Les analyses non ciblées par spectrométrie de masse haute résolution

Les composés présents dans les extraits ou fractions d’échantillons ayant un effet biologique sont identifiés par spectrométrie de masse haute résolution. L’analyseur utilisé est un spectromètre de masse hybride quadrupôle/temps de vol (i.e. Quadrupole/ Time Of Flight, QTOF). Cette configuration allie la sélectivité du quadrupôle à la résolution de l’analyseur à temps de vol. Ce spectromètre est couplé à la chromatographie en phase liquide (LC-QTOF) ou à la chromatographie en phase gazeuse (GC-QTOF). Ces deux instruments ont été employés et optimisés dans ces travaux de thèse pour identifier les molécules présentes dans des extraits et des fractions environnementaux ayant des polarités différentes. L’analyse par LC-QTOF est privilégiée pour les fractions plutôt hydrophiles alors que l’analyse par GC-QTOF sera réservée aux fractions plus hydrophobes. Les performances des appareils ainsi que les stratégies d’identification sont présentées Chapitre 5.

6.2.1 Méthode analytique en LC-QTOF

Les analyses sont réalisées avec une chaine HPLC (série 1209 Infinity, Agilent technologies, Santa Clara, USA) couplée à un spectromètre de masse hybride QTOF (série 6540, Agilent technologies, Santa Clara, USA) (Figure 22).

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Figure 22 : LC-QTOF (Agilent Technologies, Santa Clara, USA).

Les composés sont séparés sur une colonne de silice greffée avec une chaîne alkyle de 18 atomes de carbone (Kinetex^® C18, 100 x 2,1 mm, 1,7 µm) (Phenomenex, Agilent technologies, Les Ulis, France). Les solvants d’élution employés sont l’eau ultra-pure MilliQ filtré sur EDS-PAK et de l’acétonitrile. En mode d’ionisation positif, afin d’améliorer la séparation chromatographique, la reproductibilité des analyses et surtout l’ionisation des molécules, de l’acide formique est ajouté dans chaque solvant à 0,1%. Différents gradients ont été mis en place afin de répondre aux différents types d’échantillons (Tableau 15). Ces gradients sont identiques quel que soit le mode d’ionisation appliqué mais peuvent légèrement varier suivant les échantillons analysés afin d’optimiser la séparation des composés.

Tableau 15 : Conditions analytiques génériques pour la séparation des molécules en LC-QTOF.

Type d’échantillon Extrait global inconnu Fraction polaire Fraction apolaire

Volume d’injection 2 µL 2 µL 2 µL

Phase éluante A : Eau ultra-pure (± 0,1% acide formique) B : Acétonitrile (± 0,1% acide formique) A : Eau ultra-pure (± 0,1% acide formique) B : Acétonitrile (± 0,1% acide formique) A : Eau ultra-pure (± 0,1% acide formique) B : Acétonitrile (± 0,1% acide formique)

Débit _{0,3 mL.min}-1 0,3 mL.min^-1 0,3 mL.min^-1

Gradient Temps (min) % B Temps (min) % B Temps (min) % B

0 10 0 10 0 10 45 100 22 40 8 40 47 100 30 100 30 100 49 10 32 100 34 100 53 10 34 10 36 10 38 10 40 10

94 Les molécules sont ionisées par électro-nébulisation couplée à un système de gaz gainant (Agilent Jet Stream ESI) permettant une focalisation du flux d’ions et augmentant ainsi la sensibilité analytique. Les paramètres de source ont été déterminés à partir d’une méthode analytique optimisée pour l’analyse multi-résidus (n.b. pesticides, hormones et composés pharmaceutiques) (Wund, 2013). Les paramètres sont présentés dans le Tableau 16.

Tableau 16 : Paramètres de la source d’ionisation des molécules en LC-QTOF.

Éléments Paramètres en mode

d’ionisation positif

Paramètres en mode d’ionisation négatif

Température du gaz de désolvatation 300°C 300°C

Débit du gaz de désolvatation 8 L.min^-1 8 L.min^-1

Pression de nébulisation 40 psi 40 psi

Température du gaz fourreau 400°C 400°C

Débit du gaz fourreau 11 L.min^-1 11 L.min^-1

Tension du capillaire 3000 V 3000 V

Tension du « Nozzle » 0 1500V

L’acquisition des données est effectuée en deux modes suivant la complexité des échantillons.

