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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Tenenbaum, A. (1978). La fluidité membranaire: un facteur déterminant de la réactivité immunologique des modèles physico-chimiques de membranes (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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‘lUNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

•.Y

FACULTE DES SCIENCES

SERVICE DE CHIMIE GENERALE H

LABORATOIRE DE CHIM lE ■ PH YSIQUE DES MACROMOLECULES AUX INTERFACES

LA FLUIDITE MEMBRANAIRE : UN FACTEUR DETERMINANT DE LA REACTIVITE

IMMUNOLDGIQUE DES MODELES PHYSICO-CHIMIQUES DE MEMBRANES.

THESE PRESENTEE POUR L'OBTENTION DU GRADE DE

DOCTEUR EN SCIENCES

Anita TENENBAUM

1978

L’utilisatlan de madèles physlca-chimiques de membranes devrait

permettre d'établir la lacalisatian du récepteur d'hormone oestrogène

présent dans les tissus mammaires cancéreux .

SERVICE DE CHIMIE GENERALE H

LABORATOIRE DE CHIMIE - PHYSIQUE

DES MACROMOLECULES AUX INTERFACES Rép...

LA FLUIDITE MEMBRANAIRE : UN FACTEUR DETERMINANT DE LA REACTIVITE

IMMUNDLOGIQUE DES MDDELES PHYSlCD-CHIMIQUES DE MEMBRANES.

THESE PRESENTEE POUR L'OBTENTION DU GRADE DE

DOCTEUR EN SCIENCES

Anita TENENBAUM

Je KejmeJi(û.e. MonéZzuA. J. Ja{^^e poai te. Acutten cotutanX qa'tt m’a

apporté eX ta manièAe. dont tt m’a peAtnti de menen. à bten ce tnavatt.

«

Que MeAAteuAA I.R. HitteA, M. Sktnitzky et M. JnboA [Vepantement de BlomembAjanei de t’Jnitttut Welzmann - Rehovot - JAAaët) trouvent tct t’ex- pAe^éton de ma ghatitude pouA. t’accaett cliateuAeux qu’tt6 m’ont Ae&euvé danA teuA taboAotoÂAe et ta btenveJJULance avec taqueZte tù> m’ont guidée danà ce tAavatt.

J’expAtme ma AeconnaliAonce à MomleuA M. Vetunette {VépoAtement de Rkyélque UotécxitaJjie de t'UnlveAàlté- de Liège) pouA ta poAt active qu'lt a pfvu>e danA t’étaboAotlon de cette étude.

Ma gAotitude 6’adn.eAAe égatement à Madame E. HannecoAt-PokO'mi ISe^Lvlce de Chimie de t’InAtitut PaéteuA du BAobant) pouA t’obtlgeance avec taquette ette m'a accuetttle danA éon unité de AecheAche et ta cot- taboAotion eK^lcace qu’ette a bien voûta m’appoAteA.

Qu'lt me iolt peAmlA de AemeAcleA tAèA vlvenient MonAleuA C. SeAtlneA pouA 6on IntéAêt penmanent, àeà conAeÂÂA Judlcteux, Aon Aovtlen Aclentl^-i- que et moAot AonA teAquetA tt m’auAcUt été dl{,£tclte de meneA à bien cette thëAe.

Ma AeconnalAAance va à MonAleuA J.M. RuijAcchaeAt pouA m’avolA guidée dam te monde de ta AecheAche Aclentl^lque et m’avolA i^oAmée à AuAmonteA teA embûcheA qui y AuAvlennent Al {^Aéquemyievt.

J’oAAocte égateme'nt à mcA AemeAclementA touA teA membACA du taboAa- tolAe qui m’ont pemniA d’e^{,ectueA ce tAavcUt. danA une amblojice amlcate et Atùnutaite.

Je tlenA à AemeAcleA poAtlcullèAenmt MomleuA J. NlcalAe pouA

a paAtlclpatlon eUlcace dam ta con{,ectlon de cette thèAe.

En^ln, ma gAotitude va à t’l.R.S.J. A, pouA t’aide matéAlette que cet

Imtltut m'a octnoyée duAant ta pAépoAotlon de ce tAavaH.

Polarisation de fluorescence

: intensité du rayonnement fluorescent polarisé parallèlement au plan de polarisation du rayonnement d'excitation

: intensité du rayonnement fluorescent polarisé perpendiculai­

rement au plan de polarisation du rayonnement d'exoitation P

P

: Polarisation de fluorescence

: Polarisation de fluorescenoe limite r

rO

: Anisotropie de fluorescence

: Anisotropie de fluorescence limite n

T

: Viscosité

: Temps de vie de l’état excité Pression superficielle

A ; Aire moléculaire

ïï : Pression superficielle t : Temps

Résonance pararnagriétlLjuti électiunlque

a : Distance entre deux raies spectrales f : Paramètre spectral

g : Position de la raie d’absorption centrale , H : Champ magnétique

: Valeur du champ magnétique pour lequel se produit la résonanoe Température

T : Température absolue

T^ : Température de transition Viscosimétrie superficielle

^couche ■ logarithmique du film étalé

^support ■ logarithmique du support aqueux : Viscosité superficielle

GARD Gardlolipine

CHOL Gholestérol

DansylDPPE Dansyl dipalmitoylphosphatidyléthanolamine DG Dichroïsme circulaire

DLPG Dilauroylphosphatidylcholine DMPG Dimirystoylphosphatidylcholine DDPC Dioléylphosphatidylcholine DPH 1,6 diphénylhexatriène

DPPG Dipalmitoylphosphatidylcholine DPPE Dipalmitoylphosphatidyléthanolamine DSPG Distéaroylphosphatidylcholine

EggPC EggPhosphatidylcholine

EPR Résonance paramagnétique électronique

Gai Galactose

Glc Glucose

GlcNac N acétylglucosamine

Hep Heptose

KDQ 2-céto-3 déoxyoctonate LPS Lipopolysaccharide

LPS R Lipopolysaccharide à courte chaîne saccharidique ORD Dispersion optique rotatoire

PolyLys-Phe Copolypeptide L-Lysine-L-Phénylalanine

PS Phosphatidylsérine

TEMPQ 2,2,B,B tetraMéthylpipéridine-1 --oxyl

INTRODUCTION -,

CHAPITRE I - LA MEMBRANE BIOLOGIQUE 7

1.1. DEFINITION ET ROLE 7

1.2. COMPOSITION 5

1.2.1. Lipides 8

1.2.2. Protéines 8

1.3. STRUCTURE 10

1.3.1. 1er modèle de Danielli 10

1.3.2. 2ème modèle de Danielli 11

1.3.3. Modèle de Singer 12

1.3.4. Asymétrie de la membrane 13

1.4. FLUIDITE MEMBRANAIRE 14

CHAPITRE II - MODELES DE MEMBRANE 21

2.1. LA MONOCOUCHE 21

2.1.1. La monocouche lipidique 21

2.1.2. Méthodes de mesure des propriétés physiques de la

monocouche 22

2.2. LA BICOUCHE 23

2.2.1. La bicouche liposomiale 24

2.2.2. Méthodes de mesure des propriétés physiques de la

bicouche 24

CHAPITRE III - LES PROPRIETES PHYSIQUES DES LIPIDES 26

3.1. SYSTEMES LIPIDIQUES PURS 26

3.1.1. Phase cristalline 27

3.1.2. Phase fluide 27

3.1.3. Transition de phase 29

3.1.4. 2° Liposomes 31

3.2. SYSTEMES LIPIDIQUES MIXTES 33

3.2.1. Système mixte lipide cristallin 33

lipide fluide 33

3.2.2. Système mixte lipide - cholestérol 36

CHAPITRE IV - REACTIONS IMMUNOLOGIQUES ET MODELES DE MEMBRANES 42 4.1. RECONNAISSANCE IMMUNOLOGIQUE D'UN ANTIGENE MEMBRANAIRE INCLUS

