Validation au regard des activités biologiques

Les deux protocoles de séparation ont ensuite été testés avec une solution de 12 molécules biologiquement actives afin de vérifier que les fractionnements par HPLC n’entraînent pas une perte d’activité biologique. Les composés utilisés ainsi que leurs activités et leurs concentrations sont présentés dans le Tableau 20. Les fractionnements ont été évalués en fonction de trois activités ER, AhR et PXR. La méthodologie a été d’évaluer les activités biologiques de 50 µL de solution (témoin positif) et celles de 50 µL de solution après injection en HPLC. La totalité du mélange injecté est collecté. Un test de dopage a également été réalisé en RP-HPLC. Il consiste en l’ajout de 50 µL de solution dans un volume de solvant équivalent à celui collecté à l’issue du fractionnement en HPLC. En parallèle, des blancs de protocole ont été préparés dans les mêmes conditions afin de tester les contaminations potentielles. L’ensemble est évaporé sous flux d’argon repris dans 50 µL de DMSO et testé en ER, AhR et PXR sur lignées cellulaires MELN, PLHC-1 et HG₅LN-PXR, respectivement.

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Tableau 20 : Solution mélange employée pour tester l’impact du fractionnement sur l’activité biologique.

Activité Nom Concentration en µg/mL acétone Log Kow* ER Œstrone 0,0027 3,43 Œstradiol 0,0008 3,94 Bisphénol A 18,27 3,64 4t-Octylphénol 8,26 5,28 o,p-Dichlorodiphényltrichloroéthane 35,47 6,79 PXR Phosphate de triphényle 489,71 4,70 Clotrimazole 103,51 6,26 Fénofibrate 541,57 5,19 AhR 3,3',4,4',5-Pentachlorobiphényle 0,163 6,98 2,3,7,8-Tétrachlorodibenzo-p-dioxine 0,019 6,92 Dibenzo[ah]anthracène 0,084 6,70 Benzo[k]fluoranthène 0,076 6,11

*valeurs estimées par KOWWIN v1.67 (base de données Chemspider)

Les résultats obtenus en termes de EC20 sont présentés Figure 34. Pour faciliter la lisibilité des résultats, seules les solutions non injectées et collectées après passage en HPLC sont montrées. Il est important de préciser que les blancs de protocole n’ont pas montré d’activités ER et PXR mais ont présenté une légère activité AhR à 4h d’exposition cellulaire. La réponse AhR des blancs est cependant peu intense en comparaison de celle induite par la solution mélange. La distinction possible entre l’activité des blancs et celle de la solution permet de confirmer que la réponse cellulaire observée pour la solution est liée en majorité aux composés et non à une contamination lors du protocole.

Pour le fractionnement en RP-HPLC, les EC20 déterminés pour le témoin positif sont inférieures à celles obtenues pour la solution colléctée après passage en HPLC (Figure 34 A). Ceci signifie que toutes les activités mesurées après HPLC sont moins intenses que les activités initiales induites par la solution mélange, suggérant une perte de l’activité durant la procédure. Pour l’activité AhR après 24h d’incubation cellulaire, aucune réponse biologique n’a été observée sur la solution injecté montrant une perte totale de l’activité AhR. Concernant le test de dopage, il présente les mêmes résultats que la solution injectée en HPLC. Ce résultat traduit que la perte d’activité n’est pas liée à l’injection et à la collecte de la solution après passage en HPLC mais se produit durant les procédures amont (i.e. reprise dans un solvant polaire) et/ou aval (i.e. évaporation). En observant les polarités des composés présents dans la solution, plusieurs molécules possédent un logKow supérieur à 6,5, traduisant un comportement plutôt hydrophobe (Tableau 20). Lors de l’injection en phase inverse, la solution est reprise dans un mélange de solvants polaires constitués de 80% d’eau et 20% d’acétonitrile. Il est envisageable que les composés hydrophobes ne se solubilisent pas et restent adsorbés sur les parois des flacons. La succession de reprise, transfert et évaporation de la solution injectée en HPLC ou du test de dopage accentue les pertes de molécules. Le même phénomène peut également se produire lors des tests biologiques par la reprise de la solution dans du DMSO puis dans le milieu de culture de type aqueux. L’emploi de tubes

