Validation du système iMESYS dans des cellules souches neurales humaines

Les CSN représentent le modèle idéal de validation du système iMESYS puisque ces cellules normalement indifférenciées sont capables de se différencier en neurones exprimant MAP2, en astrocytes positifs pour GFAP et en oligodendrocytes exprimant CNP. Les CSN utilisées ici dans cette étude sont les cellules hNSC#5205 obtenues du laboratoire de P. Dirks à Toronto (Canada). Bien que les caractéristiques de cette lignée précise ne Figure 52 : Les cellules neuronales SHS-Y5Y expriment uniquement le rapporteur fluorescent iMESYS MAP2-mCherry. (A) Photos d’immunomarquages montrant l’expression ubiquitaire de MAP2 mais l’absence des marqueurs CNP, GFAP et Tie dans les S(S-Y5Y. (B) Photographies représentatives de l’infection des cellules avec les lentivirus iMESYS à une MO) = , sans sélection antibiotique. Panel du haut : infection avec le lentivirus contrôle CMV-GFP ; panel du bas : état d’expression des rapporteurs fluorescents iMESYS. (C) Quantification du pourcentage de cellules positives pour les différents rapporteurs. Barres d’échelle = µm.

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soient pas publiées, son comportement est comparable aux précédentes lignées obtenues dans les mêmes conditions dans son laboratoire (Pollard et al., 2009a; Sun et al., 2008a). Dans la figure 53A, on peut constater que la quasi-totalité des CSN en notre possession expriment les trois marqueurs des cellules souches à des taux très élevés : nestine (98,4 % des cellules +/- 1,2), Sox2 (99,6 % des cellules +/- 0,3) et CD133 (80,6 % des cellules +/- 2,2), confirmant ainsi leur statut de cellules souches (figue 53B).

Même si la population de CSN est relativement homogène en cellules indifférenciées comme le prouvent les expressions de la nestine, de Sox2 et de CD133, certaines expriment des marqueurs de différenciation neurale (figure 54). Ainsi dans la même culture, on relève la présence du marqueur GFAP dans 31 % (+/- 2,8) des cellules. Cependant, ce taux de GFAP n’est pas surprenant lorsque l’on tient compte de l’origine embryonnaire des CSN, dont une partie exprime le marqueur astrocytaire GFAP (cf. introduction paragraphes 2.2 et 2.3). Une partie des cellules présente un marquage pour MAP2 (6,3 % ; +/- 1,4) mais pratiquement aucune cellule n’est détectée positive pour CNP (0,6 % ; +/- 0,4). Afin de valider le système iMESYS, il semblait important de vérifier s’il était capable de détecter la présence de ces marqueurs de différenciation malgré leur faible expression (figure 54B, D).

Figure 53 : Caractérisation d’expression des marqueurs de cellules souches dans des cellules souches neurales humaines maintenues en culture indifférenciée. (A) Photos représentatives d’immunomarquages de CSN hNSC montrant l’expression des marqueurs de cellules souches (MCS) : nestine, Sox2, CD133 (B) Quantification des immunomarquages pour les MCS représentés en pourcentages de cellules positives par rapport au DAPI. Barres d’échelle = µm.

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Figure 54 : Comparaison de l’expression des marqueurs de différenciation avec l’activation des rapporteurs fluorescents iMESYS dans des cellules souches neurales humaines. (A)Photos représentatives d’immunomarquages de CSN hNSC # montrant l’expression des marqueurs de cellules neurales différenciées : CNP (turquoise), GFAP (vert) et MAP2 (rouge) (B) Photographies montrant l’expression des rapporteurs fluorescents iMESYS neuraux (CNP-CFP, GFAP-GFP et MAP2-mCherry), suite aux infections individuelles après 2 semaines de sélection antibiotique. (C) Photographies représentatives de l’infection des cellules avec le lentivirus contrôle CMV-GFP à une MOI = 3. (D) Quantification de l’expression des rapporteurs fluorescents comparés aux immunomarquages @CNP, @GFAP et @MAP Barres d’échelle = µm. Test de Mann Whitney ; +/- SEM.