DANS UNE MONOCOUCHE 43

4.2. RECONNAISSANCE IMMUNOLOGIQUE D’UN ANTIGENE MEMBRANAIRE INCOUS

DANS UNE BICOUCHE 44

4.2.1. Bicouche plane 44

4.2.2. Bicouche liposomiale 44

4.2.2. 1° Lyse immunologique du loposome 44 4.2.2. 2° Mécanisme de formation des pores 48 4.3. INFLUENCE DE LA FLUIDITE LIPIDIQUE SUR LA RECONNAISSANCE D’UN

ANTIGENE MEMBRANAIRE 49

CHAPITRE V - MATERIEL ET METHODES 53

5.1. MATERIEL 53

5.1.1. Lipides ' 53

1° Lipides neutres à chaînes hydrocarbonées non saturées 53 2° Lipides neutres à chaînes hydrocarbonées saturées 53

3° Lipide chargé négativement 54

4° Cholestérol 54

5° Cardiolipine 55

5.1.2. Antigènes bactériens 55

5.1.3. Copolymère 56

5.1.4. Antisérum de la cardiolipine 56

5.1.5. Antisérum bactériens 57

5.1.7. Marqueurs de fluidité 57

1° Marqueurs de fluorescence 57

a] DansylDPPE 57

b] DPH 59

2° Marqueur EPR 59

5.2. METHODES EXPERIMENTALES 60

5.2.1. Monocouches 60

1° Etalement du film 60

2° Viscosimétrie superficielle 60

5.2.2. Liposomes 63

1° Préparation des liposomes 63

2° Lyse immunologique 63

3° Polarisation de fluorescence 64

4° Résonance paramagnétique électronique 68

CHAPITRE VI - INFLUENCE DE LA FLUIDITE LIPIDIQUE SUR LA RECONNAISSANCE IMMUNOLOGIQUE D’UN ANTIGENE MEMBRANAIRE 76 6.1. RECONNAISSANCE IMMUNOLOGIQUE A L’INTERFACE AIR-EAU 76

6.1.1. Influence de la fluidité lipidique sur la reconnaissance de la cardiolipine étalée

à l’interface air-eau 78

6.1.2. Etude immunologique de lipopolysaccharides bactériens

étalés à l’interface air-eau 89

1° Composition et structure de la paroi bactérienne 90 2° Propriétés immunologiques des lipopolysaccharides

bactériens 94

6.2. RECONNAISSANCE IMMUNOLOGIQUE DE LA MEMBRANE LIPOSOMIALE 100 6.2.1. Etude de la fluidité liposomiale par résonance

paramagnétique électronique 101

de fluoresoence -jOg 1° Propriétés de fluidité de membranes non antigè­

niques

2° Propriétés de fluidité des membranes antigéniques 123

6.2.3. Lyse immunologique du liposome 131

CONCLUSIONS 136

BIBLIOGRAPHIE 140

Ce n'est qu’au début des années 1970, grâce aux derniers acquits de la technologie moderne que la notion de fluidité de la membrane cel­

lulaire put enfin être étudiée expérimentalement.

On se rendit alors compte, dans les divers laboratoires de recher­

che intéressés par les problèmes de régulation cellulaire, de l’importan­

ce de ce paramètre.

Et en effet la fluidité intervient dans tous les processus d’échan­

ge qui s’établissent entre la cellule et son environnement.

Or ces échanges, qu’ils soient de substance, ou d’information per­

mettent à la cellule, et a fortiori à l’organisme pluricellulaire de se maintenir en vie.

C'est par sa membrane qu’une cellule se nourrit, c’est également par elle qu’elle reconnaît la présence de cellules voisines.

Et qu’une cellule "étrangère" s’introduise dans un organisme "hôte”, c’est sa membrane qui la "dénonce” comme étrangère et qui permet son éli­

mination .

En fait, nous commençons seulement à connaître et à comprendre cer­

tains de ces processus de reconnaissance et de régulation. Or ce n’est qu’au fur et à mesure de notre progression dans ce domaine que l’importan­

ce jouée par la fluidité membranaire se révélera dans toute son étendue.

Les premières expériences faites dans l’optique de la fluidité sur des membranes biologiques ont consisté à "repérer" un constituant membra­

naire, une glycoprotéine antigénique par exemple, à le "marquer" à l’aide d’une molécule fluorescente, et à suivre ses déplacements à la surface de la cellule : la mobilité du constituant peut ainsi être directement reliée à la fluidité du milieu membranaire. C'est en particulier ainsi que deux chercheurs de l’Institut Weizmann, L. Sachs et N. Inbar ont démontré pour la première fois en 1970 que la différence entre une cellule lymphocytaire saine et un lymphocyte leucémique comportait certainement une modification de la fluidité.

Et ces résultats ont pu être largement confirmés par la suite : comparées aux cellules non malignes, les lymphocytes leucémiques pré­

sentent une fluidité membranaire anormalement élevée.

Ces modifications pathologiques de la fluidité membranaire et par voie de conséquence de la mobilité des récepteurs situés à la surface de la cellule pourraient expliquer la prolifération des cellules cancéreuses et l'absence de rejet de l’organisme hôte vis-à-vis de ces agresseurs.

En effet, l'invasion d'un organisme par des cellules "étrangères” se tra­

duit généralement par une destruction de ces cellules. Cette destruction, qui constitue le phénomène de rejet immunitaire de l'organisme, fait sui­

te à une reconnaissance de la cellule étrangère, au niveau de sites de re­

connaissance, constitués par les récepteurs antigéniques de la membrane.

Une mobilité anormale de ces récepteurs antigéniques, telle qu'elle se présente au niveau de certaines cellules cancéreuses, pourrait entraîner l'absence de tout processus de reconnaissance immunitaire au sein de l’or­

ganisme hôte, avec, pour conséquence, une prolifération de cellules can­

céreuses.

□n voit dès lors l'importance de l'étude de la fluidité membranai­

re, et de sa mise en relation avec le processus de reconnaissance immuno­

logique d’un antigène membranaire.

Dr lorsque l'on aborde ce domaine de recherche, on se trouve oon- fronté à un problème de choix quant à l’optique selon laquelle aborder le sujet.

La première option consiste à étudier les propriétés de fluidité de la membrane sur le système biologique.

Cependant, la membrane biologique est un système d’une telle com­

plexité par sa composition, le nombre de ses constituants et leur disposi­

tion, que l'interprétation des résultats obtenus est particulièrement dé­

licate et malaisée.

C’est pourquoi, la seconde option se révèle particulièrement inté­

ressante : elle consiste à recourir à des modèles artificiels de membrane.

En effet, la membrane biologique doit essentiellement ses propriétés de fluidité à la bicouche lipidique qui constitue sa zone centrale et son

"ossature”. C'est sur cette ’bssature" que les diverses protéines membra­

naires, les récepteurs, les antigènes, viennent se fixer. Mais les pro­

priétés de fluidité d’une membrane sont en fait celles de sa matrice li­

pidique.

Et donc, la constitution de modèles de membrane tels que les mono­

couches de lipides et les bicouches lipidiques permet d’aborder ce pro­

blème d’une manière simplifiée, mais cependant réaliste.

Au départ de notre travail de doctorat, pour étudier les proprié­

tés de la matrice lipidique, nous disposions de tout l’éventail des tech­

niques bidimensionnelles mises au point dans le Laboratoire de chimie phy­

sique des macromolécules aux Interfaces, et adaptées à l’étude des mono­

couches étalées à l’interface air-eau.

