéloperoxydase

Hr : poids moléculaire apparent

MDGB : methylumbelliferylguanidobenzoate

Oi' : anion superoxyde PA : acide phosphatidique

PAF : platelet-activating factor PC : phosphatidylcholine

PE : phosphatidyléthanolamine PGEi : prostaglandine Ei

pl : point isoélectrique PI : phosphatidylinositol

PIP : phosphatidylinositol-4-phosphate PIP2 : phosphatidylinositol-4, 5-diphosphate PKA : protein kinase A

PKC : protein kinase C

PKCa : calmodulin-dependent protein kinase PLA2 : phospholipase A2

PLC : phospholipase C

PMA : phorbol myristate acétate PMSF : phenylmethylsulfonyl fluorure

protéine N (Ni, Np, Nj) : protéine régulatrice liant les nucléotides guanylés (= protéines G)

PS : phosphatidylsérine

Ptdins : phosphatidylinositol

Quin-2 : 2- ( 2-bis-(carboxymethyl)-amino-S-methylphenoxy)-methyl -6-methoxy-8-bis- carboxymethyl aminoquinoline

RFLP : restriction fragment length polymorphism SDS : sodium dodecyl sulfate

SOD : superoxyde dismutase

TEMED : N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine TFP : trifluoperazine

TMB-8 : 8, 8'-(N,N-diethylamino)-octyl-3, 4, 5-trimethoxybenzoate TP : toxine du pertussis

TPP* : ion tétraphényl-phosphonium

TPMP* : ion triphényl-méthyl-phosphonium

ZO : zymosan opsonisé

consacrée à la mucoviscidose et 1'autre est une revue assez complète des données de le littérature concernant la physiologie des leucocytes

polynucléaires neutrophi1 es. Cette introduction étant longue (80 pages) mais pas nécessaire dans sa totalité pour la compréhension des recherches entreprises, une mise au point des paragraphes principaux est faite

ci-dessous afin de faciliter la lecture et de ne pas noyer le lecteur sous une avalanche de détails importants mais pas essentiels pour suivre les chapitres Résultats et Discussion.

Les pages consacrées à la mucoviscidose comportent un paragraphe citant les différentes techniques de diagnostic de la maladie (pages 22 à 26); ce paragraphe est présenté uniquement à titre indicatif. Le reste du chapitre contient déjà une sélection des nombreuses recherches menées sur la mucoviscidose dans différents domaines (histologie, physiologie, biochimie, pathologie, . . . ).

La partie consacrée à la physiologie du neutrophile est

détaillée mais, une synthèse des points essentiels est présentée à la fin de l'Introduction (pages 78 à 80) avec un schéma accompagné d'un texte explicatif. Il sera toujours loisible au lecteur soucieux d'approfondir certains points de se rapporter aux paragraphes correspondants de

l'Introduction. De plus, un bref rappel des points étudiés est fourni dans chaque paragraphe des Résultats.

J' espère avoir un peu guidé le lecteur dans le labyrinthe de

cette thèse et lui souhaite une bonne lecture.

INTRODDCTION

1) La mucoviscidose:

La mucoviscidose (ou Cystic Fibrosis ou CF) est la maladie génétique léthale la plus commune (une naissance sur 1600 à 2500) parmi les individus de race blanche et elle est transmise comme un caractère autosomique récessif. Cette maladie est caractérisée par la triade

clinique de maladie pulmonaire chronique, d'insuffisance pancréatique et de taux élévés d'électrolytes dans la sueur, quoique d'autres

manifestations cliniques puissent être présentes et compliquer le tableau (voir liste). Les homozygotes CF ont toutes les manifestations du

syndrome, du moins en substance, alors que les hétérozygotes (portant une seule copie du gène CF), qui constituent U à 5% de la population, n'ont aucun symptôme clinique reconnaissable ( Di Sant'Agnese and Davis, 1976 a, b, c). On n'a pu encore expliquer de manière convaincante la raison du maintien dans la population d'un défaut génétique à une telle fréquence;

on a avancé 1' idée d'avantages contre certaines maladies, d'accroissement de la fertilité ou de dérive génétique mais aucune hypothèse n'a pu

expliquer valablement les faits observés (Nadler and Ben-Yoseph, 1984).

Le gène de la mucoviscidose a été localisée au milieu du long bras du chromosome 7 par plusieurs équipes de recherches (KnoHlton et al, 1985; Hhite et al, 1985; Hainwright et al, 1985) (voir figure A). Ces équipes ont utilisé un polymorphisme lié à un fragment de restriction

( RFLP ou restriction-fragment linked polymorphism) pour localiser ce gène;

un RFLP est une variation dans une séquence d'ADN qui génère ou abolit un

site pour une enzyme de restriction. Quand le RFLP est localisé assez près

du gène sur le chromosome pour ne pas en être séparé par recombinaison

génétique (survenant au cours de la méiose), le RFLP peut servir de

marqueur lié du gène. La sonde d'ADN reconnaissant le RFLP de Knowlton

(DOCR1-917) s'hybride à 1'ADN à une distance de 15 millions de paires de

base du locus CF alors que celles de Hhite (met) et de Kainuright (pJ3. 11,

Defect Organ Pathogenesis Clinical Manifestations

Usual Onset

Estimated Freq uency

•Viscous mucus

Genetic defect (ail exocrine glands)

f Lungs

Altered — electrolytes

IJpper airway Gastro-

intestinal tract

Pancréas

^iver

- Gallbladder

Reproductive tract

Sweat glands

Salivary glands Kidneys

Obstruction/

infection

Obstruction/

infection Intestinal

obstruction

Inspissation/

obstruction/

fibrosis Obstruction/

fibrosis

Obstruction

Vas deferens oblitération Thick vaginal

sécrétions

?

