Implication de la voie de signalisation eNOS

La dysfonction endothéliale est caractérisée par une vasodilatation endothélium-dépendante perturbée, une biodisponibilité réduite de monoxyde d’azote (NO) et, de manière plus générale, une altération de la voie de signalisation de la NO synthase (eNOS), responsable de ces deux mécanismes. C’est pourquoi, pour compléter nos résultats d’un point de vue fonctionnel, nous avons décidé d’étudier l’impact d’une augmentation de température sur cette voie de signalisation. De plus, l’identification de cette voie dans l’analyse bio-informatique de nos microarrays nous a conforté dans l’idée qu’elle pouvait être impactée par la température (Figure 57).

Page | 118 FIGURE 57 : VOIE DE SIGNALISATION ENOS PRÉDITE POUR ÊTRE IMPLIQUÉE DANS LA RÉPONSE CELLULAIRE À LA TEMPÉRATURE.

Les 581 gènes différentiellement modulés par la température à 6h ont été intégrées dans le logiciel IPA, permettant de mettre en évidence la voie de signalisation eNOS. Les gènes différentiellement exprimés au sein de cette voie de signalisation sont annotés en rouge lorsque leur expression est augmentée en réponse à la température ou en vert, lorsque leur expression est diminuée.

Cette voie est activée par les forces de cisaillement appliquées à la surface des cellules endothéliales (Chistiakov, Orekhov and Bobryshev, 2017) et la phosphorylation de la protéine eNOS est un marqueur d’activation de cette voie de signalisation. C’est pourquoi nous avons vérifié, dans un premier temps, que nos conditions de culture permettaient de détecter une activation de la voie eNOS dans les HCAEC (Figure 58).

Page | 119 FIGURE 58 : LA PHOSPHORYLATION DE LA PROTÉINE ENOS AUGMENTE DE MANIÈRE CONCOMITANTE À L'AUGMENTATION DES FORCES DE CISAILLEMENT.

Les HCAEC ont été cultivées pendant 48h en condition de flux laminaire à 0.5 dyn.cm², 2 dyn.cm² ou 10 dyn.cm². L’expression des protéines p-eNOS, eNOS et β-actine a été quantifiée par western blot à partir de 9 µg de protéines ayant migré sur un gel « NuPAGE™ Bis-Tris 4-12% » et ayant été transférés sur une membrane PVDF 0,2 µm. L’expression des protéines p-eNOS et eNOS a été normalisée à celle de la β-actine pour s’affranchir des possibles écarts de dépôts puis le rapport de ces deux expressions a permis d’établir une quantification p-eNOS/eNOS en fonction des forces de cisaillement. Les résultats ont été obtenus sur une moyenne de 3 expériences +/- SEM. *P<0.05 et **P<0.01 entre les groupes indiqués.

La phosphorylation de la protéine eNOS augmente de manière concomitante avec l’augmentation des forces de cisaillement, suggérant une activation de la voie eNOS en condition de flux physiologique (10 dyn.cm²).

Étant capable de visualiser une activation de la voie de signalisation eNOS dans les HCAEC, nous nous sommes intéressés, dans un second temps, à l’activation de cette voie en réponse à la température. Cependant, étant donné que nos expériences de microarray ont été réalisées en condition statique, nous avons décidé de conserver ces mêmes conditions de culture pour étudier l’effet de la température sur la phosphorylation de la eNOS (Figure 59).

Page | 120 FIGURE 59 : LA TEMPÉRATURE N'A PAS D'EFFET SUR LA PHOSPHORYLATION DE LA PROTÉINE ENOS.

Les HCAEC ont été cultivées à 37°C ou à 40°C pendant 15 minutes, 30 minutes, 1h, 2h ou 4h. L’expression des protéines p-eNOS, eNOS et β-actine a été quantifiée par western blot à partir de 9 µg de protéines ayant migré sur un gel « NuPAGE™ Tris-Acetate 3-8% » et ayant été transférés sur une membrane PVDF 0,2 µm. L’expression des protéines p-eNOS et eNOS a été normalisée à celle de la β-actine pour s’affranchir des possibles écarts de dépôts puis le rapport de ces deux expressions a permis d’établir une quantification p-eNOS/eNOS en fonction de la température et du temps d’incubation des HCAEC à chaque température. Les valeurs obtenues à 40°C ont ensuite été normalisées avec celles obtenues à 37°C. Les résultats ont été obtenus sur une moyenne de 3 expériences +/- SEM.

