Transduction de cellules souches par vecteurs viraux

Cette technique se base sur la capacité naturelle des virus à infecter les cellules hôtes, libérer leur matériel génétique pour se reproduire. Leur utilisation comme vecteur a été rendue possible en biologie moléculaire par la neutralisation des séquences codantes

Figure 24 : Schéma de la transfection par des polyéthylènimines (PEI). L’ADN,

chargé négativement forme des

complexes avec les polymères

cationiques de PEI pour pénétrer les membranes cellulaires. L’ADN est libéré dans cellule puis atteint le noyau. Adapté de Nowakowski et al., Acta Neuroblio. Exp., 2013.

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pathogènes ou à forte activité de recombinaison. Pour certains types de virus naturellement très virulents, leur utilisation sous forme de vecteur nécessite de séparer les séquences virales en plusieurs plasmides afin d’éviter les recombinaisons qui les rendraient hors de contrôle. Ces manipulations génétiques ont permis de rendre l’utilisation des vecteurs viraux plutôt sûre, si bien qu’un niveau )) de confinement suffit17_{. Les vecteurs viraux sont}

intéressants en particulier pour leur intégration du génome à l’ADN de l’hôte (figure 25). L’intégration du matériel génétique lui permet d’être exprimé sur le long terme par une cellule et sa descendance (Nowakowski et al., 2013). Sur ce point, les virus Sendai et les adénovirus sont non intégratifs (figure 25), mais très utilisés en thérapie génique (Nakanishi and Otsu, 2012).

Parmi les vecteurs viraux intégratifs utilisés, on trouve les rétrovirus, qui comprennent la sous-classe des lentivirus et les virus adéno-associés (AAV, qui ne seront pas développés ici).

17 _{Le niveau de confinement L2 ou supérieur est recommandé pour la manipulation de vecteurs viraux de}

la classe HIV- , MLV ou S)V… D’après le cahier de prévention des risques biologiques du CNRS .

Figure 25 : Schéma du fonctionnement de l’infection par des vecteurs viraux. Les vecteurs viraux sont intégratifs ou non-intégratifs. Après reconnaissance des protéines de surface de la cellule hôte, le virus entre et le contenu de la capside est libéré dans la cellule. Les virus intégratifs adressent leur matériel génétique dans le noyau où il est intégré aléatoirement au génome de l’hôte. Le matériel génétique des virus non-intégratifs reste dans le cytoplasme sous forme épisomale. Adapté de Nowakowski et al., Acta Neuroblio. Exp., 2013.

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Les rétrovirus se composent d’une enveloppe lipidique renfermant une capside articulée autour d’un double brin d’ARN viral et d’une transcriptase inverse (figure 26). L’ARN libéré dans la cellule est rétro-transcrit en ADN, puis intégré au génome de l’hôte par des intégrases. C’est à la fois un avantage car l’ADN est définitivement inséré, mais aussi un inconvénient puisque cela se fait aléatoirement, créant des mutations potentiellement délétères. L’enveloppe contient des glycoprotéines de fixation aux récepteurs des hôtes, en faisant la clef du tropisme pour les cellules eucaryotes. Par exemple, le HIV-1 reconnait spécifiquement le récepteur CD des cellules immunitaires et ne peut donc qu’infecter ces cellules (Dalgleish et al., 1984). Néanmoins, les rétrovirus ne peuvent infecter que les cellules en division quel que soit leur pseudotypage 18_{. Toutes les cellules neurales post-}

mitotiques ainsi qu’un grand nombre de cellules souches quiescentes ne peuvent donc pas être infectées (Nowakowski et al., 2013). En revanche, les cellules qui peuvent être infectées le sont très efficacement, mais leur expression sur le long terme demeure labile, due à la méthylation des séquences virales (Challita and Kohn, 1994).

18Le pseudotypage d’un virus consiste à remplacer ses glycoprotéines de surface par d’autres issues

d’autres virus, afin d’augmenter généralement son tropisme (Schambach et al., 2013).

