III. Mesure de l’expression protéique
III.1. Le Western Blot
Le western blot est une technique permettant d’identifier et de quantifier la quantité d’une ou plusieurs protéines spécifiques dans un échantillon. Elle s’appuie sur une électrophorèse qui sépare les protéines en fonction de leur poids moléculaire puis ces protéines sont détectées spécifiquement à l’aide d’anticorps. Cette technique se décompose en plusieurs étapes.
III.1.1. Préparation des lysats
Après avoir réalisé un traitement par la température et/ou par la rapamycine (20 nM, Ref. R8781, Sigma®), les cellules endothéliales ont été rincées deux fois avec du PBS 1X préchauffé à la bonne température (37°C ou 40°C) avant de les placer sur glace de sorte à ralentir leur métabolisme et stopper toutes réactions ayant lieu au sein de celles-ci. Les cellules ont ensuite été lysées avec un tampon de lyse spécifique (Tableau 5) afin de détruire les membranes et libérer l’ensemble du contenu cellulaire, notamment les protéines.
Page | 52 Composant du tampon de lyse Référence / Fournisseur Composition/Concentration finale
utilisée
Cell Extraction Buffer Ref. FNN0011 / Invitrogen®
• 10mM Tris, pH 7.4 • 100 mM NaCl • 1 mM EGTA • 1 mM NaF • 20 mM Na4P2O7 • 2 mM Na3VO4 • 1% Triton X-100 • 10% Glycérol • 0.1% SDS • 0.5% Déoxycholate DTT Ref. D9163 / Sigma® 1 mM PMSF Ref. 93482 / Sigma® 1 mM
β-glycerophosphate Ref. G6251 / Sigma® 10 mM
Protéase Inhibitor Cocktail 1X Ref. P8340 / Sigma® Utilisé au 1X (concentration non
référencée par le fournisseur)
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 1X Ref. P5726 / Sigma® Utilisé au 1X (concentration non
référencée par le fournisseur)
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 1X Ref. P0044 / Sigma® Utilisé au 1X (concentration non
référencée par le fournisseur)
Orthovanadate Ref. S6508, Sigma®
0.5 mM
À préchauffer 5 minutes à 75°C avant utilisation
TABLEAU 5 : COMPOSITION DU TAMPON DE LYSE UTILISÉ EN WESTERN BLOT.
III.1.2. Dosage des protéines
Le dosage BCA (bicinchoninic acid) est une méthode permettant de mesurer la concentration des protéines présentes dans un échantillon. Chaque lysat cellulaire est centrifugé pendant 20 minutes à 16 000g et à 4°C afin d’éliminer les débris cellulaires. Les surnageants sont ensuite récupérés et dosés avec le kit de dosage BCA (Ref. 23225, Thermo Scientific®) selon les recommandations du fournisseur. C’est un dosage colorimétrique basé sur l’acide bicinchoninique. En milieu alcalin, les protéines réduisent l’ion cuivrique Cu2+ en ion cuivreux Cu+. Cela permet à l’acide bicinchoninique, hautement spécifique pour le Cu+, de réagir avec ce dernier pour former un complexe pourpre ayant une absorption optique maximale à 562 nm. L’absorbance étant proportionnelle à la concentration de protéines, la quantité de protéines totales dans les échantillons a été déterminée à l’aide d’une courbe étalon réalisée en parallèle avec une gamme de BSA (Bovine Serum Albumin).
Page | 53
III.1.3. Migration
Afin de pouvoir migrer dans un gel d’électrophorèse, les protéines doivent être sous forme linéaire et chargées négativement. Pour cela, pour chaque échantillon, 10 µg de protéines ont été chargées avec un mélange de « Laemmli Sample Buffer 2X » (Ref. 1610737, BioRad®) et DTT (Ref. D9163, Sigma®, 0.1M). Le « Laemmli Sample Buffer 2X » contient du β-mercaptoéthanol qui réduit les ponts disulfures, du détergent SDS qui linéarise les protéines et les charge négativement, du bleu de bromophénol qui sert de colorant pour le front de migration et du glycérol qui augmente la densité des échantillons et qui facilite ainsi leur dépôt dans les puits. Le DTT, quant à lui, est un agent réducteur qui permet également de réduire les liaisons disulfures. Les protéines ont été dénaturées pendant 5 minutes à 97°C. Les échantillons ainsi qu’un marqueur de taille (Precision Plus Protein™ All Blue Prestained Protein Standards, Ref. 1610373, BioRad®) ont ensuite été déposés dans les puits d’un gel « NuPAGE™ Tris-Acetate 3-8%, 1.0 mm » (Ref. EA0375PK2, Invitrogen®), préalablement placé dans une cuve contenant du tampon de migration « NuPAGE™ Tris-Acetate SDS Running Buffer 1X » (Ref. LA0041, Invitrogen®). Un champ électrique de 80V a été appliqué pendant 30 minutes afin que les protéines passent le gel de concentration, suivi de 200V pendant environ 1h. Sous l’effet du champ magnétique, les protéines migrent vers le pôle positif (anode) permettant une séparation en fonction de leur poids moléculaire. Ainsi, les plus petites protéines sont moins retenues par le maillage et migrent rapidement contrairement aux grosses protéines qui migrent plus difficilement et se retrouvent piégées en haut du gel.