En fait, l’étalement d’une monocouche de lipides à l’interface air-eau constitue le modèle de membrane le plus simple : il simule réel­

lement une demi-membrane. Les lipides s’orientent à l’interface de ma­

nière à plonger leur groupe polaire dans le support aqueux et à projeter leurs chaînes hydrocarbonées dans la phase gazeuse. Ce type d’orientation est identique à celui qui adoptent les lipides au sein de la membrane bio­

logique.

La méthodologie acquise au cours du mémoire de licence pouvait donc cons­

tituer un point de départ valable de notre étude pourvu que la méthode adoptée soit celle des modèles.

La première partie de cette thèse a donc consisté à incorporer un antigène membranaire, la cardiolipine molécule de structure très proche de celle des lipides dans des monocouches lipidiques de fluidité variable.

Le degré de fluidité de chacun de ces films est mesuré par la technique de viscosimétrie superficielle.

Pour observer le processus de reconnaissance immunologique de l’antigène, nous avons procédé à une injection de l’antisérum spécifique dans le sup­

port aqueux sous-jacent au film étalé.

Il nous a été ainsi possible d’établir une correspondance entre le degré de fluidité d’une monocouche, c’est-à-dire d’une demi-membrane et la réac­

tivité immunologique de l’antigène inclus dans la couche.

A partir de ces résultats, nous avons pu aborder la suite de notre travail grâce à un modèle de membrane plus complexe mais plus réaliste et plus proche du système membranaire naturel : la bicouche lipidique vésicu­

laire ou liposome.

Les liposomes se présentent sous la forme de vésicules dont la périphérie constituée par la bicouche lipidique entoure un certain volume d’eau.

L'orientation prise par les molécules de lipides au sein de ce système est identique à celle qu’adoptent ces molécules au sein de la structure membranaire.

Ce modèle date d'il y a au moins de dix ans, et n’était pas encore étu­

dié dans notre Laboratoire.

C’est au cours d’un séjour à l’Institut Weizmann, dans les Servi­

ces des professeurs I.R. Miller et M. Shinitzsky, que nous avons été initiée au liposome, ainsi qu’à une technique qui permet l'étude de sa fluidité : la mesure de la microviscosité membranaire par polarisation de fluorescence. Le prototype d’un microviscosimètre était en effet en cours d’essai dans le Laboratoire du professeur Shinitzsky lors de notre séjour, ce qui nous permit de mesurer la fluidité des premiers liposomes que nous avons formés.

L’utilisation du liposome dans l’étude de la reconnaissance immu­

nologique et de sa relation avec la fluidité membranaire fait donc l’ob­

jet de la seconde partie de ce travail, qui débuta dès notre retour à Bruxelles.

L’antigène membranaire, la cardiolipine, a été incorporé dans des liposomes de différentes compositions lipidiques. Deux séries de liposo­

mes l’une à partir d’un lipide fluide, l’autre, à partir d’un lipide rigi­

de, ont notamment été constituées. Notre but était d’assurer ainsi à la cardiolipine un environnement de fluidité variable.

Une difficulté de taille se présenta à ce stade de l’étude : aucune des techniques bidimensionnelles mises au point dans notre Laboratoire ne pouvait être adaptée à l’étude de ces systèmes.

En effet, ces suspensions de vésicules ne peuvent être étudiées que par des techniques tridimensionnelles, qui, cependant, doivent rendre compte des propriétés bidimensionnelles de la membrane : schématiquement, il s’agit d’inclure une molécule de type marqueur dans la vésicule et d’ob­

server si son déplacement est aisé ou non.

Ce marqueur doit bien entendu être choisi de telle manière que sa taille et sa nature lui assurent une incorporation aisée dans le milieu membra­

naire, sans entraîner de perturbation dans l’organisation moléculaire du système. D’autre part, les propriétés spectroscopiques doivent être sensibles à la fluidité de son environnement suivant le type du marqueur, qui peut être fluorescent ou contenir un radical paramagnétique libre, on emploiera la microviscosité par polarisation de fluorescence de la spec- troscopie de résonance paramagnétique électronique (EPR).

La première technique n'était pas encore concrétisée par un appa­

reil commercial et celui-ci ne fut acquise par notre laboratoire que vers la fin de la partie expérimentale de notre thèse.

La technique d'EPR par contre, qui avait été mise au point par l’équipe du professeur Mac Connel à l'Université de Stanford pour l'étu­

de des liposomes, était développée à l'Université de Liège par le Docteur Delmelle pour des membranes naturelles.

C'est dans son service que nous fîmes l’apprentissage de cette technique qui nous permit de montrer qu’une variation de la composition en lipides du milieu membranaire entourant l'antigène entraînait de pro­

fondes modifications dans les propriétés de fluidité de ces membranes.

Par la suite nous pûmes confirmer nos observations par mesures de microviscosité membranaire, notre Laboratoire ayant acquis l’appareil.

C'est à partir de ces résultats, à savoir que les propriétés de fluidité d’un système membranaire sont étroitement liées à sa composition en li­

pides, que nous avons tenté d’établir une relation entre les propriétés de fluidité d'une membrane liposomiale contenant un récepteur antigéni­

que, et sa réactivité immunologique.

L’établissement de cette relation constitue la partie finale de ce travail.

Le modèle du liposome par sa membrane périphérique, constitue le seul modèle qui permette de simuler la réaction immunologique telle qu’elle se produit "in vivo". En effet, la destruction immunologique d'une cel­

lule se fait par un mécanisme de lyse de la membrane plasmatique. Ce processus résulte de l'action combinée de l'anticorps spécifique de l’an­

tigène membranaire et d'un complexe cytolytique rupteur membranaire pré­

sent dans le sérum et constitué de 9 protéines : le complément.

Dans un premier stade, les anticorps spécifiques se fixent à la surface de la cellule, au niveau des récepteurs antigéniques.

Dans un deuxième stade, le complément se fixe à son tour sur l'immuno- complexe ainsi formé et provoque la lyse de la cellule par la formation de pores dans la membrane.

Par conséquent, la lyse immunologique d'une membrane liposomiale conte­

nant l’antigène se traduira par une brusque augmentation de sa perméabi­

lité à un marqueur inclus dans la phase aqueuse interne. L’efflux du mar­

queur vers la phase aqueuse externe, suivi par une méthode spectroscopique, permet de mesurer l’avancement de la réaction immunologique.

C'est cette approche que nous avons choisie pour étudier le proces­

sus de reconnaissance immunologique de la cardiolipine, en relation avec les propriétés de fluidité de son environnement lipidique.

La lyse immunologique est observée en incubant en présence de l'antisérum de la cardiolipine, contenant donc son anticorps, ainsi que du complément, chacune des suspensions liposomiales étudiées précédemment par spectroscopie EPR et par microviscosimétrie.

Cette démarche devait nous permettre la mise en évidence d'un lieu éventuel entre la fluidité membranaire et la réactivité immunologique de la membrane.

C'est par l'établissement de ce type de relations que nous nous proposions de conclure notre travail.

CHAPITRE I : LA MEMBRANE BIOLOGIQUE.

1.1. DEFINITION ET ROLE.

Il est impensable qu'un organisme vivant, quel qu’il soit, puisse exister sans être isolé de son environnement. Ce principe fondamental fut émis pour la première fois par le physiologue soviétique A. Dparin dans son ouvrage sur l'origine de la vie (II.

Etant donné qu’un organisme vivant, de par sa définition, diffère de son environnement par ses propriétés physiques et sa composition chimique, il devra posséder une structure "isolante" lui permettant de maintenir ces différences. Cette structure est la membrane cel­

lulaire. (1).

