Validation du rapporteur iMESYS Tie2 mVenus pour l’analyse de la trans-différenciation

Dans des conditions spécifiques exposées précédemment, il a été décrit que certaines CSG sont capables de se transdifférencier en exprimant des marqueurs spécifiques des cellules vasculaires, comme les cellules endothéliales et entre autres le récepteur aux angiopoïétines : Tie-2.

Dans un premier temps, afin de valider la spécificité d’expression de construction iMESYS Tie2-mVenus dans des cellules endothéliales, j’ai utilisé la lignée (UVEC. Les cellules présentées dans la figure 62 ont subi un immunomarquage à la recherche de l’expression du Tie- . Comme l’on peut s’y attendre la totalité des cellules sont positives pour le marquage du récepteur qui apparaît nettement ponctiforme (figure 62A). Parallèlement, la recherche des marqueurs neuronaux et gliaux (contre MAP2, GFAP et CNP) ne montre aucun signal détectable. Ensuite, les cellules ont été transduites avec le vecteur viral contrôle GFP d’une part et les constructions iMESYS d’autre part, sans subir de sélection antibiotique postérieure. Après au moins heures, l’efficacité d’infection des cellules est évaluée à 42,4

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% en comptant le nombre de cellules GFP + (activation constitutive par le promoteur du CMV) par rapport au nombre total de cellules (figure 62D). La construction Tie2-mVenus quant à elle, s’exprime dans , % des cellules infectées, sans qu’aucun autre signal des autres rapporteurs neuraux ne soit détectable. Ceci montre que la construction Tie-2 semble bien s’induire dans des cellules HUVEC exprimant le marqueur protéique relié et que le système iMESYS neural ne s’active pas de manière non spécifique dans ces cellules.

Nous avons ensuite infecté des CSG NCH644 avec la construction Tie2-mVenus à une M.O.I = 3, puis sélectionnées à la zéocine. En se basant sur la capacité des CSG à se transdifférencier grâce à l’induction de facteurs de croissance des cellules endothéliales Figure 62 : Les cellules endothéliales humaines HUVEC expriment uniquement le rapporteur fluorescent iMESYS Tie2-mVenus. (A) Photos d’immunomarquages montrant l’expression ubiquitaire du récepteur Tie-2 et l’absence des marqueurs CNP, GFAP et MAP2 dans les HUVEC. (B) Photographies représentatives de l’infection des cellules avec les lentivirus iMESYS à une MO) = 3, sans sélection antibiotique. Panel du haut : infection avec le lentivirus contrôle CMV-GFP. Panel du bas : état d’expression des rapporteurs fluorescents iMESYS. (C) Quantification de l’expression des rapporteurs fluorescents exposés en (B). Barres d’échelle = µm.

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comme le VEGF, j’ai placé les NC( -Tie2-mVenus dans plusieurs conditions de culture ou de différenciation dans le matrigel pendant 7 jours (figure 63). La construction Tie2- mVenus ne s’induit pas dans la condition témoin au temps de l’expérience figure 63A). Les cellules ont été placées dans 3 milieux différents. Après 7 jours de croissance, les CSG cultivées dans le milieu de culture d’expansion des CSG sans sérum figure 63B), présentent une fluorescence mVenus extrêmement faible, ce qui est validé par l’absence de marquage anti-Tie2. Par contre, on peut noter une apparition de l’induction de mVenus dans le milieu de différenciation avec , % de sérum, accompagnée de l’expression du récepteur faiblement détecté par immunocytochimie. L’induction de mVenus est beaucoup plus forte dans le milieu de culture conditionné des cellules endothéliales contenant entre autres 10 % de sérum de veau, du bFGF et du VEGF. Ce résultat est cohérent avec l’expression plus élevée de Tie-2 révélée par immunofluorescence. Finalement la construction Tie2-mVenus paraît s’activer spécifiquement dans les cellules exprimant le récepteur, démontrant une probable transdifférenciation des CSG NCH644 dans des conditions de différenciation avec sérum, qui peut être amplifiée dans un milieu contenant des facteurs pro-angiogéniques.

(A) CSG NCH644-Tie2-

mCherry déposées dans le matrigel au jour 0 dans du milieu de culture sans

sérum. (B) Photos en

contraste de phase

(gauche), de mVenus en fluorescence (milieu) et des immunomarquages anti Tie- 2 (rouge) sur les NCH644

après 7 jours de

différenciation dans le matrigel. Panel du haut : matrigel + milieu de culture des cellules souches. Panel du milieu : matrigel + milieu de différenciation avec 0,5 % de sérum. Panel du bas : milieu de culture des cellules HUVEC avec 10 % de sérum, enrichi en bFGF et VEGF. Barres d’échelle = 0 µm. Figure 63 : Les cellules NCH644-Tie2- mCherry se transdifférencient et expriment le rapporteur fluorescent mVenus dans le matrigel après 7 jours.

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DISCUSSION ET PERSPECTIVES

Les glioblastomes représentent aujourd’hui les tumeurs cérébrales primaires les plus fréquentes et les plus agressives, soit 25 % de toutes les tumeurs du système nerveux central. Ils sont caractérisés par une très grande hétérogénéité inter-tumorale mais également intra-tumorale, les rendant particulièrement difficiles à contrer. En effet de nombreuses sous-populations cellulaires présentes dans la tumeur ont des profils d’expression moléculaire et des sensibilités aux traitements différents. Parmi ces cellules, les CSG sont très résistantes aux drogues, capables de se différencier et de s’autorenouveler. Le traitement de première ligne actuel, le protocole de Stupp (chirurgie + radio- chimiothérapie ne permet d’obtenir qu’un gain de survie de moins (Stupp et al., 2005), avec un impact très limité sur les CSG. De plus, le GBM a un fort pouvoir récidivant, généralement dans la cavité chirurgicale ou à sa proximité (Ogura et al., 2013). Il a été montré que les CSG font partie du foyer de la récidive, capables de se camoufler et de résister aux traitements, elles se réactivent pour générer une nouvelle tumeur. Elles sont relativement indifférenciées et partagent des caractéristiques communes avec les CSN, comme l’autorenouvellement, ou la capacité de différenciation en cellules exprimant les marqueurs classique des trois lignages neuraux (Vescovi et al., 2006). Par contre, seules les CSG seraient capables de se trans-différencier en cellules de type vasculaire dans certaines conditions (Scully et al., 2012; Ricci-Vitiani et al., 2010) ou d’initier des tumeurs après leur greffe dans des souris.

Dans ce contexte, mes travaux ont consisté : 1) à produire et caractériser des CSG, (2) évaluer l’impact de peptides transmembranaires inhibiteurs des récepteurs neuropiline-1 ou plexin-A1 développés au laboratoire, (3) et mettre au point un système inductible d’expression de rapporteurs fluorescents multiples permettant de suivre le statut de différenciation des CSG.