Les mécanismes de la différenciation dans le temps et l’espace

Les CSN sont capables de former des neurosphères in vitro en condition de culture et de potentiellement pouvoir se différencier en l’une des trois lignées cellulaires fonctionnelles du système nerveux (figure 12), lorsqu’elles sont mises en conditions adhérentes avec sérum. Une CSN peut ainsi s’insérer dans deux voies de différenciation :

1. La voie neuronale permettant de donner des neurones.

2. La voie gliale qui permet de générer par des maturations distinctes, les deux types de cellules de la glie, à savoir les oligodendrocytes et les astrocytes.

La littérature dans le domaine de la différenciation in vitro et in vivo des cellules souches neurales est très riche. Les grands principes des vagues de différenciation successives ont été majoritairement décrits dans des modèles cellulaires murins, tandis que les avancées des dix dernières années se font de plus en plus dans des modèles humains, notamment grâce à l’accès de CSN primaires ou de CSN dérivées d’iPSC.

Figure 12 : Voies de différenciation classiques des CSN.

Les CSN s’autorenouvellent et peuvent donner naissance aux

trois types neuraux. En

s’engageant dans la voie

neuronale, elles donnent des

progéniteurs neuronaux qui

donneront naissance aux

neurones. En choisissant la voie gliale, elles génèrent des

progéniteurs gliaux se

transformant finalement soit en astrocyte, soit en oligodendrocyte. Les étapes intermédiaires de maturation des cellules ne sont pas représentées.

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Les nombreuses études visant à différencier des cellules souches de souris, de rat ou d’humain, convergent vers une même conclusion : la seule composition du milieu de culture peut pousser les CSN à se différencier de façon très inégale. Néanmoins, des standards existent. Parmi eux, il est possible de diminuer la concentration en facteurs de croissance (EGF et bFGF), voire de les supprimer totalement sans ajouter d’autres molécules favorisant la différenciation. Dans ce cas, les CSN sortent de leur cycle cellulaire, cessant de proliférer pour générer neurones, astrocytes et oligodendrocytes de manière complémentaire en suivant le destin intrinsèque de chaque CSN. Ce protocole peut être complété avec du sérum de veau fœtal SVF 6_{, dont la concentration ajoutée au milieu, habituellement située entre}

0,1 % et % impacte drastiquement l’orientation de la différenciation des CSN (Sauvageot and Stiles, 2002; Scully et al., 2012). D’autres protocoles de différenciation des cellules souches neurales ou de gliome permettent quant à eux d’orienter la différenciation en jouant sur l’ajout et/ou le retrait séquentiel de facteurs de croissances, vitamines et cytokines normalement impliquées dans les processus physiologiques (figure 13c). Les CNTF, BDNF, acide rétinoïque, forskoline, acide ascorbique, BMP ou bFGF… sont par exemple impliqués à des stades spécifiques du développement dans l’induction ou la maturation des cellules neurales (Glaser et al., 2007; Pollard et al., 2009; Ravin et al., 2008; Sun et al., 2008)

En conditions physiologiques, la libération régulée dans le temps et l’espace de ses informations extrinsèques contrôlent le comportement des CSN.

Lors de la corticogenèse, les trois types cellulaires apparaissent successivement.

Chez le rat, le neurogenèse débute à E12 et se termine durant la vie embryonnaire. L’astrocytogenèse, débutant un peu plus tard vers E14, est périnatale et se terminera après la naissance, tandis que l’oligodendrogenèse débute dans les tous derniers jours de vie prénatale, autour de E18-E20, pour se terminer plusieurs semaines après la naissance (figure 13a) (Qian et al., 2000; Sauvageot and Stiles, 2002; Temple, 2001).

En prélevant des CSN de cerveaux E10-E12, avant le début des vagues de différenciation, il est possible de reproduire exactement in vitro, les phénomènes

6Le sérum de veau fœtal SVF est largement employé en culture cellulaire car il représente un apport de

facteurs de croissances, d’hormones, de lipides, de vitamines et de molécules favorisant la croissance, la survie et l’adhérence des cellules, même si sa composition précise reste inconnue. La culture de cellules souches fait néanmoins exception en la matière, étant donné que la plupart des milieux de prolifération et d’expansion utilisés en sont dépourvus. Le SVF peut faire partie des suppléments de milieu de différenciation des cellules souches, apportant des facteurs de croissances et cytokines tels que EGF, FGF, NGF, PDGF, )GF, TGF… à des concentrations variées, favorisant l’activation de cascades de signalisation impliquées dans le choix du destin cellulaire (Brunner et al., 2010).

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physiologiques de différenciation observés in vivo (figure 13b). Pour cela, les CSN sont mises en condition de différenciation en retirant les facteurs de croissance EGF et bFGF, faisant apparaitre spontanément et chronologiquement, des neurones (positifs pour le marqueur Tuj-1), puis des astrocytes (positifs pour le marquage GFAP) et finalement des oligodendrocytes (révélés par marquage du ganglioside O4) (Qian et al., 2000; Sauvageot and Stiles, 2002).

Plus les CSN sont prélevées tardivement dans l’embryogenèse et plus elles perdent leur triple potentiel de différenciation en se restreignant dans les voies astrogliales puis oligodendrogliales (figure 13b). )l est donc indiqué d’utiliser des CSN les plus précoces, Figure 13 : Les progéniteurs neuraux suivent un développement séquentiel in vivo et in vitro. (a) La genèse des trois types cellulaires intervient chronologiquement dans le cortex cérébral. Chez le rat, il y a un pic de neurogenèse à E , d’astrocytogenèse vers E -P et d’oligodendrogenèse entre P et P17. (b) La culture in vitro mime la différenciation vue in vivo. Les cellules extraites à E12 donnent successivement des neurones, des astrocytes et des oligodendrocytes. Les cerveaux dissociés et mis en culture à différents temps de gestation donnent des cellules reflétant les phénomènes développementaux se déroulant au moment de la dissection. (b) La différenciation peut être induite par des facteurs de croissance. Néanmoins, la sensibilité aux facteurs change en fonction de l’âge de prélèvement des cellules. E = jour de vie embryonnaire post-conception ; P = jour de vie extra-utérine ; N = neurone ; A = astrocyte ; O = oligodendrocyte. Adapté de Sauvageot et al., Current opinion in Neurobiology, 2002.

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lorsqu’elles possèdent encore la capacité de répondre à tous les messages les engageant dans les trois voies cellulaires, si l’on souhaite conserver au maximum cette multipotence.