Dans cette partie, nous avons voulu déterminer si la température pouvait varier localement dans des zones de perturbations hémodynamiques. C’est la raison pour laquelle nous avons choisi de travailler sur des modèles ex vivo, in vitro et in vivo comprenant une bifurcation.
VIII.1. Mesure ex vivo de la température par caméra thermique
infrarouge
Au cours de ces expériences, réalisées sur des systèmes microfluidiques linéaires ou branchés, les variations thermiques liées au flux ont été cartographiées à l’aide d’une caméra thermique infrarouge (Ref. A310, FLIR®).
Une solution aqueuse a été mise en circulation à 10 dyn.cm² dans des µ-slides laminaires ou comprenant une bifurcation. Les images ont été enregistrées pendant toute la durée de l’expérience
Page | 65 à l’aide de la caméra thermique infrarouge. Les températures de surface au sein des deux µ-slides ont ensuite été comparées.
La même expérience a également été réalisée avec une bifurcation imprimée en trois dimensions à partir des données 3D obtenues par imagerie par résonnance magnétique (IRM) d’une carotide humaine. Cette fois-ci, les températures de la partie laminaire et de la zone de bifurcation ont été comparées.
VIII.2. Mesure de la température par IRM
Pour définir de manière plus précise les variations thermiques pouvant avoir lieu au sein des bifurcations artérielles ex vivo, nous avons eu recourt à la technique d’IRM en collaboration avec la plateforme d’imagerie FRIM (Hôpital Bichat) et l’aide du Dr. Sinkus. Pour cela, la bifurcation 3D reproduisant la géométrie d’une carotide humaine a été utilisée et intégrée dans un tube externe rempli d’une solution riche en eau et en lipides. Cet ensemble est appelé « fantôme ».
Lors de nos expériences, ce fantôme a été réchauffé à 37°C puis une solution aqueuse, préchauffée à cette même température, a été injectée dans le système à l’aide d’une pompe thermostatique. Une cartographie de température a ensuite été établie par spectroscopie par résonnance magnétique (SRM) à l’aide d’un scanner préclinique T7 (Bruker®). Pour ce faire, nous avons utilisé le décalage qui existe entre la fréquence de résonnance du groupement méthylène (-CH2), qui est thermo-insensible, et la fréquence de résonnance des protons H+ de l’eau, qui est thermosensible (Liu et al., 2014). Le calibrage du décalage permet d’obtenir une température absolue dans un large champ de vision, avec une résolution importante et de surmonter les problèmes d’inhomogénéités de champ, présentes dans les méthodes classiques d’IRM.
Parallèlement à ces expériences ex vivo, nous avons également réalisé les mêmes expériences in vivo en tentant d’établir des cartographies de température au niveau du sinus carotidien de souris C57Bl/6 anesthésiées à l’isofluorane. En effet, le méthylène est un groupement moléculaire omniprésent et hautement représenté dans les tissus des mammifères, nous permettant d’effectuer ces expériences d’IRM in vivo.
Page | 66
VIII.3. Utilisation d’une sonde thermique
VIII.3.1. Structure de la sonde
Des hétérogénéités thermiques existent à l’échelle subcellulaire. Afin d’étudier ces hétérogénéités, une sonde thermique (Ref. FDV-0005, Funakoshi®) a été utilisée in vitro. Cette sonde est constituée de quatre sous-unités (Figure 24) :
- Une sous-unité lui conférant une sensibilité à la température (Figure 24A). - Une sous-unité cationique (Figure 24B).
- Une sous-unité fluorescente dont l’intensité de fluorescence est dépendante de la température (Figure 24C).
- Une sous-unité fluorescente dont l’intensité de fluorescence est indépendante de la température (Figure 24D).
FIGURE 24 : STRUCTURE DE LA SONDE THERMIQUE UTILISÉE IN VITRO.
Ainsi, en évaluant le ratio des fluorescences des deux sous-unités dépendante et thermo-indépendante, nous pouvons établir une cartographie thermique relativement précise.
VIII.3.2. Traitement des cellules
Les cellules endothéliales (HCAEC ou Telo-HCAEC) ont été ensemencées en plaque 96 puits (Ref. 655096, Greiner®) et placées à 37°C. Après 24h de prolifération, les cellules ont été rincées à deux
Page | 67 reprises dans une solution de glucose 5% ou de KCl 150 mM puis elles ont été placées en contact avec une solution contenant la sonde thermique pendant 10 minutes à température ambiante. Différentes concentrations ainsi que différentes solutions de dilution de la sonde ont été testées et sont répertoriées dans le Tableau 13. Par la suite, les cellules ont été rincées trois fois avec du milieu de culture complet. Concentration de la sonde testée Solution de dilution de la sonde testée Condition de culture
testée Type cellulaire testé Température testée
10 µg/µL Glucose 5% Statique HCAEC De 25°C à 45°C avec
un pas de 2°C 5 µg/µL KCl 150 mM Flux laminaire (10 dyn.cm²) Telo-HAEC 2.5 µg/µL Milieu de culture complet 1.25 µg/µL
TABLEAU 13 : RÉSUMÉ DES CONDITIONS TESTÉES LORS DE L'UTILISATION DE LA SONDE THERMIQUE.
VIII.3.3. Lecture de fluorescence
Afin de vérifier le bon fonctionnement de la sonde thermique, les fluorescences ont été enregistrées en réponse à une gamme de température. Pour cela, la plaque de culture a été placée dans l’INCell 2200 sur un chauffe-plaque. La température a été réglée tout d’abord sur 25°C et la plaque a été maintenue pendant 30 minutes sur le chauffe-plaque. Après stabilisation complète de la température, les images ont été acquises avec une longueur d’ondes d’excitation de 458 nm et des longueurs d’ondes d’émission égales à 510 nm et 580 nm. Une augmentation progressive de la température a ensuite été appliquée avec stabilisation de chaque température pendant 30 minutes avant acquisition des images. Les ratios de fluorescence ont ensuite été calculés afin de valider le fait que la température ainsi calculée correspondait bien à la température imposée à nos cellules.
La même expérience a également été menée en condition de flux laminaire (10 dyn.cm²) pour déterminer le bon fonctionnement de la sonde dans ces conditions.
Page | 68