118 Eppendorf^® en polypropylène pour les dilutions dans le milieu avant dépôt cellulaire peut aussi favoriser l’adsortion de ces composés sur les parois du tubes. L’étape des tests cellulaires étant la même pour tous les échantillons, la perte des molécules actives durant les bio-essais n’est pas discriminante entre la solution brute et injectée en HPLC. Par conséquent, ce test du fractionnement en phase inverse en se focalisant sur l’évaluation des activités biologiques a montré que cette procédure n’était pas adaptée aux échantillons contenant des composés hydrophobes tels que les sédiments, boues de STEP par exemple, ou les fractions apolaires obtenues en SPE sur cartouche de silice, c’est-à-dire les fractions F1 et F2.

Figure 34 : Activités œstrogéniques, AhR et PXR de la solution mélange de 12 composés actifs collectée à l’issue du fractionnement en phase normale (NP-HPLC) et phase inverse (RP-HPLC) obtenues sur lignées cellulaires MELN, PLHC-1 et HG₅LN-PXR, respectivement. Le témoin positif correspond à la solution non injectée. Les réponses cellulaires sont présentées par la concentration entraînant 20% des activités (EC20) établie à partir de courbes dose-réponse. Les barres d’erreur correspondent aux intervalles de confiance (n=3).

Concernant le fractionnement en phase normale, aucune différence entre les EC20 du témoin positif ou de la solution injectée et colléctée en HPLC n’est observée pour les activités ER et AhR. Cependant, une perte d’activité PXR est remarquée pour la solution injectée en HPLC par rapport à la solution brute (Figure 34 B). Ces résultats confirment que le fractionnement en phase normale est plus adapté aux composés hydrophobes que le fractionnement en phase inverse. Contrairement à la phase inverse, la phase normale demande une reprise des solutions dans un solvant apolaire (e.g. isooctane), ne présentant ainsi aucune contrainte pour les molécules hydrophobes. De plus, les fractions colléctées sont constituées de solvants rapidement évaporés (i.e. pentane, dichlorométhane, acétonitrile) qui réduisent le temps d’évaporation et limitent les dégradations de molécules durant cette étape. Des pertes de composés actifs ont, néanmoins, pu être observées en phase normale pour l’activité PXR. Un facteur d’environ 2,5 est mesuré entre la EC20 du témoin positif et celle de la solution

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2.3 Conclusion

L’étude des fractionnements en termes d’activités biologiques a confirmé que le mode inverse était plus adapté pour les échantillons de type aqueux tels que les eaux de STEP, de rivière par exemple, ou les fractions polaires obtenues par le fractionnement SPE sur cartouches de silice (F3 et F4) contenant une majorité de composés hydrophiles. En complément, le fractionnement en phase normale convient aux échantillons de type solides, huileux, lipidiques ou fractions apolaires issues du fractionnement SPE sur cartouches de silice (F1 et F2) renfermant des molécules hydrophobes. La stratégie de fractionnement est schématisée Figure 35.

Cependant, il est important de garder à l’esprit, que les pertes de composés biologiquement actifs aux cours des procédures de fractionnement peuvent varier suivant les matrices environnementales. L’évaluation des pertes d’activités après fractionnement pour chaque échantillon doit être systématique. Cette vérification s’effectue par le regroupement d’un aliquote de chaque fraction collectée afin de recréer un échantillon global post-fractionnement. Ce dernier est alors comparé à l’échantillon sans fractionnement. En plus d’évaluer les pertes d’effets biologiques éventuelles, cette étape peut permettre, dans certain cas, de mettre en évidence la présence d’effets mélange entre les molécules.

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Chapitre 5

Identification moléculaire par