Sait loss

Bronchiectasis Bronchitis Pneumonia Atelectasis Hyperinflation Cor pulmonale Pneumothorax

Hemoptysis (massive) Sinusitis

Nasal polyps Meconium iléus Meconium peritonitis Gl. atresia

Meconium iléus equi\alent Intussusception Pancreatic

insufficiency Malabsorption Subclinical

cirrhosis

Portai hypertension

Neonatal jaundice Cystic duct

obstruction Small gallbladder

cholelithiasis Sterility

Ail âges Near 100%

Usually older

Ail âges

Birth

Usually birth

Older Birth

Older Decreased

fertility

Abnormal sweat Birth electrolytes

Heat prostration Metabolic alkalosis

Abnormal electrolyte Ail âges concentrations

Increased free water clearance

10-20^ ( 10 years ) Occasional

90%

10-15%

5-10%

Ail âges Common

Occasional 80-90%

Ail âges 25-50%

Late childhood Infancy Ail âges

Occasional 20%

10-15%

98%

Common

Near 100%

Ail âges Occasional

Near 100%?

Ail ages(?)

Defect Organ Pathogenesis Clinical Manifestât:ons

Usual Onset

Estinated Frequenc y

Secondar y plienoniena

Gastro-

i nt est:nal t ract

j'ancreas Retina

Kars

-Heart

- Ex tremities

Central nervous

System

• Endocrine glands (thyroid ,

adrenal )

Malabsorption

Stools.cough, poor subcutaneous tissue

Fibrosis

Hypoxia .exudative retinopathy Middle ear

obstruction Hypoxia,broncho-

pulmonary anastomosis

Hypoalbùminemia edema

HypoproLhrombi nemia Rectal prolapse

Ail âges Occasi.onal

Vit A

deficiency

Younger chi.ld

Diabètes mellitus Older Visual disturbance Ail âges

Conductive hearing Ail âges loss

Cor pulmonale Ail âges Fibrosis

Hypervolemia, hypoalbùminemia Hypertrophie

osteoarthropathy Clubbing Ail âges

Pseudotumor cerebri Infancy

Pathologie changes, ? neuroaxonal dystrophy Mostly biochemical ?

changes

Occasiona J.

20-23%

1-2%

-Rare

Occasional

75%

Rare

Common

Ail âges Occasional

90%

Occasional

Chromosome /

assignées aux positions indiquées par la génétique des cellules somatiques et l'hybridation in situ. La localisation physique des autres marqueurs est moins certaine, quoique met ait été assigné à la région 7q22 par hybridation in situ.

Les distances de recombinaison sont dé- duites d'études sur familles.

Les distances CF-met et CF-pJ3.11 sont de 1-2 cM. Il n'a pas été possible de déduire l'ordre génétique de ces trois marqueurs étroitement liés mais il est probable que pJ3.11 et met soient du même côté de CF.

C 0 L 1 A 2

D O C R 1 - 9 1 7

PON

CF. r7?9/. pJ3.11

- 2 0 c M

TCRB

' 2 0 c M

C0L1A2 et TCRB) ne sont qu'à une distance d'environ 1 million de paires de base. Ces deux dernières sondes confinent donc la localisation précise du gène CF à une faible fraction du génome humain (moins de 0 , T o u t récemment, Estivill et al (1987) ont décrit l'identification d'une

séquence codante sur le chromosome 7 comme candidate potentielle du gène CF à l'aide d'une séquence HTF (Hpall tiny fragment).

La mucoviscidose affecte primairement les glandes exocrines mais les glandes sécrétrices de mucus sont affectées morphologiquement et

physiologiquement par le processus pathologique (glandes muqueuses de la trachée, quelques glandes salivaires, glandes de Brunner, . . . ) tandis que les glandes séreuses ( glandes de la parotide et glandes sudoripares)

semblent normales morphologiquement et physiologiquement, quoique leurs sécrétions puissent être chimiquement anormales comme dans le cas de la teneur accrue en sodium, en chlore et en potassium de la sueur ( Di

Sant'Agnese and Davis, 1976 a, b,c; Davis and Di Sant" Agnese, 1980). Il est clair à présent que si quelques patients peuvent contracter la maladie pulmonaire tard dans leur vie et si quelques-uns peuvent échapper à la déficience pancréatique, tous les patients CF ont des taux élevés d'électrolytes dans la sueur. Le développement continu des agents antibiotiques et des approches modernes de thérapie de la maladie

pulmonaire chronique a abouti à un prolongement de l'espérance de vie et à

une amélioration de la qualité de la vie pour le patients CF. Malgré cela,

avec les meilleures estimations, plus de 50% des patients CF meurent avant

d'atteindre l'âge de 21 ans (Davis and Di Sant'Agnese, 1980).

Altérations biochimiques et physiologiques

La plupart des manifestations cliniques de la mucoviscidose sont relativement bien connues ( Di Sant'Agnese, 1975) et celles-ci sont

secondaires à deux anomalies: la "sécrétion muqueuse" anormale et le taux d'électrolytes dans la sécrétion des glandes sudoripares.

a) Glycoprotéines du mucus

Les cellules des glandes exocrines sécrètent des glycoprotéines, des enzymes et d'autres macromolécules. Les composants macromoléculaires sont largement responsables des propriétés physiques des sécrétions et les glycoprotéines sont capables de former des gels en fonction de leur

concentration, de la formation de liens intermoléculaires (ponts

disulfures) et de la composition ionique du fluide sécrété (Rose et al, 1979).

Les sécrétions muqueuses des patients CF se comportent anormalement du point de vue physicochimique: elles précipitent et obstruent les passages des organes, donnant ainsi lieu à la maladie pulmonaire chronique, à la dégénérescence pancréatique, à la cirrhose hépatique, à l'obstruction intestinale et à d'autres complications. Ces complications peuvent apparaître à n'importe quel moment de la vie depuis la naissance jusqu' à 1' adolescence. Les analyses des sécrétions muqueuses ont révélé que celles-ci avaient une viscosité accrue, un contenu réduit en eau et un taux élevé de calcium ( Boat and Dearborn, 1984) ; le calcium serait responsable de la précipitation de complexes calcium-protéines et de l'augmentation de la réabsorption du sodium par les cellules (par l'intermédiaire d'un échange Ca**/Na*), ce qui provoquerait la

réabsorption d'eau par ces mêmes cellules, expliquant ainsi les sécrétions épaisses et visqueuses qui caractérisent la maladie ( Hadorn et al, 19&8;

Johansen et al, 19b8; Sorscher and BresloH, 1982). Il y a de fortes présomptions que les glandes muqueuses sont morphologiquement normales avant le début des effets secondaires de la maladie (Reid and de Haller, 1967a; Oppenheimer and Esterly, 1973), mais, malgré les nombreuses

observations que le comportement physicochimique des sécrétions CF est

anormal, on n'a pu le démontrer catégoriquement ( Boat and Dearborn, 198U).

