La température déclenche une réponse UPR atypique

Au cours de l’analyse bio-informatique des données de transcriptomique, nous avons également identifié la voie de signalisation UPR et le régulateur génique ERN1. La réponse UPR est déclenchée suite à un stress du réticulum endoplasmique, initié par diverses situations incluant le choc thermique (Zheng et al., 2019). C’est une réponse adaptative pouvant impliquer jusqu’à trois réponses en parallèle, en fonction notamment de l’intensité et de la chronicité du stress : la réponse ERN1, la réponse ATF6 et la réponse PERK (Liu and Kaufman, 2003; Hetz, 2012; Zheng et al., 2019).

Page | 140 ERN1 est une protéine transmembranaire dans le réticulum endoplasmique qui possède à la fois une activité sérine/thréonine kinase et une activité endoribonucléasique (Han et al., 2009; Ghosh et al., 2014). Au cours d’un stress du réticulum endoplasmique, ERN1 est capable de s’oligomériser et de s’autophosphoryler entrainant ainsi son activation et lui permettant d’exercer son activité ribonucléasique (Zhou et al., 2006). La phosphorylation de la protéine ERN1 peut avoir lieu sur les sérines 724, 726 et 729, lesquelles contrôlent l’acquisition de son activité ribonucléasique (Prischi et

al., 2014). En effet, ces phosphorylations entrainent un changement conformationnel de la protéine

ERN1 nécessaire à la fixation et à l’épissage du transcrit XBP1. Il est à noter que ERN1 est le seul système enzymatique connu à ce jour pour réaliser cet épissage cytosolique du transcrit XBP1. Ainsi, l’épissage accru du transcrit XBP1 et la quantité majorée de protéine XBP1s correspondante, qui sont observés entre 1h et 3h après élévation de la température à 40°C, indiquent que l’activité ribonucléasique de ERN1 augmente dans les HCAEC en réponse à un stress hyperthermique. Nous avons également montré que cet épissage était directement dépendant de l’activité ribonucléasique de ERN1 par l’utilisation d’un inhibiteur : le B-I09. Nos données recoupent plusieurs études montrant une augmentation de l’épissage de XBP1 dépendant de ERN1, au sein de cellules soumises à un stress thermique (30 minutes à 45°C) (Heldens et al., 2011) ou à un stress induit par des agents chimiques (Yoshida et al., 2001; Calfon et al., 2002; Tang et al., 2014; Liu et al., 2019). Nous remarquons cependant que l’épissage au sein des HCAEC soumises à 40°C est déclenché plus tardivement que dans les expériences publiées, ce qui peut s’expliquer par les différences expérimentales (amplitude du choc thermique et type de cellules utilisées). En étudiant arbitrairement la phosphorylation de la sérine 724, nous n’avons pas observé de différence significative en réponse à la température, à aucun des temps d’incubation analysés. Ces données sont donc surprenantes au vu de la littérature mais aucune publication ne s’est intéressée à l’effet du stress thermique sur la phosphorylation de ERN1. Il est donc possible que dans nos conditions expérimentales, les deux autres sites de phosphorylation soient davantage impliqués dans l’activation de ERN1. Pour compléter nos résultats, il conviendrait donc d’analyser l’état de phosphorylation des sérines 726 et 729 à 40°C.

De manière surprenante, l’inhibition par le B-I09 ne nous a pas permis de mettre en évidence une modulation génique du panel de référence, y compris les gènes en aval de ERN1. Ces résultats suggèrent donc qu’à 40°C, les HCAEC semblent activer les premières étapes de la voie UPR, à savoir l’épissage du transcrit XBP1 et la synthèse de la protéine XBP1s correspondante. Cependant, nous n’avons pas mis en lumière d’activité transcriptionnelle de cette protéine à 40°C. Les HCAEC ne mettent donc pas en place une réponse ERN1 classique complète (Zheng et al., 2019). A l’instar de nos résultats sur les HCAEC, les travaux de Heldens et al. (Heldens et al., 2011) ont montré qu’une réponse UPR atypique pouvait se produire dans des cellules HEK soumises à un choc thermique

