MTP-NRP1 et MTP-PlexA1 ont des effets opposés sur la tumorigenèse des CSG

Afin d’étudier l’effet des peptides in vivo, nous avons greffé les CSG dans des modèles hétérotopiques et orthotopiques dans des souris immunodéprimées. Tout d’abord nous avons voulu exploiter le potentiel de MTP-NRP1 dans un modèle de greffe sous-cutanée avec des CSG constitutivement fluorescentes, afin de suivre la tumorigenèse et l’accroissement des tumeurs. Les CSG NCH644-mCherry ont été greffées en bilatéral dans le flanc de souris de manière à obtenir un côté avec des cellules prétraitées avec le peptide et l’autre côté avec des cellules traitées avec le véhicule seul (contrôle, figure 47A . L’acquisition de fluorescence sur les souris vivantes a été faite 5 jours après la greffe, permettant un compromis entre la possibilité de détection de fluorescence (masse tumorale suffisante) et la durée d’activité des peptides (au moins 72 heures (Popot et al., 2011; Nasarre et al., 2010)). Dans ces conditions, toutes les cellules prétraitées et greffées ont généré des tumeurs détectables (figure 47A, B) dans les souris.

Figure 47 : Le peptide MTP-NRP1 inhibe la croissance des tumeurs sous-cutanées de CSG (A) Photographies de fluorescence représentatives de la croissance des CSG nch644-mCherry après 5 jours. Le cercle blanc désigne la greffe de cellules prétraitées avec MTP-NRP1 et le cercle noir désigne la condition contrôle. (B) Nombre de souris portant des tumeurs (exprimé en pourcentage, 10 souris par groupe). (C) Quantification de la fluorescence des tumeurs dans chaque groupe, exprimée en photons par seconde. (D) Représentation du poids final des tumeurs exprimé en pourcentage de réduction par rapport au contrôle. Test T de Student, *p < 0,05. Moyennes +/- SEM.

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Cependant, on observe une diminution de l’intensité de fluorescence de - 24 % (p = 0,22), passant de 2,9.106 _{coups par seconde (cps, +/- 2,7.10}5_{) dans la condition contrôle à 2,3.10}6

cps (+/- 2,2.105_{) dans la condition traitée (figure 47C} . Cette différence qui n’atteint pas le

seuil statistique de significativité est en revanche associée à une diminution significative du poids des tumeurs (- 34 % ; p = 0,042 par rapport aux tumeurs contrôles, figure 47D). Nous avons ensuite décidé de greffer des cellules NCH644-mCherry traitées ou non avec le peptide ciblant NRP1, dans le striatum de souris immunodéprimées afin suivre la croissance de la tumeur durant 30 jours. Après 5 jours post-chirurgie, les souris ont fait l’objet de l’administration d’une dose de peptide MTP-NRP1 à 1 µg / Kg ou de contrôle LDS par injection intrapéritonéale, tous les 3 jours pendant 25 jours. A partir du 23ème _{jour, les}

tumeurs ont pu être détectées. Durant les derniers jours de l’expérience, comme le montre la figure 48A, les CSG du groupe contrôle forment des tumeurs grossissant exponentiellement, tandis que les souris traitées avec MTP-NRP1 ont des tumeurs dont l’accroissement est drastiquement diminué. L’analyse quantitative de fluorescence cumulée montre une forte réduction se traduisant par – 62 % de signal fluorescent moyen au 30ème

jour (passant de 9,7 unités arbitraires (UA) dans le groupe contrôle, à 3,7 UA dans le groupe ayant reçu le peptide ; p = 0,03) (figure 48B).

Figure 48 : Le peptide MTP-NRP1 inhibe la croissance des tumeurs intracérébrales issues de CSG (A) Photographies de fluorescence (CPS) de la croissance des nch644-mCherry aux 23è_{, 26}è _et 30è _{jours dans les 2 conditions. (B) Taux} d’accroissement cumulé des groupes contrôle et MTP-NRP1 aux J23, 26 et 30. Mann et whitney, p = 0,03. (C) Graphique en cascade de la variation de croissanceentre le jour 23 et le jour 30 des tumeurs de chaque souris traitée (barres grises) par rapport à la moyenne des contrôles (barre blanche).