Slomiany et al (1983a,b) ont démontré que les glycoprotéines du mucus gastrique des patients CF sont fortement acylées par des acides gras et ces acides gras sont capables de modifier la solubilité des

glycoprotéines et de les protéger de la dégradation protéolytique, ce qui pourrait conduire à 1' accumulation de sécrétions peu solubles et

abondantes dans les canaux des glandes sécrétoires. Ceci résulterait de l'activité accrue d'une acetyltransferase (Slomiany et al, 1985). Des modifications dans les quantités de sucres sulfatés (Reid and de Haller, 19b7b; Boat and Cheng, 1980; Frates et al, 1983), dans la glycosylation (augmentation du contenu en fucose, en galactose et en

N-acetyl-glucosamine et baisse du contenu en acide sialique) et dans la longueur des chaînes d'oligosaccharides ont été observées sur les

glycoprotéines CF (Louisot et al, 1973; Rao et al, 1977; Ben-Yoseph et al, 1981; Hesley et al, 1983); aucune variation n'était notée dans l'activité des glycosidases (Boat and Dearborn, 198U). Le fait qu'on ait observé une activité accrue de glycosyltransferases chez les patients CF (Louisot et al, 1973; Rao et al, 1977; Hesley et al, 1983), une hypoglycosylation des IgG de patients CF (Margolies and Boat, 1983) et une hypoglycosylation de 1'alpha2 -macroglobuline (Ben-Yoseph et al, 1979; Shapira and Henendez, 1980) pose le problème d'une déficience dans la régulation de la

glycosylation, essentielle à la sécrétion, chez les patients CF.

Le rôle possible de la membrane cellulaire dans la pathogénèse de la mucoviscidose a motivé de nombreuses études des glycoprotéines membranaires et a conduit à des résultats controversés sur les

fibroblastes (Fitzpatrick et al, 1972; Fletcher and Lin, 1973; Scaulin et al, 1982; Barris and Bramnell, 1983; Rudick et al, 1983) et sur les

glycoprotéines du mucus ( Oden et al, 1982). Ainsi, une étude des

glycoprotéines des fibroblastes, des membranes d'érythrocytes, de l'urine et du plasma à 1' aide de lectines n' a démontré aucun changement spécifique à la mucoviscidose mais plutôt une grande variation individuelle

attribuable en partie à des polymorphismes génétiques distincts de la maladie (Karllson et al, 1984).

On a également proposé que des anomalies dans les constituants

inorganiques des sécrétions CF, particulièrement le calcium, pourraient rendre compte de leur comportement physicochimique mais les résultats obtenus ont abouti à la conclusion qu'il n'y a probablement aucune différence appréciable dans le contenu en calcium des sécrétions CF (c'est-à-dire du matériel sécrété par les cellules avant son passage dans les canaux des glandes étudiées) d'un certain nombre de glandes comparé aux contrôles appropriés ( Dearborn, 1976; Davis and Di Sant'Agnese, 1980), tout comme il n'y a aucune évidence d* une hypersécrétion des glandes CF (Boat and Dearborn, 1984). Ce serait donc au niveau intraluminal qu'une anomalie de la teneur en calcium des sécrétions CF prendrait son origine.

b) Contenu en électrolytes

L' élévation des taux de sodium, de chlore et de potassium dans la sueur, la salive et les sécrétions pancréatiques est présente tout au long de la vie des patients CF et n'est liée ni à la sévérité de la

maladie, ni au type d'organe principalement impliqué (Dearborn, 1976). Les glandes sudoripares de patients CF et de sujets normaux ont été étudiées pour déterminer la base de 1'inhibition de la réabsorption de sodium observée dans la mucoviscidose (Knowles et al, 1981). Le potentiel électrique moyen des glandes CF est plus élevé que celui des glandes normales (-66 millivolts versus -30 millivolts). Les concentrations moyennes de Na*, de Cl" et de PO*^' sont significativement plus élevées dans les gouttes de sueur des patients CF. Les vitesses de réabsorption du chlore et du sodium sont plus faibles dans les glandes de patients CF mais la réabsorption du chlore est plus réduite que celle du sodium.

L' hypothèse fut émise qu'une diminution de la perméabilité des cellules épithéliales au chlore pouvait expliquer les changements caractéristiques en électrolytes de la sueur des patients CF et était peut-être une

anomalie généralisée de la maladie (Quinton, 1983; Quinton and Bijman,

1983). Ces résultats ont été confirmés par les travaux d'Edmonds (1983)

sur le potentiel transmembranaire de la peau périanale ( CF -40 mV versus

normal -12 mV) et de KnoRles et al (1981) sur le potentiel membranaire

transépithélial de la muqueuse respiratoire supérieure et inférieure ( CF

-53 mV versus normal -25 mV)

Actuellement, le transport défectif des ions chlore à travers les épitheliums représente 1'anomalie démontrable de la mucoviscidose la plus largement acceptée ( Stutts et al, 1985; Hiddicombe et al, 1985;

Yankaskas et al, 1985; Case, 198b; Helsh and Liedtke, 198b). Dne diminution de la perméabilité au chlore dans le canal sécrétoire se traduirait d'abord par une lumière du canal plus négative que le canal normal suite à une séparation accrue entre cations et anions à travers 1' épithélium du canal, ensuite, par une diminution de la vitesse nette de la réabsorption du sodium à travers le canal suite à 1' incapacité de son co-ion, le chlore, de satisfaire 1'électroneutralité requise pour le transport actif de sodium et enfin, si un composant du transport du potassium est distribué passivement à travers le canal (gradient électrochimique ou échange sodium/potassium), les concentrations de

potassium seront plus fortes que dans les sécrétions normales (Quinton and Bijman, 1983). Cependant, des analyses récentes de l'activité des canaux chlore dans les cellules épithéliales des voies respiratoires suggèrent que la conductance de ceux-ci n'est pas différente de celle des canaux normaux (Frizzel et al, 198b; Relsh and Liedtke, 198b), et donc que ces canaux sont intacts dans la mucoviscidose. Le problème pourrait dès lors provenir de la régulation de l'activité des canaux chlore, au niveau soit d'un médiateur intracellulaire du couplage stimulus-sécrétion, soit de la présence d'un inhibiteur intracellulaire du canal, soit d'un site

régulateur anormal du canal lui-même (Case, 198b; Helsh and Liedtke, 198b)

c) Modulation de l'activité sécrétoire

Comme les glandes séreuses et muqueuses apparaissaient normales morphologiquement avant les effets secondaires de la maladie et qu' aucun produit sécrétoire spécifiquement anormal n'a été démontré dans la

mucoviscidose, on s'est tourné vers la régulation et le contrôle de la sécrétion exocrine. A cause des difficultés techniques pour obtenir des spécimens de glandes exocrines, 1'utilisation de préparations de tissus exocriniens (épithélium trachéal, muqueuse rectale, pancréas, glandes sudoripares) ( Hadorn et al, 19b8; Boat et al, 1977; Neutra et al, 1977;

