Validation du panel de référence en condition de flux laminaire

De manière physiologique, les cellules endothéliales sont constamment soumises à un flux sanguin et leur biologie est fortement impactée par les signaux transmis par les multiples récepteurs aux forces de cisaillement qu’elles expriment à leur surface (Davies, 1995). Or, les microarrays ainsi que les validations par TLDA ont été effectués en cultivant les cellules en condition statique. Nous avons donc réalisé des expériences complémentaires avec des cellules endothéliales soumises à un flux laminaire pour explorer l’effet de la température dans ces conditions.

Dans un premier temps, nous avons vérifié que le système permettant de cultiver les cellules endothéliales en flux modulait correctement les gènes connus pour être induits par les forces de cisaillement (Cf. Annexe I, Tableau 21). Pour cela, nous nous sommes appuyés sur les travaux de Wasserman et al. (Wasserman et al., 2002) et de Chien Shu et al. (Chien Shu, Li Song and Shyy John Y-J., 1998) qui ont identifié plusieurs gènes modulés par les forces de cisaillement (à 10 dyn.cm²). Parmi eux, nous en avons sélectionné 28, appartenant à différentes familles et différentes voies de signalisation (Tableau 16), pour vérifier que les expressions géniques obtenues dans nos conditions de flux coïncidaient bien avec les données publiées.

Page | 84 TABLEAU 16 : PANEL DE GÈNES RÉGULÉS PAR LES FORCES DE CISAILLEMENT D’APRÈS WASSERMAN ET AL. ET CHIEN SHU ET AL.

28 gènes ont été sélectionnés pour vérifier l’impact des conditions de flux sur leur expression. Ces gènes font partie de plusieurs familles (facteurs de croissance, prostaglandines) et sont impliqués dans différentes fonctions cellulaires (vasomodulation, adhérence, inflammation, coagulation, stress cellulaire).

Après 24h en condition de flux, 71% des gènes présélectionnés sont modulés en réponse aux forces de cisaillement conformément aux données de la littérature (Cf. Annexe II, Tableau 24). Sur ces mêmes gènes, nous avons étudié l’effet de la température et nous avons constaté que la majorité d’entre eux n’était pas modulés à 40°C (Cf. Annexe II, Tableau 24 et Figure 33), validant nos conditions de flux et confirmant également la spécificité de la réponse cellulaire à la température.

Page | 85 FIGURE 33 : LES GÈNES MODULÉS PAR LES FORCES DE CISAILLEMENT NE SONT PAS MODULÉS PAR LA TEMPÉRATURE. Les HCAEC ont été cultivées en condition statique ou en condition de flux laminaire (10 dyn.cm²) pendant 24h puis soumises à 37°C ou à 40°C pendant 6h. Leurs ARN totaux ont été extraits et l’expression de plusieurs gènes a été étudiée par TLDA. Les résultats sont exprimés en – Delta (Ct) en fonction des conditions de culture (statique ou flux) où chaque point représente une expérience. Les résultats ont été obtenus sur une moyenne de 3 expériences +/- SEM. *P<0.05 et **P<0.01 entre les groupes indiqués.

Nous avons ensuite constaté que les gènes induits par la température en condition statique étaient également induits par la température en condition de flux (Cf. Annexe II, Tableau 23). Les gènes qui étaient sur-exprimés en condition statique à 40°C le sont davantage en condition de flux (Figure 34A) et inversement pour les gènes qui étaient sous-exprimés (Figure 34B).

Page | 86 FIGURE 34 : LE FLUX EXACERBE LES DIFFÉRENCES D'EXPRESSION GÉNIQUE EN RÉPONSE À UNE AUGMENTATION DE TEMPÉRATURE.

Les HCAEC ont été cultivées en condition statique ou en condition de flux laminaire (10 dyn.cm²) pendant 24h puis soumises à 37°C ou à 40°C pendant 6h. Leurs ARN totaux ont été extraits et l’expression de plusieurs gènes a été étudiée par TLDA. Chaque valeur d’expression obtenue à 40°C a été normalisée avec celle obtenue à 37°C, en condition statique ou en condition de flux. Les résultats sont donc exprimés en facteur d’induction en fonction des conditions de culture (statique ou flux) pour chaque gène. (A) Gènes dont l’expression est augmentée à 40°C. (B) Gènes dont l’expression est diminuée à 40°C. Les résultats ont été obtenus sur une moyenne de 3 expériences +/- SEM.

Page | 87 Parmi les gènes validés et modulés par la température en condition de flux, nous retrouvons à nouveau les gènes régulés par HSF1 et ERN1. Nous remarquons également que les gènes impliqués dans la voie de signalisation mTORC1, non modulés en condition statique, le sont en condition de flux (notamment CACYBP, CORO1A, IDI1 et STARD4), suggérant une implication de cette voie dans la réponse cellulaire à la température et validant les prédictions établies par le logiciel IPA. Il en est de même pour les gènes impliqués dans l’adhérence (notamment CCL2 et SELE), dont l’expression est modulée en flux à 40°C (Cf. Annexe II, Tableau 23).

L’ensemble de ces données consolident le fait que dans des conditions plus physiologiques et en réponse à une augmentation de température, les expressions géniques sont modulées dans le même sens qu’en condition statique, excepté pour mTORC1 où les gènes sont quasi uniquement induits en condition de flux. Néanmoins, par praticité technique, les expériences suivantes ont été majoritairement réalisées en condition statique.

Combinés ensemble, les résultats d’expression génique obtenus en statique et en flux suggèrent une implication des régulateurs HSF1 et ERN1 dans la réponse déclenchée par les HCAEC suite à une augmentation de la température. Ces deux régulateurs ainsi que les voies de signalisation sous-jacentes seront donc étudiés en détail dans les prochains chapitres, tout comme la voie de signalisation mTORC1 qui semble également être impliquée, notamment lorsque les HCAEC sont soumises à des forces de cisaillement.

En ce qui concerne les gènes impliqués dans l’adhérence endothéliale, leur expression diminue, notamment en condition de flux. Ces résultats suggèrent donc une possible diminution de l’adhérence à 40°C. Cette hypothèse a donc été étudiée en partie II des Résultats.

Suite aux différentes données obtenues en condition statique et en flux, nous avons pris la décision de retirer du panel de référence tous les gènes n’étant pas validés dans les deux conditions de culture. Dans la suite de l’étude, ce panel de 42 gènes a donc été réduit à 26 gènes.