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Les CSN ont donc subi une infection avec les lentivirus codant pour les constructions iMESYS ou le vecteur contrôle GFP à une M.O.) = d’abord en simple infection une seule construction . Le processus d’infection montre que , % +/- 1,8) des cellules peuvent être transduites avec le contrôle GFP (figure 54C). Après 1 à 2 semaines de sélection avec les antibiotiques spécifiques de chacune des constructions (puromycine pour MAP2- mCherry ; blasticidine pour GFAP-GFP ; généticine G418 pour CNP-CFP , j’ai quantifié le nombre de cellules présentant une expression des gènes rapporteurs du système iMESYS neural. L’analyse quantitative des signaux de fluorescence montre la fidélité du système qui permet l’expression CFP, GFP et mCherry à des taux similaires à ceux relevés en immunofluorescence (figure 54B, D . En effet, il n’y a aucune différence entre les nombres de cellules positives pour le marquage GFAP (noté @GFAP) et pour le rapporteur GFP (noté GFAP-GFP) respectivement de 31 % et 30,5 % (+/-2,9 ; p > 0,7 ; figure 54D). Il en va de même pour le rapporteur mCherry (noté MAP2-mCherry et l’immunomarquage anti MAP (noté @MAP2) montrant respectivement 5,5 % et 6,3 % (+/- 0,9) de cellules positives (figures 54D). La concordance de ces résultats permet de valider la sensibilité du système iMESYS, même sur des cellules exprimant faiblement des éléments de différenciation.

La vocation du système iMESYS étant de pouvoir suivre en direct le comportement de différenciation de cellules vivantes, des cultures stabilisées de CSN portant les constructions GFAP-GFP (figure 55) et MAP2-mCherry (figure 56) ont été placées dans les conditions d’un test de différenciation pendant jours avec un retrait progressif des facteurs de croissance : d’abord EGF, puis bFGF.

Dans ces conditions, les CSN montrent une augmentation significative du nombre de cellules exprimant la GFP, montrant une activation du promoteur GFAP et donc de l’engagement dans la voie de différenciation astrocytaire figure 55 . L’augmentation significative est progressive entre le jour 0 (30,5 %) et le jour 7 (56 % +/- 8 %) pour atteindre une augmentation de 1,8 fois (p = 0,047) et se stabiliser à un plateau de 46 % (+/- 2,9 %) durant la deuxième semaine (figure 55B). Il est intéressant de noter que le phénotype évolue en même temps que l’apparition du rapporteur GFP. Les cellules se complexifient, étendent des prolongements et prennent une morphologie plus étalée et étoilée, suggérant que le phénotype astrocytaire se développe durant les 14 jours (figure

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Les CSN transduites avec la construction neuronale MAP2-mCherry quant à elles (figure 56) expriment le rapporteur rouge mCherry au même état basal (compris entre 5,2 et , % des cellules jusqu’au ème _{jour inclus (figure 56B). A partir du 10}ème _{jour, la}

quantité de cellules positives pour mCherry augmente significativement de 2,3 fois (p = 0,018), passant de 5,5 % (+/- 0,9) à 12,4 % (+/- 2). A la fin de la seconde semaine de mise en différenciation sans aucun facteur de croissance (-EGF ; -bFGF), la fraction de cellules exprimant le rapporteur fluorescent rouge augmente encore passant à 19,6 % (+/- 4), représentant une augmentation de 3,5 fois (p = 0,019) par rapport à la fin de la première semaine (figure 56B).

Figure 55 : Les CSN humaines expriment la construction GFAP-GFP dans des conditions de différenciation. (A) Photographies représentatives en contraste de phase et en fluorescence des CSN hNSC#5205 placées en milieu de différenciation favorisant l’apparition des astrocytes et des neurones, pendant 14 jours. La présence de signal GFP témoigne de l’activation du promoteur GFAP astrocytaire. Barres d’échelle = µm. (B) Quantification du pourcentage de cellules exprimant le rapporteur GFP dans le temps. L’EGF est retiré du milieu au jour 1 (-EGF) et le bFGF est retiré au jour 7 (-bFGF) ; Test T de Student apparié, p < 0,05 ; +/- SEM.

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Là encore, outre le pourcentage de cellules positives pour MAP2-mCherry, l’intensité de la fluorescence émise ainsi que la complexité et l’allongement des cellules mCherry + augmentent au fur et à mesure du temps (figure 56A).

Il est intéressant de remarquer que l’augmentation du nombre de cellules mCherry + dans les CSN MAP2-mCherry (figure 56), intervienne après le 7ème _{jour, simultanément à la}

stabilisation de l’expression de la GFP dans les CSN GFAP-GFP (figure 55). Ces résultats semblent démontrer une induction de la différenciation de manière chronologique et que le système iMESYS est capable de la détecter.

Figure 56 : Les CSN humaines expriment la construction MAP2-mCherry dans des conditions de différenciation. (A) Photographies représentatives en contraste de phase et en fluorescence des CSN hNSC#5205 placées en milieu de différenciation favorisant l’apparition des astrocytes et des neurones, pendant 14 jours. La présence de signal GFP témoigne de l’activation du promoteur GFAP astrocytaire. Barres d’échelle = µm. (B) Quantification du pourcentage de cellules exprimant le rapporteur GFP dans le temps. L’EGF est retiré du milieu au jour -EGF) et le bFGF est retiré au Jour 7 (-bFGF) ; Test T de Student apparié, p < 0,05 ; +/- SEM.

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