Régulation des CSG par la niche microenvironnementale

Les GBM sont des tumeurs infiltrantes et à forte prolifération, ce qui les fait rencontrer en permanence de nouveaux environnements au sein de la tumeur d’une part et dans le parenchyme cérébral d’autre part. Schonberg et collaborateurs décrivent la relation entre les CSG et leur microenvironnement comme symbiotique (Schonberg et al., 2014). La niche périvasculaire est un lieu privilégié pour le maintien des CSG, tout comme le sont les vaisseaux sanguins dans la régulation des CSN des niches neurogéniques adultes (figure

20a). L’existence de facteurs trophiques communs aux CSN et aux GSC telle que la sécrétion

de TGF- , S(( ou Wnt dans ces zones favoriserait leur implantation (figure 20). Néanmoins il n’est pas clair si ce sont les niches qui provoquent la naissance de CSG, ou si ces dernières apparues ailleurs dans le cerveau viennent détourner les niches vasculaires des CSN à leur avantage (Egeblad et al., 2010).

Des arguments ont démontré que les CSG positives pour CD133 et nestine sont capables d’orchestrer la mise en place de cellules endothéliales in vitro et in vivo en

11L’hypoxie entraine l’activation de la voie de ()F , entrainant des boucles autocrines et paracrines de

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interagissant physiquement avec elles. En retour, les cellules vasculaires sécrètent VEGF et EGF, favorisant l’autorenouvellement et la prolifération des CSG (figure 20b). )l a d’ailleurs été démontré que les mitogènes sécrétés par les cellules endothéliales maintiennent les CSG dans un état prolifératif et que le retrait de ces facteurs entraine leur apoptose (Galan-Moya et al., 2014). De manière intéressante, greffer des cellules endothéliales avec des CSG dans le cerveau de souris augmente drastiquement la population des CSG intra-tumorales. Inversement, bloquer la croissance des cellules endothéliales (avec des anticorps anti-VEGF, notamment le bevacizumab) diminue le ratio de prises de tumeurs à partir de CSG (Calabrese et al., 2007; Lathia et al., 2015; Schonberg et al., 2014).

Soumises aux contraintes de culture in vitro, les CSG forment des gliomasphères sécrétant leur propre matrice extracellulaire en 3 dimensions, comme par exemple de la laminine nécessaire à la survie des cellules (Lathia et al., 2010). Certaines études spéculent que les CSG tentent de reproduire leur microenvironnement natif, chaque sphère étant alors comparée à une mini-tumeur. Parmi les molécules formant la matrice extracellulaire, la ténascine-C (TNC), reconnue comme particulièrement surexprimée dans les glioblastomes (Nie et al., 2015) et associée à un mauvais pronostic (Shirahata et al., 2007), est sécrétée de manière endogène in vitro et in vivo dans les tumeurs. Elle y favorise la dispersion des CSG Figure 20 : Vues schématiques de la niche micro-environnementale et vasculaire des CSN et des CSG. (a) Les cellules souches neurales (NSC ou CSN) interagissent directement avec les épendymocytes (E), les cellules des vaisseaux (BV), les cellules de support (OC) et la matrice extra- cellulaire (ECM). (b) Les cellules souches de glioblastome (CSC ou CSG) sont au contact de vaisseaux sanguins aberrants TBV , de l’ECM et des autres cellules cancéreuses OGC . Flèches pointillées = échange de facteurs solubles et diffusibles ; flèches pleines = signaux d’autorenouvellement aberrants ; lignes pleines oranges = contact cellule-cellule. Adapté de Gilbertson R. et Rich J, Nature Reviews Cancer, 2007.

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dans des modèles de migration et de cicatrisation, sans affecter la prolifération. De même, une fois greffées dans le cerveau de souris, l’infiltration des cellules peut être inhibée par le KO de la TNC par shRNA (Hirata et al., 2009). Bien que les métalloprotéinases matricielles de types 2 et 9 (MMP2 et MMP9) soient régulièrement associées au mauvais pronostic des GBM, il semblerait que ce soit ici la collaboration de MMP et d’ADAM9 avec la TNC qui augmente l’agressivité et la migration des CSG in vitro et in vivo (Sarkar et al., 2006, 2015).

Une des interrogations récurrentes dans la culture de cellules souches est son mode d’expansion. Doit-on les cultiver sous forme de sphères fabricant leur propre matrice ou alors faut-il les faire pousser sur un substrat bidimensionnel ? Depuis quelques années se développent également des modes de culture utilisant des gels à base de collagène, de gélatine, de poly-éthylène-glycol ou de membranes de polystyrène microporeux redonnant aux cellules une architecture 3D pour se développer (Fernandez-Fuente et al., 2014; Pedron et al., 2013; Lee et al., 2006). Néanmoins les techniques originelles de neurosphères ou de culture 2D, les plus populaires, permettent de maintenir les CSG en leur donnant différents messages du microenvironnement qui favorisent la prolifération et l’autorenouvellement.

L’expansion de cellules souches sur substrat bidimensionnel utilise un protocole assez standardisé composé de poly-L-ornithine (ou de poly-L-lysine) et de laminine (ou de laminine seule . Les polymères d’ornithine et de lysine permettent de donner une base moléculaire architecturée complexe et d’augmenter les capacités d’adhésion des cellules qui prolifèrent en milieu sans sérum (Ge et al., 2015; Pollard et al., 2009; Sun et al., 2008). En revanche, la laminine, un élément prépondérant de la lame basale des vaisseaux sanguins dans les niches cérébrales (cf. paragraphe 2.3.3), est essentielle à la survie des cellules souches. De manière intéressante, la laminine soluble peut également être ajoutée aux cultures de neurosphères / gliomasphères pour augmenter la viabilité et la prolifération des cellules souches (Hall et al., 2008).

)l serait légitime de s’attendre à une différence de comportement ou de phénotype entre des CSG cultivées en conditions adhérentes et flottantes puisque l’accès à la matrice extracellulaire n’est pas le même. C’est ce que prône l’équipe de Peter Dirks, démontrant une plus grande homogénéité cellulaire dans les modes de cultures utilisant un substrat de poly- L-ornithine + laminine. Les cellules expriment systématiquement les marqueurs de cellules souches : nestine, Sox2, vimentine et CD44, mais entrent moins en apoptose (2,7 % en 2D et 6,5 % en sphères). De même, une proportion plus faible de cellules exprime des marqueurs de différenciation neurale (GFAP, Tuj-1 et O4) comparativement aux populations croissant

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en sphères, plus hétérogènes (Pollard et al., 2009). Pourtant, une étude très récente a démontré que les deux techniques présentent des résultats exactement similaires dans l’analyse de l’apoptose, la fréquence de clonogénicité, l’index de prolifération ou l’expression de marqueurs différenciant GFAP et Tuj-1 (Rahman et al., 2015). Les deux techniques ont donc leurs avantages et leurs inconvénients et permettent de maintenir des CSG, tout en sachant que les techniques de culture cellulaire ne reproduisent pas les phénomènes in vivo, mais tentent de s’en approcher.