I. Réponse thermique des cellules endothéliales
I.2. Étude des voies de signalisation mises en place par les cellules endothéliales
I.2.1. Implication du régulateur HSF1
Nous nous sommes tout d’abord intéressés à HSF1 et à son implication dans la réponse cellulaire. L’objectif a été de confirmer que ce régulateur génique était activé suite à une augmentation de température et qu’il jouait un rôle dans la signalisation mise en place par les cellules endothéliales.
HSF1 est un facteur transcriptionnel séquestré dans le cytosol par des interactions avec plusieurs HSP (notamment HSP70 et HSP90). La phosphorylation de certains acides aminés le libère de cette interaction, lui permet d’entrer dans le noyau et de se fixer sur des éléments de réponse HSE (Heat
Shock Elements) présents sur les promoteurs de nombreux gènes (Dayalan Naidu and
Dinkova-Kostova, 2017).
I.2.1.1. Étude de la phosphorylation de HSF1
L’activation du facteur HSF1 peut être déclenchée par la phosphorylation de sa sérine 326 (Guettouche
et al., 2005). Nous avons étudié cette phosphorylation par western blot en cinétique et en réponse à
Page | 90 FIGURE 36 : LA PROTÉINE HSF1 EST PHOSPHORYLÉE EN RÉPONSE À UNE AUGMENTATION DE TEMPÉRATURE.
Les HCAEC ont été cultivées en condition statique à 37°C ou à 40°C pendant 0h, 30 minutes, 1h ou 2h. L’expression des protéines p-HSF1, HSF1 et β-actine a été quantifiée par western blot à partir de 9 µg de protéines ayant migré sur un gel « NuPAGE™ Tris-Acetate 3-8% » et ayant été transférés sur une membrane PVDF 0,2 µm. L’expression des protéines p-HSF1 et HSF1 a été normalisée à celle de la β-actine pour s’affranchir des possibles écarts de dépôts puis le rapport de ces deux expressions a permis d’établir une quantification p-HSF1/HSF1 en fonction de la température et du temps d’incubation des HCAEC à chaque température. Les valeurs obtenues à 40°C ont ensuite été normalisées avec celles obtenues pour la condition 37°C pour chaque temps d’incubation. Les résultats ont été obtenus sur une moyenne de 5 expériences +/- SEM.
Dans d’autres expériences réalisées séparément, il n’y avait plus de phosphorylation significative de HSF1 après 6h, par rapport aux conditions basales. La phosphorylation de HSF1 augmentant après 2h à 40°C est donc transitoire, suggérant une activation de cette protéine de manière précoce après augmentation de la température.
I.2.1.2. Étude de l’activité protéique de HSF1
Nous avons ensuite étudié l’activité promotrice de HSF1, toujours en réponse à une augmentation de température. Pour cela, nous avons choisi d’utiliser les Telo-HAEC car ces cellules sont plus résistantes que les cellules primaires dans les expériences de transfection que nous devions mener.
Préalablement à cette expérience, nous avons donc vérifié que les Telo-HAEC avaient une réponse à la température similaire à celle des HCAEC, en étudiant l’expression des gènes du panel de référence. Au total, 65% des gènes sont modulés de la même façon dans les Telo-HAEC et dans les HCAEC (Cf. Annexe II, Tableau 25). Parmi ces gènes, nous retrouvons bien ceux régulés par HSF1 et ERN1.
Page | 91 Nous avons alors transfecté les Telo-HAEC avec une construction plasmidique dans laquelle l’expression du gène rapporteur luciférase est contrôlée par un promoteur contenant des séquences HSE (Figure 37A). La mesure de la luminescence dans ce système expérimental est donc un indicateur de l’activité de HSF1. Les résultats obtenus sont illustrés Figure 37B.
FIGURE 37 : L'EXPRESSION DE LUCIFÉRASE, SOUS CONTRÔLE DES ÉLÉMENTS DE RÉPONSE À HSF1, EST FORTEMENT ACTIVÉE EN RÉPONSE À UNE AUGMENTATION DE LA TEMPÉRATURE.
Les Telo-HAEC ont été transfectées avec les plasmides pGL4.41 (A) et pmaxGFP puis cultivées en condition statique à 37°C ou à 40°C pendant 2h, 4h ou 6h. Après chaque temps d’incubation, l’intensité de fluorescence de la GFP a été mesurée afin d’évaluer la qualité de la transfection. Les cellules ont ensuite été lysées et de la luciférine (125 µM) a été ajoutée avant mesure de la luminescence. Un ratio luminescence/fluorescence a été effectué afin d’obtenir une valeur traduisant de façon proportionnelle l’activité de HSF1 (B). Plus ce ratio augmente et plus l’activité est élevée et inversement. Les résultats ont été obtenus sur une moyenne de 5 expériences +/- SEM. ****P<0.0001 entre les groupes indiqués.
Après élévation de la température à 40°C, l’activité du promoteur qui répond à l’activation de HSF1 est augmentée en continu sur 6h, avec un pic d’activité à 4h, en comparaison avec l’activité à 37°C. Ces résultats corrèlent avec les résultats précédents de phosphorylation (Figure 36) et suggèrent que la protéine HSF1 est activée après augmentation de la température, qu’elle est fonctionnelle puisqu’elle est capable d’assurer son activité promotrice et qu’elle est impliquée dans la signalisation mise en place par les cellules endothéliales.