Figure 26 : Représentation schématique de la structure d’un rétrovirus (incluant les lentivirus). La capside virale est entourée d’une membrane lipidique. Le matériel génétique est embarqué sous forme d’ARN positif double brin. Le diamètre du virion est compris entre et nm selon la nature du rétrovirus. Adapté de Rodrigues A. et al., Viral Gene Therapy, 2011.

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Pour plusieurs de ces raisons, les lentivirus (figure 26) ont pris de plus en plus de place dans les protocoles de transduction de matériel génétique. Sa biologie est similaire aux autres rétrovirus, à quelques exceptions prêtes. Il peut non seulement empaqueter environ 1000 paires de bases de plus que les rétrovirus portant à environ 9 kb l’ARN total mais également infecter les cellules qui ne sont pas en cours de division (Cai and Mikkelsen, 2016; Canté-Barrett et al., 2016). La taille du génome viral est certes plus élevée que pour les rétrovirus, mais les plus grandes constructions ne peuvent malgré tout pas être prises en charge. En fait, il a été établi que l’efficacité de fabrication des virions ainsi que leur intégration dans les cellules ciblées est en rapport direct avec la taille de l’ARN à empaqueter. Les séquences comprises entre environ 4000 et 6000 paires de bases depuis le ’LTR jusqu’au ’LTR sont facilement acceptées et représentent les meilleures efficacités. Tandis que des séquences plus grosses, jusqu’à 9 paires de bases, entrainent une baisse de production des vecteurs de 16 fois (Canté-Barrett et al., 2016). La plupart des vecteurs lentiviraux ont été pseudotypés avec la glycoprotéine-G du virus de la stomatite vésiculaire (VSV-G) permettant ainsi d’infecter un très large panel de cellules dont les CSN (Falk et al., 2002) et les CSG (Walker and Hjelmeland, 2014). Une étude intéressante a même démontré qu’il était possible de cibler sélectivement des CSG exprimant CD133 en greffant, sur les protéines de capsides des lentivirus, un anticorps reconnaissant la protéine CD133 (Bayin et al., 2014).

Dans un souci de sécurité biologique, (comme énoncé en introduction de cette partie, et largement précisé dans le paragraphe 4.3 des matériels et méthodes) les séquences nucléotidiques complètes des vecteurs lentiviraux sont réparties en 4 plasmides. Le premier comporte l’ARN viral génomique, tandis que les 3 autres portent respectivement les séquences des protéines d’architecture capsidique GAG-POL), une séquence d’aide à l’export nucléaire de l’ARN génomique Rev et la séquence du pseudotypage d’enveloppe (ici: VSV-G) (Schambach et al., 2013).

4.1.3 Système d’édition du génome CRISPR/Cas9

Le système CRISPR-Cas9 est connu depuis la fin des années 1980 pour être le système immunitaire de certaines bactéries (Jinek et al., 2012). En 2012, il a été détourné à des fins biotechnologiques dans les cellules eucaryotes. C’est donc une technique toute récente qui ne cesse d’évoluer et dont les applications d’édition du génome, d’excisions, de

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délétions, de coupures simple ou double brin et d’étiquetage révolutionnent petit à petit les principes et les protocoles (Doudna and Charpentier, 2014).

Le principe se base sur un ARN guide, complémentaire de la séquence d’ADN d’intérêt enchâssé dans une endonucléase Cas9 agissant au centre de l’ADN reconnu. Cas9 étant une protéine d’origine procaryote, elle nécessite d’être insérée dans les cellules cibles pour agir par la suite. Bien que l’efficacité et la facilité d’action revendiquées par ce système soient plus élevées que toutes les autres techniques existantes, il reste donc conditionné par le succès de la transduction de Cas9 conjointement à celle de l’ARN guide (Gilbert et al., 2013). Cette technique semble cependant très efficace pour la transduction et la modification du génome des CSG (Toledo et al., 2015).