Aucune différence significative de phosphorylation n’a été observée entre 37°C et 40°C, suggérant que la température n’a pas d’effet sur l’activation de la protéine eNOS en condition statique.

Pour compléter ces données, nous avons ensuite utilisé l’ADMA (Asymmetric DiMethylArginine) (Vallance Patrick and Leiper James, 2004; Böger, 2007) qui induit un découplage de la NOS entrainant la production d’espèces radicalaires. Parmi les 26 gènes du panel, seul le gène BDKRB2, codant pour le récepteur B2 de la bradykinine, semble être modulé par l’ADMA (Cf. Annexe II, Tableau 29). Tous les autres gènes ont une expression qui ne varie pas en réponse à l’ADMA. Ces résultats, encore préliminaires, ne semblent pas indiquer la mobilisation de la voie de signalisation eNOS en réponse à la température mais d’autres expériences nous permettant de mesurer directement le NO seraient nécessaires.

Pour ce faire, parallèlement à ces expériences et en collaboration avec l’équipe de pharmacologie de Sanofi, nous avons réalisé des expériences sur des artères iliaques de rat soumises à différentes températures. Nous avons tout d’abord induit une contraction de ces vaisseaux avec de la phényléphrine, puis nous avons ajouté des doses croissantes d’acétylcholine, pour entrainer leur relaxation (Figure 60).

Page | 121 FIGURE 60 : LA TEMPÉRATURE N’A PAS D’EFFET SUR LA RELAXATION DES ARTÈRES ILIAQUES DE RATS.

Les artères iliaques de rats mâles Wistar Han ont été placées dans des cuves d’organes isolés remplies d’une solution de Krebs à 37°C ou à 40°C pendant 4h. À la suite de cette incubation, les artères ont été soumises à une solution de phényléphrine (10-6 M) afin d’obtenir une contraction maximale des vaisseaux. Ces derniers ont ensuite été soumis à des concentrations croissantes d’acétylcholine (de 10-10 M à 10-5 M) toutes les deux minutes pour induire une vasorelaxation. Les données de cette expérience ont été enregistrées à l’aide du logiciel lox2 (EMKA Technologies®) et l’analyse a ensuite été effectuée avec le logiciel Datanalyst (EMKA Technologies®). Les résultats sont exprimés en pourcentage de relaxation à la phényléphrine en fonction de la concentration en acétylcholine et ont été obtenus sur 2 expériences (+/- SEM).

Aucune différence de relaxation n’a été observée entre 37°C et 40°C, suggérant que la température ne semble pas impacter la vasodilatation de ces vaisseaux sanguins. Néanmoins, il est à noter que ces résultats ont été obtenus après 4h d’incubation à chaque température. Il serait donc nécessaire de reproduire ces expériences avec une durée d’incubation de 6h à chaque température afin d’être en accord avec l’ensemble des résultats obtenus précédemment et laisser le temps aux cellules de mettre en place les différentes voies de signalisation ainsi que la transcription des gènes intervenants dans la réponse endothéliale à la température.

Par ces résultats fonctionnels, nous avons montré que la perméabilité des cellules endothéliales est augmentée en condition d’hyperthermie modérée mais cela ne s’accompagne pas d’un phénotype plus permissif au recrutement et au passage des leucocytes. Concernant la voie de signalisation eNOS, impliquée dans le maintien de la fonction endothéliale, elle ne semble pas être impliquée dans la réponse endothéliale à la température en condition statique. Néanmoins, il est encore difficile de tirer une conclusion définitive car les expériences réalisées sont encore majoritairement préliminaires et des expériences complémentaires sont nécessaires pour compléter l’étude de cette voie de

10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 -20 0 20 40 60 80 100 Concentration en Ach [M] % d e re la xa ti o n à la p h én yl é p h ri n e ( 1 µ M ) 37°C 40°C

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