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I.2.1.3. Étude de la translocation nucléaire de HSF1
Pour confirmer cette signalisation, la translocation nucléaire de HSF1 a été étudiée par immunomarquage (Figure 38).
FIGURE 38 : ÉTUDE DE LA TRANSLOCATION NUCLÉAIRE DE HSF1 EN RÉPONSE À UNE AUGMENTATION DE TEMPÉRATURE. Les HCAEC ont été cultivées en condition statique à 37°C ou à 40°C pendant 30 minutes, 1h, 2h, 4h ou 6h. (A) Les cellules ont ensuite été fixées, perméabilisées et marquées avec un anticorps monoclonal dirigé contre HSF1. Ce marquage est visible en orange (Cy3) sur les photos. Les noyaux cellulaires ont également été marqués grâce au Hoechst 33342 et sont visibles en bleu. (B) Zoom des marquages pour les conditions 37°C 6h et 40°C 4h. (C) Le co-marquage a permis de quantifier l’intensité de fluorescence Cy3 présente dans le noyau de chaque cellule. Ces résultats ont été obtenus sur une moyenne de 2 expériences +/- SEM.
À 37°C, l’immunomarquage de la protéine HSF1 indique que cette dernière est à la fois présente dans le noyau et dans le cytoplasme des cellules endothéliales (Figure 38A et 38B). Lorsque les cellules sont placées à 40°C, ce marquage ne semble pas être modifié et aucune translocation nucléaire significative n’est observée (Figure 38A et 38B). Ces observations sont confirmées par les analyses mesurant la fluorescence présente dans le noyau des cellules en fonction des différentes conditions (Figure 38C).
Cependant, la protéine HSF1 étant phosphorylée après 2h à 40°C et son activité promotrice étant augmentée, il est fortement probable que la protéine soit transloquée dans le noyau en réponse à une augmentation de température. Nous avons donc essayé d’optimiser cette technique pour observer
Page | 93 une translocation nucléaire. L’ensemble des conditions testées est regroupé dans le Tableau 17.
TABLEAU 17 : RÉSUMÉ DES CONDITIONS TESTÉES POUR VISUALISER LA TRANSLOCATION NUCLÉAIRE DE HSF1.
Dans un premier temps, différents types de fixation cellulaire ont été testés afin de déterminer celle permettant d’obtenir les meilleures images, avec un bruit de fond le plus faible possible. Dans un second temps, différents anticorps ciblant la forme totale ou la forme phosphorylée de HSF1 ont également été testés, chacun à différentes concentrations afin d’optimiser la détection de la protéine. Dans un dernier temps, différents temps d’incubation des cellules ont été testés ainsi que différentes conditions de culture. En effet, la translocation nucléaire n’étant pas observable en condition statique, les cellules ont été cultivées en condition de flux afin de se rapprocher le plus possible de leurs conditions physiologiques. De plus, des températures plus élevées (42°C) ont été testées afin de voir si la translocation pouvait être davantage observable dans ces conditions.
Malgré la multitude des conditions testées, des résultats similaires à ceux décrits précédemment ont été obtenus et aucune translocation nucléaire n’a pu être mise en évidence.
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I.2.1.4. Modulation des gènes régulés par HSF1
Pour confirmer l’activité transcriptionnelle de HSF1, nous avons sélectionné 9 gènes prédits par le logiciel IPA (Figure 31A) et issus de nos premières analyses (Annexe II, Tableau 23). Parmi ces neuf gènes, quatre HSP (HSPH1, HSPA1A, HSPA1B et HSP90AA1) sont capables de se lier à la protéine HSF1, de la séquestrer dans le cytosol et d’inhiber ses fonctions (Ali et al., 1998; Shi, Mosser and Morimoto, 1998). Ces protéines sont également impliquées dans le repliement protéique et capables de se lier à plusieurs autres facteurs. Par exemple, l’HSP90AA1 est capable d’établir des interactions avec AHSA1, STIP1 et FKBP4, pour augmenter sa propre activité ATPasique ou pour réguler celle de HSF1 (Lotz et
al., 2003; Woodford et al., 2016).
Ces neuf gènes sont tous sur-exprimés à 40°C (Figure 39), indiquant qu’ils sont bien impliqués dans la réponse cellulaire à la température. Ces gènes possèdent tous des séquences HSE au sein de leur promoteur et sont décrits comme étant sous le contrôle de l’activité promotrice de HSF1 (Kovács et
al., 2019).
L’ensemble de ces données suggère donc qu’à 40°C, les HCAEC déclenchent l’activation de HSF1 qui n’est alors plus séquestré dans le cytosol par les HSP et qui peut exercer ses fonctions transcriptionnelles afin de transcrire ses gènes cibles dans le noyau.
Page | 95 FIGURE 39 : LES GÈNES THÉORIQUEMENT RÉGULÉS PAR HSF1 SONT SOUS-EXPRIMÉS APRÈS 6H À 40°C.
Les HCAEC ont été cultivées en condition statique à 37°C ou à 40°C pendant 6h. Leurs ARN totaux ont été extraits et l’expression de plusieurs gènes a été étudiée par TLDA. Les résultats sont exprimés en – Delta (Ct) en fonction de la température, où chaque point représente une expérience. Les résultats ont été obtenus sur une moyenne de 3 expériences +/- SEM. *P<0.05 et **P<0.01 entre les groupes indiqués.
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