Quinton and Bijman, 1983) a connu peu de succès jusqu'à présent mais

constitue une approche pleine de promesses pour 1'identification du défaut

biochimique lié à la mucoviscidose. Cependant, la plupart des travaux réalisés sur la régulation de la sécrétion des patients CF ont utilisé des cellules plus accessibles telles que les fibroblastes, les polypes nasaux en culture, les globules rouges et les leucocytes, en posant 1' hypothèse de départ que les processus régulateurs affectés dans la maladie sont conservés d'un tissu à 1'autre.

Le système nerveux autonome (systèmes alpha- et

beta-adrénergiques et cholinergique) et les mouvements de calcium

intracellulaire sont impliqués dans le contrôle de la sécrétion dans de nombreux organes. Les fibroblastes en culture n'ont permis aucune étude significative des réponses beta-adrénergiques à cause d'une variabilité importante dans les différentes lignées utilisées (Cutler, 1979): certains observèrent un taux élevé d'AMP cyclique en réponse à 1*isoprotérénol

(analogue synthétique des agonistes beta-adrénergiques) alors que d'autres n'observèrent aucune différence (Buchwald, 1976; Davis and Di Sant'Agnese, 1980). Les conclusions en furent que la grande variabilité dans les

réponses à 1'isoprotérénol des fibroblastes CF n'est pas affectée par la maladie (Kurz and Perkins, 1981) et que les fibroblastes ne constituent pas le système optimal pour 1'étude des réponses beta-adrénergiques dans la mucoviscidose (Davis et al, 1980a). Aucune altération n'a été

démontrée dans le transport de petits métabolites (sucres, nucléosides, acides alminés) à travers les membranes des fibroblastes CF ( Limbosch et al, 1980). Par contre, Houck and Cheng (1974) ont rapporté que des

fibroblastes CF avaient un temps de doublement plus long que les

fibroblastes normaux et Pallavicini et al (1970) trouva un contenu plus élevé en glycogène dans ces cellules CF. Comme l'AMP cyclique contrôle 1' activité des enzymes du métabolisme du glycogène et la croissance

cellulaire, Butcher (1976) en conclut que l'activité des protéines-kinases

dépendantes de 1'AMP cyclique ou la liaison du nucléotide cyclique aux

kinases pouvaient être altérées dans les cellules CF. Me Pherson et al

( 1984, 1985a, b), observant une réponse altérée de la sécrétion des

cellules acinaires de glandes salivaires submandibulaires CF à la

stimulation beta-adrénergique, suggérèrent que la cause en était une

activité accrue de la phosphodiestérase de l'AMP cyclique suite à

1' altération d'une protéine intracellulaire régulatrice dépendante du

calcium, telle que la calmoduline, ce qui apporterait un lien entre les

anomalies de la régulation autonomique et le métabolisme du calcium. Dne altération de la stimulation beta-adrénergique du transport de chlore suggérait que cette altération touchait un médiateur ou un inhibiteur cellulaire commun aux 2 processus (Case, 1984; Relsh and Liedtke, 198&).

En utilisant les leucocytes, on observa que les cellules CF présentaient une réponse diminuée de la production d'AMP cyclique suite à une stimulation beta-adrénergique et à la stimulation par la

prostaglandine E1 mais pas à une stimulation par 1'histamine (Davis et al, 1978; Davis and Laundon, 1980). Seule la réponse diminuée à

1'isoprotérénol se corrélait avec la sévérité de la maladie (Lemanske et al, 1981). Galant et al (1981) ont identifié une diminution du nombre de récepteurs beta-adrénergiques des leucocytes CF et ont déterminé que la réponse diminuée des leucocytes CF à 1'isoprotérénol n'était due ni à la diminution du nombre de récepteurs, ni à une activité réduite de

1'adénylate cyclase. Par la suite, l'activité de la cyclase et la

production d'AMP cyclique furent démontrées normales dans les leucocytes

et 1' épithélium des voies respiratoires dans les conditions basales ou

lors de la stimulation par le GHPPNP (activation des protéines N) ou par

la PGEi (Davis and Laundon, 1980; Davis et al, 1983; Helsh and Liedtke,

1986). Par contre, lors d'une stimulation beta-adrénergique, la production

d'AMP cyclique est réduite dans les leucocytes CF. Cette déficience du

couplage entre stimulation beta-adrénergique et production d'AMPc serait

donc plutôt le symptôme d'une dysfonction membranaire généralisée de la

mucoviscidose (Davis et al, 1978; Davis and Laundon, 1980).

pouvait être due à une erreur innée dans le métabolisme des glycoprotéines membranaires mais, jusqu' à présent, il n' y a aucune évidence qui confirme cette hypothèse bien que des changements même mineurs dans les

glycoprotéines membranaires pourraient avoir des effets importants sur les propriétés des enzymes de surface ou sur la stabilité de la membrane.