Cependant, son rôle ne se borne pas à une isolation pure et simple. Pour se maintenir en vie, la cellule interagit avec son environnement par un échange permanent de substances et d’informa­

tions [21, (31.

Elle doit également être à même de reconnaître la présence de cellu­

les voisines [4]. Ainsi, la création d’un contact entre cellules voisines d'une même culture tissulaire inhibe toute division cellu­

laire ultérieure dans la direction du contact.

L’absence de ce contrêle est spécifique d'un état pathologique de la cellule : elle se traduit par une division cellulaire multidirec­

tionnelle continue, entraînant la formation d’une tumeur.

Ce contrôle est lié à la présence de sites de reconnaissance sur la surface de la cellule, son absence correspond à une anomalie struc­

turale de la membrane.

1.2. COMPOSITION.

Ayant esquissé le rôle de la membrane cellulaire, attachons-nous à définir sa composition chimique et sa structure.

1.2.1. Lipides

Une analyse des constituants membranaires indique la présence de lipi­

des, de protéines, ainsi que d'un taux élevé de molécules d’eau [5], [61 La cellule animale contient généralement trois types de lipides ; les phospholipides, les glycolipides et les stérols, principalement le cho­

lestérol.

Ce sont des molécules amphiphiles, possédant une importante région lipo- phile reliée à un petit groupe hydrophile.

La zone hydrophobe est constituée par une ou deux chaînes hydrocarbonées longues de 14 à 22 carbones, présentant un nombre variable de liaisons non saturées. La tête polaire est constituée par un résidu glycérophos­

phate ou glycérosaccharidique Cfig. 1.1.).

1.2.2. Protéines

Les traitements de purification des systèmes membranaires révèlent l'e­

xistence de protéines en proportion équivalente au contenu lipidique.

Ces protéines se répartissent en deux classes distinctes : - les protéines extrinsèques, adsorbées sur la membrane - les protéines intrinsèques, incorporées dans la membrane

Les analyses d'acides aminés démontrent que la première classe de cons­

tituants se caractérise par un pourcentage élevé en résidus polaires;

la deuxième classe de protéines, par contre, présente un taux élevé en résidus non polaires. Ce sont ces segments polypeptidiques hydropho­

bes qui permettent à la protéine de se fixer dans la région lipidique de la membrane.

Les mesures de dlchroïsme circulaire (DC) et de dispersion optique rota­

toire CORD) montrent que les protéines membranaires se trouvent générale­

ment sous une conformation globulaire (14).

Cholestérol

May be esteiified with a fatty acid at the —OH position.

Phosphatidyl choline (lecithin)

CH2O-CO- Ri CHO-CO-R2

1

OII

CHîO-P-OCHî. CH2. N{CH3)j

Oe

Phosphatidyl ethanolamine (cephalin) CHj-O- CO-R, ÇH-O-CO -Rj I

O

CHî-O-P-O-CHj-CHjNH;

Oe

Phosphatidyl serine

ÇHî-O-CO-R, CH-O-CO-Rj

0II

CHj-O- P-O-CH2-CH2 O1

e

/Nh;

■x:oo‘

I

flg. 1.1

O OH

Diphosphatidyl glycerol CHj-O-CO-R,

1

ÇH-O-CO-R2 OII

CHj-O-P-O—

OH

CH2-O-P-O CH,

I I I

ÇHOH Oq CH-O-CO-Rj

-CH, CH2-O-CO-R4

Oe

Sphingomyelin Ri

I

COI

NH O

I II

CHjCCHJ),2CH=CH-CH-CH-CH2-0-P-0-CH2 -CH2N-(CH3)3

OH O

e

Glycolipids HO-CH-CH=CH-(CH2)i2-CH3 CH-NH-CO-Ri

1

CH2-O CH2OH

R], R2 etc dénoté fatty acyl sidechains.

Glycolipids aie variously named cerebrosides, gangliosides, globosides, and hematosides.

Ceiebrosides contain one monosaccharide residue, glucose or galactose, the othei glycolipids contain branched oligosaccharides.

tD

1.3. STRUCTURE DE

LA

Etant donné quB lipides et protéines sont maintenus au sein de la membrane par des interactions non covalentes hydrophobes ou hydro­

philes, quel est le type de structure qui en résultera pour le systè­

me membranaire ?

1.3.1. Premier modèle de Danielli

Une première image de la structure d'une membrane plasmatique, basée sur des considérations thermodynamiques et sur l’observation de modè­

les moléculaires fut conçue par Danielli en 1937 C81. CFig. 1.2].

Original (1934) schematic model of cell membrane (top) included lipid bilayer sandwiched between loyers of adsorbed globular protein. When experiments showed that protein was actually bound tightly to the lipids, this model was revised in 1937

(lower drawing) to include two additional loyers of “unrolled"

protein in close contact with the lipid loyers, with globular pro­

teins outside as before. The unrolled protein interacts with the lipid through both polar and nonpolar forces.

FZg. 1.2.

Ce modèle présente une membrane constituée par un double feuillet lipi­

dique dont les têtes polaires seraient en contact avec les protéines.

C'est en effet la structure en blcouche qui assure au système lipidique l'état énergétique le plus stable.

1.3.2. Deuxième modèle de Danlelll

Dans une deuxième étape, afin de tenir compte de la perméabilité de la membrane aux substances nutritives présentes dans le milieu extracellu­

laire, ce premier modèle fut amélioré. En effet, la diffusion transmem­

branaire de molécules solubles en phase aqueuse implique l'existence de

"pores" à travers l'épaisseur de la membrane, pores à parois hydrophiles, c'est-à-dire tapissés de protéines dont les groupes polaires sont diri­

gés vers la phase aqueuse. (Fig. 1.3].

Early (Danielli) model of membrane structure visualized “unroUed’’ protein covering both sides of lipid bilayer,with hydrophobie amino acid residues interacting with similar lipid chains; hydrophilic residues were thought to form “pores" for molecular transport.

F-ig. 1.5.

Les mesures de diffraction aux rayons X C9], C10), d’analyse thermique différentielle [11), les observations faites au microscope électroni­

que (12), (13), vérifièrent dans la suite l'hypothèse de base de Danielli et Davson : un double feuillet lipidique constitue le sque­

lette de la membrane cellulaire, sur lequel viennent s’absorber ou pénètrent un grand nombre de protéines.

Cependant la structure présentée par Danielli est thermodynamiquement instable. Elle permet en effet aux résidus hydrophobes protéiques d’être largement en contact avec la phase aqueuse, alors que les têtes polaires lipidiques sont écartées de la phase aqueuse par une couche protéique.

D’autre part, ce modèle implique une immobilisation permanente des cons­

tituants membranaires.

1.3.3. Modèle de Singer

Dr, de nombreuses techniques ont permis de mettre en évidence l'état fluide des chaînes lipidiques, dans les conditions physiologiques de température. L’intérieur de la membrane est ainsi assimilé à un milieu liquide dans lequel les structures hydrophobes protéiques seraient en solution (14), (15). C’est ce modèle dynamique qui fut proposé par Singer et ses collaborateurs (16).

Seul ce dernier modèle satisfait pleinement aux données thermodynamiques ainsi qu’aux constatations expérimentales.

Quelles sont ces données thermodynamiques dont il faille tenir compte ? Elles concernent les interactions non covalentes hydrophobes et hydro­

philes entre les constituants membranaires. Les premières se jouent entre les régions non polaires, correspondant aux chaînes hydrocarbo­

nées lipidiques et aux résidus non polaires protéiques.

Les secondes se Jouent entre les groupements hydrophiles et l’environne­

ment aqueux, groupements hydrophiles correspondant soit aux résidus ioni­

ques des protéines, soit aux têtes polaires lipidiques.

