Les procédures de fractionnement

Le fractionnement de tous les échantillons a été mené au laboratoire EPOC-LPTC. Plusieurs procédures ont été développées et appliquées suivant la complexité des échantillons et leurs propriétés physico-chimiques.

5.1 Le fractionnement par SPE : fractionnement primaire pour matrice solide

Le fractionnement par SPE a été développé durant les travaux de thèse de Creusot (2011) et a été publié par Creusot et al. (2013). Les cartouches de silice 500 mg, 6 cc (Supelclean^TM LC-Si SPE, Supelco^®, St Quentin Fallavier, France) ont été choisies pour leurs propriétés séparatives. Le développement a été effectué sur une solution constituée de 11 composés ayant des log Kow compris entre 2 et 7 et sur un sédiment supplémenté avec cette même solution. Les rendements d’extraction des composés obtenus lors du développement sont compris entre 118% et 88% pour les composés en solution (Figure 19). Pour les molécules contenues dans le sédiment, un léger effet matriciel est observé puisque les rendements sont légèrement inférieurs à ceux observés pour les composés en solution (Creusot et al., 2013). Les valeurs obtenues sont comprises entre 99% et 63%. Globalement, les rendements sont satisfaisants puisque les composés sont extraits à plus de 70 %, à l’exception du clotrimazole pour lequel le rendement est de 63 % (Figure 19).

Le protocole de fractionnement SPE a été appliqué durant ces travaux de thèse aux extraits de matrices solides pour permettre d’effectuer une première séparation des composés. Dans un premier temps, la cartouche est conditionnée avec 5 mL d’heptane. L’échantillon préalablement repris dans l’heptane est déposé sur la phase. L’élution des composés débute par l’ajout de 10 mL d’heptane, constituant ainsi la première fraction. 10 mL d’un mélange heptane/dichlorométhane (50/50, v :v) sont ensuite ajoutés. Les composés élués par ce mélange de solvants forment la seconde fraction. L’élution continue avec 10 mL d’acétate d’éthyle et se termine par 10 mL d’un mélange méthanol/eau ultra-pure (50/50, v :v) permettant ainsi de former la troisième et quatrième fraction. Ce protocole sépare l’extrait environnemental en quatre fractions de polarités croissantes. Chaque fraction est ensuite évaporée sous flux d’argon jusqu’au volume final souhaité. Comme pour chaque préparation d’extrait, les fractions sont séparées en deux. Un aliquote est destiné aux tests biologiques, le second est réservé pour un fractionnement supplémentaire ou pour l’analyse chimique. Les fractions sont suivies par gravimétrie et conservées à -20°C.

86

Figure 19 : Rendements d’extraction obtenus sur cartouches Supelclean^TM LC-Si (n = 3) (Creusot et al., 2013). Aucun composé n’a été détecté dans la fraction 4.

5.2 Le fractionnement par chromatographie liquide

Dans le but de réaliser une séparation fine des composés biologiquement actifs, un fractionnement par chromatographie en phase liquide a été développé. Pour que ce fractionnement puisse être adapté à tous extraits d’échantillon, deux modes de séparation ont été mis en place, un fractionnement en phase inverse et un fractionnement en phase normale. Pour le Programme National Arcachonnais, un fractionnement optimisé pour l’extrait de bivalves a été spécialement développé pour le projet et est présenté Chapitre 6.

Une chaine HPLC (Agilent HPLC system, série 1200) équipée d'un détecteur UV/Visible à barrettes de diodes (Agilent série 1200) et d’un collecteur automatique de fractions (Agilent série 1260 infinity) (Agilent Technologies, Les Ulis, France) a été utilisée pour développer et appliquer les différents fractionnements (Figure 20). Les développements pour le fractionnement en phase inverse et normale sont exposés Chapitre 4.

87

Figure 20 : Chaine HPLC équipée d'un détecteur UV/Visible à barrettes de diodes et d’un collecteur automatique de fractions (Agilent Technologies, Les Ulis, France).