supra-Page | 141 physiologique. Au sein de ces cellules, ces auteurs ont montré que le transcrit XBP1 était induit et épissé mais que la protéine XBP1s produite n’était pas capable d’induire la transcription de ses gènes cibles. C’était notamment le cas des gènes DNAJB9 et HSPA5, pourtant bien induits en réponse à un choc thermique dans leurs expériences. Par ailleurs, ils ont montré que l’activité transcriptionnelle de XBP1s était correctement induite lorsque les cellules étaient soumises à un stress induit par la tunicamycine, confirmant qu’une réponse UPR différente est induite lors d’un choc thermique. Malgré le fait que plusieurs paramètres expérimentaux diffèrent, nos résultats coïncident avec ces données publiées. Pour confirmer l’hypothèse d’une réponse UPR atypique au sein des HCAEC, il faudrait vérifier que la protéine XBP1s est capable d’induire la transcription de ses gènes cibles en cas de stress non thermique (lors d’un traitement à la tunicamycine par exemple). Dans leur article, Heldens et al. ont également montré qu’au sein du promoteur du gène DNAJB9, les régions régulatrices impliquées en réponse à la chaleur et celles de XBP1s était différentes. Il serait nécessaire de vérifier cette information au sein des HCAEC puisque si cette hypothèse est confirmée, cela suggère que d’autres facteurs de transcription sont capables de cibler les mêmes promoteurs que XBP1s en cas de stress thermique, masquant ainsi les sites de liaison de XBP1s et expliquant le peu de modulation génique en présence de B-I09. Une détection par immunoprécipitation de la chromatine des gènes cibles permettrait d’identifier, par spectrométrie de masse, les partenaires moléculaires impliqués.

Comme mentionné précédemment, les gènes majoritairement modulés à 40°C font partie de la famille des HSP. Hormis leur interaction avec la protéine HSF1, ces HSP sont également capables de se lier à la protéine ERN1 afin de la maintenir dans un état inactif. C’est le cas de HSPA5 (Miyata, Badolato and Neamati, 2018) et de DNAJB9 (HSP40) (Amin-Wetzel et al., 2017), également impliquées dans le repliement protéique. Le mécanisme d’activation de ERN1 serait donc assez similaire à celui de HSF1, par dissociation des HSP (Figure 71).

Au-delà de ERN1, la voie UPR comprend également la réponse ATF6 que nous avons étudiée partiellement au cours de ce projet. ATF6 est une protéine transmembranaire dans le réticulum endoplasmique pouvant participer à la transcription de nombreux gènes, dont certains sont également régulés par XBP1s (Lee, Iwakoshi and Glimcher, 2003). En utilisant un système rapporteur dans les Telo-HAEC, nous avons montré que l’activité de ATF6 était diminuée entre 2h et 24h après une augmentation de la température (Cf. Annexe II, Figure 72), suggérant que cette protéine n’est pas impliquée dans la réponse cellulaire. Cependant, il est décrit que lors d’un stress, la quantité de protéine ATF6 est réduite. ATF6 quitte le réticulum endoplasmique pour rejoindre l’appareil de Golgi où elle subit un clivage protéolytique, clivage nécessaire afin qu’elle acquiert son activité transcriptionnelle (Walter and Ron, 2011; Zheng et al., 2019). Cette protéolyse est un mécanisme rapide à se mettre en place, contrairement à la voie faisant intervenir l’épissage de XBP1, qui est un

Page | 142 mécanisme plus lent (que nous avons observé entre 1h et 3h) puisqu’après l’épissage du messager, la protéine XBP1s doit encore être traduite avant de pouvoir exercer son activité transcriptionnelle. Les temps d’analyse dans nos expériences étaient vraisemblablement trop tardifs pour observer l’activité de ATF6 car le clivage protéolytique de ce facteur a sans doute eu lieu dans la première heure suivant l’élévation de la température. Il serait donc nécessaire de reproduire cette expérience à des temps plus précoces et d’envisager de bloquer spécifiquement ce clivage pour déterminer l’implication de ATF6 dans la réponse génique à la température.

La Figure 71 résume l’ensemble des mécanismes d’adaptation des cellules endothéliales que nous avons pu mettre en évidence.

FIGURE 71 : SCHÉMA RÉSUMÉ DES DIFFÉRENTES VOIES DE SIGNALISATION MISES EN LUMIÈRE PENDANT CE TRAVAIL DE THÈSE ET DÉCLENCHÉES PAR LES HCAEC À 40°C.

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