Seule la structure en bicouche du matériel lipidique permet de combiner ces deux effets, en stabilisant d’une part les interactions hydrophobes entre chaînes hydrocarbonées, et, d’autre part, les interactions hydro­

philes entre les têtes polaires des lipides. Les protéines devront s’in­

tercaler dans la membrane de manière à mettre leurs résidus non polaires en contact avec les chaînes hydrocarbonées, et leurs résidus polaires en contact avec les têtes hydrophiles et la phase aqueuse (Fig. 1.4.).

I t

K'V ^v A^

Fii;. 2. The lipid-clobular protcin niosaic model of membrane structure: scheniatic cross-süctional \icw. The phosnhülipids are tlepiclccl as in Hig. 1, and are arranged as a discontimiüus bilaycr wiih their ionic and polar heads in contact rviih jome lipirl niay be sirnclnrally difTercmiated ftom the biiik of the lipid (see tcxt), but this is not expliciily shown in the figure. The integra! prolcins, with the hcavy Unes repre- seniing the folded polypeptide chains, are shown as globular n'oieculcs paitialiy em- beddcd in, and paitially protrnding from, the membrane, rite protruding parts hâve on their surfaces the ionic ie.sidiics (— and -f-) °f the protcin, whiie the nonpoiar residucs ate largely in the embedded parts; accordingiy, ihc protcin molccules are ain- phipathic. T he dcgree lo which the intégral prolcins arc embedded and, in purticu.ar vsltciher they span lire entire membrane thickncss dépend on the size and structure of the molccules. The arrow marks the (tlanc of clcavacc lo be expected in f-ecze clchmc expcrimenis (see te\l). [FriJiri Lenard and Singer (d) and Singer (/)!

722

Ug. ],4.

1.3.4. Asymétrie de la membj2ane

De plus, la structure membranaire est encore compliquée par une asymé­

trie dans la distribution des protéines et des lipides.

Il est possible, par marquage chimique, de démontrer que le mouvement transmembranaire de ces composés est inexistant ou très lent C17], (18).

C'est le cas, notamment, pour les antigènes membranaires protéiques.

Il semble également que les phospholipides à. chaînes saturées, ainsi que le cholestérol, soient distribués sur la face externe de la membra­

ne plasmatique.

Cette asymétrie pourrait conduire à une différence de fluidité entre les deux faces de la membrane (19).

1.4. FLUIDITE MEMBRANAIRE.

Sous les conditions physiologiques, les lipides de la membrane cellulaire sont dans un état fluide. Ils constituent une matrice au sein de laquelle les protéines peuvent effectuer un mouvement de trans­

lation latérale ou rotationnelle dont la vitesse est déterminée par la viscosité de la matrice lipidique (20), (21).

Ce type de structure a pu être confirmé par des images obtenues en mi­

croscopie électronique, montrant l'existence d’une matrice lipidique

"lisse" dans laquelle s’incorporent des particules d’un diamètre cons­

tant : les protéines membranaires (7). Dans le cas d’une étude faite sur l’érythrocyte humain, les particules observées correspondent aux antigènes membranaires glycoprotéiques.

Quels sont les paramètres caractérisant un état fluide du système lipidique ?

Les chaînes hydrocarbonées des lipides se trouvant à l’état fluide pré­

sentent un haut degré de flexibilité; de plus les molécules sont ani­

mées d’un mouvement latéral et rotationnel rapide. La vitesse de dif­

fusion des lipides a pu être mesurée pour plusieurs systèmes membranai­

res (22), (23), grâce à l'incorporation d’un marqueur de spin dans la membrane. Les caractéristiques du spectre de résonance paramagnétique électronique (EPR) ainsi obtenu dépendent de la concentration du mar­

queur et de sa vitesse de diffusion latérale.

On trouve ainsi des coefficients de diffusion D d’une valeur de 10"® cm^ / sec (24).

Les caractéristiques spectrales d’un marqueur EPR sont également fonction de la fluidité de son environnement. Son incorporation dans une membrane permet donc une estimation directe de la fluidité membranaire (25).

Parallèlement à ce type de mesures, il est possible de déterminer la viscosité d’une membrane par la technique de polarisation de fluores­

cence. Celle-ci est basée sur l’utilisation d’une molécule dont le ca­

ractère hydrophobe assure son incorporation dans la région lipidique de la membrane (26).

Le degré de dépolarisation du rayonnement émis correspond à la mobilité rotationnelle du marqueur; il fournit donc une mesure directe de la vis­

cosité du milieu environnant le marqueur (27), (28), (29). Les résul­

tats obtenus par B. Rudy et C. Gitler sur la membrane plasmatique des érythrocytes renseignent une microviscosité de 1.32 poises pour le sys­

tème placé dans les conditions physiologiques de température (37°C).

(Fig. 1.5).

Kig. -V Tenipcralurc depciuJcnce of microviscosily in membranes of humjii cryihrocylcs (O O)- chromjltiii granules ( ■ ~ ) .inJ mitüdiundriu <9-0).

fZg

1.5.

En fait, la fluidité n’est pas un paramètre constant dans le système membranaire. Des forces d'interaction préférentielles s’exercent entre les divers constituants de la membrane, ayant pour effet la formation de microdomaines.

□n assiste ainsi à l’agrégation de constituants de même nature, dans des régions spécifiques de la membrane.

Des protéines intégrales peuvent ainsi s’associer si leurs interactions sont favorisées par rapport aux interactions lipide-protéine.

Des associations entre glycolipides ou glycoprotéines peuvent également se produire, induites par des forces d'interaction hydrophiles.

Ce même phénomène est observé entre les molécules de lipides. Les interactions préférentielles entre chaînes hydrocarbonées "rigides"

provoquent la formation d'îlots solides coexistant avec une phase lipidique fluide.

Des observations faites en microscopie électronique sur des membranes de Mlcoplasme ont permis de visualiser cette séparation latérale de phase (30). Elle est sensible à la température du milieu.

Une élévation de température provoque la fluidification des domaines lipidiques solides, abolissant ainsi la séparation de phase.

Par contre, pour tous les animaux dont le corps est maintenu à une température constante, la modulation de fluidité d'un système mem­

branaire à l'autre ou d'une région membranaire à l'autre, ne peut se faire par effet thermique.

Dans ce cas, c'est le taux de cholestérol présent dans la membrane qui module la fluidité du système en exerçant un effet antagoniste sur les lipides fluides et rigides. Il exerce un effet de rlgidification sur les zones lipidiques fluides mais augmente la mobilité des lipides constituant les phases solides.

Dn observe ainsi que les membranes cellulaires riches en cholestérol (30 % en mole) possèdent une fluidité lipidique réduite.

Le système biologique le plus étudié est représenté par les membranes des cellules lymphocytes, en raison de l'importance de leur fonction physiologique : ce sont les lymphocytes qui sont impliqués dans le pro­

cessus de défense immunitaire de l'organisme. Ces cellules, présentes dans la circulation sanguine, possèdent sur leur surface des récepteurs les immunoglobulines, détectant la présence de tout corps étranger dans le sérum sanguin.

La mobilité de ces récepteurs a été largement étudiée, étant donné la relation étroite existant entre ce paramètre et la fluidité de la mem­

brane.

L'influence du cholestérol sur la fluidité membranaire des lymphocytes a été mise en évidence par M. Shinitzky et ses collaborateurs, qui ont montré que l'incorporation croissante de cholestérol dans les cellules provoquait une augmentation de leur viscosité (31). (Fig. 1.6).