Une des caractéristiques principales de la mucoviscidose est une déficience en acides gras essentiels, indépendante de la déficience

pancréatique et donc ne résultant pas de malnutrition (Rivers and Hassam, 1975; Chase and Dupont, 1978; Rogiers et al, 1982). Dne altération dans le métabolisme des phospholipides membranaires (turnover accru) a été observée dans les cellules CF ( Hubbard et al, 1977; Chase and Dupont, 1978; Cromnell et al, 1981; Rogiers et al, 1980, 1982, 1983). Cette altération est intrinsèque et non due à des facteurs extérieurs aux

cellules testées (globules rouges et fibroblastes) et pourrait constituer une base d'explication pour les déficiences liées à la maladie (Chase et al, 1980; Rogiers et al, 1984). Dne altération des lipides dans les

sécrétions gastriques fut aussi signalée (Slomiany et al, 1983b). L'acide arachidonique étant un des acides gras essentiels affectés ( Carlstedt-Duke et al, 1986) et étant le substrat pour la synthèse de composés biologiques très actifs, les icosanoïdes (voir métabolisme des phospholipides dans le chapitre sur le neutrophile), une altération dans sa libération pourrait avoir des effets physiologiques variés. L'acide arachidonique est formé par l'action de la phospholipase A2, enzyme dont l'activité est inhibée par la lipomoduline (ou lipocortine ou phospholipase A2 inhibitory protein) ( voir métabolisme des phospholipides). En raison de

1' augmentation du taux d'acide arachidonique libéré dans la mucoviscidose,

on a postulé que le défaut de base lié à la maladie était situé au niveau

de la lipomoduline ou de la phospholipase A2 elle-même (Carlstedt-Duke et

al, 1986); en effet, l'acide arachidonique et les icosanoïdes jouent un

rôle important dans beaucoup de fonctions cellulaires, y compris le

transport de chlore, la balance du calcium et la sécrétion de mucus

(Carlstedt-Duke et al, 1986).

e) Métabolisme du calcium

L' ion calcium joue un rôle critique dans la régulation de la sécrétion; la libération de calcium à partir de la membrane plasmique , de sites intracellulaires et l'entrée de calcium eïtracellulaire sont

essentielles pour la sécrétion (Douglas 1978). Feigal and Shapiro

( 1979a,b) et Shapiro and Lam (1981) ont rapporté que la prise de calcium par les mitochondries des fibroblastes CF était fortement augmentée et, puisqu'il s'agit d'un processus consommant de l'énergie, il en résultait une consommation d'oxygène accrue. De plus, les pH optimaux de la NADH déshydrogénase des fibroblastes normaux, hétérozygotes CF et homozygotes CF semblent différents (Shapiro et al, 1979). De même, les leucocytes CF accumulent plus de calcium que les cellules normales et l'accumulation de calcium dans les cellules normales peut être élevée au niveau des cellules CF en les exposant au sérum CF, posant ainsi l'hypothèse d'un effet

ionophore du sérum CF ( Banschbach et al, 1978; Conover and Conod, 1978).

Il semble que cet effet du sérum CF soit dû à une stimulation anormale de la phospholipase A2 membranaire, enzyme dépendante du calcium et au rôle important dans le système de relais transmembranaire de la stimulation de la sécrétion ( Roscher and Hadorn, 1981) (voir paragraphe concernant les effets des icosanoïdes dans le neutrophile), ce qui permettrait

d'expliquer le facteur de "dégranulation" découvert par Conod et al (1975) (voir plus loin). Sorscher and Breslou (1982) ont suggéré que la

réabsorption épithéliale accrue du sodium et le calcium intracellulaire élevé causaient la pathogénèse de la mucoviscidose. En s'appuyant sur la découverte des concentrations élevées de calmoduline dans les fibroblastes ( Gnegy et al, 1981) et dans quelques spécimens d'expectorats de patients CF, Killbourn (1983) suggéra que le calcium intracellulaire élevé dans les cellules CF pouvait être causé par ce taux élevé de calmoduline ou par une calmoduline anormale. Cette calmoduline serait également responsable des augmentations intracellulaires de la réabsorption du sodium, stimulées par le calcium, et de la réabsorption consécutive d'eau, comme l'avaient déjà proposés Sorscher and Breslou (1982).

Aucune différence dans les concentrations de calcium

cytoplasmique libre n' a été observée dans les lymphocytes CF mais une

élévation du calcium cellulaire total (controversée) a été rapportée.

élévation qui serait due à une accumulation dans les mitochondries (Grinstein et al, 1984; Haller et al, iqSU). Par contre, dans les neutrophiles CF, le calcium cytoplasmique était plus élevé dans les cellules CF au repos et, suite à la stimulation, 1'élévation du calcium cytoplasmique ramènerait les neutrophiles CF et normaux à un même niveau (Cabrini and De Togni, 1985). Ceci suggère que des altérations du

métabolisme du calcium ne seraient pas généralisées mais confinées à certains types de tissus, comme les tissus sécrétoires. Cependant cette observation n'a pas été reproduite ni par nous (voir Résultats) ni par d'autres dans les neutrophiles (Suter et al, 1985).

On a également observé une activité réduite de la calcium-ATPase dans les érythrocytes CF et dans les fibroblastes d'hétérozygotes et

d'homozygotes CF (Katz, 1978; Muallem et al, 1985). Cependant, cette

altération n'est pas due à l'activité de 1'ATPase elle-même mais plutôt à sa régulation (Bridges and Katz, 1986).

Les implications de ces observations restent à déterminer mais les altérations du contenu cellulaire en calcium ou de la

compartimentalisation du calcium peuvent affecter certaines fonctions

cellulaires, y compris la sécrétion. Cependant, il n' y a aucune preuve que

ceci représente 1' anomalie primaire de la mucoviscidose.

f) Autres observations

Bien que les fibroblastes CF en culture soient apparemment normaux et pourraient ne pas exprimer le défaut de base (Davis and Di

Sant' Agnese, 1980) et bien que beaucoup de résultats contradictoires aient été obtenus avec ces cellules ( Di Sant'Agnese and Davis, 197ba,b,c), de nombreuses études furent réalisées sur des fibroblastes isolés à partir du fluide amniotique et mis en culture. Le problème de ces cultures et de la non-reproductibilité des résultats vient de la culture elle-même: les milieux utilisés, les techniques de récolte, les conditions de croissance qui peuvent être critiques pour les résultats varient d'une équipe de recherches à 1'autre. Divers travaux rapportèrent que ces cellules

présentaient une résistance accrue aux effets toxiques de la dexaméthasone (analogue de stéroïde) (Epstein et al, 1977; Breslow et al, 1978a), de 1'ouabaïne (inhibiteur de la pompe Na*/K*-ATPase) dans un système sans potassium ( Breslow et al, 1977), des stéroïdes sexuels (BresloH et al, 1978b), du dibutyryl-AMP cyclique, de 1'isoprotérénol et de la

théophylline (inhibiteur de phosphodiestérases de 1'AHP cyclique) (Epstein et al, 1978), par rapport aux cellules normales. Les hétérozygotes CF

donnaient des valeurs intermédiaires (BreslOH et al, 1978a). Ces observations, non reproduites, ne peuvent être expliquées par des différences dans l'activité des protéines-kinases, dans les sites de liaison de 1'AHP cyclique ou des stéroïdes ou dans 1' inhibition par 1'ouabaïne de l'activité de la Na*/K*-ATPase (Epstein et al, 1978).