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Les résultats présentés dans la figure 48C montrent le ralentissement de l’accroissement tumoral dans les souris du groupe traité avec le peptide. Ce mode de représentation dit « en cascade » permet d’illustrer la variation de croissance de la masse tumorale de chaque souris traitée (7 animaux ayant une tumeur détectable en fluorescence) entre le 23è _{et le 30}è jour, comparativement à la moyenne d’accroissement du groupe

contrôle. Il permet notamment de classer les souris en catégories de répondeuses au traitement selon une partie des critères de MacDonald 31 (Wen et al., 2010 ; Macdonald et al., 1990). Ainsi, 85 % des souris (6/7) sont en réponse partielle (RP - 100 < score < - 50) et 15 % (1/7) se retrouve dans la catégorie sans progression (SP) comprise entre – 50 % et + 25 % (figure 48C). La totalité de ces résultats démontrent une franche activité de MTP-NRP1 contre la prolifération des CSG in vitro et leur croissance tumorale in vivo.

Finalement, j’ai également procéder à l’analyse du peptide MTP-PlexA1 dans les mêmes conditions expérimentales. Pour cela nous avons procédé exactement selon le même protocole de greffes hétérotopiques sous-cutanées présenté précédemment. Ici, les CSG NCH644-mCherry ont été pré-incubées pendant 60 minutes avec du peptide MTP-PlexA1 à 10-7 M ou avec son contrôle LDS, avant d’être greffées en bilatéral dans des souris

immunodéprimées (figure 49A).

31 _{Critères de MacDonald : ces critères décrits pour la première fois en 1990 ont été remis à jour en 2010.}

Normalement basés sur des analyses CT, puis IRM, ils sont utilisés en clinique et maintenant en préclinique afin d’é aluer l’effi a ité des traite e ts da s les tumeurs cérébrales de haut grade. Ils se basent sur la taille en 2 dimensions des lésions et permettent de regrouper les individus en plusieurs classes selon la réponse au traitement. Progression tumorale (PR : score > 25 % ; Sans progression (SP : - 50 % < score < 25 %) ; Réponse partielle (RP : - 100 % < score < - 50 %) ; Réponse complète (RC : score = - . Les s ores so t asso iés à l’état clinique du patient (Wen et al., 2010).

Figure 49 : Le peptide MTP-PlexA1 bloque l’initiation des tumeurs sous-cutanées de CSG (A) Photographies de fluorescence représentatives de la croissance des CSG NCH644-mCherry après 5 jours. Le cercle blanc désigne la greffe de cellules prétraitées avec le peptide et le cercle noir désigne le contrôle. (B) Nombre de souris portant des tumeurs en % (10 souris par groupe). (C) Quantification de la fluorescence des tumeurs dans chaque groupe, exprimée en photons par seconde. Test T de Student ; **p = 0,008. Moyennes +/- SEM.

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Après jours de croissance, l’acquisition des images par fluorescence montre que 65 % des souris (14/20) du groupe contrôle présentent des tumeurs détectables pour seulement 5 souris sur 20 (25 %) dans le groupe traité avec le peptide anti-PlexA1 (figure

49B). Ce résultat suggère que MTP-PlexA1 est capable de perturber l’initiation de la

croissance tumorale (- 62 %, p = 0,008). De manière surprenante, la moyenne du signal de fluorescence émis par les 4 tumeurs ayant pu se développer (figure 49C) dans le groupe traité (7.104 _{CPS ; +/- 3,10}4_{) est similaire à celle des 14 tumeurs du groupe contrôle (5.10}4

CPS ; +/- 1,8.104 laissant penser qu’une fois la croissance démarrée, l’inhibition de Plexine-

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