A'.'i.'. Sci. rSA 77 (0/7.',)

Fi«. 1. The (lei)eii(lonrc of membrane mierovîscosity on llio mollir ratio of cliolesterol to phospholipids as deterinineil by fluorescence polarizalion analysis of ibe Ilnorcscent probe, 1,(>- ilipbenjl l.:5,')-bexatricne, einlicdded in lipid ret;inn.s (IG-IS).

O, Sitrf tee membranes of normal lymphocytes from rats or mice (IS); O. surface membranes of malignant, lymphoma cells from mice (l's); A, surface mornbraiies of bnman normal lymphocyte.'';

A, stirfiice membranes of human chronie !yni]ihatic icukcmii;

cells'‘; a, lipo.somes of lecilliin-sphingomyelin (2:1 mole/molc’');

<», human cryjhrocyle gho.'! membranes'*. Bars indicate SFM.

The dcsc!ibed relation can lie expie.'sed by liie empirical ei|ua- lion, log ^ = 0.17 + 0.0-c/p, whorc r) is Ihc microviseosity al 2ô° in poiscs (IS) and e/p is Iho molar ratio of cholestérol lo idiospholipid.s.

»M. Inbar, M. Shinitzky, and If. Ben-Bassat, subinitted for publication.

'* Y. Barenhnlz and M. Shinitzky, unpublished result.s.

F^g. J.6.

Par contre l’extraction du cholestérol des membranes lymphocytaires se traduit par une fluidification du système.

La modulation du taux de cholestérol est effectuée selon deux procédés :

Le premier consiste à incorporer des quantités croissantes de cholesté roi dans le système cellulaire.

A cette fin. les cellules lymphocytaires sont incubées en présence d’une suspension de vésicules mixtes lipide-cholestérol. Un processus d'échange se produit entre les vésicules et les cellules, permettant au cholestérol de passer dans le système membranaire.

Le taux du cholestérol incorporé est d’autant plus élevé que le temps d’incubation est long.

L’élimination progressive du cholestérol du milieu membranaire est ob­

tenue en incubant les lymphocytes avec une suspension de vésicules lipi­

diques pures. Le cholestérol natif est ainsi déplacé de la membrane cellulaire vers la suspension de lipides, par un processus d’échange inverse. Le contrôle du temps d’incubation permet une extraction pro­

gressive du cholestérol membranaire.

Les mesures de polarisation de fluorescence, réalisées en incor­

porant un marqueur dans la membrane cellulaire, montrent que la visco­

sité membranaire augmente lorsque le taux de cholestérol s’accroît, par contre, l’extraction du cholestérol du milieu membranaire induit une fluidification progressive du système (32). (Fig. 1.7).

028

£ I 026

■I 'a

?

I °

022

0 I 2 3 4

Incubation tima (h )

Fin. 4. Tho e£Tect of titne of incubation on the dogrec of fluorescence polarization {P) moasured at 2S°C of DPH-labellod normal lymphocytes inoubated at 4°C with 8 œg/ml lecithin liposomes in 0-16 m-KCI (—•—•—) and with 0-16 m-KCI (—O—O—)î and of OFH-labelled lymphoma oells inoubated at 4°C with 12 mg/ml leoithin-eholesterol liposomes (1:1) (—A—A—) and with 0-16 m-KCI (—A—A—)• Tlia bars represent the range of experimental variation.

VZg. 1.7.

Il semble, par ailleurs, que la fluidité membranaire puisse être mise en relation avec le caractère pathologique d'une cellule.

Les mêmes auteurs ont comparé les taux de cholestérol présents dans les membranes des cellules saines et malignes. Il apparaît que le taux de cholestérol, et, par conséquent, la microviscosité membranaire, sont deux fois plus élevés pour les lymphocytes sains.

Système membranaire

Rapport cholestérol/lipide

(mole/mole)

Lymphocyte humain sain

0,75 (33)

Lymphocyte humain leucémique

0,38 (34)

La mise en évidence du lien existant entre une fluidité membranaire éle­

vée et l’état pathologique d’une cellule est d’une importance capitale.

Elle correspond aux observations faites sur la mobilité des antigènes membranaires des cellules saines et tumorales.

L. Sachs et ses collaborateurs [35) ont ainsi démontré une plus faible mobilité des antigènes "leucémiques” par rapport aux antigènes membra­

naires des cellules normales. En effet, lorsqu’on incube des lymphocy­

tes sains avec leur anticorps complémentaire, rendu fluorescent, on cons­

tate la formation rapide d’un pôle fluorescent, recouvrant une zone res­

treinte de la surface cellulaire. La formation d’un tel pôle est inhi­

bée, entre autres facteurs, par une diminution de la température du mi­

lieu.

Par contre, aucune formation de pôle n’est observée lorsque des cellules leucémiques sont incubées en présence de leur anticorps. CFig. 1.8.).

r'iOR/V.AL LYMPHOCYTES

1 ij. 5. Schcmatic rcpicsenlation of antibody-induccd Ig redistribution (capping) on normal lym- plioeytcs and lymphocytes froni patients wilh chronic lymphocytic Icukcmia (CLL). The dark dots repiescnt fluorescent anti-Ig. Most normal lymphocytes cappcd in the (A) configuration at 30 minutes with a few showing more extensive uropod cap rormation (B). Most C LL cells werc in the uncapped cr.r,iii;uralion (C) with a few showing sorr.c polar redistribution (D). (front Cohen and Gilbertsen

|5%i).

rzg. us.

Les auteurs constatent, de plus, que les patients en voie de guérison présentent à nouveau un pourcentage normal de cellules susceptibles de former un pôle.

La relation inverse est obtenue pour des cellules non lymphocytaires : les fibroblastes. Les fibroblastes sains possèdent une fluidité supé­

rieure à celle des cellules tumorales, mais une mobilité réduite de leurs récepteurs de surface ; la formation d’un pôle de récepteurs n’est observée que pour les cellules tumorales.

Cet effet s’explique si les récepteurs de surface sont plus accessibles au milieu extérieur lorsque la viscosité membranaire augmente. Une mem­

brane fluide permettrait aux récepteurs de pénétrer profondément dans la couche lipidique, réduisant ainsi leur mobilité. A l’opposé, une couche lipidique rigide provoquerait une expulsion partielle des récep­

teurs membranaires vers la phase aqueuse externe, augmentant ainsi leur mobilité.

Ces modifications pathologiques de la mobilité des récepteurs si­

tués dans la membrane cellulaire expliquent sans doute la prolifération des cellules cancéreuses et l’absence de rejet de l’organisme hôte vis- à-vis des tumeurs.

CHAPITRE II : LES MODELES DE MEMBRANE.

Les problèmes associés à la compréhension de la structure et du fonctionnement de la membrane ne peuvent être seulement résolus par une approche biologique, en raison du caractère complexe du sys­

tème. C’est pourquoi, le recours à des membranes artificielles, dont les paramètres de structure et de composition peuvent être en­

tièrement contrôlés, s’est révélé particulièrement intéressant. Ce qui conduisit les physico-chimistes à concevoir ces modèles de mem­

brane, est l’existence d’une structure de base commune à tout le sys­

tème membranaire ; celle du double feuillet lipidique.

2.1. MONOCOUCHES.

2.1.1. La monocouche lipidique

Le premier modèle conçu, et aussi le plus simple, fut celui de la mono­

couche de lipides étalée à l’interface air-eauj cette monocouche cons­

tituant une ”demi-membrane".

Les lipides étant amphiphiles s’orientent à l’interface de manière à plonger leur groupe polaire dans le support aqueux, et à projeter leurs chaînes hydrocarbonées dans la phase gazeuse. Ce type d’orientation est identique à celui qu’adoptent les lipides au sein de la membrane (36),(37).