Cependant, 1' ATPase a une affinité inférieure à la normale pour le

potassium (Reznik et al, 1981).

Facteurs "CF"

Depuis 1967, l'idée d'un facteur "CF" dans le sérum ou le plasma a fait son chemin (Di Sant'Agnese, 1976a,b,c) mais les recherches

entreprises pour 1' identifier ont été retardées par une foule de résultats non reproductibles et de tests subjectifs. Ainsi, 1' identification de ces peptides n'a pas été suivie rapidement par l'isolement et le séquençage de ces peptides ou par une étude établissant leur lien direct avec le gène CF ou avec des effets secondaires de la maladie.

Les facteurs "CF" peuvent être divisés en 5 groupes: ceux qui influencent 1' activité ciliaire dans les modèles expérimentaux, ceux qui affectent la sécrétion, ceux qui affectent le transport membranaire et ceux qui affectent la distribution des polyamines. Un cinquième groupe comprend les interactions anormales ente protéases et antiprotéases. Il existe en outre des facteurs sériques CF qui n'ont pas d'effets définis ( Brock et al, 1982) et des facteurs inhibant la réponse lymphocytaire (Van Geffel et al, 1982) (voir le paragraphe Immunologie).

a) facteurs affectant la mobilité ciliaire:

En 1967, Spock et al identifièrent dans le sérum des patients CF un facteur qui désorganisait le battement des cils d'explants trachéaux de lapin, un phénomène appelé dyskinésie, et le baptisèrent "facteur

ciliotoxique". D'autres modèles expérimentaux furent utilisés: les cils des branchies de 1'huître Crassotrea virginica (Bowman et al, 1969), des bactéries flagellées (Besley et al, 1969) et des moules d'eau douce (Cohen and Daniel, 1974). Mais aucun groupe ne trouva de différence entre le sérum de patients normaux et CF. L'inconvénient de ces tests était leur soumission à la variabilité (les huîtres et les moules sont affectées par les variations de température, de saisons et des maladies trachéales inflammatoires peuvent affecter le test du lapin) et à la subjectivité (l'arrêt du battement des cils ou la dyskinésie étaient mesurées

visuellement).

La purification du facteur ciliotoxique fut tentée et 1'activité

de ce facteur fut attribuée à plusieurs protéines cationiques de poids moléculaires compris entre 4.000 et 10.000 daltons, au point isoélectrique élevé et associées aux IgG (Schmayer et al, 1972; Danes et al, 1973;

BoRman et al, 1975; Blitzer and Shapira, 1983).

Conover et al (1973a) trouvèrent une activité ciliotoxique dans le sérum de patients CF ayant un complément anormal. En outre, dans le sérum normal traité par un inhibiteur de la carboxypeptidase, une activité ciliotoxique peut se développer alors que celle-ci disparaît dans le sérum CF traité à la carboxypeptidase (Conover et al, 1973b). Ces résultats, associés à une déficience de 1'arginine estérase (Rao and Nadler, 1974) et à des taux élevés du facteur C3 du complément (Conover et al, 1973a, b) dans le sérum CF, pourraient indiquer que le facteur ciliotoxique est un constituant normal du sérum mais qui n'est pas inactivé de manière

adéquate chez les patients CF; ce facteur pourrait être C3 puisqu'il a une activité ciliotoxique lorsqu'il est associé aux IgG. Cependant, la

déficience en arginine estérase ou en carboxypeptidase et 1'augmentation de C3 dans le sérum CF ne purent être reproduites par Lieberman (1975).

Cependant, 1'inactivation par la chaleur (Kennedy and Lin, 1983) et

1' incubation du sérum CF avec des anticorps dirigés contre les composants du complément (Kennedy et al, 1982) inhibent l'activité ciliotoxique mais pas la capacité du sérum CF de causer une hypersécrétion de mucus

(Kurlandsky et al, 1980), ce qui suggère qu'il y a 2 activités séparées

dans le sérum CF, une affectant le mouvement ciliaire et 1' autre induisant

la libération de mucus. En tout état de cause, le facteur du complément C3

ne peut constituer le défaut primaire de la mucoviscidose, son gène étant

localisé sur le chromosome 19 (et non le chromosome 7).

b) facteurs influençant la sécrétion:

Conod et al <1975) ont identifié dans le sérum CF un "facteur de dégranulation", c'est-à-dire qui induit la libération d'enzymes

lysosomiales dans des leucocytes normaux. Le sérum d'homozygotes CF a un effet plus puissant que celui des hétérozygotes CF qui, à son tour, a un effet plus puissant que le sérum normal. Cependant, cette activité n'est pas augmentée par un inhibiteur de carboxypeptidase et il est donc peu probable que ce facteur soit le facteur ciliotoxique, ce qui confirme ce qui a été dit plus haut.

D' autres laboratoires ont utilisé la sécrétion plutôt que 1' activité ciliotoxique du sérum CF pour étudier les effets d'un facteur CF. Des mesures quantitatives et qualitatives des sécrétions furent réalisées (Kennedy and Allen, 1980; Blitzer and Shapira, 1982; Boat et al, 1982; Me Pherson et al, 1983; Rudick et al, 1984). Une activité

hypersécrétoire du sérum CF fut démontrée sur les explants trachéaux de lapin, les acini submandibulaires de rat et les cellules épithéliales de trachée de hamster, comparée au sérum normal inactif (Kurlandsky et al, 1980; Boat et al, 1982; Me Pherson et al, 1983; Rudick et al, 1984).