III.1.4. Transfert sur membrane
La migration des protéines a été suivie d’un transfert sur membrane. Pour cela, le gel a été rincé à l’eau et déposé sur une couche d’éponges surmontée d’une membrane PVDF 0,2 µM (Ref. 1704156, Biorad®). Un courant de 13 mA a ensuite été appliqué pendant 12 minutes à l’aide de l’appareil TransBlot Turbo Transfer System (Ref. 1704150, Biorad®). Une fois de plus, grâce au champ électrique, les protéines chargées négativement migrent vers l’anode et sont piégées par la membrane suivant la même disposition que dans le gel.
III.1.5. Immuno-détection
Après transfert sur membrane, cette dernière a été placée pendant 1h dans une solution de saturation contenant du TBS 1X (Ref. T6664, Sigma®) et 10% de lait (Ref. 1706404, BioRad®). Cette étape est indispensable pour masquer les sites de liaisons aspécifiques présents sur la membrane. Cette dernière
Page | 54 a ensuite été rincée sous agitation rapide avec du TBS-Tween 0.1% puis incubée une nuit, sous agitation lente, à 4°C dans une solution de TBS-Tween 0.05% + 5% BSA (Ref. A7030, Sigma®) contenant les anticorps primaires (Cf. Partie III.1.7, Tableau 6). La membrane a de nouveau été rincée afin d’éliminer les excès d’anticorps puis hybridée pendant 1h, à l’obscurité, à température ambiante et sous agitation lente avec une solution de TBS-Tween 0.05% contenant 1% de lait et les anticorps secondaires (Cf. Partie III.1.7, Tableau 7) couplés à la peroxydase de raifort (HRP). L’excès d’anticorps a été éliminé par des lavages consécutifs au TBS-Tween 0.1%.
III.1.6. Révélation
La révélation a été réalisée à l’aide d’un substrat chimio-luminescent : l’ECL (Enhanced
Chemiluminescence, Ref. GERPN2109, Sigma). Ce dernier réagit avec les anticorps secondaires couplés
à l’HRP et produit un signal lumineux visible. Les membranes ont ainsi été incubées 1 minute 30 avec l’ECL puis placées dans un système G:Box Chemi XL 1.4 (Syngene®) qui permet l’acquisition quantitative de la lumière émise grâce à une caméra de haute résolution et au logiciel Genesys®. Les bandes d’intérêt ont été ensuite identifiées par comparaison avec le marqueur de poids moléculaire et les images obtenues ont été analysées par densitométrie avec le logiciel GeneTools V4.03 (Syngene®). Cela a permis de quantifier les protéines en fonction de l’intensité de la bande révélée. La quantification de la β-actine a permis de normaliser les échantillons pour corriger les écarts de dépôts.
III.1.7. Liste des anticorps utilisés en western blot
Lors des différentes expériences de western blot, plusieurs anticorps primaires et secondaires ont été utilisés. Leurs caractéristiques ont été répertoriées dans les Tableaux 6 et 7 respectivement.
Page | 55 Nom de l’anticorps
Monoclonal [clone] / Polyclonal
Référence Fournisseur Dilution
p-HSF1 (S326) Monoclonal
[EP1713Y] Ab76076 Abcam® 1/1000e
HSF1 total Monoclonal
[EP1710Y] Ab52757 Abcam® 1/1000e
p-ERN1 (S724) Polyclonal Ab48187 Abcam® 1/1000e
ERN1 total Monoclonal
[14C10] #3294 Cell Signaling® 1/1000e XBP1s Monoclonal [D2C1F] #12782 Cell Signaling® 1/1000e p-p70-S6 Kinase (Thr389) Monoclonal [108D2] #9234 Cell Signaling® 1/1000e
p70 S6 Kinase Polyclonal #9202 Cell Signaling® 1/1000e
p-eNOS Monoclonal
[C9C3] #9570 Cell Signaling® 1/1000
e
eNOS Polyclonal #9572 Cell Signaling® 1/1000e
β-actine Monoclonal
[AC-15] #A5441 Sigma® 1/10 000
e
TABLEAU 6 : LISTE ET CARACTÉRISTIQUES DES ANTICORPS PRIMAIRES UTILISÉS EN WESTERN BLOT.
Nom de l’anticorps
Monoclonal [clone] / polyclonal
Référence Fournisseur Dilution
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG
(H+L)
Polyclonal 111-035-045 Jackson
Immunoresearch® 1/10 000
e
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG
(H+L)
Polyclonal 115-035-003 Jackson
Immunoresearch® 1/10 000
e
Page | 56