Pour les échantillons peu complexes (e.g. fractions obtenues en HPLC), la détection des molécules est réalisée en mode donnés-dépendant. Durant une même acquisition, les composés sont détectés par le TOF (mode MS simple) permettant de connaître avec exactitude (n.b. 10^-4 Da) le rapport masse sur charge des ions générés, les plus intenses sont sélectionnés puis fragmentés et analysés en mode MS/MS (Q/TOF) permettant d’obtenir ainsi le spectre de fragmentation des ions sélectionnés. Cette méthode d’acquisition permet en une injection d’obtenir un maximum d’informations sur les composés présents dans l’échantillon.

Pour les échantillons complexes (e.g. extraits globaux), l’acquisition s’effectue en deux temps. Dans un premier temps, le spectromètre fonctionne en mode MS simple (i.e. le quadrupôle ne sélectionne aucun ion) afin de connaître précisément la masse moléculaire des composés détectés. Cette première acquisition permet d’établir une liste d’ions précurseurs à fragmenter. Une seconde analyse est ensuite effectuée en mode MS/MS pour obtenir les spectres de fragmentation des ions sélectionnés.

Les spectres sont acquis sur une gamme de masse comprise entre 70 m/z et 1700 m/z à une fréquence d’acquisition de 2 GHz. Les ions précurseurs sont soumis à trois énergies de collision (e.g. 10, 20 et 40 V ou 20, 40 et 60 V) lors de la fragmentation. Pour le Programme National Arcachonnais, les paramètres de détection sont différents et sont exposés dans le Chapitre 6.

Durant l’acquisition, un composé de référence est continuellement injecté (HP-921 = hexakis(1H, 1H, 3H-tétrafluoropropoxy)phosphazine ; 922.009798 m/z [M+H]⁺, 966.000725

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m/z [M+HCO2]) afin de s’assurer qu’aucune dérive en masse n’est apparue au cours de

l’enregistrement des données.

Les données chromatographiques sont traitées avec le logiciel MassHunter Qualitative (Agilent technologies). La stratégie d’identification est détaillée dans le Chapitre 5.

6.2.2 Méthode analytique en GC-QTOF

Les analyses sont réalisées par chromatographie en phase gazeuse (GC, série 7890 B, Agilent technologies, Santa Clara, USA) couplée à un spectromètre de masse hybride QTOF (série 7200, Agilent technologies, Santa Clara, USA) (Figure 23).

Figure 23 : GC-QTOF (Agilent Technologies, Santa Clara, USA).

L’acquisition des données est effectuée seulement en employant le TOF (i.e. mode MS). Une source à impact électronique est utilisée pour former les ions radicalaires. Ces derniers pouvant être instables, peuvent de fragmenter dans la source. Grâce à cette interface, l’utilisation du mode MS permet d’obtenir la masse exacte des ions mais également des informations sur la fragmentation de la molécule. Les conditions analytiques sont présentées dans le Tableau 17 .

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Tableau 17 : Conditions analytiques en GC-QTOF.

Éléments Paramètres en GC-QTOF

Colonne HP-5MS (Agilent technologies, Massy, France)

5 % Phényle- 95 % Méthyle-siloxane (30 m x 250 µm x 0,25 µm)

Source / énergie Impact électronique / 70 ev

Mode d’injection /Température/ débit de purge

Sans division pulsée / 280°C/ 60 mL.min^-1 pendant 1.5 min

Volume d’injection 1 µL

Gaz vecteur Hélium (99,99990%)

Débit 1,3 mL.min^-1

Gradient de température 50 C pendant 2 min , 10°C.min^-1 jusqu’à 320 C, maintenue durant 8 min

Temps d’acquisition 37 min

Gamme de masse 50 à 500 m/z

Fréquence d’acquisition 2 GHz

Les données chromatographiques sont traitées avec le logiciel MassHunter Qualitative (Agilent Technologies). La stratégie d’identification est détaillée dans le Chapitre 5.