5.2.1 Assurance qualité pour la préparation des fractions par HPLC

Les mêmes consignes que celles citées pour la préparation des échantillons sont appliquées lors du fractionnement de façon à éviter la contamination des échantillons (Chapitre 3 §4.1, p 78). Pour s’assurer de la répétabilité de la procédure de séparation (i.e. temps de rétention), une solution de contrôle qualité contenant 9 et 16 composés en phase inverse et phase normale, respectivement, est injectée avant chaque fractionnement. De façon à vérifier l’absence de contamination, un blanc de procédure est réalisé en amont du fractionnement du blanc d’extraction et de l’extrait de l’échantillon.

5.2.2 Fractionnement en RP-HPLC

Le fractionnement en phase inverse est basé sur les travaux de Creusot (2011) et Creusot et al. (2013). Avant injection, l’échantillon est évaporé et repris dans 100 µL d’un mélange d’eau ultra-pure /acétonitrile (80/20, v:v). Les composés présents dans l’extrait injecté sont séparés sur une colonne de silice greffée C18 (C18 Spherisorb ODS2, 5 µm, 4,6 x 250 mm) (Waters, Milford, USA). Le gradient d’une durée de 120 min débute par un mélange eau ultra-pure/acétonitrile (80/20, v:v) et se termine à 100 % d’acétonitrile avec un débit fixé à 1 mL.min^-1 (Figure 21). Toutes les 3 min, une fraction est collectée. Au total, 40 fractions sont obtenues par RP-HPLC (f1 à f40) et sont évaporées à sec sous évaporateur automatique EZ-2 Plus (Genevac^®, Fischer scientific, Illkrich, France) et sous flux d’argon à 45°C. Après reprise dans du méthanol, chaque fraction est divisée en deux, l’une destinée aux tests biologiques, l’autre à l’analyse chimique. Les fractions à tester biologiquement sont ensuite à nouveau séparées en deux. Un des aliquotes est destiné à reformer l’extrait global sans fractionnement. Ainsi, les aliquotes sont regroupés dans un même flacon. L’extrait reconstitué est évaporé juste à sec sous flux d’argon et repris dans le solvant souhaité pour le bio-essai employé (e.g. méthanol, DMSO, acétonitrile). L’activité biologique des fractions combinées

88 est comparée à celle de l’extrait brut de façon à vérifier l’absence de perte d’effets biologiques liés au processus de fractionnement et éventuellement observer la présence d’effets de mélange entre les molécules. Le second aliquote des fractions réservées aux tests biologiques est évaporé sous flux d’argon et repris dans le solvant désiré pour effectuer les bio-essais. Toutes les fractions sont suivies par gravimétrie et conservées à -20°C.

Figure 21 : Gradient d’élution de la phase mobile en RP-HPLC.

5.2.3 Fractionnement en NP-HPLC

Le fractionnement en phase normale est réalisé sur un extrait d’échantillon préalablement évaporé et repris dans 100 µL d’isooctane. La séparation des molécules s’effectue sur une colonne de silice greffée avec NH2 (Microsorb NH₂ 100- 5, 4,6 x 250 mm, Varian^®) (Agilent technologies, Les Ulis, France). Le gradient d’élution est composé de trois solvants (n.b. pentane, dichlorométhane, acétonitrile). Les conditions du gradient sont résumées dans le Tableau 14. Une fraction est collectée toutes les 2 min. Au total, 20 fractions sont obtenues par NP-HPLC (f1 à f20) et sont évaporées à sec sous flux d’argon à 45°C. Tout comme pour le fractionnement en RP-HPLC, chaque fraction est reprise dans du méthanol, est divisée en deux pour effectuer les tests biologiques et en parallèle les analyses chimiques. L’extrait global sans fractionnement est également reconstitué dans les mêmes conditions qu’exposées précédemment (Chapitre 3, §5.2.2, p 87). Toutes les fractions sont suivies par gravimétrie et conservées à -20°C.

89

Tableau 14 : Gradient d’élution utilisé en NP-HPLC

Temps (min)

Pentane (%) Dichlorométhane (%) Acétonitrile (%) Débit (mL.min^-1) 0 100 0 0 1 7 100 0 0 1 17 0 100 0 1 22 0 100 0 1 26 0 0 100 1 30 0 0 100 1 35 0 100 0 1 40 100 0 0 1 45 100 0 0 1