Une possibilité d'action de la protéine du sérum CF sur l'activité sécrétoire est la stimulation des mouvements du calcium. Le sérum CF est capable d'affecter les mouvements de calcium dans les cellules traitées ( Banschbach et al, 1978; Hooten et al, 1984). Le sérum CF, mais pas le sérum normal, stimule l'influx de calcium dans les

cellules et la sécrétion s'ensuit. Le facteur CF pourrait influencer la

perméabilité membranaire au calcium, déclenchant ainsi les événements

cellulaires menant à la sécrétion.

c) facteurs influençant le transport membranaire:

Dans la salive et la sueur des patients CF, on a identifié un facteur inhibant la réabsorption du sodium (Hangos and Me Sherry, 1968;

Kaiser et al, 1971; Mangos, 1973; Taylor et al, 1974). Ce facteur est si labile qu'il a été impossible de 1'isoler et de le caractériser. Mangos et Me Sherry (1968) postulèrent que ce facteur était une maoromolécule

fortement basique qui interagissait électrostatiquement avec la surface de la membrane plasmique des épitheliums, affectant sa structure et son

fonctionnement. Le polyanion héparine inhibe le facteur inhibiteur de la réabsorption du sodium dans la salive. La nature chimique de ce facteur est toujours inconnue ainsi que la nature de son action sur les glandes sudoripares et les glandes salivaires mineures mais apparemment pas ailleurs dans le corps.

Une inhibition de la prise de glucose par des entérocytes de rat traités par le sérum CF a été observée (Arvanitakis et al, 1973); celle-ci était éliminée par préincubation du sérum avec la diamine oxydase et augmentée par 1' addition de spermidine au plasma normal, suggérant un niveau anormal de polyamines pouvant affecter les mécanismes de transport membranaires dans la mucoviscidose.

d) les polyamines:

Les polyamines (putrescine, spermidine, spermine) sont de

petites molécules polycationiques ubiquitaires qui sont essentielles à la croissance cellulaire et au développement, peuvent se lier aux acides nucléiques et apparaissent intimement liées à la synthèse et au

métabolisme de 1'ADN et de 1'ARN ainsi qu'à la synthèse des protéines ( Tabor and Tabor, 1984). Les polyamines peuvent interagir avec les

membranes plasmiques et mimer quelques effets hormonaux, et leurs niveaux intracellulaires peuvent être fortement stimulés par certaines hormones et des facteurs de croissance (Oda and Perry, 1974; Pegg, 1986; Desiderio et al, 1987). Les polyamines du sang sont élevées dans les états malins et non-malins de renouvellement cellulaire rapide (croissance, anémie,

tumeurs) (Russel, 1983). En outre, elles affectent l'activité de protéines

kinases indépendantes de l'AMP cyclique et stimulent l'activité de la phosphatidylinositol-U-phosphate kinase ( PIP kinase), enzyme qui forme le phosphatidylinositol-4,5-biphosphate, substrat-clé du couplage

stimulus-sécrétion dans de nombreuses cellules (voir paragraphe sur le métabolisme des phosphoinositides dans le neutrophile) ( Lundberg et al, 1986; Vogel and Hoppe, 1986).

Des groupes de recherches ( Klagsbrun and Farrell, 1973; Lundgren et al, 1975; Me Evoy and Hartley, 1975; Rosenblum et al, 1978) observèrent une augmentation du rapport spermidine/spermine dans le sang total des homozygotes et hétérozygotes CF. Cette augmentation apparaissait dans la fraction des érythrocytes. Les implications exactes de cette différence restent obscures mais, comme la spermidine est capable d'interagir avec les membranes plasmiques, elle pourrait en modifier les propriétés et influencer 1' exocytose. Des processus qui peuvent être anormaux dans la mucoviscidose (transport d'ions, activité des glycosyltransferases, activité d'enzymes liées au cycle des phosphoinositides) sont influencés par les polyamines dans d'autres systèmes (Davis and Di Sant'ignese, 1980, Lundberg et al, 198b).

e) interactions protéase-antiprotéase:

Ce domaine de recherches a suscité 1' attention des chercheurs car il permettait d'expliquer la cause de l'apparition des facteurs CF dans le sérum. En effet, Shapira et al (1976) rapportèrent que l'activité réduite de l'arginine estérase dans le sérum CF était due aux interactions anormales des protéases du sérum avec 1'alpha2-macroglobuline (alphazH) qui les convertit normalement en peptidases (c'est-à-dire que leur

spécificité passe de grands substrats en petits substrats). Ceci pourrait

donc rendre compte de 1' existence des facteurs CF qui sont de petits

peptides. En effet, en temps normal, ils sont dégradés par les protéases

converties en peptidases par l'alpha2M, mais, dans la mucoviscidose, à

cause d'interactions protéase-antiprotéase anormales, cette dégradation

n'aurait pas lieu (Shapira et al, 1976). Cependant, les recherches sur

l'alphazM ayant donné des résultats contradictoires (Choy et al, 1978; Van

Leuven et al, 1979), la relation entre la fonction de l 'alpha2M et le

phénotype CF reste à définir.

f) autres facteurs sériques:

Hilson et al (1975) ont identifié une protéine sérique, décrite comme une bande de pl 8,4 sur un gel de focalisation isoélectrique en présence d'urée, présente chez les homozygotes CF à un taux élevé, chez les hétérozygotes CF à un taux moyen et dans le sérum normal à un taux nul ou très faible; ces résultats ont été confirmés par d'autres (Manson and Brock, 1980; Nevin et al, 1981; Brock et al, 1982; Grataroli et al, 1984).

Cette protéine, baptisée antigène CF depuis que des anticorps monoclonaux ont été purifiés, a un poids moléculaire relatif de 70 Kda et est

fortement contaminée par 1'albumine. Les leucocytes de leucémie myéloïde chronique sont fortement positifs pour l'antigène CF et l'antigène venant de granulocytes normaux est immunologiquement identique à 1'antigène CF (avec les antisera disponibles) (van Heyningen et al, 1985). Cependant, le gène de 1' antigène CF se trouve sur le chromosome 1 et n'est donc pas le gène muté de la mucoviscidose. L'antigène CF possède une séquence

peptidique ayant une homologie significative avec des protéines liant le calcium ( intestin et cerveau) (van Heyningen et al, 1985; Dorin et al, 1987). Les neutrophiles étant la source la plus probable pour la

production de l'antigène CF, le métabolisme du calcium dans ces cellules

activant les canaux ioniques (Von Tscharner et al, 198b) et les tissus

myéloïdes et les neutrophiles étant affectés par la mucoviscidose (Galant

et al, 1981; Davis et al, 1983; voir Résultats), les recherches sur les

neutrophiles pourraient aboutir à 1'identification du défaut lié à la

maladie (Dorin et al, 1987).