Les monocouches ont permis l’étude d’un grand nombre de propriétés phy­

siques de la membrane : Interactions lipides-lipides, interactions li­

pides-constituants membranaires protéiques, interactions entre les groupes polaires des lipides et les ions "physiologiques” présents dans

le support aqueux (Na*, K*, Ca** , Mg**).

La structure d’une monocouche est présentée dans la figure suivante (fig. 2.1.).

Measurements on monolayer models show that the surface area occupied by a lipid molécule varies with the type of lipid (graph at top); schematic drawings helow show why. Molécules with two long, saturated chams (18:0/18:0) occupy minimum space at a given pressure; with one short chain (18:0/12:0), space required is greater because of lessened attraction between short chains. When one chain is unsaturated (18:0/18:1), the *"kink'' in the unsaturated chain produces maximum séparation.

FZg. 2.1.

2.1.2. Méthodes de mesure des propriétés physiques de la monocouche.

Un grand nombre de techniques bidimensionnelles ont été mises au point pour l’étude de ce modèle de membrane. Elles sont basées essentielle­

ment sur les propriétés de tension superficielle et de viscosité super­

ficielle des films étalés. C38], C39], (40).

Les mesures de tension superficielle permettent de déterminer l'aire occupée par chaque molécule de lipide au sein du film. Celle-ci va­

rie selon la nature du lipide étalé : elle est liée, notamment, à la longueur et au nombre de non-saturations des chaînes hydrocarbonées.

Les mesures de viscosité superficielle permettent d'évaluer la mobi­

lité des molécules de lipides, au sein de la monocouche. La viscosité varie également avec la nature des chaînes hydrocarbonées constituant le film.

Cependant, le modèle de la monocouche présente deux limitations majeu­

res.

La première est qu'il ne représente qu'une "demi-membrane” :il faut donc être prudent lorsqu'on attribue à la membrane les constatations obtenues pour la monocouche.

La seconde limitation est constituée par le fait que le film se trouve à l'interface air-eau et non liquide-liquide : il ne permet donc pas l'étude des phénomènes de diffusion transmembranaire, qui sont essen­

tiels à la survie de la cellule.

2.2. LA BICOUCHE.

C'est ce qui amena les physico-chimistes à la création d'un se­

cond type de modèle : celui de la bicouche lipidique séparant deux pha­

ses aqueuses.

La mise en présence de molécules de lipides et de molécules d'eau permet de se rapprocher d'une manière plus réaliste du système membranai­

re, le rôle des molécules d'eau étant d'orienter les lipides au sein de la bicouche. En fait, c'est le caractère polaire de la phase aqueuse qui détermine la structure de la membrane.

Les bicouches artificielles possèdent des propriétés de capaci­

tance et de perméabilité aux solutés proches de celles des membranes cel­

lulaires C41]. Leur utilisation dans l'étude des propriétés du système membranaire est donc particulièrement avantageuse.

Le modèle du double feuillet lipidique est utilisé sous deux formes ; la forme plane [420, (430 ou la forme vésiculaire sphérique.

Nous nous attacherons à la description de cette dernière, plus particu­

lièrement employée dans ce travail.

2.2.1. La blcouche llposomiale.

Les liposomes C44Î se présentent sous la forme de vésicules dont la périphérie constituée par la bicouche lipidique entoure un certain volume d'eau. Ils sont obtenus en dispersant les lipides en milieu aqueux, à l'aide d'un agitateur Vortex. On obtient ainsi des vési­

cules à multiples bicouches concentriques séparées entre-elles par une couche d'eau, (fig. 2.2.].

Lorsque la suspension est soumise à ultrasonication, les vésicules multilamellaires sont brisées en liposomes unilamellaires, d'un dia-

O

mètre de 300 A [45].

,Q) (b) (c)

Fig. I. Schematic représentations of liposomes, (a) Multilamellarliposome, (b) Enlarged viewof(a), (c) Smull, unilaniellar liposome.

.

.

.

2.2.2. Méthodes de mesure des propriétés physiques de là bicouche liposomiale.

Un grand nombre de techniques ont été adaptées à l'étude des propriétés physiques de ces systèmes.

La diffraction des rayons X C46] permet de déterminer la structure et l’organisation moléculaire de la bicouche. Elle indique que les molé­

cules de lipides s’organisent de manière à exposer leur groupe polaire vers la phase aqueuse, orientant leurs chaînes hydrocarbonées vers l’intérieur de la bicouche.

Le passage d’un état moléculaire ordonné à un état désordonné, au sein de la membrane, peut être observé soit par analyse thermique (47), soit par l’incorporation d’un marqueur fluorescent (48) ou paramagnétique

(49) dans la bicouche. Ces deux dernières techniques spectroscopiques permettent également une étude de la mobilité des chaînes hydrocarbonées au sein de la membrane, par le choix d’un marqueur adapté.

La mise au point de ces techniques permet ainsi une étude approfondie des propriétés physiques des lipides et de leur organisation au sein de la bicouche.

CHAPITRE III : PROPRIETES PHYSIQUES DES LIPIDES.

3.1. SYSTEMES LIPIDIQUES PURS.

La caractéristique principale des chaînes hydrocarbcnées est une variabilité chimique quasi illimitée. Chaque classe de phospho­

lipides, caractérisée par un même groupe polaire, possède des chaînes hydrocarbonées variant par leur longueur, par le nombre et la position des liaisons non saturées.

Par conséquent, une bicouche membranaire constituée par un mélange de lipides possédera des propriétés reflétant la nature et la proportion de chaque chaîne hydrocarbonée présente.

Les molécules de lipides peuvent se trouver dans divers états physiques selon la nature de leurs chaînes.

Il existe deux phases contribuant essentiellement à la structure de la membrane : la première est fluide, constituée par des chaînes lipi­

diques mobiles et flexibles; la seconde est solide, constituée par des molécules immobiles et rigides (501.

Ces deux phases sont appelées respectivement liquide-cristalline et cristalline (fig. 3.1.1.

0

Hguic 2A l)ijgumm;ttic rcpresoiitalion of tlio structure oF two phospholipicl bnidbr phases; (a) crystai; (b) liquiJ-crystaL C irdcs represent Ihc piiospholipid pulai groups and liues indicate tlic hydrocarbon chains <Iront refcrence 17).

VZg

3.1.1. Phase cristalline.

Les lipides se trouvant dans un état ordonné alignent leurs chaînes dans une configuration plane. Leur vitesse de diffusion latérale au sein du réseau est très faible. Les oscillations de torsion autour des liaisons C-C sont de faible amplitude, ce qui confère aux chaînes une flexibilité très réduite (51], (523.

Par conséquent, l'aire occupée par chaque molécule au sein de la cou- O

che est petite (Inférieure à 60 /molécule]. Ces lipides forment des films monomoléculalres structurés et condensés.

Les chaînes hydrocarbonées se trouvant, à la température ambiante, dans un état cristallin, sont caractérisées par une longueur de chaîne égale ou supérieure à 16 C, et par une absence d'insaturations (53].

3.1.2. Phase fluide.

La phase lipidique fluide est un système entièrement déstructuré, au sein duquel les molécules sont animées d'un mouvement rapide de diffu­

sion latérale (54]. Les oscillations de torsion autour des liaisons C-C sont très amplifiées et provoquent un reploiement des chaînes empê­

chant tout alignement ordonné (55], (56].

Il en résulte une expansion du réseau lipidique, correspondant à une O

aire moléculaire élevée (supérieure à 100 /molécule].

Ces lipides constituent des films monomoléculalres liquides, non struc­

turés (57].

Les lipides fluides à température ambiante sont caractérisés par des chaînes hydrocarbonées saturées, de longueur inférieure à 16 C, ou par des chaînes comportant une ou plusieurs liaisons non-saturées.

