La recherche des ions et l’attribution des formules brutes

4.1.1 Difficultés mis en évidence en LC-QTOF a. Les anomalies d’attribution

Pour les échantillons complexes analysés en LC-QTOF, la recherche des ions présents est effectuée automatiquement par l’emploi de la fonction MFE du logiciel MassHunter. Cette fonction se base sur les caractéristiques moléculaires et est capable d’identifier les molécules multichargées et/ou possédant des adduits. En vérifiant manuellement quelques résultats, il est apparu que pour certains composés, la détection mais également l’attribution de la formule brute était incorrecte. En effet dans le cas de molécules polymériques, telles que les polyéthylène-glycols (PEG), détectés dans les échantillons d’eaux de STEP, des pertes répétées de 44,0262 m/z correspondant au groupement –[C2H4O] sont observées sur le chromatogramme sur une majeure partie de l’acquisition (Figure 46).

Figure 46 : Spectre MS de polyéthylène-glycol dans une eau brute de STEP. Le spectre montre la présence d’ions mono-chargés (Z=1), di-chargés (Z=2) et tri-chargés (Z=3). Les ions mono-chargés sont séparés de 44,026 Da correspondant au groupement –[C₂H₄O].

144 Ces ions sont considérés par le logiciel comme des molécules indépendantes même en ajoutant dans les paramètres de recherche de composés (MFE), l’adduit [M+C₂H₄O]⁺. Le problème réside dans l’attribution des formules entre deux ions qui peut donner des résultats incohérents. Un exemple de génération de formules brutes est donné Tableau 21. Les deux ions détectés appartiennent aux mêmes polymères et sont séparés de 44,026 Da soit – [C2H4O]. Cependant, le logiciel attribue les formules C57H116 F4N7O18PS et C58H110F8N8O17S aux ions 1326,7779 et 1375,7655, respectivement. De plus, l’algorithme les identifie comme des molécules protonées or il s’agit de molécules possédant un adduit NH4⁺ et Na⁺, respectivement (Figure 47).

Tableau 21 : Exemple d’attribution automatique pour deux signaux appartenant à un motif polymérique de type PEG différent de 44,026 Da détectés dans les eaux de STEP.

ion m/z (Da) Masse du neutre (Da) Diff (ppm) Formule brute Score MS (%)

[M+H]^{+ 1375.7655 1374.7592 -0.72} C58 H110 F8 N8 O17 S ^94,14

[M+H]^{+ 1326.7844 1325.7779 -0.55 C57 H116 F4 N7 O18 P S 96,93}

Les mêmes observations ont été rapportées par Aminot (2013) dans des échantillons d’eau de STEP concernant les PEG. L’examen des attributions concernant les motifs constitutifs des PEG a également révélé que les adduits étaient parfois mal évalués par la recherche automatique. Le logiciel peut être amené à identifier à un temps de rétention donné plusieurs ions protonés [M+H]⁺ alors qu’il semble s’agir de la même molécule comportant différents adduits (Figure 47). Ces erreurs peuvent être réduites par le traitement automatique du chromatogramme sur des plages de temps courtes permettant ainsi de diminuer le nombre d’ions présents et par conséquent de faciliter le calcul effectué par les algorithmes. Cependant, malgré cette précaution, des anomalies persistent et la vérification des molécules détectées une à une demande un travail long et fastidieux qui peut même se révéler quasiment impossible lors d’échantillons très complexes possédant plusieurs milliers de signaux. Ces erreurs d’interprétation soulignent que les algorithmes régissant les recherches et attributions automatiques possèdent actuellement quelques lacunes pour le traitement d’analyses environnementales. Ces anomalies, si elles ne sont pas corrigées, peuvent créer un biais lors des interprétations globales des données en mode MS (e.g. diagramme de Van Krevelen, indice d’aromaticité…). Par conséquent, le traitement des données manuellement est privilégié lorsque ce dernier est possible, c’est-à-dire pour l’analyse d’échantillons peu complexes. Cependant, l’extraction des données automatiquement est actuellement le seul outil pour caractériser de la manière la plus exhaustive possible des matrices complexes. Les algorithmes utilisés doivent donc évoluer et être optimisés pour répondre aux problématiques environnementales.

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Figure 47 : Attribution manuelle des adduits présents sur un spectre MS de PEG détecté dans une eau brute de STEP.

b. Dilution du signal et interférence

En parallèle aux quelques anomalies d’attribution des compositions élémentaires des molécules détectées, l’analyse des échantillons complexes est affectée par la présence d’un nombre important de signaux pouvant s’élever à plusieurs milliers de composés suivant les paramètres de traitement de données renseignés. La présence d’autant de molécules lors d’une analyse en HRMS peut perturber le processus d’ionisation des composés. En effet, le nuage de molécules présentes dans la source peut être tellement dense qu’il est envisageable qu’une partie des composés ne puisse pas être ionisée. En absence d’ionisation, les molécules ne peuvent pas être détectées. La simplification de l’échantillon telle qu’elle est réalisée lors du fractionnement permet de diminuer la quantité de molécules et donc d’éviter ce problème.

Des molécules pouvant agir comme des interférents peuvent également représenter un frein aux analyses non ciblées. Certains composés, comme les PEG, possèdent une forte affinité protonique qui les rend facilement ionisables (Lin et al., 1993). Ces polymères génèrent des ions multichargés qui amènent à la détection de massifs isotopiques denses et complexes (Figure 46, p 143). En plus de contribuer à la monopolisation de l’énergie d’ionisation de la source, les PEG de par leurs distributions isotopiques peuvent empêcher la visualisation des autres ions pseudo-moléculaires présents.

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4.1.2 Obstacle rencontré en GC-QTOF

L’attribution des formules brutes en GC-QTOF n’est pas toujours réalisable puisque, comme pour les analyses en GC-MS, l’ion moléculaire n’est pas forcément visible. En effet, l’impact électronique peut totalement fragmenter l’ion moléculaire l’amenant à disparaître du spectre obtenu. Cette caractéristique est problématique dans le cas de la recherche de composés inconnus pour lesquels aucun spectre de fragmentation n’est disponible, pour comparaison, dans les bases de données.