Modèles animaux

A cause des difficultés et des limitations du travail avec le matériel humain, des modèles animaux ont été recherchés. Ces modèles devaient présenter des similitudes raisonnables avec les patients CF.

Martinez et al (1975) mirent en évidence des similitudes biochimiques, physiologiques et morphologiques entre les patients CF et des rats traités par de fortes doses de réserpine, mais il est probable que c' était 1' effet cytotoxique de la réserpine, plutôt que ses effets sur le système nerveux autonome, qui était responsable des changements observés dans les animaux traités. Néammoins le modèle pourrait servir à définir la pathophysiologie de la maladie ( Perlsmutter et al, 1978) mais aucune donnée significative n' a encore été obtenue en utilisant ce modèle.

Un modèle animal intéressant fut un singe rhésus de 6 mois qui avait quelques similitudes histologiques avec les patients CF. Mais la production de ce type d'animal, qui a une période de gestation longue, ne peut permettre des études sur un nombre élevé de cas. De plus, des

facteurs non-génétiques pourraient provoquer la maladie du singe rhésus (Davis and Di Sant'Agnese, 1980).

L' utilisation des modèles animaux ne doit jamais faire perdre de vue que la production de symptômes biochimiques, physiologiques et

histologiques de type CF par n' importe quel mécanisme n' implique pas que la mucoviscidose chez 1' homme est produite par le même mécanisme.

Une étude a été réalisée in vivo sur des êtres humains CF et normaux (Davis et al, 1980b; Davis and Kaliner, 1983). En examinant la réponse pupillaire à l'administration d'agents alpha- et

beta-adrénergiques et cholinergiques, ces auteurs ont démontrés que les

patients CF présentaient une sensibilité accrue aux agents cholinergiques

et alpha-adrénergiques et réduite aux agents beta-adrénergiques. Ceci

impliquait une lésion dans la mucoviscidose au niveau des récepteurs du

système nerveux autonome ou du couplage des récepteurs avec les réponses

subséquentes.

Immunologie

Plus de 90% des patients CF meurent de maladie pulmonaire progressive, compliquée par 1'infection des sécrétions bronchiques par Staphylococcus aureus ou Pseudomonas aeruginosa (ou les 2). Chez le patient très jeune, les pathogènes les plus communs sont toujours Staphylococcus aureus et Haemophilus influenzae, 1' infection par

Pseudomonas aeruginosa devenant plus fréquente avec l'âge (Lancet, 1983).

Pourtant, les patients CF ne sont pas plus enclins que les autres aux infections et leur système immunitaire est, en général, intact. Le nombre et la proportion des lymphocytes T et B sont normaux, ou appropriés à l'état infectieux, et les tests d'hypersensibilité retardée sont normaux (Hiby and Mathiesen, 1974; Talamo et al, 1976; Van Geffel et al 1982a).

Les niveaux d'immunoglobulines M, G et A dans le sérum sont normaux ou élevés en présence de l'infection pulmonaire (Hoiby et al, 1975). Il y a des anticorps dans le sérum des patients CF pour les antigènes communs, y compris Pseudomonas aeruginosa, mais l'augmentation des titres

d'anticorps, par exemple par vaccination contre le Pseudomonas, n' altère pas le cours de la maladie, ce qui est normal puisque 1' infection est secondaire à l'obstruction bronchiale et que la réponse des anticorps circulants est adéquate (Pennington et al, 1975). Le sérum ou le plasma des patients CF est incapable de tuer des lignées autologues de P.

aeruginosa qui sont sensibles au sérum ou au plasma d'individus sains ou d'autres patients CF. Ceci suggère que les patients CF ont acquis un phénomène de tolérance vis-à-vis de leur propre lignée de Pseudomonas, sans doute par 1' intermédiaire d'un facteur inhibant la réponse

lymphocytaire (Van Geffel et al, 1982a,b; Lancet, 1983). Actuellement, la résistance des patients CF à la propagation de l'infection du tronc

pulmonaire est probablement due aux antibiotiques qui permettent à 1'hote d'établir une réponse immunitaire en arrêtant l'infection.

L'incidence de l'allergie est la même chez les patients CF et la population générale, quoique les niveaux d'immunoglobulines E soient légèrement élevés chez les patients CF de tous âges (Allen et al, 1975;

Turner et al, 1978). L'allergie pourrait être un phénomène secondaire dû à

la colonisation des poumons par le Pseudomonas ( Pitcher-Hilmott et al,

1982).

Il existe un défaut immun chez les patients CF: 1' effet

inhibiteur du sérum sur l'ingestion et la destruction des Pseudomonas par les macrophages alvéolaires, effet qui apparait spécifique des Pseudomonas (Biggar et al, 1971; Boxerbaum et al, 1973; Sorensen et al, 1978). Mais les résultats ne sont pas clairs concernant ce facteur car la phagocytose et la destruction des bactéries par les leucocytes humains ne sont pas inhibées par le sérum CF et sont normales dans les patients CF (Biggar et al, 1971), alors que le chémotactisme des leucocytes est diminué chez les patients CF, ce qui pourrait être responsable de la susceptibilité accrue à 1' infection ou une conséquence des infections constantes qui ont lieu chez les malades (Sorensen et al, 1981; Zielinski et al, 1982). L'activité de sécrétion et de chémi1uminescence des neutrophiles est également réduite dans la mucoviscidose, ce qui pourrait gêner leur activité anti-infection ( Lemanske et al, 1981; (îraft et al, 1982). Les résultats que nous avons obtenus sur les réponses des neutrophiles CF à la

stimulation chémotactique sont en accord avec 1' idée d'une déficience de

ces cellules au niveau du couplage entre les récepteurs membranaires et

1' activation des réponses de sécrétion et de chémiluminescence.