2.1 Cellules souches neurales
Une lignée primaire de cellules souches neurales humaines (CSNh) hNSC#5250 a été obtenue grâce à l’aimable collaboration avec le laboratoire de biologie des cellules souches et du développement de Peter Dirks (The Hospital for Sick Children, Toronto, Canada). Ces cellules sont dérivées à partir du tissu nerveux d’embryons humains âgés entre les stades 19
20Le CREMEAS est agréé par le Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche et se compose de
chercheurs, personnels d’animalerie, vétérinaires, personnels non chercheurs menant des expériences sur animaux et personnes extérieures à la recherche impliquées dans la cause animale.
21 Directive 2010/63/UE du parlement européen et du conseil. Ce texte encadre les règlements de
protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et son respect est imposé en France par la Loi du 7 février 2013.
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et 22 de Carnegie22récupérés à la suite d’interruption volontaire de grossesse avec
consentement éclairé de la mère.
Les cellules hNSC#5250 sont cultivées en 2 dimensions dans un milieu spécifique MC5250 (tableau 2) en flacon T ou boîte de culture cm Primaria®, recouverte d’une première couche de 10 µg/mL de poly-L-ornithine et d’une seconde couche de µg/mL de laminine. Le milieu de culture est changé tous les 3 jours et les cellules sont repiquées lorsqu’elles atteignent % de confluence en utilisant de l’accutase Stem Cell Technologies) pendant 3 minutes. Le milieu est changé le lendemain puis tous les 3 jours.
2.2 Cellules souches de glioblastome
2.2.1 Culture de lignée de cellules souches de glioblastome
Nous avons obtenu en collaboration avec le professeur Christel Herold-Mende (Université de Heidelberg, Heidelberg, Allemagne) deux lignées de cellules souches de glioblastome : NCH644 et NCH421k. Ces dernières présentant un cycle de mitose de plusieurs jours n’ont pas été retenues comme modèle principal car elles ne permettaient pas de générer les grandes quantités de matériel biologique nécessaires à cette d’étude. La lignée NCH quant à elle, décrite précédemment par les chercheurs de l’équipe de Christel Herold-Mende (Campos et al., 2010; Podergajs et al., 2013) a un temps de doublement d’environ jour. C’est pourquoi j’ai opté pour cette lignée comme modèle d’étude principale. Son mode de culture est basé sur la technique de culture des neurosphères décrite par Weiss et Reynolds en 1992 (Reynolds and Weiss, 1992), permettant dans ce cas d’obtenir des gliomasères (figure 28). Brièvement les cellules sont cultivées dans des flasques traitées non adhérentes, dans un milieu de culture sans sérum et enrichi en EGF et bFGF (MCCS ; tableau 2). Tous les 3-4 jours, les cellules sont repiquées, en dissociant mécaniquement les sphères à la pipette P200.
Les modèles de xénogreffe de CSG dans les souris exigent de pouvoir visualiser ces cellules à tout moment, c’est pourquoi j’ai également développé des lignées fluorescentes vertes (CMV-GFP) et rouges (CMV-mCherry). Afin d’obtenir une fluorescence constitutive, j’ai inséré par transduction lentivirale (Mission® Lentiviral Control, Sigma, cf. paragraphe 5.2.1) les constructions comprenant les séquences d’ADN des protéines GFP 23 ou
22 Les stades de Carnegie, ou stades de développement embryonnaires sont définis selon la corrélation de
l’âge, de la taille et des caractéristiques morphologiques. Les semaines de la période de vie embryonnaire sont ainsi décomposées en 23 stades de Carnegie. Ici, le stade 19 correspond au 46ème jour
et stade 22 au 53ème jour de développement embryonnaire. 23 GFP : Protéine verte fluorescente. Ex = 488 nm / Em = 507 nm.
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mCherry24. Ces cellules ont été infectées avec des lentivirus à une M.O.I 25 = 3 pendant 48
heures puis sélectionnées avec 1 µg/mL de puromycine pendant tout leur temps de maintien en culture.
2.2.2 Dérivation de cellules souches tumorales à partir de glioblastome
Afin de compléter la collection de CSG, les lignées adhérentes de glioblastome humain U373MG, U87MG, U118MG (ATCC BioServices) ont été dérivées en cultures de cellules souches tumorales en les plaçant dans du MCCS (tableau 2) après les avoir détachées avec une solution de trypsine 0,05% + EDTA 1x (Life Technologies) pendant 5 à 10 minutes. Seules les cellules U373MG et U118MG ont pu être dérivées, tandis que les cellules U87MG ne permettent pas de générer de culture de CSG dans ce milieu MCCS.
De même dans le cadre d’un partenariat avec le service de neurochirurgie de l’hôpital de Hautepierre (CHRU de Strasbourg), nous avons obtenu des biopsies de glioblastomes de patients que nous avons également dérivées en lignées cellulaires adhérentes. Ces cellules sont d’abord maintenues pendant cinq passages avant d’être détachées avec une solution de trypsine 0,05% + EDTA 1x (Life Technologies) et placées en MCCS afin de débuter le processus de dérivation en cellules souches. Dans ce cas, le MCCS sans sérum, permet de sélectionner et d’amplifier les seules cellules souches répondeuses à ce cocktail (Tropepe et al., 1999). Néanmoins, la réussite de ce protocole est dépendante de chaque biopsie, de sa zone de prélèvement dans la tumeur et de la faible portion de CSG au sein des glioblastomes qui en est général inférieure à 1% de la masse tumorale globale (Wan et al., 2010a).
24 mCherry : Protéine rouge fluorescente en conformation monomérique. Ex = 587 nm / Em = 610 nm. 25 M.O.I : Multiplicity Of )nfection Multiplicité d’infection correspond au nombre de vecteurs lentiviraux
apportées par cellule. Cette valeur est susceptible de changer en fonction du type de cellules à infecter. Il est néanmoins préférable d’avoir une MO) la plus faible possible pour ne pas déséquilibrer l’expression du génome de la cellule hôte.
Figure 28 : Divisions des cellules initiales de cellules souches de glioblastome cultivées en condition de neurosphères. Photographies en contraste de phase prises à différents temps de la culture in vitro. Une cellule unique (photo de gauche) génère après 7 jours une neurosphère d’environ µm de diamètre. Barre d’échelle = µm.
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2.3 Cultures de cellules neuronales et endothéliales
Les cellules neuronales (SHS-Y5Y) et endothéliales (HUVEC) utilisées dans cette étude ont toutes été cultivées dans des flasques T75 à bouchon ventilé ou dans des boites de Petri 10 cm (BD Falcon). Tous les 3-4 jours, le milieu est changé. Une fois par semaine les cellules sont repiquées si elles atteignent 80-90 % de confluence en les détachant avec une solution de trypsine 0,05% + EDTA 1x (Life Technologies). Les cellules SHS-Y5Y sont cultivées dans un milieu adapté MCSH (tableau 2) supplémenté en acide rétinoïque à 10 µM, et les cellules HUVEC (PromoCell ; C-12200) dans un kit de milieu de culture des cellules endothéliales (PromoCell ; C-22110).