Le système de pompe Ibidi®

Ce système permet de cultiver les cellules en condition de flux et présente de nombreux avantages. Tout d’abord, le flux peut être maintenu pendant plusieurs semaines, permettant de réaliser des études à plus ou moins long terme. De plus, le débit du fluide ainsi que la contrainte de cisaillement appliquée à la surface des cellules peuvent être finement contrôlés. Enfin, plusieurs types de flux peuvent être imposés (laminaire, oscillatoire, etc.) et plusieurs applications sont possibles (imagerie pendant le flux, immunomarquage, western blot, RT-qPCR, etc.).

Ce système est constitué de différents composants ayant chacun un rôle bien précis pour la culture des cellules en flux. Pour une compréhension globale de son fonctionnement, chacun des composants sera présenté.

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I.4.1.1. La pompe

FIGURE 12 : VUES AVANT (A) ET ARRIÈRE (B) DE LA POMPE.

La pompe (Ref. 10905, Ibidi®) est un composant central du système (Figure 12), relié à trois autres composants : l’ordinateur, l’unité fluidique et le flacon de séchage. Son rôle est capital puisqu’elle permet de générer une pression allant de 5 à 100 mbar. Cette pression permet ainsi d’aspirer l’air présent dans l’incubateur et de l’envoyer au niveau de l’unité fluidique afin de déclencher la circulation du fluide. La pompe est également capable de contrôler différents paramètres tels que la direction du flux d’air ou encore le temps de commutation des vannes au niveau des unités fluidiques. Une pompe peut gérer jusqu’à 4 unités fluidiques en parallèle.

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I.4.1.2. L’unité fluidique

FIGURE 13 : VUES AVANT (A), DE PROFIL (B) ET ARRIÈRE (C) DE L'UNITÉ FLUIDIQUE.

L’unité fluidique (Ref. 10903, Ibidi®) permet de maintenir en place réservoirs, perfusion set et µ-slide. Elle est constituée de deux vannes de commutation permettant de générer un flux unidirectionnel à la surface des cellules.

La vanne 1 (V1) est localisée à l’arrière de l’unité fluidique (Figure 13C) et permet de guider la pression d’air vers le réservoir droit ou gauche.

La vanne 2 (V2), au contraire, est située sur le devant de l’unité fluidique (Figure 13A). C’est une valve à pincement constituée de 4 fentes (2 avant et 2 arrière) dans lesquelles sont insérées les tubulures des perfusion set (Figure 13B). Cette vanne est commutée simultanément avec la vanne 1. Ainsi, en fonction de la position de la vanne 1, une barre mobile va être capable de pincer les deux fentes avant ou arrière afin de maintenir un flux unidirectionnel (Figure 14).

Cette unité fluidique est reliée à la pompe par un câble électrique, pour le contrôle des vannes, mais également par un tube, permettant de recevoir l’air préalablement filtré pour rendre possible la circulation du fluide.

Page | 35 FIGURE 14 : PRINCIPE DE FONCTIONNEMENT DES VANNES POUR CRÉER UN FLUX UNIDIRECTIONNEL.

La capacité des réservoirs n’étant pas infinie, les vannes sont indispensables afin de passer d’un état 1 à un état 2 et de maintenir un flux unidirectionnel.

État 1 : La vanne 1 permet d’envoyer l’air dans le réservoir A et de pousser le liquide situé à l’intérieur. Ce liquide est donc mis en mouvement et circule à la surface des cellules de la gauche vers la droite pour remonter dans le réservoir B.

État 2 : Après commutation des vannes 1 et 2, la vanne 1 permet d’envoyer l’air dans le réservoir B et de pousser le liquide situé à l’intérieur. Ce liquide est ainsi mis en mouvement et circule à la surface des cellules toujours de la gauche vers la droite grâce à la commutation qui s’est établie au niveau de la vanne 2. Le liquide remonte ensuite dans le réservoir A puis la commutation de vanne s’effectue à nouveau pour permettre au système de revenir à l’état 1.

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I.4.1.3. Perfusion set et µ-slide

FIGURE 15 : DESCRIPTION D'UN PERFUSION SET (A) ET D'UNE µ-SLIDE (B).

Le perfusion set est constitué de deux parties. D’une part, les réservoirs avec leur filtre, qui contiennent le liquide à faire circuler et d’autre part, la tubulure qui permet de faire passer ce liquide et qui s’adapte parfaitement à l’unité fluidique, notamment au niveau de la connexion avec les valves à pincement (Figure 15A). Il existe plusieurs types de perfusion set qui varient en fonction de leur diamètre et de leur longueur. Ces perfusion set sont connectés à des µ-slides.

Les µ-slides sont des lames à l’intérieur desquelles des cellules peuvent être ensemencées et cultivées en condition de flux (Figure 15B). Il existe différents types de µ-slides qui varient en fonction de la hauteur (0.2 à 0.8 mm) et du nombre de canaux présents (1 à 6) sur la µ-slide.

Ainsi, en jouant sur le diamètre du perfusion set et sur la hauteur du canal de la µ-slide, il est possible d’appliquer différents débits et donc de modifier les contraintes de cisaillement appliquées à la surface des cellules. Si un perfusion set à faible diamètre est combiné avec une µ-slide ayant une hauteur de canal importante, alors les contraintes de cisaillement appliquées aux cellules seront faibles et inversement.

Page | 37 Pour l’ensemble des expériences réalisées en flux, nous avons utilisé les perfusion set ayant un diamètre de 1.6 mm et une longueur de 15 cm (Ref. 10962, Ibidi®) et les µ-slides I Luer contenant un canal, avec une hauteur de 0.4 mm et une longueur de 50 mm (Ref. 80176, Ibidi®).

I.4.1.4. L’ordinateur et le logiciel de flux

FIGURE 16 : LOGICIEL DE CONTRÔLE DES POMPES.

La pompe est contrôlée par le logiciel PumpControl qui permet de contrôler tous les paramètres de flux afin de se rapprocher au mieux des conditions physiologiques : débit, contraintes de cisaillement, pression, temps de commutation, durée de l’expérience, type de perfusion set et type de µ-slide (Figure 16).

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I.4.1.5. Le flacon de séchage

FIGURE 17 : FLACON DE SÉCHAGE.

Le flacon de séchage est connecté à la pompe mais également à l’intérieur de l’incubateur où il va être capable d’aspirer l’air et de l’envoyer dans la pompe tout en la protégeant de l’humidité de l’incubateur. En effet, ce flacon contient des billes de silice qui vont permettre de capter l’humidité de l’air aspiré avant de le renvoyer dans la pompe (Figure 17). Ces billes ont un indicateur orange. Lorsqu’elles deviennent blanches, cela signifie qu’elles sont saturées en humidité et qu’il faut les remplacer.