Kuï. 8. l*r<'HHiirt*- UM'ii nirvcH ror sa!unitrd I ,iî ilmr\I-i,-j)lioHjiïniti(i\'|rli<ilin»‘H itt

l!u' uir <1.1 iM NaCI inlrifiui' ni ((J) Dili' lu iu>yl l^•<•ltl^lll (t'i.l: ( I ilisti-aniyl (('lo); ( • ) (iil'almituvl liTitlmi ( ' ) «liiii.Mal'i\ I lu Mlim (<-'14): (V ) «licii|>ryl Iccitliin (Kn-in l liiiliiis uiid Cliapiimii, ÜHl.s). K. |>riHlm<-4l

by jK-rmissioM of KIwvrt l'iilili-sbing C‘o.

FXg. 3.2.

Ainsi, la distéaroylphosphatidylcholinB (DSPC), dont les chaînes saturées sont longues de 18 C, forme un film entièrement condensé, caractérisé par

O une aire moléculaire de 41 .

Une réduction de la longueur de la chaîne se traduit par une augmentation de l’aire moléculaire, provoquant la formation d’un film fluide. C’est le cas pour la dimyristoylphosphatidylcholine CDMPC), dont les chaînes saturées sont longues de 14 C, et qui possède une aire moléculaire de 58 A^ .

L’introduction de doubles liaisons dans les chaînes lipidiques provoque également une très forte augmentation de l’aire moléculaire ; la stéa- royl-oléylphosphatidylcholine, possédant une chaîne saturée longue de 18 C et une chaîne non saturée de même longueur, se caractérise par

O

une aire de 63 , alors que la dioléylphosphatidylcholine CDOPC), dont les deux chaînes sont non saturées et longue de 16 C, occupe une aire

O moléculaire encore accrue : 76 .

3.1.3. Transition de phase.

Le passage de l’état cristallin vers l’état liquide-cristallin fluide, se fait à une température appelée température de transition de phase T^, caractéristique de la nature des chaînes hydrocarbonées et du groupe polaire des lipides [58), (59). Cette température augmente avec la lon­

gueur et le nombre de non saturations de la chaîne (60). (Fig. 3.3.).

Figure 2.5 Diflcrential scanning calorinieler ticaling curves for saturatcd 1,2-di3cylpI)ospha- tidv■lcl^olincs dispctscd iii an equal mass of waler (data front references 20, 21).

F.ig. 3.3.

Les mesures de diffraction de rayons X (61) indiquent que le passage de l'état ordonné à l'état fluide correspond à une expansion du réseau cristallin, due à une augmentation du mouvement moléculaire des chaînes, Celui-ci s'amplifie progressivement avec 1 'accroissemà|nt de la tempéra­

ture du milieu. Lorsque la température de transition ^st atteinte, le mouvement moléculaire s'accroît brusquement, provoquant un^\^pansion du réseau.

3.1.4. - 1°) Monocouche.

L'influence de la température du milieu sur l'aire occupée par une molé­

cule de lipide peut être étudiée sur la monocouche. (Fig. 3.4.).

fycg. 3.4.

Courbes expérimentales ir-A pour la DPPC étalée à l'interface air 0,1 M NaCl, pour les températures de

courbe (1) : 45°C courbe (2) : B°C courbe (3) : 26°C

Lorsque la température de la couche est supérieure à la température de transition, la phase lipidique est entièrement fluide. Les cour­

bes donnant la pression superficielle en fonction de l'aire molécu­

laire ne présentent pas de zone intermédiaire. Dans un tel film, les chaînes hydrocarbonées sont très mobiles et peuvent se reployer vers la tête polaire, conférant ainsi au lipide une aire moléculaire

O

élevée (Aire = 70-100 /molécule]; courbe (1] (53).

Lorsque la température du système est inférieure de 20° à 30° à la température de transition, la monocouche est dans un état totalement condensé, et on obtient une courbe de pression du type (2) (62).

Au sein d'un tel film, les molécules constituent un réseau dense, quasi cristallin, aux chaînes lipidiques alignées dans une même con­

figuration.

Aux températures intermédiaires, les isothermes de pression montrent l'existence d'une zone intermédiaire entre l'état condensé et l'état fluide : courbe (3) (63). Dans cette zone, le film est constitué par des îlots de molécules "cristallisées", immiscibles dans le milieu li­

pidique fluide.

3.1.4. - 2°) Liposome.

La fluidification des chaînes hydrocarbonées peut être aisément mise en évidence sur les dispersions liposomiales, par la technique de po­

larisation de fluorescence. Un marqueur fluorescent est incorporé dans la bicouchej le degré de polarisation du rayonnement qu’il émet est directement lié à la viscosité de son environnement (64), (65).

(Fig. 3.5.).

Temperofure {“C)

60.3 39.5 ÎI.O 4.»

1/T X Io’C’K ’)

riGlülF. 1: Plol of nalural logarilhin of lhe apparent niicroviscosity v.s.

(lempcrature)"' for di.spcrsions of large, multilamcll.ir vesides préparai from (A) DOK.'; (•) OMl'C; (0) DPPC; (X) DSPC. Arrows a and b des'gnatc liniils of the Iran.silion range (see icxl).

Ug.

Ce type de transition peut également être détecté par spectrosco- pie EPR d'un radical paramagnétique, le TEMPO, soluble en phase aqueuse et eri phase lipidique fluide, mais insoluble en phase lipidique solide

C6B]. Sa solubilité dans le milieu lipidique augmente linéairement avec la fluidité du système.

Le spectre de résonance du TEMPO en solution dans une dispersion lipidi­

que, peut être résolu en deux signaux, l'un correspondant à la fraction de marqueur présent dans la phase lipidique - raie H-, l'autre émanant du radical présent dans la phase aqueuse - raie P-.

Il existe un autre type de technique permettant de suivre l'évolution de la fluidité lipidique et ne nécessitant pas l’utilisation d’un marqueur : il s’agit de l’analyse thermique différentielle, basée sur une mesure de l’énergie de transition (69). La méthode est basée sur une comparaison entre le comportement thermique de la suspension lipi­

dique et d’un échantillon de référence thermiquement inerte. Les deux échantillons sont chauffés simultanément de manière à maintenir nulle la différence de température entre les deux systèmes. Lorsque, pour une température donnée, la transition de phase endothermique se produit au sein du système lipidique, la différence de température cesse d’être nulle. Elle est rétablie à zéro lorsqu’une quantité de chaleur corres­

pondant à l’enthalpie de la transition est fournie au milieu lipidique.

En portant les valeurs de A H en fonction de la température, on enregis­

tre l’absorption de chaleur sous la forme d’un pic dont la position dé­

finit la valeur de transition et dont l’aire constitue une mesure di­

recte de l’enthalpie de transition.

3.2. SYSTEMES LIPIDIQUES MIXTES.

Les systèmes membranaires naturels sont constitués d’un mélange de phospholipides différant par la longueur de leurs chaînes, le nombre de liaisons non saturées et la nature de leur groupe polaire. Un des constituants lipidiques présent dans la plupart des systèmes membranai­

res est un stérol ; le cholestérol.

Les proportions en cholestérol et en divers lipides variant d’un type de membrane à l’autre, confèrent à chaque système membranaire une flui­

dité lipidique qui lui est propre.

L’utilisation des modèles de membrane permet de reconstituer ces mélanges de lipides et d’étudier les propriétés de fluidité membranaire qui en découlent (70), (71).

3.2.1. Système mixte lipide cristallin - lipide fluide.

Que se passe-t-il lorsque deux types de lipides de longueur de chaîne comparable et de même groupe polaire sont incorporés dans une bicouche ?